專利名稱：多花黃精微衛(wèi)星標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種多花黃精微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA又稱作短串連重復(fù)(Short Tandem R印eats， STRs)、簡單重復(fù) 序列(Simple Sequence R印eat， SSRs)、簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)。是指基 因組中以1 6個核苷酸為單位串聯(lián)組成的核苷酸序列。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成， 微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型單一型，復(fù)合型(compound)和間斷型 (interrupted)。 例如
單一型AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT
復(fù)合型ATATATCACACACACACACAC
間斷型ATATATCA ATATATCA ATATATA
微衛(wèi)星DNA作為一種分子標(biāo)記具有以下特點廣泛分布于真核生物的基 因組中；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性，多態(tài)性信息容量高 呈共顯性，遵循孟德爾法則遺傳；選擇中性等等。
基于以上特點，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品 種鑒定和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多 樣性及物種進化與親緣關(guān)系等方面的研究。
多花黃精為百合科黃精屬多年生草本植物，是我國特有植物，藥用其根莖。 2005年版《中國藥典》中以黃精，多花黃精和滇黃精的干燥根莖作為黃精藥材 入藥。黃精的使用歷史至今己逾兩千年，是著名的食療補益中藥。其肉質(zhì)根狀 莖具有補氣養(yǎng)陰、健脾潤肺、益腎生津等功效，被視為傳統(tǒng)的中藥材，并譽有 "血氣雙補之土"之稱。另外多花黃精還具有食用和觀賞價值。
近年來，人們對黃精及其黃精屬植物的研究不斷深入?，F(xiàn)代藥理研究證實，其化學(xué)成分主要有黃精多糖、粘液質(zhì)、淀粉、甾體皂苷、蒽醌類化合物、生 物堿、強心苷、木脂素、維生素和多種對人體有用的氨基酸等化合物。目前有 研究表明黃精多糖能增強機體的免疫、延緩衰老、抗菌、抗病毒和降脂、降糖 作用。李循等研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖能活化巨噬細胞、活化淋巴細胞、提高NK細胞
和LAK細胞的活性、促進有絲分裂作用、增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、促進細胞因子分泌、 增強紅細胞免疫等作用而提高宿主免疫功能。而張庭亭通過研究小鼠發(fā)現(xiàn)PSP可 提高7月齡小鼠全血中S0D以及GSH—Px的活性，降低小鼠心、肝、腦組織中LF和 MDA含量；說明黃精多糖在一定程度上有抗衰老作用的。辜紅梅等通過研究發(fā)現(xiàn) 黃精多糖能顯著提高病毒感染的Vero細胞的活力，對細胞有保護作用。黃精甾 體皂苷具有去痰止咳之功效，還具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌等作用。
中藥上的黃精包括黃精，多花黃精，滇黃精。黃精屬植物還有其他的一些 藥用植物，如玉竹，長梗黃精等，但它們與黃精在藥理和藥效上是存在差異的， 有些不能混用。如黃精和玉竹在臨床上就是不能混用的，入藥時需將它們區(qū)分 開來。
黃精的分子標(biāo)記研究起步很晚，目前報道的只是RAPD分子標(biāo)記，ISSR分子 標(biāo)記(周曄，RAPD標(biāo)記法鑒定中藥黃精及長梗黃精的研究；周曄，ISSR法鑒定中 藥黃精和巻葉黃精)，微衛(wèi)星標(biāo)記尚未見報道。但RAPD分子標(biāo)記穩(wěn)定性，重復(fù)性 差，ISSR分子標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純和基因型和雜合基因型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題分離克隆多花黃精的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，建立多 花黃精微衛(wèi)星DNA技術(shù)體系并用這些分子標(biāo)記研究多花黃精遺傳多樣性，黃精屬 植物種間和居群間的變異和進化關(guān)系以及進行多花黃精品種鑒定。
實現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案包括多花黃精微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建;含 微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測序，得到55個含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆;篩選 得到14個多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pcl、 Pc2、 Pc3、 Pc4、 Pc5、 Pc6、 Pc7、 Pc8、Pc9、 PclO、 Pcll、 Pcl2、 Pcl3、 Pcl4; Pcl為480個核苷酸，Pc2為550個核苷酸， Pc3為310個核苷酸，Pc4為338個核苷酸，Pc5為630個核苷酸，Pc6為767個核苷 酸，Pc7為435個核苷酸，Pc8為584個核苷酸，Pc9為399個核苷酸，Pcl0為595個 核苷酸，Pcll為677個核苷酸，Pcl2為512個核苷酸，Pcl3為488個核苷酸，Pcl4 為473個核苷酸。


圖1: Pel位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖2: Pc2位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖3: Pc3位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖4: Pc4位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖5: Pc5位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖6: Pc6位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖7: Pc7位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖8: Pc8位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖9: Pc9位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖10: PclO位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖11: Pcll位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖12: Pcl2位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖13: Pcl3位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
