專利名稱：一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化的嗜吡啶紅球菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物技術(shù)處理領(lǐng)域，涉及一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化的嗜吡啶紅球菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，畜禽養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；目焖侔l(fā)展，隨之而帶來的環(huán)境污染問題也越發(fā)嚴(yán)重。其中畜禽養(yǎng)殖廢水中氮污染問題最為突出，多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中的氨氮都超標(biāo)，超標(biāo)率為80%以上，氮超標(biāo)所引起水體的富營(yíng)養(yǎng)化以及嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染已經(jīng)成為世界性的問題。因此，對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水中氮降解的研究，就顯得尤為迫切。目前，在水污染環(huán)境處理方面微生物脫氮法與物理、化學(xué)法相比較，以它高效率、 低成本、無(wú)二次污染等不可比擬的優(yōu)點(diǎn)已被人們所廣泛認(rèn)可，成為環(huán)境科學(xué)和水處理領(lǐng)域關(guān)注和研究的主要內(nèi)容。同時(shí)硝化反硝化(Simultanous nitrification and denitrification，SND)可使硝化和反硝化反應(yīng)在同一反應(yīng)器內(nèi)同時(shí)完成，節(jié)省反應(yīng)空間，縮短反應(yīng)時(shí)間，平衡了反應(yīng)條件，還克服了傳統(tǒng)生物脫氮的很多弊端，被認(rèn)為是在廢水生物脫氮中具有很大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化的嗜吡啶紅球菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的嗜吡啶紅球菌(Iihodococuus pyridinivorans)，命名為CPZ-24，分離自浙江蕭山養(yǎng)豬場(chǎng)氧化塘的廢水，已于2010年12月03日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，菌種保藏號(hào)為 CGMCC No. 4401。嗜吡啶紅球菌(Rhodococuus pyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401簡(jiǎn)稱嗜吡啶紅球菌CPZ-M，是一種新型異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌。嗜吡啶紅球菌CPZ-M是采用極限稀釋和GN顯色培養(yǎng)基顯色相結(jié)合的方法篩選得到的，具體篩選過程如下(1)通過多次富集培養(yǎng)含有氨氧化菌的最優(yōu)富集液；(2)采用極限稀釋篩選法從最優(yōu)富集液中篩選異養(yǎng)硝化菌；(3)采用GN顯色培養(yǎng)基顯色的篩選方法篩選好氧反硝化菌；(4)對(duì)異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株進(jìn)行分離純化進(jìn)行保藏。嗜吡啶紅球菌CPZ-M可應(yīng)用于水體脫氮。嗜吡啶紅球菌CPZ-M可應(yīng)用于廢水脫氮。所述廢水具體可為畜禽養(yǎng)殖廢水。嗜吡啶紅球菌CPZ-24可應(yīng)用于制備廢水處理菌劑。所述廢水具體可為畜禽養(yǎng)殖廢水。本發(fā)明還保護(hù)一種廢水處理菌劑，它的活性成分為嗜吡啶紅球菌CPZH所述廢水具體可為畜禽養(yǎng)殖廢水。
嗜吡啶紅球菌CPZ-M可應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)化水體處理。嗜吡啶紅球菌CPZ-M可應(yīng)用于制備富營(yíng)養(yǎng)化水體處理菌劑。本發(fā)明還保護(hù)一種富營(yíng)養(yǎng)化水體處理菌劑，它的活性成分為嗜吡啶紅球菌 CPZ-M。本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)生物脫氮的弊端，提供了一株新功能菌，嗜吡啶紅球菌CPZ-M。該菌具有異養(yǎng)硝化作用和好氧反硝化作用，且具有同步硝化反硝化功能，可獨(dú)立高效完成脫氮的全過程。該菌在脫氮過程中，產(chǎn)生99%的氣體為隊(duì)，1%的氣體為隊(duì)0、而、NO2,利于環(huán)境保護(hù)。本發(fā)明為更有效、更經(jīng)濟(jì)、更快速地去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的氮提供了基礎(chǔ)，對(duì)于治理水體富營(yíng)養(yǎng)化，恢復(fù)健康的生態(tài)環(huán)境具有深遠(yuǎn)意義。


