專利名稱：癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件cpd及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及基因表達(dá)調(diào)控，具體地說，涉及一種特異性針對(duì)癌胚抗原陽性 腫瘤細(xì)胞的靶向性基因表達(dá)元件CPD的設(shè)計(jì)、制備及其在癌胚抗原陽性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表 達(dá)、其產(chǎn)物可以有效地阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，使細(xì)胞周期因DNA復(fù)制受阻而無法進(jìn) 行下去，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療藥物。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是目前人類主要"殺手"之一，近年來隨著人們生活方式及環(huán)境的改變，其發(fā) 病率呈上升趨勢(shì)，在許多城市己成為第一位死亡原因，在農(nóng)村位列第二位。肺癌、胃腸道腫 瘤、乳癌等在我國是最常見的危害極大的惡性腫瘤，雖然目前可以通過手術(shù)和化療等常規(guī)方 式進(jìn)行治療，對(duì)較早期發(fā)現(xiàn)的上述腫瘤能收到一定的甚至較好的療效，但對(duì)于較晚期的上述 腫瘤的療效和預(yù)后均不理想。
被稱為腫瘤治療新模式的生物治療目前正顯示出越來越良好的應(yīng)用前景。在各種腫瘤生 物治療手段中，基因治療始終是一個(gè)主要方向，我國研制的世界上第一個(gè)正式進(jìn)入臨床使用 的基因藥物、針對(duì)許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)生突變的抑癌基因p53的、可表達(dá)野生型p53的腺病毒 注射液"今又生"即是其代表。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)和知識(shí)的飛速發(fā)展，各種先進(jìn)的分 子生物學(xué)手段都運(yùn)用到腫瘤的基因治療研究中。但是由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因，而 目前的研究大都僅針對(duì)個(gè)別靶基因，因此，這些研究雖然都顯示出較好的細(xì)胞水平的體外抑 瘤效果甚至荷瘤動(dòng)物模型的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)，但實(shí)際效果并不理想。因此，探索、嘗試新的腫 瘤基因治療手段具有十分重要的意義。
正常細(xì)胞在各種致癌因素的作用下逐漸發(fā)生變化直至最后發(fā)生癌變，有相當(dāng)多的基因表 現(xiàn)出過度表達(dá)的現(xiàn)象，尤其是一些促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲等惡性表型的基因的過量表達(dá)。針對(duì) 腫瘤中異常表達(dá)的基因，人們?cè)O(shè)計(jì)了許多靶向性基因治療的方法，其中以封閉促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、 侵襲等相關(guān)基因的表達(dá)的研究是一個(gè)相當(dāng)熱門的領(lǐng)域。在以往大量的研究中，人們利用反義 RNA (antisense RNA)對(duì)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)基因進(jìn)行封閉，但由于反義RNA本身存在的限制， 這類研究在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、控制細(xì)胞侵襲遷移等方面雖然取得了較大的成績(jī)，其封閉基 因表達(dá)的效果仍不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抑制腫瘤效果好、適應(yīng)性廣、安全性好的癌胚抗 原陽性細(xì)胞耙向性基因表達(dá)元件CPD。本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD而改造的用于構(gòu)建其他的耙
向性基因表達(dá)元件
本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD在制備耙向性腫瘤基因治療 藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD在制備腸癌藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD在制備胃癌藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD在制備乳癌藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明還涉及癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD在制備肺癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的CEA陽性腫瘤細(xì)胞耙向性基因表達(dá)元件CPD為一種DNA分子，具有如 SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。其中第7位至第375位為人CEA基因翻譯起始點(diǎn)(定為 +1)上游第-407位至第-39位，該區(qū)域含有CEA的基本啟動(dòng)子和第一外顯子5，非翻譯區(qū)部分 序列，為CEA陽性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列；第376位至第1599位為3個(gè)3種串聯(lián)連接的針對(duì)人 DNA聚合酶S催化亞基p125基因的人工設(shè)計(jì)的microRNA;第1600位至第1948位為牛生長(zhǎng) 激素基因多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)，為基因表達(dá)提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