圖14: Pcl4位點的特異性引物擴增23個多花黃精的DNA的銀染PAGE圖。
具體實施方式
h1、多花黃精微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建1.1基因組的提取與酶切-
用Doyle J介紹的CTAB法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation [A]. In Hewitt GM， Johnston A (eds. )， Molecular Techniquesin Taxonomy [M]. Berlin: Springer, 1991， 283-293)提取基因組，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI (購自TaKaRa公司)酶切基因組，酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下300-900 bp大小的DNA片段并用膠回收試劑盒(購自上海生工)純化回收的酶切產(chǎn)物。
1.2加接頭
將純化回收的酶切產(chǎn)物的兩端加入接頭
LA(5， -GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)
LB (5， -P04-GATCCGMGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，
在T4連接酶(購自Promega公司)作用下16。C水浴連接過夜。
1.3 PCR檢測接頭連接
以LA為引物，以1.2工序制的連接產(chǎn)物為模板進行PCR， (50ul反應(yīng)體系如下25 ul TaqGreen (購自Promega公司)，5yl弓l物L(fēng)A， 5ul連接產(chǎn)物，加水H20補至50ul。 PCR反應(yīng)程序如下94"預(yù)變性5分鐘，94。C變性50秒，56。C退火一分鐘，72。C延伸2分鐘，變性至退火三個步驟重復(fù)25次，72。C充分延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(購于Axygen公司)進行純化。
1.4磁珠富集
將1. 3所制的純化產(chǎn)物與雜交探針(CTU在7CTC下雜交一個半小時。將雜交液加入已平衡好的磁珠，室溫放置30分鐘。將離心管依次用6XSSC， 2XSSC，1XSSC于6(TC洗兩次，最后用O. 1XSSC室溫洗一次。加入TE緩沖液，在PCR機上95。C變性15分鐘，收集上清。1. 5 PCR富集
以磁珠富集產(chǎn)物為模板，LA為引物進行PCR擴增，25ul反應(yīng)體系如下TaqGreen 12.5ul， LA 1.5ul，富集后的DNA2. 5ul，加水補至25 ul。PCR反應(yīng)程序如下94"C預(yù)變性3分鐘，94"C變性35秒，6(TC退火35秒，72X:延伸1分鐘，變性至退火三個步驟重復(fù)25次，72'C充分延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進行純化。1.6感受態(tài)細胞的制備
將1 mL過夜培養(yǎng)的f coh' DH5 a培養(yǎng)液接于50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)2小時至對數(shù)生長期(OD,"O. 3-0. 6)時取出。將菌液于4。C離心10分鐘。棄上清，加入lmL 0. 1 mol/L預(yù)冷的Cacl2重新懸浮細胞，用槍頭輕輕打勻。4'C離心10分鐘。棄上清，加入預(yù)冷的甘油/ CaCl2混合物重新懸浮菌體，用槍頭打勻，-S(TC保存。
1.7倒平板
將LB固體培養(yǎng)基完全融化，冷卻至50。C左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培養(yǎng)基(比例為LB固體培養(yǎng)基100mL; Amp青霉素100 ul; 20%異丙基-0-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 7 u 1; 2% 5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-Gal)40p1)，混合均勻后倒入一只培養(yǎng)皿里，待培養(yǎng)基凝固后放入37'C烘箱，晾干水蒸氣。
1.8連接轉(zhuǎn)化
取1. 5工序所制的PCR富集后的純化產(chǎn)物加入pMD19-T載體(購自TaKaRa公司)于16'C水浴連接2小時，制成連接產(chǎn)物。
取出感受態(tài)細胞，冰上復(fù)蘇至液態(tài)，加入上述連接產(chǎn)物，混勻。冰浴30分鐘后放入42。C水浴鍋，熱激90秒，立即放入冰中冰浴2分鐘，加入新鮮的LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)1-1. 5小時。取70 u 1培養(yǎng)液涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG培養(yǎng)基上，37'C倒置培養(yǎng)過夜。
2. 陽性克隆的篩選-
將平板上的白色單菌落分別放入事先裝有LB/Amp培養(yǎng)基的EP管中。37°C振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。15 ulPCR反應(yīng)體系包括Taq酶0.075U (購自TaKaRa公司)，10XBuffer1.5 ul， dNTPO. 2 u M， mg2+1. 5 u M，引物0. 4 uM (LA，primer-c (CT15))，水。反應(yīng)程序94"C預(yù)變性3分鐘，94'C變性50秒，56°C退火35秒，72。C延伸1分鐘，變性至延伸三個步驟重復(fù)30次。最后72'C充分延伸12分鐘，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 陽性克隆測序及引物設(shè)計陽性克隆送生物公司測序，共得到84條含有微衛(wèi)星DNA的序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列，利用軟件primerprimer5設(shè)計引物，如表1所示。
實施例2:
2. 1篩選有多態(tài)性的引物