圖1為未接菌的GN顯色培養(yǎng)基。圖2為接入嗜吡啶紅球菌CPZ-M培養(yǎng)3天的GN顯色培養(yǎng)基。圖3為嗜吡啶紅球菌CPZ-M的掃描電鏡照片(8000 X)。圖4為嗜吡啶紅球菌CPZ-M的透射電鏡照片(8000 X)。圖5為嗜吡啶紅球菌CPZ-M異養(yǎng)硝化生長(zhǎng)曲線。圖6為嗜吡啶紅球菌CPZ-M異養(yǎng)硝化效果圖。圖7為嗜吡啶紅球菌CPZ-M好養(yǎng)反硝化生長(zhǎng)曲線。圖8為嗜吡啶紅球菌CPZ-M好養(yǎng)反硝化效果圖。圖9為嗜吡啶紅球菌CPZ-M同步硝化反硝化功能實(shí)驗(yàn)的硝化產(chǎn)物曲線圖。圖10為嗜吡啶紅球菌CPZ-M同步硝化反硝化功能實(shí)驗(yàn)的反硝化產(chǎn)物曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。氨氮濃度的檢測(cè)方法納氏試劑光度法(GB 7479-87)。亞硝酸鹽氮濃度的檢測(cè)方法N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-84)。硝酸鹽氮濃度的檢測(cè)方法紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)。總氮濃度的檢測(cè)方法過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法(GB 11894-89)。N2 的檢測(cè)采用 GC-TCD 方法；參考文獻(xiàn)Su J. J.，Liu B. Y.，Chang Y. C.， 2001. Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere byThiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newlyisolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatmentsystem. J Appl Microbiol. 90，457-462.N2O 的檢測(cè)采用 GC-ECD 方法；參考文獻(xiàn)=Su J. J.，Liu B. Y.，Chang Y. C.，2003. Emission of greenhouse gas from livestock waste and wastewater treatment inTaiwan. Agr. Ecosyst. Environ. 95,253-263.
NO的檢測(cè)采用NOx分析儀(型號(hào)AP1200A，Riken keiki)測(cè)定；參考文獻(xiàn) Hung-SooJoo, Mitsuyo Hirai, Makoto Shoda,2006. Piggery wastewater treatment usingAlcaligenes faecalis strain No. 4 with heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification. Water Research. 40,3031.NO2的檢測(cè)采用NOx分析儀(型號(hào)AP1200A，Riken keiki)測(cè)定；參考文獻(xiàn) Hung-SooJoo, Mitsuyo Hirai, Makoto Shoda,2006. Piggery wastewater treatment usingAlcaligenes faecalis strain No. 4 with heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification. Water Research. 40, 3031.細(xì)胞內(nèi)的氮的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)Hung-Soo Joo，Mitsuyo Hirai, Makoto Shoda, 2006. Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis strain No. 4 withheterotrophic nitrification and aerobic denitrification. Water Research. 40, 3031.實(shí)施例1、嗜吡啶紅球菌CPZ-M (異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌)的分離和鑒定一、樣品的采集實(shí)驗(yàn)樣品為2008年4月取自浙江蕭山養(yǎng)豬場(chǎng)氧化塘的廢水。二、嗜吡啶紅球菌CPZ-M的分離和篩選1、最優(yōu)富集液的培養(yǎng)取IOmL水樣接入相同的裝有90mL已滅過菌的富集培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min 搖床培養(yǎng)。經(jīng)多次富集培養(yǎng)，通過格里斯試劑和二苯胺試劑檢測(cè)樣品中氨氧化菌的存在，并選取鏡檢下菌落大、數(shù)量多的作為最優(yōu)富集液。富集培養(yǎng)基將(NH4)2SO4 0. 5g、琥珀酸2. 17g、維氏鹽溶液50mL溶解后用蒸餾水定容至1L(固體培養(yǎng)基中加入瓊脂，使其質(zhì)量百分含量為2% )。維氏鹽溶液將K2HPO4 · 3H20 6. 5g、MgSO4 · 7H20 2. 5g、NaCl 2. 5g、 FeSO4 · 7H200. 05g、MnSO4 · H2O 0. 04g 溶解后用蒸餾水定容至 IL02、異養(yǎng)硝化菌的篩選富集液中分別吸取ImL菌液，加入IOOmL新鮮液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30°C、120r/ min搖床培養(yǎng)2d。檢測(cè)氨氮量，將氨氮降低的樣品重復(fù)以上操作2次。對(duì)氨氮降低較明顯的樣品進(jìn)行極限稀釋，樣品分別稀釋105、IO6UO7倍，將稀釋液移入IOOmL新鮮液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，300C、120r/min搖床培養(yǎng)2d。檢測(cè)其氨氮降低量，篩選出氨氮降低最多的樣品進(jìn)行多次純種分離，采用平板涂布法和平板劃線分離法進(jìn)行多次純種分離。異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基將(NH4)2SO4 0. Mg、琥珀酸鈉2. 81g、維氏鹽溶液50mL溶解后用蒸餾水定容至1L(固體培養(yǎng)基中加入瓊脂，使其質(zhì)量百分含量為2% )。3、好氧反硝化菌的篩選將若干初篩菌再次進(jìn)行氨氮和總氮降解率的測(cè)定，挑選出降解率較高的菌株。將其接種到GN顯色培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)Mh，能使GN培養(yǎng)基由綠色變成藍(lán)色的菌株作為復(fù)篩菌，即為異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌(見圖1和圖2)。GN顯色培養(yǎng)基(ρΗ7· 0) =KNO3 1. Og，L-天冬酰胺1. Og，用酒精稀釋的0. (質(zhì)量百分含量)百里酚藍(lán)(BTB) 5mL，檸檬酸鈉 8. 5g，KH2PO4 1. Og，MgSO4 ·7Η20 1. Og，CaCl2 ·6Η20 0. 2g，F(xiàn)eCl3 · 6H20 0. 05g，溶解后用蒸餾水定容至IL0
