專(zhuān)利名稱(chēng)：蟲(chóng)熒光素酶制備方法及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)制備蛋白質(zhì)的方法，特別是涉及蟲(chóng)熒光素酶利用層 析純化脫鹽的方法和保藏方法，及由所述方法制得的蟲(chóng)熒光素酶制劑。
背景技術(shù)：
微生物數(shù)量的快速檢測(cè)在食品、醫(yī)藥和衛(wèi)生領(lǐng)域都有非常廣泛和重要的應(yīng)用。食 品、飲料等的衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)技術(shù)越來(lái)越受到人們的重視。傳統(tǒng)的食品衛(wèi)生達(dá)標(biāo)檢測(cè)方法是 在食品樣品中加入化學(xué)試劑，通過(guò)一系列生化反應(yīng)來(lái)檢測(cè)被測(cè)物中的微生物含量。該方法 檢測(cè)周期長(zhǎng)、效率低、判斷標(biāo)準(zhǔn)模糊，在很多情況下并不適用。蟲(chóng)熒光素酶是一種以ATP、蟲(chóng)熒光素以及氧為底物，催化生物發(fā)光反應(yīng)的酶，這一 特性使其被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)ATP中。ATP生物發(fā)光法的原理是熒光素酶在鎂離子存在的條件下，與還原熒光素和ATP 結(jié)合形成熒光素酶_熒光素_單磷酸腺苷的復(fù)合物，該復(fù)合物與氧結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光ATP+Luciferin+020xyluciferin+AMP+PPi+C02+Light (565nm)實(shí)質(zhì)上，蟲(chóng)熒光素酶促進(jìn)的生物發(fā)光反應(yīng)，使用了 ATP分子內(nèi)的化學(xué)能，激發(fā)了熒 光素氧化脫羧作用，然后產(chǎn)生發(fā)光。在有過(guò)量底物下，發(fā)射的光強(qiáng)度與反應(yīng)系統(tǒng)的酶量成正 比。從其發(fā)光機(jī)制上看蟲(chóng)熒光素酶具有高度的特異性，但是蟲(chóng)熒光素酶又是非常不穩(wěn)定的 酶，化學(xué)修飾穩(wěn)定性差、極易被氧化，價(jià)格又很昂貴，這些缺陷都限制了蟲(chóng)熒光素酶在生物 發(fā)光檢測(cè)方面的應(yīng)用。目前所用的大部分蟲(chóng)熒光素酶純化方法都用親和層析柱對(duì)重組表達(dá)后蟲(chóng)熒光素 酶進(jìn)行分離，然后經(jīng)過(guò)透析對(duì)酶液進(jìn)行脫鹽，但是此方法會(huì)影響酶的活性。Jeffrey等1985 年曾構(gòu)建了含蟲(chóng)熒光素酶基因的重組載體pkwlOl。Matuda等也構(gòu)建了含蟲(chóng)熒光素酶基因 的重組體。并進(jìn)而獲得了能產(chǎn)生蟲(chóng)熒光素酶的重組大腸桿菌菌株。但是，利用了 Jeffrey 構(gòu)建的重組載體PkwlOl生產(chǎn)螢火蟲(chóng)熒光素酶，在細(xì)菌的培養(yǎng)過(guò)程中，要經(jīng)過(guò)45°C .熱誘導(dǎo) 30分鐘的處理，再轉(zhuǎn)到37°C培養(yǎng)才能產(chǎn)酶，影響酶的穩(wěn)定性利用Matuda構(gòu)建的重組體生 產(chǎn)螢火蟲(chóng)熒光素酶，存在提取蟲(chóng)熒光素酶的方法繁瑣、工藝復(fù)雜的缺點(diǎn)。1989年日本專(zhuān)利 (PCT/JP89/00811)的申請(qǐng)者曾從海洋甲殼類(lèi)動(dòng)物中獲得熒光素酶基因，并構(gòu)建了重組體 DNA，但在大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中仍存在同樣的問(wèn)題，1993年金振華等構(gòu)建了具有分泌信號(hào)肽 的蟲(chóng)熒光素酶重組DNA，可以分泌到周質(zhì)空間，但當(dāng)菌體破碎后，蟲(chóng)熒光素酶的純化同樣存 在著分離困難，純度低、得率低，酶活損失嚴(yán)重等問(wèn)題(專(zhuān)利號(hào)93117156)。

發(fā)明內(nèi)容