用1.1的CTAB法提取長梗黃精基因組。用設(shè)計的引物(表l)擴增基因組。反應(yīng)程序94'C預(yù)變性4分鐘，94。C變性45秒，退火30秒(退火溫度見表l) ， 72'C延伸35秒，變性至退火三個步驟重復(fù)35次。最后72。C充分延伸8分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用PAGE電泳進行檢測，共得到14個有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記；Pcl為480個核苷酸，Pc2為550個核苷酸，Pc3為310個核苷酸，Pc4為338個核苷酸，Pc5為630個核苷酸，Pc6為767個核苷酸，Pc7為435個核苷酸，Pc8為584個核苷酸，Pc9為399個核苷酸，Pcl0為595個核苷酸，Pcll為677個核苷酸，Pcl2為512個核苷酸，Pcl3為488個核苷酸，Pcl4為473個核苷酸。
2. 2結(jié)果分析
使用Cervus3. 0軟件計算期望雜合度和觀察雜合度。使用Gen印叩3. 4軟件計算哈代-溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來描述14個多花黃精微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點的特征。由附圖1-14可看出，本發(fā)明的14個微衛(wèi)星序列的長度在供試的23個多花黃精中都出現(xiàn)的多樣性，由此可見，本發(fā)明的這14個微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究多花黃精的遺傳多樣性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進化關(guān)系及多花黃精品種的鑒定，具有重復(fù)性好的特點，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。
位點基序引物序列退火溫
PelG8(GA)32F ACT TCC TCC ATC CTT ACA CCA T R CTC TCC TAT CGG CAG CAA CT55
Pc2(AG) 48F GTC ACA CCT TTC CCT CTA CTT AAC R TCT TGC TCT ACC TCC TTG CTT CT53
Pc3(AG) 10T(AG)40F TGT TCA AGG CAT AAT TCT CC R TTT CCT CTT CCA TTC TCA A48
Pc4(AG) 21G (GA) 22F CTG TTG ATT CAT CTG GTG CTT G R AGG AAA TGG AGA TGA GTG ATG C53
Pc5(AG) 40F CCA ATT GCC TCC TTC ACA TC R GGA CAC CCG AAG AAA TAC AAG55
Pc6(AG)48(AGAC)5F TGA TTA TCT GGT GCC GGA C R CAT GCT ATC TCC CCT CAC TTG55
Pc7(CT) 8CC (CT) 18F CCC AAC ATC TCG TAG TCG CAA
(TA)5R CTC CCT TTC CCA ATC CCG T58
Pc8(TC) 23T (TC) 5F TCT TGG TTG CTA GGG AGG ACA R GCC TTT GAT TAT CTG GTA TCG GAC52
Pc9(CT) 23F GAT TCA ATC AAA GTC CAC CTC G R TTA AGT CTT CAG ACC CGT CM CC54
PclO(GAA)3-(AG)34F CCC TCC CCT TCA TAA TTG CT R AGC AAG AM AGG GCA CTC G55
Pcll(GA) 50F AAA CAA CCA TCA TCC CCA T R TCC TTT TCC TCT TCT TGC TG55
Pcl2(GA) 34F GTA GGC MG GAA CAC CCA CAC R CGC ACC CAG ACC GAG AAA59
Pcl3(AG) 8G (GA) 41F GTT GAT TCA TCT GGT GCT TGT CTC R GCT TAG AGT GGA AGA AAT GGA GTA G59
Pcl4(GA)46F CTG TGT GTT TAT TCT GTA GAG TTG C R TTT GGC AAT GAT TTG AGG G55
15表1中F表示5'端引物，R表示.3'端引物。
序列表
〈110〉安微師范大學(xué)〈120〉多花黃精微衛(wèi)星標(biāo)記〈130> 1〈160> 14
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1〈211〉 480<212〉 腿
<213〉 多花黃精(Polygonatura cyrtonema Hua)<400〉 1
gatcgggcct cccttttctc cacgaacaag aaagagaaaa agagggaggt aaagaaa朋t 60a犯ggagaag gagagaagac aagtctgacc ccttctcaag ttgataaaga aagggggaga 120gaagagagaa ttagagagga gagtagacaa gctacctgat cctctcggcg gagatcaaga 訓(xùn)aggaaagaag gaaatgagag aaatggagag gagataaccc tctcctatcg gcagcaacta 240卿acag卿agg卿aaga g卿g朋agt ggggggggga gag卿gaga g卿gagaga 300g3gagagaga g3gagagag3 ga_ga<gagaga_ g兆3gagaga g朋3tgaatc 3tctctccct 360ctcggctggg gatcaaaaga gagggaatga ttgaggggga geiaagaaaBt tctccccccc 420cctc3ctcaa caatt肪tgc ggcasggsca tgcatggtgt aaggatggag g幼gtg朋ga ■
<210> 2〈211> 550<212> 腿
〈213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)<400〉 2
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<210> 3〈211〉 310<212> DNA
〈213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)〈400〉 3
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〈210〉 4〈211〉 338〈212〉 DNA
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60120180240300360420■540550
60120180240300310<213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua) 〈400〉 4
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gatgagtgatg咖ggtagg卿ggagctctgccttctcttcttgctggt120
gag卿g,g卿g已g卿g卿ggg卿gag卿g卿180