4、異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株進(jìn)行純化、進(jìn)行石蠟保藏。將篩選后的復(fù)篩菌種，經(jīng)過多次的平板劃線培養(yǎng)后得到不同的單個(gè)菌落，直至顯微鏡下檢驗(yàn)無(wú)雜菌，即為純化的菌株，將其命名為CPZ-M。將液體石蠟置于IOOmL的小錐形瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，外包牛皮紙，高壓蒸汽滅菌， 121°C滅菌30min。滅菌后將裝有液體石蠟錐形瓶置于105 110°C的烘箱內(nèi)lh，以除去液體石蠟的水分。將菌株CPZ-M接種至斜面培養(yǎng)基上。30°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，使其充分生長(zhǎng)。用無(wú)菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入到已長(zhǎng)好的斜面上，使菌種CPZ-M與空氣隔絕。將已注入液體石蠟的斜面培養(yǎng)物直立，置于4 5°C冰箱保存。三、嗜吡啶紅球菌CPZ-M的鑒定1、形態(tài)學(xué)鑒定將菌株CPZ-M涂于平板上，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)，用透射電鏡和掃描電鏡觀察其菌體形態(tài)等。CPZ-M顏色為橙紅色，菌體形態(tài)為桿狀(見圖3和圖4)。2、生理生化鑒定依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1。表1 菌株CPZ14的生理生化特征
權(quán)利要求
1.嗜吡啶紅球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24，其保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 4401。
2.嗜吡啶紅球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在水體脫氮中的應(yīng)用。
3.嗜吡啶紅球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在廢水脫氮中的應(yīng)用。
4.嗜吡啶紅球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在制備廢水處理菌劑中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述廢水為畜禽養(yǎng)殖廢水。
6.一種廢水處理菌劑，它的活性成分為嗜吡啶紅球菌(lihodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401。
7.如權(quán)利要求6所述的廢水處理菌劑，其特征在于所述廢水為畜禽養(yǎng)殖廢水。
8.嗜吡啶紅球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在富營(yíng)養(yǎng)化水體處理中的應(yīng)用。
9.一種富營(yíng)養(yǎng)化水體處理菌劑，它的活性成分為嗜吡啶紅球菌 (Rhodococuuspyridinivorans)CPZ-24CGMCC No. 4401。
10.嗜吡啶紅球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在制備富營(yíng)養(yǎng)化水體處理菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化的嗜吡啶紅球菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的嗜吡啶紅球菌(Rhodococuus pyridinivorans)，命名為CPZ-24，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4401。該菌具有異養(yǎng)硝化作用和好氧反硝化作用，且具有同步硝化反硝化功能，可獨(dú)立高效完成脫氮的全過程。該菌在脫氮過程中，產(chǎn)生99％的氣體為N2，1％的氣體為N2O、NO、NO2，利于環(huán)境保護(hù)。嗜吡啶紅球菌CPZ-24可應(yīng)用于水體脫氮、廢水脫氮和富營(yíng)養(yǎng)化水體處理。本發(fā)明為更有效、更經(jīng)濟(jì)、更快速地去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的氮提供了基礎(chǔ)，對(duì)于治理水體富營(yíng)養(yǎng)化，恢復(fù)健康的生態(tài)環(huán)境具有深遠(yuǎn)意義。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102154172SQ201110006790
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者李季, 王立剛, 王迎春, 陳昢圳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)