蟲(chóng)熒光素酶是在ATP檢測(cè)中的關(guān)鍵酶，但其分離困難，純度低而且具有在溶液中 性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解和易失活等特性，使其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用受到限制。針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，包括表達(dá)步驟，所 述表達(dá)步驟之后包括利用Si^phadex G-25層析柱脫鹽的步驟。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述利用S印hadex G_25脫鹽的步驟包括步驟一、將Sephadex G-25浸泡22 26小時(shí)，然后將所述Sephadex G-25裝柱；步驟二、采用平衡緩沖液平衡層析柱；步驟三、上樣到20 30%柱體積；步驟四、采用洗脫緩沖液洗脫層析柱，收集前1/3 2/3柱體積的洗脫液。其中所述表達(dá)步驟包括步驟一、將蟲(chóng)熒光素酶(luciferase或Iuc)基因重組到表達(dá)載體中，并將含有蟲(chóng) 熒光素酶基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞中；步驟二、培養(yǎng)表達(dá)宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為pET_30a(+)質(zhì)粒；所述表達(dá)宿主細(xì)胞為 受體菌株BL21(DE3)；所述培養(yǎng)表達(dá)宿主細(xì)胞的條件是在36 38°C和搖床轉(zhuǎn)速為240 260rpm條件下；所述誘導(dǎo)蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)的條件是加入IPTG到終濃度為1. 0 1. 5mM進(jìn) 行誘導(dǎo)，21 23°C和搖床轉(zhuǎn)速為240 260rpm條件下培養(yǎng)4 6小時(shí)以誘導(dǎo)表達(dá)。所述表達(dá)步驟之后，脫鹽步驟之前可包括利用Ni-NTA親和層析柱純化的步驟步驟一、用LE緩沖液平衡層析柱；步驟二、用清洗緩沖液淋洗除去雜蛋白；步驟三、用洗脫緩沖液將結(jié)合在M-NTA親和層析柱上的蟲(chóng)熒光素酶洗脫下來(lái)。所述表達(dá)步驟之后，所述利用Ni-NTA親和層析柱純化的步驟之前可采用25 35%，優(yōu)選30%的硫酸銨對(duì)蟲(chóng)熒光素酶進(jìn)行初步純化。在所述脫鹽步驟后制得的蟲(chóng)熒光素酶保存在保存緩沖液中，所述保存緩沖液含有 pH7. 0 8. 0 的 10 50mM Tris-Acetate, 25 35% 乙二醇，1 5mMEDTA，0. 5 2mM DTT, 0. 5 2% BSAJP 5 15%甘油。本發(fā)明又進(jìn)一步提供了由上述的制備方法制備得到的蟲(chóng)熒光素酶保存緩沖液，其 特征在于所述緩沖液含有pH7. 0 8. 0的10 50mM Tris-Acetate，25 35%乙二醇， 1 5mM EDTA，0. 5 2mM DTT，0. 5 2% BSA，禾口 5 15%甘油。本發(fā)明再進(jìn)一步提供了由上述的制備方法制備得到的蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)菌株， 所述表達(dá)菌株為BL21(DE3)菌株，所述BL21(DE3)菌株轉(zhuǎn)化有重組蟲(chóng)熒光素酶基因的 pET-30a(+)質(zhì)粒載體。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種蟲(chóng)熒光素酶制劑，其由上述任一項(xiàng)所述的蟲(chóng)熒光素酶 的制備方法而制得。本發(fā)明采用北美熒火蟲(chóng)的蟲(chóng)熒光素酶基因構(gòu)建了能高效表達(dá)的宿主細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn) 了蟲(chóng)熒光素酶的異源高效表達(dá)和高效的提取純化。采用本發(fā)明所用方法產(chǎn)生的顯著的技 術(shù)效果有可進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶的快速表達(dá)、提取純化和長(zhǎng)期保存。進(jìn)一步，實(shí)驗(yàn)證明采用 Sephadex G_25層析柱進(jìn)行快速脫鹽和冷凍干燥，有利于對(duì)酶活性的保持和長(zhǎng)期保存。本發(fā) 明工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，很好的解決了蟲(chóng)熒光素酶的大量生產(chǎn)問(wèn)題，可為ATP檢測(cè)試劑組提 供優(yōu)質(zhì)的酶制劑。


圖1 :Luc基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證結(jié)果電泳圖譜
