專利名稱：：嗜熱毀絲霉菌株及其在產(chǎn)角蛋白酶方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及嗜熱毀絲霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：角蛋白酶(keratinase)是一種專一性很強(qiáng)的蛋白酶，能特異性地分解角蛋白，而角蛋白廣泛存在于自然界中，主要來(lái)源于動(dòng)物的外胚層細(xì)胞，包括皮膚以及皮膚的衍生物，是其結(jié)構(gòu)蛋白，可分為a和|3兩種類型。該類蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是一種抗性很強(qiáng)的硬性蛋白，它的結(jié)構(gòu)通過(guò)二硫鍵、氫鍵、鹽鍵和其它交鍵作用使得非常穩(wěn)定，不溶于水，難以被胰蛋白酶、胃蛋白酶等常見(jiàn)蛋白酶降解，但能被角蛋白酶所降解。角蛋白酶具有降解天然角蛋白的特性，屬于堿性絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶族，被認(rèn)為是一類誘導(dǎo)酶。由于角蛋白酶具有能特異性地分解角蛋白的特性，使其在飼料工業(yè)、肥料工業(yè)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、皮革工業(yè)、洗滌用品、美容產(chǎn)品、食品工業(yè)、環(huán)境治理及紡織工業(yè)等方面均有廣泛的應(yīng)用。因此，研究與開(kāi)發(fā)產(chǎn)角蛋白酶意義重大。嗜熱菌具有在發(fā)酵中利用其嗜熱特性可以提高反應(yīng)溫度，以增大反應(yīng)速度，提高單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)率，節(jié)約成本；減少中溫型雜菌的污染幾率等優(yōu)勢(shì)。而嗜熱真菌產(chǎn)角蛋白酶的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。毀絲霉屬的其他真菌也尚未見(jiàn)報(bào)道可以產(chǎn)生角蛋白酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供嗜熱的、產(chǎn)角蛋白酶能力強(qiáng)且生長(zhǎng)快速的嗜熱毀絲霉菌株。本發(fā)明的另一目的是提供該嗜熱毀絲霉菌株在產(chǎn)角蛋白酶方面的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的是提供該嗜熱毀絲霉菌株產(chǎn)角蛋白酶的方法。嗜熱毀絲霉菌株從四川平武的土樣中分離而獲得，已于2009年7月15日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國(guó)武漢武漢大學(xué))，名稱為嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.l(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，保藏號(hào)CCTCCNO:M209140。本發(fā)明的嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1，具有以下形態(tài)學(xué)特征在PDA培養(yǎng)基上，38t:培養(yǎng)2.5天，菌落直徑85mm，平展，褐色，邊緣白色，延長(zhǎng)培養(yǎng)全部變?yōu)楹稚q狀至粉狀，表面有菌絲呈網(wǎng)狀分布；正反面顏色一致。菌絲具隔膜，半透明，表面光滑，氣生菌絲明顯分為粗細(xì)兩種類型，均可育，細(xì)菌絲寬O.9-1.8ym，粗菌絲寬3.6-6.3(8.1)ym。無(wú)球拍狀菌絲。頂生和側(cè)生分生孢子，無(wú)柄，或生在短柄或短突或側(cè)枝上，單生或雙生或3個(gè)成鏈，半透明，光滑或具瘤，大多橢圓形，大小4.5-7.2X2.3-4.5iim，單孢，雙孢極少，基痕寬O.5-2iim，產(chǎn)孢豐富。無(wú)間生孢子。厚垣孢子未見(jiàn)。有性型未知。此菌為嗜熱真菌，在2(TC時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，25t:培養(yǎng)7天菌落直徑為15mm，最適生長(zhǎng)溫度為35-40。C，53。C培養(yǎng)7天，直徑達(dá)45mm。60。C下未見(jiàn)生長(zhǎng)。本發(fā)明嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1菌株產(chǎn)角蛋白酶的方法，是以雞毛粉20.10g/L3為碳、氮源和誘導(dǎo)物、尿素0.98g/L為補(bǔ)充氮源、NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶溫度為3『C初始pH為7.9，連續(xù)培養(yǎng)6天，酶活測(cè)定時(shí)間為培養(yǎng)的第6天。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本菌株從四川平武的土樣中分離而獲得，為中國(guó)本土的菌株，并非從國(guó)外引進(jìn)。該菌株的產(chǎn)角蛋白酶能力強(qiáng)。由于是一個(gè)嗜熱菌株，因而在發(fā)酵中可以提高反應(yīng)溫度，以增大反應(yīng)速度，提高單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)率，節(jié)約成本；而且有減少中溫型雜菌的污染幾率等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，由于本菌株生長(zhǎng)快速，可以縮短發(fā)酵周期，也有提高單位時(shí)間產(chǎn)率，減少污染機(jī)會(huì)，節(jié)約生產(chǎn)成本等優(yōu)勢(shì)。