本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種復(fù)合微生物制劑及其在鉛污染土壤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，土壤重金屬日趨污染，嚴(yán)重威脅著生態(tài)平衡、食品安全和人體健康。其中鉛（pb）、鎘（cd）、汞（hg）、砷（as）、鉻（cr）被認(rèn)為是主要重金屬污染物中的“五毒”。在我國(guó)24個(gè)省份（及城市）開(kāi)展的受污染農(nóng)作物種植地調(diào)查中，80％的土壤污染類(lèi)型為重金屬污染，其中礦冶活動(dòng)是重金屬污染的主要來(lái)源。鉛屬于重金屬的一種，是一種人體的非必需元素，它可影響神經(jīng)、造血、生殖和發(fā)育、內(nèi)分泌、免疫、骨骼等各類(lèi)系統(tǒng)和器官。全世界平均每年排放約500萬(wàn)噸鉛，其中大部分進(jìn)入土壤，致使世界各國(guó)土壤出現(xiàn)不同程度的鉛污染。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展和含鉛化學(xué)物質(zhì)的廣為應(yīng)用，鉛在礦產(chǎn)開(kāi)采、電鍍冶金、廢物處理處置等過(guò)程中，大量含鉛污染物進(jìn)入土壤環(huán)境，造成世界范圍內(nèi)土壤中鉛污染現(xiàn)象普遍存在。鉛對(duì)人類(lèi)健康的危害很大，能對(duì)神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌等個(gè)系統(tǒng)造成危害，甚至危及生命。因此鉛污染土壤的治理及修復(fù)受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前土壤鉛污染修復(fù)主要修復(fù)途徑有三種：物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。物理修復(fù)具有徹底、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)施工程量大、投資費(fèi)用高，破壞土壤結(jié)構(gòu)，并且還要對(duì)換出的污土進(jìn)行堆放或處理?；瘜W(xué)修復(fù)雖然簡(jiǎn)單易行，見(jiàn)效快，但往往修復(fù)劑用量較大，且重金屬元素易活化。生物修復(fù)則包括植物修復(fù)和微生物修復(fù)，其中植物修復(fù)雖然標(biāo)本兼治，但修復(fù)周期長(zhǎng)，投資大。微生物修復(fù)雖然處理費(fèi)用低、對(duì)周邊環(huán)境擾動(dòng)小、不產(chǎn)生二次污染，但合適微生物資源少，修復(fù)效果不明顯。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中生物修復(fù)鉛污染土壤的缺陷，本發(fā)明提供了一種復(fù)合微生物制劑及其在鉛污染土壤中的應(yīng)用。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種復(fù)合微生物制劑，其按照如下步驟制備而得：將短小芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）按照1-2:2-3的體積比混合，然后按照10%的接種量轉(zhuǎn)到發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h，得到短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為：按照質(zhì)量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米漿3%，尿素0.1%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，ph6.5。將短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液、戈登氏菌發(fā)酵液、乙酸鈣不動(dòng)桿菌發(fā)酵液、鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液以及成晶節(jié)桿菌發(fā)酵液按照7-10:5-8:3-4:2-3:2-3的體積比混合均勻，得到液體菌劑；戈登氏菌發(fā)酵液、乙酸鈣不動(dòng)桿菌發(fā)酵液、鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液以及成晶節(jié)桿菌發(fā)酵液的濃度均控制在1×1010cfu/ml；將小麥秸稈用粉碎機(jī)粉碎，然后過(guò)100目篩，得到秸稈粉，將秸稈粉和硅藻土按照2:1的質(zhì)量比混合攪拌均勻得到載體；將液體菌劑添加到兩倍重量的載體中，200rpm攪拌3min，然后進(jìn)行低溫干燥，干燥溫度為15-20℃，干燥后含水量為6-10％，包裝，即得。短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)cgmccno.7126（cn104152377a）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）cgmccno：0954（cn1554744a）、戈登氏菌(gordoniaamicalis)cgmccno.4794（cn102250801a）、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)cgmccno.7334（cn103266073a）、鞘氨醇假單胞菌（sphingomonassp．）cgmccno.4589（cn102168054a）、成晶節(jié)桿菌(arthrobactercrystallopoietes)atcc15481。本發(fā)明所述的菌種均可以從cgmcc和美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（atcc）等商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)得到。本發(fā)明的各菌種發(fā)酵培養(yǎng)為本領(lǐng)域的常規(guī)培養(yǎng)方式，不是本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)，此處不詳述。本發(fā)明取得的有益效果主要包括：本發(fā)明微生物制劑中各菌種之間合理配伍，共生協(xié)調(diào)，互不拮抗，活性高，能夠有效地處理鉛污染土壤；相對(duì)于單一發(fā)酵方式，混合發(fā)酵枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌之間的協(xié)同作用使得菌株中sod以及脫氫酶的活性大大提高，提高了處理重金屬的能力；本發(fā)明采用硅藻土和秸稈粉作為載體，不僅增強(qiáng)菌株的存活時(shí)間及在土壤中的定植能力，對(duì)重金屬也有較強(qiáng)的吸附性，還可以為土壤提供養(yǎng)料；本發(fā)明利用微生物制劑的修復(fù)方法操作簡(jiǎn)單易行，修復(fù)成本低，環(huán)保無(wú)污染，可應(yīng)用于大規(guī)模的鉛污染土壤中，應(yīng)用前景廣闊。具體實(shí)施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本申請(qǐng)中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具體實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本申請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒旧暾?qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1一種復(fù)合微生物制劑，其按照如下步驟制備而得：將短小芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）按照1:2的體積比混合，然后按照10%的接種量轉(zhuǎn)到發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h，得到短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為：按照質(zhì)量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米漿3%，尿素0.1%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，ph6.5。將短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液、戈登氏菌發(fā)酵液、乙酸鈣不動(dòng)桿菌發(fā)酵液、鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液以及成晶節(jié)桿菌發(fā)酵液按照7:5:3:2:2的體積比混合均勻，得到液體菌劑；戈登氏菌發(fā)酵液、乙酸鈣不動(dòng)桿菌發(fā)酵液、鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液以及成晶節(jié)桿菌發(fā)酵液的濃度均控制在1×1010cfu/ml；將小麥秸稈用粉碎機(jī)粉碎，然后過(guò)100目篩，得到秸稈粉，將秸稈粉和硅藻土按照2:1的質(zhì)量比混合攪拌均勻得到載體；將液體菌劑添加到兩倍重量的載體中，200rpm攪拌3min，然后進(jìn)行低溫干燥，干燥溫度為20℃，干燥后含水量為7％，包裝，即得。菌株選自以下：短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)cgmccno.7126（可參見(jiàn)cn104152377a）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）cgmccno：0954（可參見(jiàn)cn1554744a）、戈登氏菌(gordoniaamicalis)cgmccno.4794（可參見(jiàn)cn102250801a）、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)cgmccno.7334（可參見(jiàn)cn103266073a）、鞘氨醇假單胞菌（sphingomonassp．）cgmccno.4589（可參見(jiàn)cn102168054a）、成晶節(jié)桿菌(arthrobactercrystallopoietes)atcc15481。實(shí)施例2一種復(fù)合微生物制劑，其按照如下步驟制備而得：將短小芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）按照2:3的體積比混合，然后按照10%的接種量轉(zhuǎn)到發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h，得到短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為：按照質(zhì)量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米漿3%，尿素0.1%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，ph6.5。將短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液、戈登氏菌發(fā)酵液、乙酸鈣不動(dòng)桿菌發(fā)酵液、鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液以及成晶節(jié)桿菌發(fā)酵液按照10:8:4:3:3的體積比混合均勻，得到液體菌劑；戈登氏菌發(fā)酵液、乙酸鈣不動(dòng)桿菌發(fā)酵液、鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液以及成晶節(jié)桿菌發(fā)酵液的濃度均控制在1×1010cfu/ml；將小麥秸稈用粉碎機(jī)粉碎，然后過(guò)100目篩，得到秸稈粉，將秸稈粉和硅藻土按照2:1的質(zhì)量比混合攪拌均勻得到載體；將液體菌劑添加到兩倍重量的載體中，200rpm攪拌3min，然后進(jìn)行低溫干燥，干燥溫度為15℃，干燥后含水量為9％，包裝，即得。菌株選自以下：短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)cgmccno.7126（cn104152377a）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）cgmccno：0954（cn1554744a）、戈登氏菌(gordoniaamicalis)cgmccno.4794（cn102250801a）、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)cgmccno.7334（cn103266073a）、鞘氨醇假單胞菌（sphingomonassp．）cgmccno.4589（cn102168054a）、成晶節(jié)桿菌(arthrobactercrystallopoietes)atcc15481。實(shí)施例3土壤中鉛金屬的去除試驗(yàn)：樣品選擇：樣品1：含鉛量為400mg/kg；樣品2：含鉛量為200mg/kg；樣品3：含鉛量:100mg/kg；樣品4：含鉛量:50mg/kg。操作流程：將按照上述實(shí)施例制備的微生物制劑0.1kg加入到鉛污染土壤樣品100kg中，攪拌均勻，培養(yǎng)7d，保證含水量為20-30％左右。7d后，將土壤在65℃下烘干，準(zhǔn)確稱取1g，用bcr連續(xù)提取法，提取土壤中可交換態(tài)的鉛。步驟如下：準(zhǔn)確稱取通過(guò)100目篩的風(fēng)干土壤樣品1g，加40ml0.1mol/l的hac，放在恒溫振蕩器中24±1℃下連續(xù)振蕩16h，然后5000rpm下離心15min。取上清液，用icp-aes測(cè)定pb2+含量。具體結(jié)果見(jiàn)表1。表1組別實(shí)施例1組實(shí)施例2組樣品112.7515.91樣品24.136.58樣品30.360.72樣品40.230.49結(jié)論：本發(fā)明微生物制劑適用于處理各種濃度的鉛污染土壤，但是濃度降為100mg/kg以下時(shí)，鉛濃度下降效果并不明顯，可以優(yōu)選在100-400mg/kg濃度時(shí)使用。實(shí)施例4各菌株的配伍協(xié)同除鉛效果：選擇土壤樣本鉛含量為300mg/kg；微生物制劑分別為實(shí)施例1組，對(duì)照組1（不添加短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵液，其他同實(shí)施例1），對(duì)照組2（不添加戈登氏菌發(fā)酵液，其他同實(shí)施例1），對(duì)照組3（不添加鞘氨醇假單胞菌發(fā)酵液，其他同實(shí)施例1），對(duì)照組4（短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌采用分開(kāi)發(fā)酵的方式，其他同實(shí)施例1）；操作流程同實(shí)施例3；具體結(jié)果見(jiàn)表2：表2組別實(shí)施例1組對(duì)照組1對(duì)照組2對(duì)照組3對(duì)照組4鉛濃度（mg/kg）6.0149.827.631.218.7結(jié)論：本發(fā)明復(fù)合微生物制劑中各菌株相互協(xié)同，配伍合理，除鉛能力較好，應(yīng)用前景廣闊。在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁(yè)12