專利名稱：抗cd 20抗體及其融合蛋白和使用方法
抗CD 20抗體及其融合蛋白和使用方法本申請(qǐng)是以下申請(qǐng)的分案申請(qǐng)申請(qǐng)日2003年2月14日；申請(qǐng)?zhí)?03808357. 4(PCT/GB03/00665)；發(fā)明名稱同上。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人源化、嵌合型和人抗CD20抗體，特別是人源化、嵌合型和人抗CD20 抗體的單克隆抗體(MAb)治療和診斷綴合物，和涉及用人源化、嵌合型和人抗CD20抗體來(lái) 治療B-細(xì)胞淋巴瘤和白血病以及多種自身免疫病的方法。本發(fā)明涉及抗體融合蛋白或者 其片段，它們含有至少兩個(gè)抗CD20 MAb或其片段，或者含有至少一種抗CD20 MAb或其片段 和至少一種除了抗CD20 MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段。人源化、嵌合型和人 抗CD20 MAb、其片段、其抗體融合蛋白或其片段可以單獨(dú)進(jìn)行施用，作為治療綴合物(cong jugate)或者與治療免疫綴合物、與其他裸露的抗體或與治療試劑聯(lián)合進(jìn)行施用，或者作為 診斷綴合物進(jìn)行施用。本發(fā)明涉及編碼人源化、嵌合型和人抗CD20抗體和抗體融合蛋白的 DNA序列、含有該DNA序列的載體和宿主細(xì)胞以及制造人源化、嵌合型和人抗CD20抗體的方 法。2.背景脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)由許多器官和細(xì)胞類型組成，它們已經(jīng)進(jìn)化成可準(zhǔn)確地識(shí)別 外來(lái)抗原，并特異性地與這些外來(lái)抗原結(jié)合和去除/破壞這些外來(lái)抗原。其中，淋巴細(xì)胞對(duì) 于免疫系統(tǒng)是關(guān)鍵性的。淋巴細(xì)胞劃分為兩個(gè)主要亞群，即T-細(xì)胞和B-細(xì)胞。雖然是相 互依賴的，但是T-細(xì)胞主要在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中起作用，而B-細(xì)胞主要在抗體產(chǎn)生(體液 免疫)中起作用。在人中，每個(gè)B-細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的抗體分子。這種抗體的產(chǎn)生一般在外來(lái)抗原 已被中和的時(shí)候停止(或者基本上減退了)?？墒?，有時(shí)特殊B-細(xì)胞的增殖會(huì)持續(xù)地不減 弱，從而可以導(dǎo)致稱為B-細(xì)胞淋巴瘤的癌癥。B-細(xì)胞淋巴瘤例如非Hodgkin’ s淋巴瘤的 B-細(xì)胞亞型對(duì)于癌癥死亡率起著重要的作用?；旌狭?B-細(xì)胞惡性腫瘤對(duì)于多種形式的治 療的反應(yīng)。例如，在可能對(duì)非Hodgkin's淋巴瘤進(jìn)行恰當(dāng)?shù)呐R床分期的情況下，場(chǎng)放射療法 能夠提供令人滿意的治療。但是仍有大約一半的患者死于該疾病。Devesa等人，J.Nat’ 1 Cancer Inst. 79 701(1987)。慢性淋巴細(xì)胞白血病的大部分是B-細(xì)胞系的。Freedman，Hemato 1. Oncol. Clin. North Am. 4 :405(1990)。這一類型的B-細(xì)胞惡性腫瘤在西方世界中是最普遍的白血病。 Goodman等人，Leukemia andLymphoma 22:1(1996)。慢性淋巴細(xì)胞白血病的天然病史分成 幾個(gè)階段。在早期階段中，慢性淋巴細(xì)胞白血病是無(wú)痛感的疾病，其特征在于積聚了小的、 成熟的、功能不全的惡性B-細(xì)胞，它們具有延長(zhǎng)的壽命。最后，惡性B-細(xì)胞的倍增時(shí)間減 少，和患者的癥狀增加。雖然治療能夠提供癥狀的緩解，但是患者的總存活率只是最低程度 地受到了影響。慢性淋巴細(xì)胞白血病的后期階段的特征為貧血和/或血小板減少。在這一 點(diǎn)上，中值存活時(shí)間小于兩年。Foon等人，Annals Int. Medicine 113:525(1990)。由于非 常低的細(xì)胞增殖率，慢性淋巴細(xì)胞白血病對(duì)于細(xì)胞毒性藥物治療具有抗性。