該表達(dá)元件在導(dǎo)入CEA陽性的腫瘤細(xì)胞后，可以在細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)DNA聚合酶5催化亞 基p125的人工microRNA,并有效抑制細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶S催化亞基p125的表達(dá)，進(jìn)而影 響到DNA復(fù)制，最終阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)行，抑制細(xì)胞增殖。
本發(fā)明提供該表達(dá)元件可用于構(gòu)建的靶向性基因治療載體，進(jìn)而制備基因治療藥物，用 于CEA陽性的腫瘤的靶向基因治療。該表達(dá)元件中針對(duì)人DNA聚合酶S催化亞基p125的人 工microRNA序列可以用于其它表達(dá)載體達(dá)到抑制相應(yīng)細(xì)胞中DNA聚合酶S催化亞基pl25 的表達(dá)目的。
小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的發(fā)現(xiàn)為人為干預(yù)細(xì)胞中基因的表達(dá)提供了 一個(gè)有力的工具。利用化學(xué)合成的雙鏈形式的siRNA，或是由III型啟動(dòng)子帶動(dòng)轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)類 似的小發(fā)卡樣RNA (small hairpin RNA, shRNA)，可以通過序列特異性匹配原則降解耙基因， 從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行有效的抑制，因此也被嘗試應(yīng)用于基因治療。但是由于化學(xué)合成的 siRNA代價(jià)太高，而shRNA的表達(dá)又不利于調(diào)控，這些因素大大地限制了這一技術(shù)的應(yīng)用。
微小RNA (microRNA)是細(xì)胞內(nèi)天然存在的一種小分子RNA，是在基因轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn) 行表達(dá)調(diào)控的一種重要方式，能在序列完全匹配的情況下降解耙基因mRNA，也可以在序列 非完全匹配的情況下抑制靶基因的翻譯，是目前生命科學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，在腫瘤相關(guān)microRNA方面也有大量研究，而且大都集中在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間表達(dá)有差異的各 種天然microRNA的發(fā)現(xiàn)以及功能鑒定。
由于天然microRNA是由II型啟動(dòng)子帶動(dòng)轉(zhuǎn)錄，因此如果人工設(shè)計(jì)類似的microRNA分 子，也應(yīng)該可以由II型啟動(dòng)子引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，而II型啟動(dòng)子的特點(diǎn)是其轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能可以調(diào)控， 所以其下游的人工miRNA的表達(dá)應(yīng)該可以受到人為控制，而microRNA的作用方式最近的一 些文獻(xiàn)報(bào)道已證實(shí)這一設(shè)想。
在本發(fā)明中我們選擇細(xì)胞周期中的DNA復(fù)制過程為作用點(diǎn)，設(shè)計(jì)人工microRNA的序列， 抑制DNA復(fù)制中必需的DNA聚合酶S的催化亞基p125表達(dá)。由于DNA的復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜 而又精密調(diào)控的過程，主要由DNA聚合酶ct、狩BS等酶催化、以原有的DNA鏈為模板進(jìn)行 的半保留復(fù)制，因此對(duì)DNA聚合酶S催化亞基p125表達(dá)的抑制將有效阻斷細(xì)胞的DNA復(fù)制， 從而使細(xì)胞周期因DNA無法復(fù)制而停止，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。
為了達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性作用，針對(duì)我國高發(fā)的肺癌、胃腸道腫瘤、乳癌等惡性腫 瘤，利用在胚胎細(xì)胞中表達(dá)而在正常成人細(xì)胞中不表達(dá)、但在上述腫瘤細(xì)胞中又常會(huì)重新表 達(dá)胚胎性抗原——癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)的特點(diǎn)，重組了CEA基因上游 的表達(dá)調(diào)控序列，用來調(diào)控人工設(shè)計(jì)的microRNA的表達(dá)。這一基因表達(dá)元件在導(dǎo)入正常細(xì) 胞后不會(huì)有任何表達(dá)，而在導(dǎo)入CEA陽性的腫瘤細(xì)胞后，可以表達(dá)出相應(yīng)的microRNA并有 效地阻斷腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制，從而達(dá)到靶向性抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
基于本發(fā)明的思路，還可以DNA聚合酶5催化亞基p125基因的其它位點(diǎn)做為耙序列進(jìn)行 人工microRNA的設(shè)計(jì)，或是以DNA復(fù)制過程中其它重要基因作為靶基因來進(jìn)行DNA復(fù)制 的阻斷，從而抑制細(xì)胞增殖。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果