以下通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:(1)材料來(lái)源采自四川平武的土樣。馬丁氏培養(yǎng)基KH2P04lg，MgS04.7H200.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊脂18g，孟加拉紅1/300mL。滅菌條件12rC，30min。用前待溫度冷卻在4(TC左右，加青霉素20/mg，鏈霉素40iig/mg。PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g切塊，加水約500mL，煮沸30min，過(guò)濾，加葡萄糖20g，瓊脂20g，水補(bǔ)足1000mL，pH自然。滅菌條件121°C，30min。(2)菌株的分離純化稱取2g土樣加入盛有20mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min左右，使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液。吸取lmL土壤懸液到9mL無(wú)菌水中，依次按10倍法稀釋，通常稀釋在10—110一3。采用混菌法接種，吸取lmL懸液于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，然后傾注已熔化并冷卻到45t:的雙抗馬丁氏培養(yǎng)基，充分混勻，待凝固后倒置，4(rC保溫培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿進(jìn)行純化，獲得GZUIFR-H94.1菌株。(3)分離株的鑒定把待鑒定菌株移入PDA培養(yǎng)基中，采用點(diǎn)中法接種，倒置放于38t:溫箱中培養(yǎng)7天。采用膠帶粘帖法進(jìn)行標(biāo)本片的制作并采用Motic數(shù)碼顯微鏡進(jìn)行顯微攝影，描述記載待定菌株的菌落特征和微觀形態(tài)特征。通過(guò)經(jīng)典形態(tài)學(xué)鑒定，該分離株為嗜熱毀絲霉，具體描述如下在PDA培養(yǎng)基上，38t:培養(yǎng)3天，菌落直徑85mm，平展，褐色，邊緣白色，延長(zhǎng)培養(yǎng)全部變?yōu)楹稚?，絨狀至粉狀，表面有菌絲呈網(wǎng)狀分布；正反面顏色一致。菌絲具隔膜，半透明，表面光滑，氣生菌絲明顯分為粗細(xì)兩種類型，均可育，細(xì)菌絲寬0.9-1.8iim粗菌絲寬3.6-6.3(8.1)ym。無(wú)球拍狀菌絲。頂生和側(cè)生分生孢子，無(wú)柄，或生在短柄或短突或側(cè)枝上，單生或雙生或3個(gè)成鏈，半透明，光滑或具瘤，大多橢圓形，大小4.5-7.2X2.3-4.5iim，單孢，雙孢極少，基痕寬O.5-2iim，產(chǎn)孢豐富。無(wú)間生孢子。厚垣孢子未見(jiàn)。有性型未知。此菌為嗜熱真菌，在2(TC時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，25t:培養(yǎng)7天菌落直徑為15mm，最適生長(zhǎng)溫度為35-40。C，53。C培養(yǎng)7天，直徑達(dá)45mm。60。C下未見(jiàn)生長(zhǎng)。實(shí)施例2:嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1菌株產(chǎn)角蛋白酶的方法，包括以下步驟(1)培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基雞毛粉20.10g，尿素0.98g，NaCl5g，K2HP046g，KH2P04lg，水1000m，初始pH為7.9。[OOSO](2)液體發(fā)酵培養(yǎng)將本發(fā)明的菌株接種在含固體PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，38t:培養(yǎng)3天，用直徑7mm的打孔器打空，然后將菌絲塊接種到裝有50mL復(fù)篩液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌絲塊，每組作3個(gè)重復(fù)，放入3『C搖床中，140rpm保溫靜止培養(yǎng)，測(cè)定酶活力。(3)粗酶液的制備孢子液的制備取4t:冰箱保存的菌種，用接種環(huán)挑取少量菌絲，用劃線法將其接種于PDA培養(yǎng)基上，38t:培養(yǎng)。長(zhǎng)好后，用滅菌的0.05%的Tween-80輕輕洗出平板表面的分生孢子，并在無(wú)菌條件下用16層紗布過(guò)濾，所得孢子懸液以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后置于4t:保存?zhèn)溆?。粗酶液的提取取適量的孢子液加入250mL的三角瓶中(內(nèi)裝50mL發(fā)酵液)，于38t:，120rpm搖床上培養(yǎng)。6天后取發(fā)酵液，4000rpm離心5min，然后再用快速定性濾紙過(guò)濾，取濾液既得粗酶液。(4)角蛋白酶活力的測(cè)定在9.5mL0.1M，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中加底物(雞毛粉20mg)和酶液(0.5mL)，于38°C、120rpm的搖床中反應(yīng)2h，冰浴冷卻10min，先用濾紙過(guò)濾，濾液再用真空纖維微孔過(guò)濾器(0.45iim)過(guò)濾，280nm測(cè)光吸收。