包括化學(xué)療法和放射療法在內(nèi)的治療B-細(xì)胞惡性腫瘤的傳統(tǒng)方法由于毒副作用 而具有有限的應(yīng)用。使用單克隆抗體來(lái)引導(dǎo)放射性核素、毒素或其他治療試劑提供了這樣 的可能性，即這些試劑可以選擇性地遞送到腫瘤部位，因此限制了對(duì)于正常組織的毒性。此 外，在這些B-細(xì)胞惡性腫瘤上B-細(xì)胞抗原的存在使得它們成為使用未綴合的B-細(xì)胞抗體 (例如抗B-細(xì)胞上的CD19、CD20、CD21、CD23和CD22標(biāo)記)的療法的最佳目標(biāo)。HLA-DR和 其他抗原可以用作正常和惡性B-細(xì)胞的目標(biāo)，雖然它們也在其他細(xì)胞類型上表達(dá)。此外， 某些MUC1、MUC2、MUC3和MUC4抗原(優(yōu)選為MUC1)也在不同的造血惡性腫瘤中表達(dá)，包括 表達(dá)⑶20和其他B-細(xì)胞標(biāo)記的B-細(xì)胞腫瘤。另外的其他抗原目標(biāo)，如那些與腫瘤的血管 內(nèi)皮相聯(lián)系的抗原，包括腱生蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)，以 及其他類別的與B-細(xì)胞惡性腫瘤相聯(lián)系的抗原如癌基因產(chǎn)物，它們也是在本發(fā)明中使用 的該互補(bǔ)性抗體的合適的目標(biāo)。B-細(xì)胞具有可用作用于區(qū)分和鑒定的標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白。一種這樣的人B-細(xì) 胞標(biāo)記為人局限于B-淋巴細(xì)胞的分化抗原Bp35，稱為⑶20。⑶20在前B-細(xì)胞的發(fā)育早 期期間進(jìn)行表達(dá)，并保持到漿細(xì)胞的分化。CD20在正常的B-細(xì)胞和惡性B-細(xì)胞上表達(dá)， 惡性B-細(xì)胞的不正常生長(zhǎng)能夠?qū)е翨-細(xì)胞淋巴瘤。已經(jīng)研究了抗CD20抗原的抗體用于 B-細(xì)胞淋巴瘤的治療。例如，標(biāo)示為“IDEC-C2B8”的嵌合型抗CD20抗體當(dāng)以下列條件進(jìn)行 施用時(shí)具有抗B-細(xì)胞淋巴瘤的活性，即以未綴合的抗體形式進(jìn)行提供，并以每次注射超過(guò) 500mg 的劑量進(jìn)行重復(fù)的注射。Maloney 等人，Blood 84:2457(1994) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 =353(1996)。大約50%的具有低級(jí)無(wú)痛感形式的非Hodgkin，s患者在用這一治療 方法進(jìn)行治療時(shí)顯示出反應(yīng)。當(dāng)以每次注射超過(guò)600mg的劑量進(jìn)行重復(fù)給藥時(shí)，治療反應(yīng) 也可以通過(guò)使用131I標(biāo)記的抗⑶20鼠類單克隆抗體Bl來(lái)獲得。Kaminski等人，N. Engl. J. Med. 329 459(1993) ；Press 等人，N. Engl. J. Med. 329 1219 (1993) ；Press 等人，Lancet 346 :336(1995)?？墒?，這些以未綴合的形式或者以放射性標(biāo)記的形式提供的抗體在具有更 普遍和致死形式的B-細(xì)胞淋巴瘤(中間或侵染性形式)的患者中沒(méi)有顯示出高比率的客 觀和持久的反應(yīng)。因此，存在需要來(lái)形成對(duì)于B-細(xì)胞惡性腫瘤的免疫療法，其可獲得具有 明顯持續(xù)時(shí)間的治療反應(yīng)。已經(jīng)用抗⑶20鼠類單克隆抗體IF5驗(yàn)證了另外的將⑶20表面抗原作為目標(biāo)的研 究，IF5通過(guò)持續(xù)的靜脈內(nèi)輸注而施用于B-細(xì)胞淋巴瘤患者。