圖2 :pMD19-T-luc(NdeI和HindIII)雙酶切結(jié)果電泳圖譜圖3 :pET30-luc重組表達(dá)的PCR驗(yàn)證結(jié)果電泳圖譜1 pET30_luc ；2、3 pET30a9(+) ；4 :DL2000marker圖4 :pET30-luc的誘導(dǎo)表達(dá)和純化結(jié)果SDS-PAGE電泳檢測(cè)1 過(guò)鎳柱后1 5 分鐘取樣進(jìn)行電泳；2 :lmmol/ml IPTG 誘導(dǎo) 16h ；3 =Immol/ml IPTG 誘導(dǎo) 6h ；4 0. 5mmol/ml IPTG 誘導(dǎo) 6h ；5 =Immol/ml IPTG 誘導(dǎo) 2h ；6 0. 5mmol/ml IPTG 誘導(dǎo) 2h ；7 未加 IPTG 誘導(dǎo)； 8 蛋白質(zhì)低分子量marker圖5 =Sephadex G-25層析柱脫鹽和透析方法脫鹽制得蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光值比較圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1蟲(chóng)熒光素酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建1、蟲(chóng)熒光素酶基因的克隆克隆Iuc基因時(shí)，以含Iuc基因的質(zhì)粒(pGEM-luc，Promega)，用Taq DNA聚合酶 (Promega，美國(guó))進(jìn)行PCR(多聚酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)條件為94°C lmin，25個(gè)循 環(huán)(94°C，30s ;58°C，45s ;72°C，2. 5min)，然后72°C延伸IOmin。擴(kuò)增出的目的基因被重組 到克隆載體pMD18_T(Takara，日本)中，然后轉(zhuǎn)化DH5a。目的基因序列使用ALFexpress DNA自動(dòng)分析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia，美國(guó))，核酸序列用軟件Jellyfish (versionl. 4) (http://www. biowire. com)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，通過(guò)PCR，擴(kuò)增出蟲(chóng)熒光素酶目的基因。目的基因包括了 Iuciferase基 因完整的閱讀框1650個(gè)堿基(Genebank登錄號(hào)X65316)，編碼550個(gè)氨基酸的蟲(chóng)熒光素酶 蛋白。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，大小約為1650bp，與所需目的基因大小相吻合(如圖1所示)。2、表達(dá)載體的構(gòu)建通過(guò)采用限制性?xún)?nèi)切酶Sac I和Hindi 11 (Takara,日本)分別雙酶切帶有 Iuciferase目的基因的pMD18_T質(zhì)粒(如圖2所示)和空表達(dá)載體pET_30a(+) (Novagen, 美國(guó))，將目的基因通過(guò)T4連接酶(Takara，日本)定向克隆到表達(dá)載體pET_30a(+)中，然 后轉(zhuǎn)化DH5ci。在加入卡那霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，挑取單克隆后利用PCR 和雙酶切的方法篩選鑒定出陽(yáng)性重組子，并提取出重組質(zhì)粒pET30a-luC，將其轉(zhuǎn)入到受體 菌株BL21(DE3)中，得到可過(guò)表達(dá)蟲(chóng)熒光素酶的基因工程菌(BL-Iuc)。用PCR的方法篩選出陽(yáng)性重組子，然后經(jīng)過(guò)測(cè)序證明所連入的片斷在PCR過(guò)程中 沒(méi)有由于PCR的堿基錯(cuò)配發(fā)生突變，與蟲(chóng)熒光素酶基因的閱讀框1650個(gè)堿基完全吻合。然 后雙酶切帶有Iuciferase目的基因的pMD18_T質(zhì)粒，將切下的片斷定向連接到含組氨酸標(biāo) 簽的空表達(dá)載體pET_30a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化DH5 α。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定(如 圖3所示)，所連入的片斷正是Iuciferase基因，然后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)，從而構(gòu)建 出蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)菌株，定名為BL-Luc。