酶活力定義為pH8.0、38t:條件下，lh水解角蛋白使光吸收值(對(duì)對(duì)照)每增加O.Ol，所對(duì)應(yīng)的酶量為l個(gè)活力單位(U)。測(cè)量3次，取平均值。則酶活力(U/L)=1000X測(cè)定所得的活力單位(即0.5mLX2X2hX(1/2)X(OD值/0.01)X1000)。嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1菌株產(chǎn)角蛋白酶的方法選擇實(shí)驗(yàn)例—、不同補(bǔ)充碳源對(duì)產(chǎn)角蛋白酶的影響在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2%的可溶性淀粉、麥芽糖、甘油、葡萄糖，發(fā)酵第6天時(shí)，測(cè)定酶活力的結(jié)果如表1。由表可知，在所試條件下，分別加入可溶性淀粉、麥芽糖和甘油時(shí)，所得到的酶活均高于用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)所得的酶活，即相對(duì)于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它們對(duì)產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用。其中，可溶性淀粉對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大，使每升溶液的酶活增加了1000個(gè)單位；而加入葡萄糖時(shí)的酶活與不加葡萄糖時(shí)的酶活相同，即在所試條件下葡萄糖對(duì)產(chǎn)酶沒(méi)有影響表1補(bǔ)充C源對(duì)嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1產(chǎn)角蛋白酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、不同補(bǔ)充氮源對(duì)產(chǎn)角蛋白酶的影響在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.1%的硝酸鈉、硝酸氨、氯化鈉、尿素，發(fā)酵第6天時(shí)測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。在所試條件下，分別加入硝酸鈉、硝酸氨和氯化氨時(shí)，所得到的酶活均低于用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)所得的酶活，即相對(duì)于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它們對(duì)產(chǎn)酶均有抑制作用。其中，氯化氨對(duì)產(chǎn)酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活減少了700個(gè)單位，幾乎抑制了產(chǎn)酶；而加入尿素時(shí)使每升溶液的酶活比不加入尿素時(shí)增加了200單位，說(shuō)明尿素對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。表2補(bǔ)充N源對(duì)嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1產(chǎn)角蛋白酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、不同補(bǔ)充S源對(duì)產(chǎn)酶活力的影響在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.5mmol/L的亞硫酸鈉、巰基乙醇、硫代硫酸鈉、二硫蘇糖醇、硫酸鈉。發(fā)酵第6天時(shí)測(cè)定酶活力的結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，在所試條件下，分別加入硫酸鈉、亞硫酸鈉、巰基乙醇和二硫蘇糖醇時(shí)，所得到的酶活均低于用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)所得的酶活，即相對(duì)于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它們對(duì)產(chǎn)酶均有抑制作用。其中，二硫蘇糖醇對(duì)產(chǎn)酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活減少了700個(gè)單位，幾乎抑制了產(chǎn)酶；而加入硫代硫酸鈉時(shí)使每升溶液的酶活增加了600個(gè)單位，即相對(duì)于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它對(duì)產(chǎn)酶有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。表3補(bǔ)充S源對(duì)嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1產(chǎn)角蛋白酶的影響酶活(U/L)補(bǔ)充S源KerationaseActivity(U/DSulfurSource加入補(bǔ)充S源的酶活(U/L)用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的酶活(U/L)(對(duì)昭)"、、/碌K代石克酸鈉1400800碌酸鈉300800亞錄^酸鈉300800巰基乙醇300800二碌u蘇糖醇200800四、不同無(wú)機(jī)離子對(duì)產(chǎn)酶活力的影響在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.01%的MgS047H20、CaCl2、CuS045H20、ZnS047H20和FeS047H20，在發(fā)酵第6天時(shí)測(cè)定酶活力。