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〈210〉 5
〈211〉 630
〈212〉 DNA
〈213> 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)
〈400〉 5
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卿g已g卿gag卿g卿g3g卿g卿g3g卿g卿Cgttagttct已gtactaxxac240
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agccgctccttctcccctctcctctctcag630
〈210> 6〈211> 767
〈212〉 DNA
〈213> 多花黃精(Polygonatum cyrtone腿Hua)
〈400> 6
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〈210> 7
〈211> 435
〈212〉 DNA
<213> 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)
<400〉 7
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〈210〉 8 <211〉 584 〈212〉 DNA
〈213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua) 〈400〉 8
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〈210〉 9 <211〉 399 〈212〉 DNA
〈213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua) <400> 9
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〈210〉 10 〈211〉 595 <212〉 DNA
<213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua) 〈400〉 10
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〈210〉 11
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〈213〉 多花黃精(Polygonat醒cyrtonema Hua)
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〈213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)
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〈210〉 14 〈211〉 473 <212> DNA
〈213〉 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua) <400> 14
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1、多花黃精微衛(wèi)星標(biāo)記，其特征在于所述微衛(wèi)星標(biāo)記的標(biāo)號分別為Pc1、Pc2、Pc3、Pc4、Pc5、Pc6、Pc7、Pc8、Pc9、Pc10、Pc11、Pc12、Pc13、Pc14；其核苷酸序列分別為Pc1gatcgggcct cccttttctc cacgaacaag aaagagaaaa agagggaggt aaagaaaaat 60aaaggagaag gagagaagac aagtctgacc ccttctcaag ttgataaaga aagggggaga120gaagagagaa ttagagagga gagtagacaa gctacctgat cctctcggcg gagatcaaga180aggaaagaag gaaatgagag aaatggagag gagataaccc tctcctatcg gcagcaacta240agaacagaga aggagaaaga gagagaaagt ggggggggga gagagagaga gagagagaga300gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaaatgaatc atctctccct360ctcggctggg gatcaaaaga gagggaatga ttgaggggga gaaagaaaat tctccccccc420cctcactcaa caattaatgc ggcaaggaca tgcatggtgt aaggatggag gaagtgaaga480Pc2gaccgccctt gataagaaaa tcgtatagcg ataagaagta ctcgcttcct tcttgagggt 60gttgatgata aaggcccaaa gccaatatct ttcaaaaaag cccaagctca agtcttcatt120ttttgctcct tggcttgtga ggatgaaagc ctaaggcttt ggaatgagct cttgctctac180ctccttgctt cttctctttt cttcttgttg ctcttgcttg caaatgagag agagagagag240agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 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2.<image>image see original document page 8</image>
全文摘要
本發(fā)明公開了多花黃精微衛(wèi)星標(biāo)記，包括多花黃精微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建；含微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測序，得到55個含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克??；篩選得到14個多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pc1、Pc2、Pc3、Pc4、Pc5、Pc6、Pc7、Pc8、Pc9、Pc10、Pc11、Pc12、Pc13、Pc14；本發(fā)明14個微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究多花黃精的遺傳多樣性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進化關(guān)系及多花黃精品種的鑒定，具有重復(fù)性好的特點，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK101654707SQ20091014504
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者劉婷婷, 彭艷秋, 朱國萍, 暉 王, 王宗達, 程文娟, 陳露露 申請人:安徽師范大學(xué)