并且經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)顯示，重組質(zhì)粒在表達(dá)菌株 中能夠穩(wěn)定存在。實(shí)施例2蟲(chóng)熒光素酶基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)在37°C和250rpm的條件下，將菌種接入含100 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中， 過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1 100的比例接入新鮮的含100yg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C 和250rpm條件下培養(yǎng)；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(0D = 0. 3 0. 4)時(shí)，加入1.5mM IPTG誘導(dǎo)，22°C和250rpm條件下培養(yǎng)5h，收獲菌體，進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶的提取純化。鑒于蟲(chóng)熒光素酶基因在大腸桿菌中屬于異源表達(dá)，易于形成無(wú)活性的包涵體狀 態(tài)，本發(fā)明對(duì)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行探索后，確定采用1.5mM IPTG在22°C 對(duì)BL-LUC菌進(jìn)行誘導(dǎo)5h，獲得的表達(dá)量和活性最高。蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)情況檢測(cè)結(jié)果顯示， 蟲(chóng)熒光素酶基因可以在大腸桿菌中進(jìn)行高效異源表達(dá)，并且折疊正確，以可溶態(tài)存在于大 腸桿菌細(xì)胞中。大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)破壁后，蟲(chóng)熒光素酶釋放到裂解液上清中。蟲(chóng)熒光素酶基因工程菌中的蟲(chóng)熒光素酶基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)上，由T7 操縱子控制，在不加入誘導(dǎo)劑時(shí)，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄。分別將基因工程菌BL-LUC和對(duì)照菌BL21在37°C，250rpm培養(yǎng)，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期 (0D600 = 0. 3 0. 4)，加入1. 5mM的IPTG誘導(dǎo)后，測(cè)定BL-Luc和野生型菌BL21的生長(zhǎng)曲 線(xiàn)(表1)。菌株BL21和BL-LUC在誘導(dǎo)后0 7h處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，到了 7h以后基本處于 穩(wěn)定期。在誘導(dǎo)后的前4h，BL-Luc的生長(zhǎng)與BL21無(wú)顯著性差異。總體來(lái)說(shuō)，蟲(chóng)熒光素酶基 因工程菌與對(duì)照菌株的生長(zhǎng)情況無(wú)顯著差異，這說(shuō)明蟲(chóng)熒光素酶的合成對(duì)于該基因工程菌 的生長(zhǎng)沒(méi)有造成明顯的負(fù)擔(dān)。表IIPTG處理后BL-LUC大腸桿菌和對(duì)照大腸桿菌的生物量(0D_值)
IPTG誘導(dǎo)后 培養(yǎng)時(shí)間(h)00.512457對(duì)照菌BL210.38 士 0.0020.49±0.0020.63 ±0.0151.04 ±0.0381.11 ±0.0011.29 ±0.0021.30 ±0.002工程菌BL-LUC0.36 + 0.0040.46 ±0.0080.59 + 0.0240.98 ±0.0671.11 土 0.0021.36±0.0111.49 ±0.005在本實(shí)施例中將蟲(chóng)熒光素酶基因連入到高效表達(dá)的載體pET30a(+)上，Iuc基因 不再受到其他天然啟動(dòng)子的調(diào)控，而只受到質(zhì)粒上的強(qiáng)啟動(dòng)子T7的調(diào)控，Iuc基因得到了 大量的表達(dá)，并且蟲(chóng)熒光素酶表現(xiàn)出高活性。