利用本發(fā)明提供的表達(dá)元件可以制備的基因治療藥物，其特點(diǎn)在于以多種腫瘤細(xì)胞均重 新表達(dá)的胚胎性抗原——癌胚抗原為腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)調(diào)控手段、以腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)分 裂所需的DNA聚合酶S催化亞基p125為作用耙點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)抑制，有效地引起細(xì)胞周期阻斷， 特異性地抑制CEA陽性的腫瘤細(xì)胞的增殖。


圖1為CEA陽性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖2為針對(duì)人DNA聚合酶S催化亞基p125的三種人工microRNA構(gòu)建PCR產(chǎn)物電泳圖。 圖3為Western blot法檢測(cè)CPD對(duì)GAPDH表達(dá)的抑制的比較圖。圖4為MTT法檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明 并不局限于以下實(shí)施例。 實(shí)施例1:
人CEA陽性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列的克隆
首先從GenBank檢索得到包含人CEA基因5'側(cè)翼及第一個(gè)外顯子的基因組DNA序列 (GenBank登錄號(hào)Z21818),然后參考Nyati MK等人的文獻(xiàn)(Cancer Research 62, 2337 — 2342, 2002)，設(shè)計(jì)并合成引物1和引物2，利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴(kuò)增CEA翻譯起始點(diǎn)(定為+l)上游包含基本啟動(dòng)子和部分第一外顯子的5'非翻譯區(qū) 在內(nèi)的-407至-39位序列。引物1序列為:5' - AGA TCT CCC GGG ACC CTG CTG GGT TTC -3，、 引物2序列為5， - GGA TCC AGC TTG AGT TCC AGG AAC G -3'，以人腸癌細(xì)胞SW620基因 組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，獲得381 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。
將上述擴(kuò)增產(chǎn)物以T-A克隆的方式分別克隆至pGEMT-easy載體(Promega公司，.美國)， 參見圖1，其中泳道1為1Kb Plus DNA分子量標(biāo)記，泳道2為pGEM T-easy/CEA經(jīng)EcoR I酶 切，如克隆成功，則會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)條帶，大的一個(gè)條帶為約3.0 kb的載體pGEM T-easy,小的 一個(gè)條帶為約0. 4 kb的插入片段CEA陽性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列，如果未克隆成功，則僅有一個(gè) 條帶，即約3.0 kb的載體pGEM T-easy，從圖中可以看出PCR產(chǎn)物克隆成功，條帶大小與預(yù) 期完全相符。經(jīng)DNA序列測(cè)定并與基因組DNA序列(GenBank登錄號(hào)Z21818)核對(duì)驗(yàn)證其 正確性。測(cè)序結(jié)果如下，其中下劃線部分分別為兩端加的BglII和BamHl位點(diǎn)，加框部分為 人CEA基因翻譯起始點(diǎn)上游第-407位至第-39位序列。 AGATCTCCCG GGACCCTGCT GGGTTTCTCT GTCACAAAGG AAAATAATCC CCCTGGTGTG 60 ACAGACCCM GGACAGAACA CAGCAGAGGT CAGCACTGGG GAAGACAGGT TGTCCTCCCA 120 GGGGATGGGG GTCCATCCAC CTTGCCGAAA AGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG 180 GAAAAAAGAG GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA GGACACCTGA 240 ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC 300 TCAGGGCAGA GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG ACAAAACGTT 360 CCTGGAACTC AAGCTGGATC C 381
針對(duì)人DNA聚合酶S催化亞基Pl25基因的人工microRNA的克隆從GenBank檢索得到人DNA聚合酶S催化亞基p125基因的mRNA序列(GenBank登錄號(hào) NM—002691. 1)，利用網(wǎng)上軟件分析該mRNA序列上合適的位點(diǎn)，確定3個(gè)人工microRNA的作 用靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成引物D卜IS: 5， — TGC TGT TGA CAG TGA GCG CCG GCT TCG CTC CCT ACT TCT ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA -3' 、 Dl-1R: 5' - TCC GAG GCA GTA GGC AAC GGC TTC GCT CCC TAC TTC TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA -3， 、 Dl-2S: 5' -TGC TGT TGA CAG TGA GCG ACG GGA CCA GGG AGA ATT AAT ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA-3， 、 D1-2R: 5' -TCC GAG GCA GTA GGC AGC GGG ACC AGG GAG AAT TAA TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA-3' 、 D卜3S: 