專利名稱：一種粒毛盤菌胞外多糖單一組分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌多糖的制備方法，確切地說是一種粒毛盤菌胞外多糖單一組分的制備方法。
二、 背景技術(shù)-
粒毛盤菌，是廣泛分布于世界的一類腐生性真菌，也是近幾年來發(fā)現(xiàn)的具有重要經(jīng)濟價值的一類真菌。長期以來，世界各國學(xué)者在盤菌系統(tǒng)分類方面作了大量的研究工作，但大多學(xué)者尚未關(guān)注此類真菌純培養(yǎng)物的分離及其培養(yǎng)條件研究。真菌多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，是目前公認的有較高療效的免疫增強劑，研究發(fā)現(xiàn)其還具有明顯的抗衰老、消除人體過剩的自由基，抗腫瘤等藥理功能，在食品加工、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。
2009年，浙江大學(xué)學(xué)報公開了一種禾本科粒毛盤菌多糖的提取方法，并對提取的多糖進行了初步純化，但未實現(xiàn)多糖的分級分離。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在為粒毛盤菌多糖的基礎(chǔ)研究提供一種單一組分的粒毛盤菌多糖，所要解決的技術(shù)問題是對提取的胞外多糖實現(xiàn)分級分離。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括粒毛盤菌的培養(yǎng)、胞外多糖的提取純化以及分級分離，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別是所述的分級分離是對提取純化的胞外多糖用葡聚糖凝膠層析柱進行分離，以雙蒸餾水為洗脫劑，在苯酚一碳酸法跟蹤檢測下依次分管收集洗脫液，于490nm波長處測定吸光度，以吸光度對管編號作圖得到洗脫曲線，如圖1所示，合并曲線中單一高峰部分，經(jīng)真空干燥得到粒毛盤菌多糖的單一組分。
本單一組分多糖可用于粒毛盤菌多糖的結(jié)構(gòu)分析及構(gòu)效關(guān)系的研究。
具體操作過程如下(一)培養(yǎng)基的配制
1、 平板培養(yǎng)基
2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，1.5%瓊脂，水余量，調(diào)pH值6.5后固化為固體
培養(yǎng)基。
2、 搖瓶培養(yǎng)基-
2% 3%葡萄糖，0. 2% 0. 5%蛋白胨，0. 2% 0. 5%酵母膏，0. 05% 0. 1% MgS04, 0. 05% 0. 1% KH2P04，水余量。3、發(fā)酵培養(yǎng)基
3% 4%葡萄糖，0. 2% 0. 5°/。酵母膏，0. 5% 1%玉米淀粉，0. 05% 0. 1% MgS04， 0. 05% 0、 1% KH2P04，水余量。
(二)粒毛盤菌的培養(yǎng)
1、 平板培養(yǎng)
將菌種轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基中，于24 2S 'C培養(yǎng)3 4 d。
2、 搖瓶培養(yǎng)
于250 ml三角瓶中裝入50ml搖瓶培養(yǎng)基，高壓滅菌后，接種平板菌種，于24 28 。C、 180 200 r/min振蕩培養(yǎng)3 4d。
3、 發(fā)酵罐培養(yǎng)
采用5 L自控發(fā)酵罐液態(tài)深層發(fā)酵，培養(yǎng)基采用發(fā)酵培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為0.6 0. 7，接種量為10% 15°/。，培養(yǎng)溫度為24 28 。C ，通氣量為1. 0 1. 5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180 200 r/min，發(fā)酵時間為8 10天。
(三) 胞外多糖的提取及純化
將發(fā)酵液抽濾得濾液，濾液濃縮到原來體積的1/3 1/4,加2 3倍體積95%的乙醇于4。C醇析8 24 h，醇析液4000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用無水乙醇、丙酮洗漆2 3遍，然后用蒸餾水溶解，三氯乙酸法脫蛋白，流水、蒸餾水透析，真空干燥得多糖粉末。
(四) 多糖的分級分離及純度鑒定
取10 20mg多糖粉末溶于雙蒸水中，上Sephadex G-100 (1.6 cmX60 cm)進行層析，洗脫劑為雙蒸水，洗脫體積為70ml,流速為0.2ml/min，每管收集2 3ml，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，于490腦波長處測吸收度，以吸光度對管號作圖，得洗脫曲線，如圖1所示，合并單一高峰部分。
純度鑒定儀器為waters-2414型HPLC主機，配置waters-1515型視差遮光監(jiān)測器；分析柱為UltrahydrogelTM2000和UltrahydrogelTM250 ( 7. 8mmX 30cm)串聯(lián)住，以雙蒸水為流動相，流速為0.6-1. OmL/min，柱溫為35°C，根據(jù)峰形判斷純度。結(jié)果如圖2所示。真空干燥得到粒毛盤菌多糖單一組分。外觀為白色粉末。