并且，由于本發(fā)明采用的載體pET30a(+)是低 拷貝質(zhì)粒，可以減輕菌株生長(zhǎng)的負(fù)擔(dān)，因此轉(zhuǎn)基因菌株的生長(zhǎng)與對(duì)照菌在生長(zhǎng)前期沒(méi)有顯 著性差別，并且所表達(dá)的蟲(chóng)熒光素酶以可溶態(tài)存在于胞內(nèi)，經(jīng)菌體收集和細(xì)胞破壁后很容 易得到高濃度的酶蛋白，經(jīng)硫酸銨沉淀后，可以除去大量的雜蛋白，簡(jiǎn)化后面的提純，并提 高酶的產(chǎn)率。同時(shí)，pET30a(+)所表達(dá)的蛋白含有組氨酸標(biāo)簽，可以用Ni親和層析快速進(jìn) 行純化。實(shí)施例3蟲(chóng)熒光素酶基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)在36°C和240rpm的條件下，將菌種接入含100 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中， 過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1 100的比例接入新鮮的含100yg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，36°C 和240rpm條件下培養(yǎng)；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD = 0. 3 0. 4)時(shí)，加入l.OmM IPTG誘導(dǎo)，21°C和 240rpm條件下培養(yǎng)6h，收獲菌體，進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶的提取純化。實(shí)施例4蟲(chóng)熒光素酶基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)在38°C和260rpm的條件下，將菌種接入含100 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中， 過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1 100的比例接入新鮮的含100yg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，38°C 和260rpm條件下培養(yǎng)；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD = 0. 3 0. 4)時(shí)，加入1.3mM IPTG誘導(dǎo)，23°C和260rpm條件下培養(yǎng)4h，收獲菌體，進(jìn)行蟲(chóng)熒光素酶的提取純化。實(shí)施例5蟲(chóng)熒光素酶的提取純化用裂解緩沖液(50mMρΗ7· 8 的 Tris-Acetate，ImM EDTA, 300mM NaCl，0· 5% Triton X-100, lmg/ml溶菌酶)重懸菌體，冰浴超聲破碎，IOOOOrpm離心lOmin，取上清加30%硫酸 銨沉淀，10000rpm，4°C離心lOmin，取上清過(guò)Ni-NTA親和層析柱，用8倍床體積的含IOmM咪 唑的緩沖液洗柱，然后逐漸提高洗脫液中咪唑的濃度至250mM進(jìn)行洗脫，分管收集。測(cè)定每 管中蟲(chóng)熒光素酶的活性，合并有活性各管，采用Si^phadex G-25層析柱脫鹽，合并有活性各 管，冷凍干燥，得蟲(chóng)熒光素酶凍干粉。在蟲(chóng)熒光素酶提取和純化的各步驟中，采用Hitachi F-7000對(duì)蟲(chóng)熒光素酶的活性 進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)活性檢測(cè)試驗(yàn)三個(gè)平行，進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。蟲(chóng)熒光素酶在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)，收集菌體破碎后，含有大量的雜蛋白。本實(shí)施例 采用硫酸銨濃度梯度(10%，20%，30%，40%，60% )進(jìn)行蛋白的初分，發(fā)現(xiàn)采用30%的硫 酸銨濃度可以去除大量的雜蛋白，同時(shí)蟲(chóng)熒光素酶以溶解態(tài)保留在上清中。由于表達(dá)的蟲(chóng) 熒光素酶帶有組氨酸標(biāo)簽，可以特異性結(jié)合在Ni柱上，經(jīng)硫酸銨初分后的上清上Ni-NTA柱 進(jìn)行純化。具體純化步驟如下步驟一、用LE buffer平衡柱；步驟二、將經(jīng)30%硫酸銨初分后的上清上柱；步驟三、用8倍床體積的清洗緩沖液淋洗除去雜蛋白；步驟四、用洗脫緩沖液將結(jié)合在M柱上的蛋白洗脫，分管收集洗脫液；步驟五、對(duì)每管洗脫液進(jìn)行酶活性測(cè)定，合并有活性的各管。