5， -TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG AGT CTG AGC TGT ATC AGA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA_3，、 D1-3R: 5' -TCC GAG GCA GTA GGC AGG GAG TCT GAG CTG TAT CAG AAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TT-3， 、 PS: 5' -AGA TCT GAT CCA AGA AGG TAT ATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3，和 PR: 5， -GGA TCC ATC GTA GCC CTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3'。先分別將引物D1-1S 和引物D1-1R、引物D1-2S和引物Dl-2R、引物D1-3S和引物D1-3R配對(duì)進(jìn)行重疊延伸PCR， 均分別得到97 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物D1-lp、 Dl-2p和D卜3p，再分別以這些擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引 物PS和引物PR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再分別得到142 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物Dl-lf、 Dl-2f和Dl-3f ，參 見圖2，其中泳道l、 2、 4分別為三種不同人工microRNA的PCR產(chǎn)物，均顯示出142 bp的 PCR產(chǎn)物條帶，泳道3為DL2000分子量標(biāo)記，說明按照設(shè)計(jì)進(jìn)行的人工microRNA的PCR合 成成功。
上述142 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物以T-A克隆的方式分別克隆至pGEM T-easy載體，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn) 證其正確性。這些即為針對(duì)人DNA聚合酶S催化亞基p125基因3個(gè)不同耙點(diǎn)的人工microRNA 序列。為了加強(qiáng)其作用效果，每一種人工microRNA分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Bgl II雙酶 切后回收該人工microRNA序列并重新插入同一載體的BamH I位點(diǎn)，獲得各有3個(gè)串聯(lián)連接 的人工microRNA序列，再將它們串聯(lián)連接在一起成為完整的針對(duì)人DNA聚合酶S催化亞基pl25 基因的人工microRNA序列。
腫瘤靶向性基因表達(dá)元件CPD的構(gòu)建及腺病毒載體的制備
首先構(gòu)建pDC312-BGHpA載體將腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312載體(Microbix公司，美國) 用限制性內(nèi)切酶XbaI單酶切開，用Klenow酶補(bǔ)平，再用限制性內(nèi)切酶HindIII單酶切，去掉 Xbal到HindIII之間的部分(從HindIII、 Sac I 、 Ecl國I、 Acc I 、 SalI到XbaI)，回收 部分一端為平端，另一端為HindIII粘性末端。pcDNA3. 1(+)載體(Invitrogen公司，美國) 用限制性內(nèi)切酶PvuII和HindIII雙酶切，回收包括HindIII、 Asp718、 Kpn I 、 BamH I 、 BstXI、 EcoR I 、 EcoRV、 BstXI、 Not I 、 Xho I 、 Xba I 、 DraII 、 Apa I和Pme I多克隆位點(diǎn)和牛生長(zhǎng)因子基因多聚腺苷酸信號(hào)(BGHpA)的片段， 一端為Hindin粘性末端，另一端為PvuII的 平端。將上述兩個(gè)片段連接起來，即成pDC312-BGHpA載體，可在多克隆位點(diǎn)上插入啟動(dòng)子和 目的基因編碼區(qū)。
再將前面所述的CEA陽性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列從載體上用限制性內(nèi)切酶BamH I和Bgl II雙 酶切后回收，并插入pDC312-BGHpA的BamH I位點(diǎn)，得到帶有CEA陽性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列和 BGHpA的腺病毒穿梭質(zhì)粒。最后將串聯(lián)連接的完整的針對(duì)人DNA聚合酶5催化亞基p125基因 的人工microRNA序列從載體上用限制性內(nèi)切酶BamH I和Bgl II雙酶切后回收，插入此穿梭質(zhì) 粒的BamHI位點(diǎn)，得到帶有完整腫瘤靶向性表達(dá)元件CPD的腺病毒穿梭質(zhì)粒，酶切鑒定結(jié)果 與預(yù)期完全相符。
將上述帶有完整腫瘤靶向性表達(dá)元件CPD的腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒 pBHGlox(delta)El,3cre (Microbix公司,美國)共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞293細(xì)胞，得到帶 有表達(dá)元件CPD的腺病毒載體。也就是完成了癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD的 制備。
應(yīng)用實(shí)施例1:
基因表達(dá)元件CPD對(duì)CEA陽性細(xì)胞DNA聚合酶S催化亞基p125基因表達(dá)的抑制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CEA陽性的人腸癌細(xì)胞服8348細(xì)胞，按3 X 105細(xì)胞/孔的密度接種于6
孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁并達(dá)到80%的匯合度。用培養(yǎng)基稀釋上述帶有表達(dá)元件cra的
腺病毒，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, M0I)為100 pfu/cell感染細(xì)胞，48hr 后中止作用，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠，5%濃縮膠)， 然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后與1 : 1000稀釋的抗DNA聚合酶5催化亞基pl25的抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.,美國，DNA pol 5 2 (C-20): sc-8800，)于4。C結(jié)合過夜，用 TBST洗膜3次，再與1 : 10000稀釋HRP標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)結(jié) 合，室溫2小時(shí)后，用TBST洗膜3次，然后用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Roche公司，美國)顯影， X光片暴光。用帶綠熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的腺病毒感染和無腺病 毒感染的細(xì)胞作對(duì)照。從圖3中可看到，感染帶有表達(dá)元件CPD的腺病毒的CEA陽性腸癌細(xì) 胞HR8348中的DNA聚合酶5催化亞基p125表達(dá)明顯受到抑制。圖中1為無病毒感染的HR8348 腸癌細(xì)胞DNA聚合酶S催化亞基p125基因表達(dá)情況，2為帶CPD的腺病毒以MOI 100感染服8348 腸癌細(xì)胞48小時(shí)后DNA聚合酶S催化亞基p125基因表達(dá)情況。 應(yīng)用實(shí)施例2:
基因表達(dá)元件CPD對(duì)CEA陽性細(xì)胞體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(MTT法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腸癌細(xì)胞HR8348，按3X105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小 時(shí)使其貼壁。將帶CPD的腺病毒以MOI為200 pfu/cel1、 100 pfu/cel1、 10 pfu/cell和0 pfu/cell感染細(xì)胞。在病毒感染48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 200^1， 37。C繼 續(xù)培養(yǎng)4hr，中止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入DMS0 2ml，振蕩10min，使結(jié)晶物充分 溶解，取IOO pl在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各樣品570nm波長(zhǎng)OD值。每組設(shè)立3復(fù)孔。從圖 4可以看出，不同MOI的帶CPD的腺病毒對(duì)CEA陽性的腸癌細(xì)胞HR8348的生長(zhǎng)均有不同程度 的抑制。
此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實(shí)施例，其零、部件的形狀、所取名稱 等可以不同。凡依本發(fā)明專利構(gòu)思所述的構(gòu)造、特征及原理所做的等效或簡(jiǎn)單變化，均包括 于本發(fā)明專利的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做 各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結(jié)構(gòu)或者超越本權(quán)利要 求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
雖然本發(fā)明已以實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何熟悉該項(xiàng) 技術(shù)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)所作的更動(dòng)與潤飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD電子序列 <110>杭州安倍生物科技有限公司
<120>癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD及其應(yīng)用 <160> 1
<210>
<211>1948 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD <400> 1
AGATCTCCCG GGACCCTGCT GGGTTTCTCT GTCACAAAGG AAAATAATCC CCCTGGTGTG 60
ACAGACCCAA GGACAGAACA CAGCAGAGGT CAGCACTGGG GAAGACAGGT TGTCCTCCCA 120
GGGGATGGGG GTCCATCCAC CTTGCCGAAA AGATTTGTCT GAGGAACTGA AAATAGAAGG 180
GAAAAAAGAG GAGGGACAAA AGAGGCAGAA ATGAGAGGGG AGGGGACAGA GGACACCTGA240
ATAAAGACCA CACCCATGAC CCACGTGATG CTGAGAAGTA CTCCTGCCCT AGGAAGAGAC 300
TCAGGGCAGA GGGAGGAAGG ACAGCAGACC AGACAGTCAC AGCAGCCTTG ACAAAACGTT 360
CCTGGAACTC AAGCTGGATC TGATCCAAGA AGGTATATTG CTGTTGACAG TGAGCGCCGG 420
CTTCGCTCCC TACTTCTATA GTGAAGCCAC AGATGTATAG AAGTAGGGAG CGAAGCCGTT 480
