專(zhuān)利名稱(chēng)：：長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記。
背景技術(shù)：
：微衛(wèi)星DNA又稱(chēng)作短串連重復(fù)(ShortTandemRepeats,STRs)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SimpleSequenceR印eat，SSRs)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)。是指基因組中以16個(gè)核苷酸為單位串聯(lián)組成的核苷酸序列。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星麗A序列被分為3種類(lèi)型單一型，復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如單一型ATATATATATATATATATATATAT復(fù)合型ATATATCACACACACACACAC間斷型ATATATCAATATATCAATATATA微衛(wèi)星麗A作為一種分子標(biāo)記具有以下特點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性，多態(tài)性信息容量高呈共顯性，遵循孟德?tīng)柗▌t遺傳；選擇中性等等?；谝陨咸攸c(diǎn)，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多樣性及物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等方面的研究。黃精為百合科黃精屬多年生草本植物，是我國(guó)特有植物，為藥用黃精原植物中的一種。藥用黃精的肉質(zhì)根狀莖具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺、益腎生津等功效，被視為傳統(tǒng)的中藥材，并譽(yù)有"血?dú)怆p補(bǔ)之土"之稱(chēng)。另外長(zhǎng)梗黃精還具有食用，保健和觀賞價(jià)值。近年來(lái)，人們對(duì)黃精及其黃精屬植物的研究不斷深入，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，其化學(xué)成分主要有黃精多糖、粘液質(zhì)、淀粉、甾體皂苷、蒽醌類(lèi)化合物、生物堿、強(qiáng)心苷、木脂素、維生素和多種對(duì)人體有用的氨基酸等化合物。目前有研究表明黃精多糖能增強(qiáng)機(jī)體的免疫、延緩衰老、抗菌、抗病毒和降脂、降糖作用。李循等研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖能活化巨噬細(xì)胞、活化淋巴細(xì)胞、提高NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞的活性、促進(jìn)有絲分裂作用、增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌、增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫等作用而提高宿主免疫功能。黃精甾體皂苷具有去痰止咳之功效，還具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌等作用。黃精屬藥用植物包括長(zhǎng)梗黃精、黃精、湖北黃精、安徽黃精、多花黃精、玉竹等。研究發(fā)現(xiàn)它們的性狀和藥用功效存在一定差異，有些不能混用，如黃精和玉竹在臨床上就是不能混用的。黃精種屬的分子標(biāo)記研究起步很晚，目前報(bào)道的只是RAPD分子標(biāo)記，ISSR分子標(biāo)記，但RAPD分子標(biāo)記穩(wěn)定性，重復(fù)性差，ISSR分子標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純和基因型和雜合基因型，相比而言微衛(wèi)星標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，具有更豐富的多態(tài)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果且穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。但長(zhǎng)梗黃精的微衛(wèi)星標(biāo)記尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題分離克隆長(zhǎng)梗黃精的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，建立長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星DNA技術(shù)體系并用這些分子標(biāo)記研究長(zhǎng)梗黃精遺傳多樣性，黃精屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系以及進(jìn)行長(zhǎng)梗黃精品種鑒定。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案包括長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星(CTh富集文庫(kù)的構(gòu)建；含微衛(wèi)星序列陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，得到84個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克??；篩選得到ll個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Ptl、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、PtlO、Ptll;Ptl為250個(gè)核苷酸，Pt2為370個(gè)核苷酸，Pt3為277個(gè)核苷酸，Pt4為905個(gè)核苷酸，Pt5為729個(gè)核苷酸，Pt6為343個(gè)核苷酸，Pt7為247個(gè)核苷酸，Pt8為403個(gè)核苷酸，Pt9為297個(gè)核苷酸，Ptl0為298個(gè)核苷酸，Ptll為319個(gè)核苷酸。