純化后的蟲(chóng)熒光素酶利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)的圖譜如圖4所示。經(jīng)M柱純化后的蛋白盡管純度較高，但在洗脫液中含有咪唑等成分，且洗脫液的 緩沖體系不適合酶的儲(chǔ)存和活性的表現(xiàn)，需對(duì)咪唑和鹽進(jìn)行脫除。蟲(chóng)熒光素酶在水溶液中 不穩(wěn)定，不適合采用透析的方法進(jìn)行脫鹽，需采用Si^phadex G-25層析柱進(jìn)行脫鹽，因?yàn)橄?比S^hadex G-25層析柱脫鹽，采用透析方法脫鹽蟲(chóng)熒光素酶的活性會(huì)損失很多，如圖5所 示，檢測(cè)時(shí)發(fā)光值遠(yuǎn)低于利用S印hadex G-25層析柱進(jìn)行脫鹽。利用S印hadex G_25層析 柱進(jìn)行可以在30min到Ih內(nèi)完成整個(gè)脫鹽過(guò)程。具體步驟如下步驟一、用蒸餾水將S印hadex G-25浸泡24h，超聲去氣泡后裝柱；步驟二、用緩沖液(Tris-Acetate pH 7. 8,200mM乙酸銨)平衡柱；步驟三、上樣到20%的柱體積；步驟四、用洗脫緩沖液洗脫，分管收集前1/2柱體積的洗脫液；步驟五、檢測(cè)活性，合并有活性各管，冷凍干燥。經(jīng)脫鹽后基本完成蟲(chóng)熒光素酶的提純工作，采用冷凍干燥的方法進(jìn)行凍干后的蟲(chóng) 熒光素酶制劑于冰箱中可長(zhǎng)期保存。采用S印hadex G-25層析柱進(jìn)行快速脫鹽除去了咪唑 等成分，采用冷凍干燥將酶從過(guò)M柱后的緩沖液中分離出來(lái)，這些有利于對(duì)酶活性的保持 和長(zhǎng)期保存。實(shí)施例6蟲(chóng)熒光素酶的提取純化用裂解緩沖液(50mMρΗ7· 8 的 Tris-Acetate，ImM EDTA, 300mM NaCl，0· 5% Triton X-100, lmg/ml溶菌酶)重懸菌體，冰浴超聲破碎，IOOOOrpm離心lOmin，取上清加25%硫酸銨沉淀，10000rpm，4°C離心lOmin，取上清過(guò)Ni-NTA親和層析柱，用8倍床體積的含IOmM咪 唑的緩沖液洗柱，然后逐漸提高洗脫液中咪唑的濃度至250mM進(jìn)行洗脫，分管收集。測(cè)定每 管中蟲(chóng)熒光素酶的活性，合并有活性各管，采用Si^phadex G-25層析柱脫鹽，合并有活性各 管，冷凍干燥，得蟲(chóng)熒光素酶凍干粉。由于表達(dá)的蟲(chóng)熒光素酶帶有組氨酸標(biāo)簽，可以特異性結(jié)合在Ni柱上，經(jīng)硫酸銨初 分后的上清上Ni-NTA柱進(jìn)行純化。具體純化步驟如下步驟一、用LE buffer平衡柱；步驟二、將經(jīng)25%硫酸銨初分后的上清上柱；步驟三、用8倍床體積的清洗緩沖液淋洗除去雜蛋白；步驟四、用洗脫緩沖液將結(jié)合在M柱上的蛋白洗脫，分管收集洗脫液；步驟五、對(duì)每管洗脫液進(jìn)行酶活性測(cè)定，合并有活性的各管。經(jīng)M柱純化后的蛋白盡管純度較高，但在洗脫液中含有咪唑等成分，且洗脫液的 緩沖體系不適合酶的儲(chǔ)存和活性的表現(xiàn)，需對(duì)咪唑和鹽進(jìn)行脫除。蟲(chóng)熒光素酶在水溶液中 不穩(wěn)定，不適合采用透析的方法進(jìn)行脫鹽。需采用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，可以在30min到Ih內(nèi) 完成整個(gè)脫鹽過(guò)程。具體步驟如下步驟一、用蒸餾水將S印hadex G-25浸泡22h，超聲去氣泡后裝柱；步驟二、用緩沖液(Tris-Acetate pH 7. 8,200mM乙酸銨)平衡柱；步驟三、上樣到25%的柱體積；步驟四、用洗脫緩沖液洗脫，分管收集前1/3柱體積的洗脫液；步驟五、檢測(cè)活性，合并有活性各管，冷凍干燥。經(jīng)脫鹽后基本完成蟲(chóng)熒光素酶的提純工作，采用冷凍干燥的方法進(jìn)行凍干后的蟲(chóng) 熒光素酶制劑于冰箱中可長(zhǎng)期保存。實(shí)施例7蟲(chóng)熒光素酶的提取純化用裂解緩沖液(50mMρΗ7· 8 的 Tris-Acetate，ImM EDTA, 300mM NaCl，O. 5% Triton X-100, lmg/ml溶菌酶)重懸菌體，冰浴超聲破碎，IOOOOrpm離心lOmin，取上清加35%硫酸 銨沉淀，10000rpm，4°C離心lOmin，取上清過(guò)Ni-NTA親和層析柱，用8倍床體積的含IOmM咪 唑的緩沖液洗柱，然后逐漸提高洗脫液中咪唑的濃度至250mM進(jìn)行洗脫，分管收集。測(cè)定每 管中蟲(chóng)熒光素酶的活性，合并有活性各管，采用S印hadex G-25層析柱脫鹽，合并有活性各 管，冷凍干燥，得蟲(chóng)熒光素酶凍干粉。