由表4可知，在所試條件下，分別加入CuS045H20和MgS047H20時(shí)，所得到的酶活均低于用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)所得的酶活，即相對(duì)于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它們對(duì)產(chǎn)酶均有抑制作用。其中，MgS047H20對(duì)產(chǎn)酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活減少了700個(gè)單位，幾乎抑制了產(chǎn)酶；而分別加入CaCl2和ZnS047H20時(shí)，所得到的酶活均高于用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)所得的酶活，即相對(duì)于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它們對(duì)產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用。其中，CaCl2對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大，使每升溶液的酶活增加了900個(gè)單位；而加入FeS047H20時(shí)的酶活與不加FeS047H20時(shí)的酶活相同，即在所試條件下FeS0471120對(duì)產(chǎn)酶沒(méi)有影響。表4無(wú)機(jī)離子對(duì)嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1產(chǎn)角蛋白酶的影響7酶活(U/L)無(wú)機(jī)離子Keratio腦eActivity(U/Uinorganicions加入無(wú)機(jī)離子的酶活(U/L)用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的酶活(U/L)(對(duì)照)氯化釣1700800硫酸鋅1100800錄u酸i失800800硫酸銅500800硫酸4美100800五、培養(yǎng)條件對(duì)嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1產(chǎn)角蛋白酶的影響實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1試驗(yàn)用培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基雞毛粉20.10g，尿素0.98g，NaCl5g，K2HP046g，KH2P04lg，水1000m，初始pH為7.9。1.2液體發(fā)酵培養(yǎng)將研究菌株接種在含固體PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，3『C培養(yǎng)3天，用直徑7mm的打孔器打空，然后將菌絲塊接種到裝有50mL復(fù)篩液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌絲塊，每組作3個(gè)重復(fù)，放入38t:搖床中，140rpm保溫靜止培養(yǎng)，測(cè)定酶活力。1.3粗酶液的制備孢子液的制備取4t:冰箱保存的菌種，用接種環(huán)挑取少量菌絲，用劃線法將其接種于PDA培養(yǎng)基上，38t:培養(yǎng)。長(zhǎng)好后，用滅菌的0.05%的Tween-80輕輕洗出平板表面的分生孢子，并在無(wú)菌條件下用16層紗布過(guò)濾，所得孢子懸液以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后置于4t:保存?zhèn)溆?。粗酶液的提取取適量的孢子液加入250mL的三角瓶中(內(nèi)裝50mL發(fā)酵液)，于38t:，120rpm搖床上培養(yǎng)。6天后取發(fā)酵液，4000rpm離心5min，然后再用快速定性濾紙過(guò)濾，取濾液既得粗酶液。1.4角蛋白酶活力的測(cè)定在9.5mL0.1M，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中加底物(雞毛粉20mg)和酶液(0.5mL)，于38°C、120rpm的搖床中反應(yīng)2h，冰浴冷卻10min，先用濾紙過(guò)濾，濾液再用真空纖維微孔過(guò)濾器(0.45iim)過(guò)濾，280nm測(cè)光吸收。酶活力定義為pH8.0、38t:條件下，lh水解角蛋白使光吸收值(對(duì)對(duì)照)每增加O.Ol，所對(duì)應(yīng)的酶量為l個(gè)活力單位(U)。測(cè)量3次，取平均值。則酶活力(U/L)=1000X測(cè)定所得的活力單位(即0.5mLX2X2hX(1/2)X(OD值/0.01)X1000)。