四

1、 圖1是葡聚糖凝膠層析柱雙蒸餾水洗脫曲線圖，曲線中有兩個單一峰，自左至右依次命為LEPS — 1、 LEPS — 2。
2、 圖2是LEPS — 1HPGPC色譜圖。
五具體實施方式
現(xiàn)以禾本科粒毛盤菌為例，非限定實施例敘述如下。1、 平板培養(yǎng)
取菌種轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基中，于25 'C培養(yǎng)3 4 d，平板培養(yǎng)基為2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，1.5%瓊脂，PH值6.5。
2、 搖瓶培養(yǎng)
于250 ml三角瓶中裝入50 ml搖瓶培養(yǎng)基，高壓滅菌后，用打孔器接種9mra菌塊，25 °C、 200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d得種子液，搖瓶培養(yǎng)基為2%葡萄糖，0.5°/。蛋白胨，0. 5%酵母膏，0. 1% MgS04， 0. 1% KH2P04。
3、 發(fā)酵罐培養(yǎng)
采用5 L自控發(fā)酵罐液態(tài)深層發(fā)酵，培養(yǎng)基采用發(fā)酵培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為0. 7，接種量為10%,培養(yǎng)溫度為(25±1) °C，通氣量為1. 5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵時間為8天，發(fā)酵培養(yǎng)基為3%葡萄糖，0. 5%酵母膏，0. 5%玉米淀粉，0. l%MgS04, 0. 1%KH2P04。
4、 多糖的提取及純化
將發(fā)酵液抽濾得濾液，濾液濃縮到原來體積的1/3 1/4，加三倍體積95%的乙醇于4。C醇析12h，醇析液4000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌，然后用蒸餾水溶解，三氯乙酸法脫蛋白多糖溶液中加入等體積5%三氯乙酸，攪拌10min， 4"C放置4h，調(diào)pH值至中性，濃縮至原體積，離心，取上清液重復(fù)以上操作2次。流水透析24 h，蒸餾水透析12 h，真空千燥得多糖粉末。
5、 多糖的分級分離及純度鑒定
取15mg多糖粉末溶于雙蒸水中，上S印hadex G-100 (1.6 cmX60 cm)進行層析，洗脫劑為雙蒸水，洗脫體積為70ml，流速為0.2 ml/min，每管收集2ml，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，于490 nm波長處測吸收度，以吸光度對管號作圖，得洗脫曲線如圖1，由圖中可知洗脫曲線出現(xiàn)兩個單一峰，按其先后順序命為LEPS-1、 LEPS-2，合并LEPS-1單一高峰部分。純度鑒定儀器為waters-2414型HPLC主機，配置waters-1515 型視差遮光監(jiān)測器；分析柱為 UltrahydrogelTM2000 和UltrahydrogelTM250 (7. 8mmX30cm)串聯(lián)住，以雙蒸水為流動相，流速為0. 6mL/min,柱溫為35°C，由圖2可知HPGPC譜中出現(xiàn)的單一對稱峰的多糖組分是單一組分。真空干燥得到粒毛盤菌多糖單一組分LEPS-1。
研究表明，本培養(yǎng)、提取分離方法，同樣適用于其他粒毛盤菌，如萼狀粒毛盤菌、潔白粒毛盤菌等。
權(quán)利要求
1、一種粒毛盤菌胞外多糖單一組分制備方法，包括粒毛盤菌的培養(yǎng)、胞外多糖的提取純化以及分級分離，其特征在于所述的分級分離是對提取純化的胞外多糖用葡聚糖凝膠層析柱進行分離，以雙蒸餾水為洗脫劑，苯酚一硫酸法跟蹤檢測下依序分管收集洗脫液，于490nm處測定吸光度，吸光度為縱座標，管編號為橫座標作圖得到洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線合并單一高峰部分，真空干燥得到粒毛盤菌多糖單一組分。
全文摘要
一種粒毛盤菌多糖單一組分的制備方法，包括粒毛盤菌的培養(yǎng)、胞外多糖的提取純化以及分級分離，其特征是用葡聚糖凝膠層析柱對提取純化的胞外多糖進行分級分離，以雙蒸餾水為洗脫劑，依序分管收集洗脫液，于490nm處測定吸光度，以吸光度對管編號作圖得到洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線，合并曲線中單一高峰部分，真空干燥得到粒毛盤菌胞外多糖單一組分。本單一組分多糖可用于毛盤菌多糖的結(jié)構(gòu)分析及構(gòu)效關(guān)系的研究。
文檔編號C12P19/00GK101649338SQ20091014492
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者明 葉, 偉 彭 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)