圖1:Ptl位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖2:Pt2位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖3:Pt3位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖4:Pt4位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖5:Pt5位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖6:Pt6位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖7:Pt7位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖8:Pt8位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖9:Pt9位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖10:PtlO位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。圖11:Ptll位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增21個(gè)長(zhǎng)梗黃精的DNA的銀染PAGE圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:1、長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星DNA富集文庫(kù)的構(gòu)建1.1基因組的提取與酶切用DoyleJ介紹的CTAB法(DoyleJ.DNAprotocolsforplants-CTABtotalDNAisolation[A].InHewittGM，JohnstonA(eds.)，MolecularTechniquesinTaxonomy[M].Berlin:Springer,1991,283-293)提取基因組，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(購(gòu)自TaKaRa公司)酶切基因組，酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下300-900bp大小的DNA片段并用膠回收試劑盒(購(gòu)自上海生工)純化回收的酶切產(chǎn)物。1.2加接頭將純化回收的酶切產(chǎn)物的兩端加入接頭LA(5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)LB(5，-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，在T4連接酶(購(gòu)自Promega公司)作用下16'C水浴連接過(guò)夜。1.3PCR檢測(cè)接頭連接以LA為引物，以1.2工序制的連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，(50Pl反應(yīng)體系如下25ulTaqGreen(購(gòu)自Promega公司)，5ul弓l物L(fēng)A，5ul連接產(chǎn)物，加水H20補(bǔ)至50ul。PCR反應(yīng)程序如下:94r預(yù)變性5分鐘，94'C變性50秒，56。C退火一分鐘，72。C延伸2分鐘，變性至退火三個(gè)步驟重復(fù)25次，72。C充分延伸IO分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(購(gòu)于Axygen公司)進(jìn)行純化。1.4磁珠富集將1.3所制的純化產(chǎn)物與雜交探針(CTk在7(TC下雜交一個(gè)半小時(shí)。將雜交液加入已平衡好的磁珠，室溫放置30分鐘。將離心管依次用6XSSC，2XSSC，1XSSC于60。C洗兩次，最后用0.1XSSC室溫洗一次。加入TE緩沖液，在PCR機(jī)上95。C變性15分鐘，收集上清。1.5PCR富集以磁珠富集產(chǎn)物為模板，LA為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25ul反應(yīng)體系如下TaqGreen12.5ul，LA1.5ul，富集后的DNA2.5yl，加水補(bǔ)至25yl。PCR反應(yīng)程序如下94。C預(yù)變性3分鐘，94。C變性35秒，60。C退火35秒，72"C延伸1分鐘，變性至退火三個(gè)步驟重復(fù)25次，72'C充分延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化。1.6感受態(tài)細(xì)胞的制備將1mL過(guò)夜培養(yǎng)的￡co力'DH5a培養(yǎng)液接于50mL液體LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD,"O.3-0.6)時(shí)取出。將菌液于4。C離心10分鐘。棄上清，加入lmLO.1mol/L預(yù)冷的Cacl2重新懸浮細(xì)胞，用槍頭輕輕打勻。4"C離心10分鐘。棄上清，加入預(yù)冷的甘油/CaCl2混合物重新懸浮菌體，用槍頭打勻，-8(TC保存。1.7倒平板將LB固體培養(yǎng)基完全融化，冷卻至50。C左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培養(yǎng)基(比例為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基100mL;Amp青霉素100ul;20%異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)7P1;2%5-溴_4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷(X-Gal)40ul)，混合均勻后倒入一只培養(yǎng)皿里，待培養(yǎng)基凝固后放入37'C烘箱，晾干水蒸氣。