81.5對(duì)產(chǎn)酶重要因子的篩選及結(jié)果優(yōu)化用SAS軟件中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)角蛋白酶重要因素進(jìn)行篩選，在此基礎(chǔ)上用RSA法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，尋找最佳試驗(yàn)點(diǎn)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.lPlackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)角蛋白酶重要因素的篩選結(jié)果在單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選擇可溶性淀粉、尿素、CaCl2、ZnS047H20、Na2S203作為C-源、補(bǔ)充N-源、補(bǔ)充S-源、無(wú)機(jī)離子，并對(duì)以上因素與培養(yǎng)溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速等，使用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，考察它們對(duì)發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響。本試驗(yàn)中Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表5，各個(gè)因素的水平及其效應(yīng)見(jiàn)表6。表5N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其響應(yīng)值Table5TheresultofPlackett-Burmandesign<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表6各因素的名稱、水平及其影響效應(yīng)Table6Name,levelandmaineffectofeachvariabletermfactorLowlevelHighlevelestimateStderrtPr>|t|prominenceX,可溶性淀粉2%2.5%-550528.01160.5864720.5987675X2尿素0.0.125%-450528,0116-3.518830.038952X3CaCl20.01%0.0125%-716.6667528.01160.0977450.9282997X4ZnS(V7H200.01%0.0125%-283.3333528.01161.3684340.2646494X5Na&Q,0.05%0.0625%650528.0116-O.293240.7884566X6PH78.8616.66667528.01164.0075570.027871X7轉(zhuǎn)速120150-250528.0116-2.932360.0608853X8溫度35440528.0116t18設(shè)定t檢驗(yàn)大于t值概率高于95%的因素為顯著影響因素，由表3.5可以看出pH、尿素對(duì)產(chǎn)酶影響顯著。由于在發(fā)酵過(guò)程中雞毛粉起到了非常重要的作用，一方面雞毛粉可作為C、N源，另一方面也是重要的產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，所以在進(jìn)一步的優(yōu)化中選擇對(duì)雞毛粉和對(duì)產(chǎn)酶影響顯著的PH和尿素作為優(yōu)化目標(biāo)，確定其最佳量。2.2RSA法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果本試驗(yàn)中按Box-Behenken設(shè)計(jì)法的設(shè)計(jì)，各因素所取水平見(jiàn)表7，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的表格及結(jié)果如表8。表7三因素水平的取值Table7Levelandcodeof3keyfactorsforBox_Behenkendesign10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表8Box-Behenken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table8TheresultsofBox_Behenkendesign<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>9-10-122001010-1350011-10128001210118001300053001400052001500053002.3試驗(yàn)結(jié)果分析表8結(jié)果經(jīng)過(guò)SAS軟件的分析得出二次回歸方程為Y丄=5266.667-25X^162.5X2_212.5X3_1058.333X^-175X^2-575X^3-1783.333X22-1633.333X32從上面的方程的平方項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)數(shù)可知，此方程的拋物面開(kāi)口向下，有極大值點(diǎn)。經(jīng)計(jì)算該模型的決定系數(shù)R2=0.9940，離回歸標(biāo)準(zhǔn)差0.172723，表明回歸方程擬合程度好。由表9回歸系數(shù)的估計(jì)可知WX3對(duì)酶活力影響的線性關(guān)系不顯著；X/、X/、X/對(duì)酶活力影響的曲面效應(yīng)顯著；^、X3對(duì)產(chǎn)酶活力的交互影響效應(yīng)顯著，XpX2，X2、X3交互影響效應(yīng)不顯著。表9回歸系數(shù)的估計(jì)Table9EstimatevalueofregressioncoefficientEstimateStderrtPr>|tlprominenceX-2561.0669-0.409390.699203x2-162.561.0669-2.661020.044829X3-212.561.0669-3.479790.017663X晶-1058.33389.88805-11.77390.0001**(非常顯著)Xl*X2-17586.36164-2.026360.098567Xl*X3-57586.36164-6.658050.001153*(顯著)12**(非常顯0.0001著)1林(非常顯0.0001_著)由表10回歸方程的各項(xiàng)方差分析可知此模型中各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系高度顯著，其中平方項(xiàng)和交互相的影響顯著，一次項(xiàng)影響不顯著。