據(jù)報(bào)道，需要非常高水平(> 2克)的IF5來(lái)減少循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，該結(jié)果被Press等人(人B-細(xì)胞淋巴瘤的單克隆抗 # IF5 ( CD20) 青去(Monoclonal Antibody IF5 (Anti-CD20)Serotherapy ofHuman B-Cell Lymphomas)，Blood 69/2 =584-591 (1987))描述為“短暫的”?？墒?，該方法的潛在 問(wèn)題是非人單克隆抗體(例如鼠類單克隆抗體)通常缺乏人效應(yīng)物功能性，即它們不能夠 介導(dǎo)依賴補(bǔ)體的裂解，或者通過(guò)依賴抗體的細(xì)胞毒性或Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用來(lái)裂解人 靶細(xì)胞。此外，非人單克隆抗體能夠被人宿主識(shí)別為外源蛋白質(zhì)，因此重復(fù)注射這種外源抗 體可以引起導(dǎo)致有害過(guò)敏反應(yīng)的免疫反應(yīng)。對(duì)于基于鼠類的單克隆抗體，這常常稱為人抗 鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。使用嵌合型抗體是更加優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)引起與鼠類抗體一樣強(qiáng)的HAMA反 應(yīng)。嵌合型抗體是含有來(lái)自兩個(gè)或更多個(gè)不同物種的部分的抗體。例如Liu，A.Y.等 人(具有有效的Fc依賴性生物活性的抗CD20小鼠-人嵌合型單克隆抗體的生產(chǎn)(Production of a Mouse-HumanChimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-DependentBiologic Activity)，J. Immun. 139/10 :3521_3526 (1987))描述了 導(dǎo)向抗 CD20抗原的小鼠/人嵌合型抗體。也可見(jiàn)PCT發(fā)表號(hào)W088/04936?？墒牵谠撐墨I(xiàn)中沒(méi)有提 供關(guān)于使用這種嵌合型抗體對(duì)于治療B-細(xì)胞紊亂的能力、效用或?qū)嵱眯缘男畔ⅰＲ⒁獾?是，體外功能測(cè)定(例如依賴補(bǔ)體的裂解(CDC)；依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)等等)不能自 然地預(yù)測(cè)嵌合型抗體破壞或減少表達(dá)特異性抗原的靶細(xì)胞的體內(nèi)能力。見(jiàn)例如，Robinson， R.D.等人，介導(dǎo)不同的抗腫瘤細(xì)胞生物活性的嵌合型小鼠-人抗癌抗體(Chimeric mouse-humananti—carcinoma antibodies that mediate different anti—tumorcell biological activities), Hum. Antibod. Hybridomas 2 :84_93 (1991)(具有無(wú)法覺(jué)察的 ADCC活性的嵌合型小鼠_人抗體)。因此，嵌合型抗體的潛在治療效能只能真正地通過(guò)體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)測(cè)，優(yōu)選地在用于特異性療法的目標(biāo)物種中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。有一種方法已經(jīng)改善了鼠類單克隆抗體的能力以使其在治療B-細(xì)胞紊亂中是 有效的，這一方法將放射性標(biāo)記或化療試劑與抗體綴合，從而標(biāo)記或試劑可定位于腫瘤 部位。例如，上面所提及的IF5抗體和其他B-細(xì)胞抗體用131I進(jìn)行標(biāo)記，并據(jù)報(bào)道對(duì)于 在兩個(gè)患者中的生物分布進(jìn)行評(píng)價(jià)。見(jiàn)Eary，J. F.