由于表達(dá)的蟲(chóng)熒光素酶帶有組氨酸標(biāo)簽，可以特異性結(jié)合在Ni柱上，經(jīng)硫酸銨初 分后的上清上Ni-NTA柱進(jìn)行純化。具體純化步驟如下步驟一、用LE buffer平衡柱；步驟二、將經(jīng)35%硫酸銨初分后的上清上柱；步驟三、用8倍床體積的清洗緩沖液淋洗除去雜蛋白；步驟四、用洗脫緩沖液將結(jié)合在M柱上的蛋白洗脫，分管收集洗脫液；步驟五、對(duì)每管洗脫液進(jìn)行酶活性測(cè)定，合并有活性的各管。經(jīng)M柱純化后的蛋白盡管純度較高，但在洗脫液中含有咪唑等成分，且洗脫液的 緩沖體系不適合酶的儲(chǔ)存和活性的表現(xiàn)，需對(duì)咪唑和鹽進(jìn)行脫除。蟲(chóng)熒光素酶在水溶液中 不穩(wěn)定，不適合采用透析的方法進(jìn)行脫鹽。需采用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，可以在30min到Ih內(nèi)完成整個(gè)脫鹽過(guò)程。具體步驟如下步驟一、用蒸餾水將S印hadex G_25浸泡26h，超聲去氣泡后裝柱；步驟二、用緩沖液(Tris-Acetate pH 7. 8,200mM乙酸銨)平衡柱；步驟三、上樣到30%的柱體積；步驟四、用洗脫緩沖液洗脫，分管收集前2/3柱體積的洗脫液；步驟五、檢測(cè)活性，合并有活性各管，冷凍干燥。經(jīng)脫鹽后基本完成蟲(chóng)熒光素酶的提純工作，采用冷凍干燥的方法進(jìn)行凍干后的蟲(chóng) 熒光素酶制劑于冰箱中可長(zhǎng)期保存。實(shí)施例9蟲(chóng)熒光素酶的產(chǎn)率和提取過(guò)程中的酶活性變化將蟲(chóng)熒光素酶的凍干后，對(duì)酶的產(chǎn)率進(jìn)行計(jì)算可知，IL的發(fā)酵液凍干后可得40mg 蟲(chóng)熒光素酶蛋白。而在基因工程菌生長(zhǎng)的不同階段和純化的不同階段，用蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè) 試劑(D-熒光素，Mg2+，ATP, Tris, EDTA，pH 7.8)檢測(cè)所制備的蟲(chóng)熒光素酶活性。結(jié)果表 明，1. 5mM IPTG誘導(dǎo)5h后，其發(fā)光強(qiáng)度為798，經(jīng)超聲破碎后全細(xì)胞裂解液中蟲(chóng)熒光素酶的 發(fā)光強(qiáng)度為1890，硫酸銨沉淀后上清的發(fā)光強(qiáng)度為1660，經(jīng)M-NTA柱層析后發(fā)光強(qiáng)度為 3670，用S印hadex G_25脫鹽后，發(fā)光強(qiáng)度為2900。在純化的過(guò)程中酶的純度不斷地在增 加。實(shí)施例10蟲(chóng)熒光素酶制劑的制備將純化脫鹽后制得的蟲(chóng)熒光素酶凍干粉溶于含酶保護(hù)劑的緩沖液中，所述保護(hù) 緩沖液含有(50mM Tris-Acetate (pH7. 8)，ImM EDTA, ImMDTT, 1% BSA，30% 乙二醇，5%甘 油)，即得蟲(chóng)熒光素酶制劑。實(shí)施例11蟲(chóng)熒光素酶制劑的制備將純化脫鹽后制得的蟲(chóng)熒光素酶凍干粉溶于含酶保護(hù)劑的緩沖液中，所述保護(hù)緩 沖液含有(30mM Tris-Acetate (pH7. 0), 2mM EDTA，0. 5mMDTT，0. 5% BSA，25% 乙二醇，15% 甘油)，即得蟲(chóng)熒光素酶制劑。實(shí)施例12蟲(chóng)熒光素酶制劑的制備將純化脫鹽后制得的蟲(chóng)熒光素酶凍干粉溶于含酶保護(hù)劑的緩沖液中，所述保護(hù)緩 沖液含有(10mM Tris-Acetate (pH8. 0), 5mM EDTA, 2mMDTT, 2 % BSA，35 % 乙二醇，10 % 甘 油)，即得蟲(chóng)熒光素酶制劑。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，包括表達(dá)步驟，其特征在于所述表達(dá)步驟之后包括利用Sephadex G 25脫鹽的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，包括表達(dá)步驟，其特征在于所述利 用S印hadex G-25脫鹽的步驟包括步驟一、將S印hadex G-25浸泡22 26小時(shí)，然后將所述S印hadex G-25裝柱；步驟二、采用平衡緩沖液平衡層析柱；步驟三、上樣到20 30%柱體積；步驟四、采用洗脫緩沖液洗脫層析柱，收集前1/3 2/3柱體積的洗脫液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，其特征在于所述表 