GCCTACTGCC TCGGACTTCA AGGGCTACGA TGGATCTGAT CCAAGAAGGT ATATTGCTGT 540TGACAGTGAG CGCCGGCTTC GCTCCCTACT TCTATAGTGA AGCCACAGAT GTATAGAAGT 600
AGGGAGCGAA GCCGTTGCCT ACTGCCTCGG ACTTCAAGGG CTACGATGGA TCTGATCCAA 660
GAAGGTATAT TGCTGTTGAC AGTGAGCGCC GGCTTCGCTC CCTACTTCTA TAGTGAAGCC 720
ACAGATGTAT AGAAGTAGGG AGCGAAGCCG TTGCCTACTG CCTCGGACTT CAAGGGCTAC 780
GATGGATCTG ATCCAAGAAG GTATATTGCT GTTGACAGTG AGCGACGGGA CCAGGGAGAA 840
TTAATATAGT GAAGCCACAG ATGTATATTA ATTCTCCCTG GTCCCGCTGC CTACTGCCTC 900
GGACTTCAAG GGCTACGATG GATCTGATCC AAGAAGGTAT ATTGCTGTTG ACAGTGAGCG %0
ACGGGACCAG GGAGAATTAA TATAGTGAAG CCACAGATGT ATATTAATTC TCCCTGGTCC 1020
CGCTGCCTAC TGCCTCGGAC TTCAAGGGCT ACGATGGATC TGATCCAAGA AGGTATATTG 1080
CTGTTGACAG TGAGCGACGG GACCAGGGAG AATTAATATA GTGAAGCCAC AGATGTATAT 1140
TAATTCTCCC TGGTCCCGCT GCCTACTGCC TCGGACTTCA AGGGCTACGA TGGATCTGAT 1200
CCAAGAAGGT ATATTGCTGT TGACAGTGAG CGAGGAGTCT GAGCTGTATC AGAATAGTGA 1260
AGCCACAGAT GTATTCTGAT ACAGCTCAGA CTCCCTGCCT ACTGCCTCGG ACTTCAAGGG 1320
CTACGATGGA TCTGATCCAA GAAGGTATAT TGCTGTTGAC AGTGAGCGAG GAGTCTGAGC 1380
TGTATCAGAA TAGTGAAGCC ACAGATGTAT TCTGATACAG CTCAGACTCC CTGCCTACTG 1440CCTCGGACTT CAAGGGCTAC GATGGATCTG ATCCAAGAAG GTATATTGCTGTTGACAGTG 1500
AGCGAGGAGT CTGAGCTGTA TCAGAATAGT GAAGCCACAG ATGTATTCTGATACAGCTCA1560
GACTCCCTGC CTACTGCCTC GGACTTCAAG GGCTACGATG GATCCACTAGTCCAGTGTGG 1620
TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC GGCCGCTCGA GTCTAGAGGGCCCGTTTAAA1680
CCCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTTTGCCCCTCCC 1740
CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAATAAAATGAGG l細(xì)
AAATTGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGGGTGGGGCAGG1860
ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCGGTGGGCTCTA1920
TGGCTTCTGA GGCGGAAAGA ACCAGCTG 1948
1權(quán)利要求
1、一種癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD，其特征是一種DNA分子，具有如SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 一種基于如權(quán)利要求1所述的CPD而改造的用于構(gòu)建其他的靶向性基因表達(dá)元件。
3、 一種癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元件CPD在制備靶向性腫瘤基因治療藥物中 的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元 件CPD在制備腸癌藥物中的應(yīng)用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元 件CPD在制備胃癌藥物中的應(yīng)用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元 件CPD在制備乳癌藥物中的應(yīng)用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述的癌胚抗原陽性細(xì)胞靶向性基因表達(dá)元 件CPD在制備肺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及基因表達(dá)調(diào)控，具體地說，涉及一種特異性針對(duì)癌胚抗原陽性腫瘤細(xì)胞的靶向性基因表達(dá)元件CPD的設(shè)計(jì)、制備及其在癌胚抗原陽性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)、其產(chǎn)物可以有效地阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，使細(xì)胞周期因DNA復(fù)制受阻而無法進(jìn)行下去，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療藥物。本發(fā)明具有抑制腫瘤效果好、適應(yīng)性廣、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101638654SQ20091010185
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者江 曹, 賈振宇 申請(qǐng)人:杭州安倍生物科技有限公司