失擬項(xiàng)很小，說(shuō)明可以用此模型來(lái)解釋預(yù)測(cè)試驗(yàn)。表10回歸方程各項(xiàng)方差分析表TablelOAnalysisofmean叫imredeviationSourc6DFSSMSFPr〉FModel92455483272831591.451890.0001(Linear)35775001925006.4525140.035917(Quadratic)322532337510778251.75790.0001(CrossProduct)31445000481666.716.145250.00527Error5149166.729833.33(Lackoffit)31425004750014.250.066284(PureError)26666.6673333.333Tota1424704000SourceDFSSMSFPr>F分析此模型可知存在最大值點(diǎn)，當(dāng)X:=0.010154，X2=-0.046059，X3=-0.066838時(shí)，即以羽毛粉為20.10g/L、尿素為0.9770g/L、初始PH為7.933和其他無(wú)機(jī)離子(NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L)為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件在所試范圍之時(shí)能夠得到預(yù)期最大的酶活為5277.38U/L。而驗(yàn)證性試驗(yàn)證明在優(yōu)化條件下，角蛋白酶活達(dá)到了4443.55U/L，此結(jié)果是以基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)所得酶活800U/L的5.6倍。綜上所述，嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1菌株產(chǎn)角蛋白酶的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件為以雞毛粉20.10g/L為碳、氮源和誘導(dǎo)物，尿素0.98g/L為補(bǔ)充氮源，NaCl5g/L，13X2*X2-1783.333X2*X30X3*X3—1633.33389.88805-19.839586.36164089.88805-18.1708K2HP046g/L，KH2P04lg/L為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶溫度為38。C初始pH為7.9，連續(xù)培養(yǎng)6天，酶活測(cè)定時(shí)間為培養(yǎng)的第6天。不同金屬離子對(duì)酶活的影響差異顯著。在O.lg/L的濃度和所試條件下，&2+均表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)作用，Zn2+也有增強(qiáng)作用，而Mg"和Cu"表現(xiàn)出明顯的抑制作用。Fe3+對(duì)產(chǎn)酶沒(méi)有影響。權(quán)利要求一種嗜熱毀絲霉菌株GZUIFR-H94.1(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，其特征在于所屬菌株保藏號(hào)為CCTCCNOM209140。2.如權(quán)利要求1所述的嗜熱毀絲霉菌株在產(chǎn)角蛋白酶方面的應(yīng)用。3.—種嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.l菌株產(chǎn)角蛋白酶的方法，是以雞毛粉20.10g/L為碳、氮源和誘導(dǎo)物、尿素0.98g/L為補(bǔ)充氮源、NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶溫度為38t:初始pH為7.9，連續(xù)培養(yǎng)6天。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種嗜熱毀絲霉菌株及其在產(chǎn)角蛋白酶方面的應(yīng)用，嗜熱毀絲霉菌株GZUIFR-H94.1(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，其菌株保藏號(hào)為CCTCCNOM209140。嗜熱毀絲霉GZUIFR-H94.1菌株產(chǎn)角蛋白酶的方法，是以雞毛粉20.10g/L為碳、氮源和誘導(dǎo)物、尿素0.98g/L為補(bǔ)充氮源、NaCl5g/L，K2HPO46g/L，KH2PO41g/L為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶溫度為38℃初始pH為7.9，連續(xù)培養(yǎng)6天。本菌株是一個(gè)生長(zhǎng)快速、嗜熱的菌株，且具有較強(qiáng)的產(chǎn)角蛋白酶能力。文檔編號(hào)C12N1/14GK101717727SQ200910102968公開(kāi)日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年12月23日優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日發(fā)明者張繼偉,杜文,梁宗琦,梁建東,韓燕峰申請(qǐng)人:貴州大學(xué)