達(dá)步驟包括步驟一、將蟲(chóng)熒光素酶基因重組到表達(dá)載體中，并將含有蟲(chóng)熒光素酶基因的重組表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞中；步驟二、培養(yǎng)表達(dá)宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，其特征在于所述表達(dá)載體為 pET-30a(+)質(zhì)粒；所述表達(dá)宿主細(xì)胞為受體菌株BL21(DE3)；所述培養(yǎng)表達(dá)宿主細(xì)胞的條 件是在36 38°C和搖床轉(zhuǎn)速為240 260rpm條件下；所述誘導(dǎo)蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)的條件 是加入IPTG到終濃度為1. 0 1. 5mM進(jìn)行誘導(dǎo)，21 23°C和搖床轉(zhuǎn)速為240 260rpm條 件下培養(yǎng)4 6小時(shí)以誘導(dǎo)表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，其特征在于所述表達(dá)步驟之后，脫 鹽步驟之前包括利用Ni-NTA親和層析柱純化的步驟，包括步驟一、用LE緩沖液平衡層析柱；步驟二、用清洗緩沖液淋洗除去雜蛋白；步驟三、用洗脫緩沖液將結(jié)合在M-NTA親和層析柱上的蟲(chóng)熒光素酶洗脫下來(lái)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，其特征在于所述表達(dá)步驟之后，所述 利用M-NTA親和層析柱純化的步驟之前采用25 35 %的硫酸銨對(duì)蟲(chóng)熒光素酶進(jìn)行初步純 化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法，其特征在于在所述脫鹽步驟后 制得的蟲(chóng)熒光素酶保存在保存緩沖液中，所述保存緩沖液含有PH7. 0 8. 0的10 50mM Tris-Acetate，25 35% 乙二醇，1 5mM EDTA，0.5 2mM DTT，0· 5 2 % BSA，和 5 15%甘油。
8.蟲(chóng)熒光素酶的保存緩沖液，所述蟲(chóng)熒光素酶為根據(jù)權(quán)利要求1 7中任意一項(xiàng)所 述的制備方法制備得到的蟲(chóng)熒光素酶，所述保存緩沖液含有PH7. 0 8. 0的10 50mM Tris-Acetate，25 35% 乙二醇，1 5mM EDTA，0.5 2mM DTT，0· 5 2 % BSA，和 5 15%甘油。
9.一種蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)菌株，所述蟲(chóng)熒光素酶為根據(jù)權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)所述的 制備方法制備得到的蟲(chóng)熒光素酶，所述表達(dá)菌株為BL21(DE3)菌株，所述BL21(DE3)菌株轉(zhuǎn) 化有重組蟲(chóng)熒光素酶基因的pET-30a(+)質(zhì)粒載體。
10.一種蟲(chóng)熒光素酶制劑，其由權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的蟲(chóng)熒光素酶的制備方法 而制得。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蟲(chóng)熒光素酶的制備方法。蟲(chóng)熒光素酶是在ATP檢測(cè)中的關(guān)鍵酶，但其分離難、純度低而且還具有在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)使其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用受到限制。本發(fā)明提供了包括蟲(chóng)熒光素酶高效表達(dá)、純化、Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽和長(zhǎng)期保存的制備方法及制劑。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，有利于對(duì)酶活性的保持和長(zhǎng)期保存，很好的解決了蟲(chóng)熒光素酶的大量生產(chǎn)問(wèn)題，可為ATP檢測(cè)試劑組提供優(yōu)質(zhì)的酶制劑。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101993858SQ20091010958
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者葉慧, 曹妮妮, 肖 琳 申請(qǐng)人:深圳市朗石生物儀器有限公司;南京大學(xué)