1.8連接轉(zhuǎn)化取1.5工序所制的PCR富集后的純化產(chǎn)物加入pMD19-T載體(購(gòu)自TaKaRa公司)于16'C水浴連接2小時(shí)，制成連接產(chǎn)物。取出感受態(tài)細(xì)胞，冰上復(fù)蘇至液態(tài)，加入上述連接產(chǎn)物，混勻。冰浴30分鐘后放入42。C水浴鍋，熱激90秒，立即放入冰中冰浴2分鐘，加入新鮮的LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)1-1.5小時(shí)。取70n1培養(yǎng)液涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG培養(yǎng)基上，37'C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。2.陽(yáng)性克隆的篩選將平板上的白色單菌落分別放入事先裝有LB/Amp培養(yǎng)基的EP管中。37°C振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。15y1PCR反應(yīng)體系包括Taq酶0.075U(購(gòu)自TaKaRa公司)，lOXBufferl.5u1，dNTPO.2線mg2+1.5uM，引物O.4(LA，primer-c(CT15))，水。反應(yīng)程序94。C預(yù)變性3分鐘，94'C變性50秒，56°C退火35秒，72。C延伸l分鐘，變性至延伸三個(gè)步驟重復(fù)30次。最后72"C充分延伸12分鐘，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3.陽(yáng)性克隆測(cè)序及引物設(shè)計(jì)陽(yáng)性克隆送生物公司測(cè)序，共得到84條含有微衛(wèi)星DNA的序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列，利用軟件primerprimer5設(shè)計(jì)引物，如表1所示。實(shí)施例2:2.1篩選有多態(tài)性的引物用1.1的CTAB法提取長(zhǎng)梗黃精基因組。用設(shè)計(jì)的引物(表l)擴(kuò)增基因組。反應(yīng)程序94'C預(yù)變性4分鐘，94'C變性45秒，退火30秒(退火溫度見(jiàn)表l)，72。C延伸35秒，變性至退火三個(gè)步驟重復(fù)35次。最后72。C充分延伸8分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)，共得到ll個(gè)有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記；Ptl為250個(gè)核苷酸，Pt2為370個(gè)核苷酸，Pt3為277個(gè)核苷酸，Pt4為905個(gè)核苷酸，Pt5為729個(gè)核苷酸，Pt6為343個(gè)核苷酸，Pt7為247個(gè)核苷酸，Pt8為403個(gè)核苷酸，Pt9為297個(gè)核苷酸，Ptl0為298個(gè)核苷酸，Ptll為319個(gè)核苷酸。2.2結(jié)果分析-使用Cervus3.0軟件計(jì)算期望雜合度和觀察雜合度。使用Gen印叩3.4軟件計(jì)算哈代-溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來(lái)描述11個(gè)長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點(diǎn)的特征。由附圖1-11可看出，本發(fā)明的11個(gè)微衛(wèi)星序列的長(zhǎng)度在供試的長(zhǎng)梗黃精中都出現(xiàn)了多樣性，由此可見(jiàn)，本發(fā)明的這ll個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究長(zhǎng)梗黃精的遺傳多樣性、黃精屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，具有重復(fù)性好，是一種可靠有效地分子標(biāo)記。表l:引物特性表_位點(diǎn)基序引物序列退火溫度("c)Ptl(CT)16GT(CT)4F:GTAAGTGTAGATGGGAGT57R:AAATATTAACCGCTACTA<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表1中F表示5'端引物，R表示.3，端引物。序列表〈110〉安徽師范大學(xué)<120〉長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星標(biāo)記〈130>1〈160〉11<170>Patentlnversion3.3〈210〉1<211>250〈212〉腿〈213〉長(zhǎng)梗黃精(Polygonat咖filipesMerr)<400>1ccctaaatctcccaatcctccttcaattggtcgtcctagtggagcatcgcggacaacgcc60gaggagtccaccgctacctccaggtccttcccccgttactccgcccccctcccctctctc120tctctctctctctctctctctctctgtctctctctcctcctgtcatcgtcccgctgttct180ctctcccccgtcagtcatcggtgacgtcgccctgtcctccttagcagctcaacaaccacc240tccgccctct250〈210〉2<211〉370〈212〉DNA<213〉長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)14<400〉2ctcccttaaccg肪stgtatgtgtcccataccacatttagatcagttsagttcaagttac60aatggaactaagaaataagagacgggacgtagttcgagaagtgtagatggagagagagag1203g3gaga_g3gag3ga_g3g3g3g3g2igsag3g3g3g3g3gag朋c肪ctgtgaasttccctg180agaggtacctatagttacatcaggcgaagaccagggaccgaagccaccattccttccctt240gtggggatttcaaagcatggggagagagaaaagaaggccaaagaaacaactgttgttacc300tgagaggtactgttgagcacgttaggtctatgacceiggtgtcaagactgtcctgatcgca360gtaggactat370<210〉3<211〉277<212〉DNA<213〉長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)〈400〉3cggggg卿tgccatgaaagagatggagag卿aaatgaagag卿aagagaaagagatg60at卿gaggcaatggagggatgg卿g卿gaagggggag卿agg卿g卿gataatt120ag卿g卿a卿ggatgagagac朋agggagttat卿gag卿g卿gag卿ga朋c18015accgacgaggggggcggctgccagtggttaUggctatggctaagcacggccccaagtgg240gg鄰gcggccacctatgggag卿ggggaagtgggga277<210>4〈211〉905<212〉腿<213〉長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)〈400〉4gtgaggttacgacggcagtgattcgagctcggtacccggggatcctctag卿ttggcca60gagaccccaagcttcggatccaaatctaactagct犯gigtaagctaeictEiatacaactga120tgaacaaagaaatcgatttcattttcttttcttttctttccttttacattgctctgtctc180acaaactcactctctctctctctctctctttctctctctctctctctgaaccaagcgcag240cagcacccctagctcttctgaccccaaggaacccaccaacttccctgttccccctcgtgg300aacactacaatctcccctaccagaacaaccactccacccccaactcctcctccaccactg360cagctcgaccgtaccacccccatcaccactgccttcaagacctcaccctcgcctacgctt420ccccatcaaccacttgatccgaagcttggggtctctggccaatcgtcgacctgcaggcat480gcaagcttggcgt肪tcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaBgtgtaeiEigcctggggtgcctaatgagtgagct3actc3C3tt3attgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcggga33cctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtatttgggcgcUcttccgcttcct.cgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagcctcactcaaaggcggg犯ttcggttatccacag朋tcagggat朋cgcaga朋aaacatgtgagcaaaaggceigtaaaggtcaggaaccgtaa卿gccgcgttgttggcgtttUct〈210〉5〈211〉729〈212>畫(huà)〈213〉長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)〈400〉5cggagtttacgacagcagtg助ttcgagctcggtacccggggatcctctag卿ttggcc卿gaccccaagcttcggatcagagggcgggggtggttgttgagctgctaaggagg織gggcgacgtcaccgatgactgacggggg卿g卿acagcgggacgatgacaggaggagag180ag卿gagag卿gag卿g卿gag卿g卿ggcggggggcggattaacgggggaagg240acctggaggtagcggtggactcctcgtccttgtccgcgatgctccactaggacgccctct300tgaagg鄉(xiāng)aatcgaatcttgtggtctctggctctttcgtcgacctgtaggcatgcaagc360ttggagtaacttgggtctaactgtatcctgtgtgttcttgttatcctctcgctattcctt420acaacattctagccgcaataacaaattgtaaagcttgaggtgtcttttgatgatxttaac480tcccatttacttgcgtagcactcatgactgttttcctggcggcaacctgattgccttctg540Uttatgtatctgccacgtgcggctgaaaggggatttttattttttttcttctttgtttc600tttttcattaatcttgcgcttgttcttcagctactacatattattctatctatttttttc660ttatttctttttttttttattctttgttttttttctatattatattttatgtctcttact720gtxattatc729〈210〉6〈211〉343〈212>腿<213>長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)〈400>6cggaaaacaatgtagcagagtctcacctactgagttgtcgacatgggttgttccttattg60ataggctcatatacataactatcgtatggaagcctccctgtcgatatgtaagagagactc120aaattcgagggcttgttttaggacccaattttaatggttataaaaggatgttttgtaatc180ttagUagtatgcattttttt卿gcaatcaattag卿gagag卿gagag卿gagag240卿gag卿g卿g卿gag,g卿gagag卿g卿g卿ttatggcctttgtaagg300attgtg卿gactaggttgtcttggtgtgagcaaagtaagtga343〈210〉7<211>247<212>DNA〈213>長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)<400>7caccagacgttttccctttctcttcttcttttgtcgccagacctccttgtcgccagaaca60ccccgagtctccgcgtcgccagacattagctctctctctctctctctctctctctctctc120tctctctctctctctccttttcttctgccgtcgctagacgaggaaaactgagcctctaag180gcttggttatttcttttgtgtagaagctgttgagctgggcttttaatattctagttgggc240tcttatt247〈210〉8〈211〉403〈212〉腿〈213>長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)<400>8cgagactcaggg卿tataatggtgctcgagcgtagcacgtggc卿gtgttgccgggca60gtacggaggttagtgtggaggggttggtaaccgtcgaggttgatggatcattgtcgatgt120tgtttctgaggagcttgagccacgggtgagctagcagcggtcgaagccatcaacaggggg180tcgtggggctggctgctcgtgacttttcaaagaaagaagctttgatcgttagtggaggca240gagggtgctcg3gctggggttgcsggg卿g卿g卿gag卿g卿gsgag卿g卿300g卿g卿gag卿gag卿g卿g卿gag卿gcaacagctaggattgagcatgg卿360caggctagggttagggttaggttttgaataaattgagagagaa40320〈210〉9〈211〉297〈212〉DNA<213>長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)<400〉9ccaggcaccELccctggggcttcgacgacagtcgatggtcgatgatgatgagaccataggcgactcatcttcagtcgttgatgatcgagag卿g聊gagag卿g卿gag卿g卿g卿g卿gagag卿g卿g卿gag卿gag卿g卿g卿tccattgtcggtgacatcgtagtcgtcgeiggaatgaggctggaagagagatttattcgatgtcatcgtcattgtcaBggatcgaggctggacgagagaggtcaattcaatgtcgatgtcgtcatcatcattgag〈210〉10〈211〉298<212〉DNA〈213〉長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)〈400>10cttgaggtcgttgccgctgccgccUgcggagggtccggaggc卿ccgggaggaggatgccgtggcggcattggggtcgacggtgagcaggggtttgatctgag卿gaggcatagggggaatttg卿g卿g卿gag卿gag卿g卿gag卿getg卿gagag卿g卿ga21gagagagagsgagagaacaagagctcataaatgagcaaataatgggttatataccctagg240tcaatctttggagtaatctaggccgtccataccaattcccaacgaatccteigccttag298〈210〉11<211〉319<212〉DNA〈213〉長(zhǎng)梗黃精(PolygonatumfilipesMerr)〈400〉11aaggggctgctgctagggtatggcgacata卿gggtttggcgatgctgag卿g聊ga60g卿gagagagag卿g卿gag卿g卿g卿g卿gaagtatctggcgtcggtgact120cgaaggtcgagtcaggcaacggggagtatggcgacaagcggggggttxaaatgggtgtct180ggcaatccagtgacaggcgagtagctaggtcaggc幼cgagattcgagtgggtacggcga240tgcaagggttgagcUggaggcggggtctggcgacgctgatccttgggtccggcgacgat300ggatatgatgUgtttggc319權(quán)利要求1、長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星標(biāo)記，其特征在于所述的微衛(wèi)星標(biāo)記編號(hào)為Pt1、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、Pt10、Pt11，其核苷酸序列為Pt1ccctaaatctcccaatcctccttcaattggtcgtcctagtggagcatcgcggacaacgcc60gaggagtccaccgctacctccaggtccttcccccgttactccgcccccctcccctctctc120tctctctctctctctctctctctctgtctctctctcctcctgtcatcgtcccgctgttct180ctctcccccgtcagtcatcggtgacgtcgccctgtcctccttagcagctcaacaaccacc240tccgccctct250Pt2ctcccttaaccgaaatgtatgtgtcccataccacatttagatcagttaagttcaagttac60aatggaactaagaaataagagacgggacgtagttcgagaagtgtagatggagagagagag120agagagagagagagagagagagagagagagagagagagagaacaactgtgaaattccctg180agaggtacctatagttacatcaggcgaagaccagggaccgaagccaccattccttccctt240gtggggatttcaaagcatggggagagagaaaagaaggccaaagaaacaactgttgttacc300tgagaggtactgttgagcacgttaggtctatgaccaggtgtcaagactgtcctgatcgca360gtaggactat370Pt3cgggggagatgccatgaaagagatggagagagaaaatgaagagagaaagagaaagagatg60atagagaggcaatggagggatggagagagagaagggggagagaaggagagagagataatt120agagagagaaagaggatgagagacaaagggagttatagagagagagagagagagagaaac180accgacgaggggggcggctgccagtggttattggctatggctaagcacggccccaagtgg240ggaggcggccacctatgggagagaggggaagtgggga277Pt4gtgaggttacgacggcagtgattcgagctcggtacccggggatcctctagagattggcca60gagaccccaagcttcggatccaaatctaactagctaaagtaagctaactaatacaactga120tgaacaaagaaatcgatttcattttcttttcttttctttccttttacattgctctgtctc180acaaactcactctctctctctctctctctttctctctctctctctctgaaccaagcgcag240cagcacccctagctcttctgaccccaaggaacccaccaacttccctgttccccctcgtgg300aacactacaatctcccctaccagaacaaccactccacccccaactcctcctccaccactg360cagctcgaccgtaccacccccatcaccactgccttcaagacctcaccctcgcctacgctt420ccccatcaaccacttgatccgaagcttggggtctctggccaatcgtcgacctgcaggcat480gcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcaca540attccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtg600agctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcg660tgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtatttgggcg720cttcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcgg780tatcagcctcactcaaaggcgggaattcggttatccacagaatcagggataacgcagaaa840aaacatgtgagcaaaaggcagtaaaggtcaggaaccgtaaaaggccgcgttgttggcgtt900tttct905Pt5cggagtttacgacagcagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagattggcc60agagaccccaagcttcggatcagagggcgggggtggttgttgagctgctaaggaggacag120ggcgacgtcaccgatgactgacgggggagagagaacagcgggacgatgacaggaggagag180agagagagagagagagagagagagagagagagaggcggggggcggattaacgggggaagg240acctggaggtagcggtggactcctcgtccttgtccgcgatgctccactaggacgccctct300tgaaggaggaatcgaatcttgtggtctctggctctttcgtcgacctgtaggcatgcaagc360ttggagtaacttgggtctaactgtatcctgtgtgttcttgttatcctctcgctattcctt420acaacattctagccgcaataacaaattgtaaagcttgaggtgtcttttgatgatcttaac480tcccatttacttgcgtagcactcatgactgttttcctggcggcaacctgattgccttctg540ttttatgtatctgccacgtgcggctgaaaggggatttttattttttttcttctttgtttc600tttttcattaatcttgcgcttgttcttcagctactacatattattctatctatttttttc660ttatttctttttttttttattctttgttttttttctatattatattttatgtctcttact720gtcattatc729Pt6cggaaaacaatgtagcagagtctcacctactgagttgtcgacatgggttgttccttattg60ataggctcatatacataactatcgtatggaagcctccctgtcgatatgtaagagagactc120aaattcgagggcttgttttaggacccaattttaatggttataaaaggatgttttgtaatc180ttagttagtatgcatttttttagagcaatcaattagagagagagagagagagagagagag240agagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagattatggcctttgtaagg300attgtgagagactaggttgtcttggtgtgagcaaagtaagtga343Pt7caccagacgttttccctttctcttcttcttttgtcgccagacctccttgtcgccagaaca60ccccgagtctccgcgtcgccagacattagctctctctctctctctctctctctctctctc120tctctctctctctctccttttcttctgccgtcgctagacgaggaaaactgagcctctaag180gcttggttatttcttttgtgtagaagctgttgagctgggcttttaatattctagttgggc240tcttatt247Pt8cgagactcagggagatataatggtgctcgagcgtagcacgtggcagagtgttgccgggca60gtacggaggttagtgtggaggggttggtaaccgtcgaggttgatggatcattgtcgatgt120tgtttctgaggagcttgagccacgggtgagctagcagcggtcgaagccatcaacaggggg180tcgtggggctggctgctcgtgacttttcaaagaaagaagctttgatcgttagtggaggca240gagggtgctcgagctggggttgcagggagagagagagagagagagagagagagagagaga300gagagagagagagagagagagagagagagagagagcaacagctaggattgagcatggaga360caggctagggttagggttaggttttgaataaattgagagagaa403Pt9ccaggcaccaccctggggcttcgacgacagtcgatggtcgatgatgatgagaccataggc60gactcatcttcagtcgttgatgatcgagagagagagagagagagagagagagagagagag120agagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagatccattgtcggtgacat180cgtagtcgtcgaggaatgaggctggaagagagatttattcgatgtcatcgtcattgtcaa240ggatcgaggctggacgagagaggtcaattcaatgtcgatgtcgtcatcatcattgag297Pt10cttgaggtcgttgccgctgccgccttgcggagggtccggaggcagaccgggaggaggatg60ccgtggcggcattggggtcgacggtgagcaggggtttgatctgagagagaggcatagggg120gaatttgagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagaga180gagagagagagagagaacaagagctcataaatgagcaaataatgggttatataccctagg240tcaatctttggagtaatctaggccgtccataccaattcccaacgaatcctagccttag298Pt11aaggggctgctgctagggtatggcgacataagagggtttggcgatgctgagagagagaga60gagagagagagagagagagagagagagagagagagagagaagtatctggcgtcggtgact120cgaaggtcgagtcaggcaacggggagtatggcgacaagcggggggttcaaatgggtgtct180ggcaatccagtgacaggcgagtagctaggtcaggcaacgagattcgagtgggtacggcga240tgcaagggttgagcttggaggcggggtctggcgacgctgatccttgggtccggcgacgat300ggatatgatgttgtttggc3192.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星標(biāo)記，其特征在于所述的Ptl、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、PtlO、Ptll個(gè)位點(diǎn)的引物序列為:PtlF:GTAAGTGTAGATGGGAGTPtlR:AAATATTAACCGCTACTAPt2F:CGGCATCGTCTGCAACAAPt2R:TCCTTTGCGCTCCCATCAPt3F:GATTAGGTGCCGAGATGAPt3R:CGCATGTCTGTCTATCCCPt4F:AGGGAAGGGACGGAGTTTPt4R:AAGTGCCTTCTGGCGTTTPt5F:TGGCGAGACGGCGGAATGPt5R:TCACCACGCGGGGAGGAGPt6F:TAAATCAAGGTAGCAACTPt6R:TACCCTACCATTACTCCCPt7F:GTACTCGGGGAAGTCTGGPt7R:TCCTATGTTTCTGCGACCPt8F:GCTGGCTGCTCGTGACTTPt8R:TAGCCTGTCTCCATGCTCPt9F:ATGATGAGACCATAGGCGPt9R:GACGACTACGATGTCACCPtlOF:GACGGTGAGCAGGGGTTTPtlOR:GGGAATTGGTATGGACGGPtllF:GGGGCTGCTGCTAGGGTATPtllR:TCGCCTGTCACTGGATTGC。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星標(biāo)記，包括長(zhǎng)梗黃精微衛(wèi)星(CT)<sub>n</sub>富集文庫(kù)的構(gòu)建；含微衛(wèi)星序列陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，得到84個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆；篩選得到11個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pt1、Pt2、Pt3、Pt4、Pt5、Pt6、Pt7、Pt8、Pt9、Pt10、Pt11；本發(fā)明的這11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究長(zhǎng)梗黃精的遺傳多樣性、黃精屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，具有重復(fù)性好，是一種可靠有效地分子標(biāo)記。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101654708SQ20091014504公開(kāi)日2010年2月24日申請(qǐng)日期2009年9月21日優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日發(fā)明者劉婷婷,彭艷秋,朱國(guó)萍,暉王,王宗達(dá),程文娟,翟羽佳申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)