等人，B-細(xì)胞淋巴瘤的成像和治療 (Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma), J. Nuc. Med. 31/8 1257-1268(1990)； 也可見(jiàn)Press，0. W.等人，用放射性標(biāo)記的MB-I (抗⑶37)抗體治療頑固性非Hodgkin，s 淋巴瘤(Treatment ofRefractory Non-Hodgkin' s Lymphoma with Radiolabeled MB-I (Anti-CD37) Antibody), J. Clin. One. 7/8 :1027-1038 (1989)(表明一個(gè)用 131I 標(biāo)記 的IF-5進(jìn)行治療的患者獲得了部分的反應(yīng))；Goldenberg，D. Μ.等人，用131I標(biāo)記的LL2 單克隆抗體對(duì)于B-淋巴瘤進(jìn)行定向、劑量測(cè)定和放射免疫治療(Targeting，Dosimetry andRadioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with 131 I-Labeled LL2Monoclonal Antibody)，J. Clin. Oncol. 9/4 =548-564(1991)(報(bào)道了八個(gè)接受多次注射的患者中有三 個(gè)形成了對(duì)于該⑶22鼠類抗體的HAMA反應(yīng))；Appelbaum，F(xiàn). R.，在治療非Hodgkin’ s淋
Φ(Radiolabeled Monoclonal Antibodies in theTreatment
of Non-Hodgkin，s Lymphoma), Hem. /Oncol. Clinics of N. A. 5/5 :1013-1025(1991)(綜 述文章)；Press，0. W.等人，用自體骨髓支持物所進(jìn)行的B-細(xì)胞淋巴瘤的放射性標(biāo)記抗 體療法(Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma withAutologous Bone Marrow Support), New England Journal of Medicine329/17 1219-12223 (1993) (131I fe 記的抗CD20抗體IF5和Bi)；和Kaminski，Μ. G.等人，用[131 I]抗Bl (抗CD20)抗體所進(jìn) ^fW B- ^IfiSE^W^M^^^T^ (Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomaswith [131 I] Anti-Bl (Anti-CD20) Antibody)，NEJM 329/7 459(1993) (131 I 標(biāo)記的抗 CD20 抗體 Bl ；在 下文中稱為“Kaminski”)；PCT發(fā)表的申請(qǐng)WO 92/07466 (與化療試劑如阿霉素或絲裂霉素 綴合的抗體)?？墒?，這些方法沒(méi)有消除與使用鼠類抗體相聯(lián)系的障礙，盡管有這樣的事實(shí)， 即在侵染之前接受細(xì)胞毒性化療的許多具有淋巴瘤的患者是免疫抑制的，因此比沒(méi)有進(jìn)行 深切預(yù)治療的淋巴瘤患者具有更低的HAMA比率。自身免疫病是一類與B-細(xì)胞紊亂相聯(lián)系的疾病。例子包括免疫介導(dǎo)的血小板減 少癥如急性原發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性原發(fā)性血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力、狼瘡 腎炎、紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。最普通的治療為皮質(zhì)類固醇和細(xì)胞毒性藥物，其可以是非常毒的。這些藥物也抑制整個(gè)免疫系統(tǒng)，從而可導(dǎo)致嚴(yán)重的感染，和對(duì)于骨髓、肝和腎產(chǎn) 生不利的影響。到目前為止已用于治療III型自身免疫病的其他治療劑已經(jīng)導(dǎo)向抗T-細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞。有需要來(lái)獲得更有效的治療自身免疫病的方法，特別是III型自身免疫病。為了找出許多與B-細(xì)胞紊亂和其治療相關(guān)的組織，本發(fā)明提供了人源化、嵌合型 和人抗CD20單克隆抗體，這些單克隆抗體具有同樣的與本發(fā)明的CD20抗原結(jié)合的互補(bǔ)決 定區(qū)(CDR)，它們可單獨(dú)使用、與治療試劑綴合使用或者與其他治療形式聯(lián)合使用，以用于 在人和其他哺乳動(dòng)物中治療B-細(xì)胞淋巴瘤與白血病和自身免疫紊亂，而沒(méi)有與使用鼠類 抗體相聯(lián)系的不利反應(yīng)。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20抗體，它們與被稱為CD20的人 B-細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合，該B-細(xì)胞標(biāo)記可用于B-細(xì)胞紊亂如B-細(xì)胞惡性腫瘤和自身免疫病的治 療和診斷。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用一種或多種人源化、嵌合型和人CD20抗體來(lái)治療哺乳動(dòng) 物受試者如人或家養(yǎng)動(dòng)物的方法，這些抗體單獨(dú)使用，或者作為抗體融合蛋白、作為治療綴 合物單獨(dú)或作為抗體融合蛋白的一部分進(jìn)行使用，或者聯(lián)合其他抗體、其他治療試劑或免 疫調(diào)節(jié)劑而以多形式療法進(jìn)行使用，或者作為與至少一種治療試劑、治療放射性核素或免 疫調(diào)節(jié)劑相連的免疫綴合物進(jìn)行使用。這些人源化、嵌合型和人CD20抗體也可以單獨(dú)、與 其他診斷成像劑聯(lián)合和/或與治療應(yīng)用一起而用作診斷成像劑。本發(fā)明另外涉及抗CD20 MAb或其片段，它們含有特異性鼠類CDR或來(lái)自多于一種 鼠的鼠類⑶R組合，或者含有對(duì)于⑶20具有特異性的嵌合型抗⑶20 MAb。這些MAb可以為 人源化、嵌合型和人抗⑶20 MAb。本發(fā)明也涉及抗體融合蛋白，其含有至少兩個(gè)抗CD20 MAb或其片段，或者含有具 有抗CD20 MAb或其片段的第一種MAb和第二種MAb。本發(fā)明進(jìn)一步涉及抗⑶20 MAb或其片段、或者抗⑶20 MAb或其他MAb或其片段的 抗體融合蛋白與至少一種治療試劑或至少一種診斷試劑結(jié)合所形成的治療或診斷綴合物。 具有多個(gè)相同或不同類型的治療試劑的抗體融合蛋白包括在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明另外涉及使用抗CD20 MAb或其片段或者其抗體融合蛋白或其片段進(jìn)行治 療的方法，它們單獨(dú)進(jìn)行施用，互相聯(lián)合進(jìn)行施用，作為具有一個(gè)或多個(gè)治療試劑的治療免 疫綴合物的抗體成分進(jìn)行施用，或者與一個(gè)或多個(gè)治療試劑或各自與具有一個(gè)或多個(gè)治療 試劑的治療免疫綴合物聯(lián)合施用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用抗CD20 MAb或其片段或者其抗體融合蛋白或其片段作為 與一種或多種診斷試劑結(jié)合的診斷劑的方法。本發(fā)明另外涉及在患有B-細(xì)胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中用本發(fā) 明的抗體融合蛋白或其片段預(yù)定向細(xì)胞的方法。附圖簡(jiǎn)述

圖1公開了通過(guò)RT-PCR從產(chǎn)生鼠類抗⑶20的雜交瘤細(xì)胞系中克隆得到的V基因 序列，和由此推斷出的A20抗體可變輕鏈(圖1A)和重鏈(圖1B)的氨基酸序列，分別標(biāo) 示為A20Vk和A20VH。下劃箭頭線指明了用于克隆的PCR引物的序列。由Kabat編號(hào)方案 所定義的推定CDR區(qū)域序列以粗體和下劃線表示。氨基酸序列以位于相應(yīng)核苷酸序列之下的單字母碼來(lái)給出。Kabat編號(hào)方案用于氨基酸殘基。根據(jù)Kabat，用一個(gè)字母編號(hào)的氨基 酸殘基代表了插入殘基，其具有與以前殘基的編號(hào)一樣的編號(hào)。例如，圖IB中的殘基82、 82A、82B和82C分別表示為82A、B和C。圖2公開了 cA20這一嵌合型抗⑶20抗體的Vk (可變輕鏈)和VH (可變重鏈)的 序列。CDR區(qū)域的序列用粗體和下劃線表示。氨基酸殘基和核苷酸順次進(jìn)行編號(hào)，同樣的編 號(hào)系統(tǒng)用于人源化的V序列。輕鏈可變區(qū)顯示在圖2A中，重鏈可變區(qū)顯示在圖2B中。編 號(hào)系統(tǒng)與用于圖1的是一樣的。用于構(gòu)建cA20的限制位點(diǎn)用下劃線表示。圖3顯示了嵌合型A20(cA20)和鼠類A20 (A20)在對(duì)于125I標(biāo)記的A20的細(xì)胞表 面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中結(jié)合親和力的比較。cA20的濃度增加以與鼠類A20(用實(shí)心的菱形來(lái) 描繪)相當(dāng)?shù)姆绞阶钄嗔朔派湫詷?biāo)記的A20(用實(shí)心的圓來(lái)描繪)與Raji細(xì)胞的結(jié)合。圖4比較了人抗體與嵌合型和人源化抗⑶20抗體的可變重鏈(VH)和可變輕鏈 (Vk)的氨基酸序列。圖4A比較了人抗體EU和NEWM (只是FR4)、嵌合型抗體(cA20VH)與 兩個(gè)人源化抗體(hA20VHl和hA20VH2)的可變重鏈(VH)的氨基酸序列；圖4B比較了人抗 體(REIVk)、嵌合型抗體(cA20Vk)與人源化抗體(hA20Vk)的可變輕鏈(Vk)的氨基酸序列。 點(diǎn)表示A20中的殘基與人抗體中的相應(yīng)殘基是一樣的。CDR標(biāo)示為加框的區(qū)域。Kabat編 號(hào)方案用于將氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。圖5分別公開了 hA20輕鏈V基因(hA20Vk)的核苷酸序列(圖5A)，和重鏈V基因 hA20VHl (圖5B)與hA20VH2 (圖5C)的核苷酸序列，以及VKpBR2 (圖5A)和VHpBS2 (圖5B 和5C)分階段載體的鄰近側(cè)翼序列。非翻譯核苷酸序列以小寫字母顯示。用于亞克隆的限 制位點(diǎn)加上下劃線而指明。分泌信號(hào)肽序列用雙下劃線來(lái)指明。Vk和VH氨基酸殘基的編 號(hào)與圖2中的一樣。圖6顯示了細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，該測(cè)定是為了比較兩種人源化A20 抗體(hA20-l和hA20-2)與A20、cA20和嵌合型抗⑶20MAb (c2B8)的結(jié)合活性。圖6A顯示 了 hA20-l (實(shí)心的三角形)與hA20-2 (實(shí)心的圓形)和鼠類抗⑶20抗體A20(實(shí)心的正 方形)同樣良好地競(jìng)爭(zhēng)125I-A20與Raji細(xì)胞的結(jié)合。圖6B顯示了 hA20-l(實(shí)心的圓形)、 cA20(實(shí)心的正方形)和c2B8(實(shí)心的菱形)同樣良好地競(jìng)爭(zhēng)125I_c2B8與Raji細(xì)胞的結(jié)
I=I ο圖7公開了人IgGl的恒定區(qū)(CH-鉸鏈)(圖7A)和人κ鏈的恒定區(qū)(Ck)(圖 7Β)。圖8為競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞表面結(jié)合測(cè)定。通過(guò)與鼠類2Β8和rituXimab(IDEC制藥公司， San Diego，CA)所進(jìn)行的細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)人源化抗⑶20 Ab(cA20、hA20 和clF5，通過(guò)A蛋白柱上的親和層析而純化)的Ag結(jié)合特異性和親和性研究。圖8(A)為 cA20(正方形)、hA20-2(三角形)和hA20-l(圓形)與m2B8 (菱形)的結(jié)合活性的比較； 圖8 (B)比較了 cA20 (正方形)、clF5 (三角形)和rituximab (菱形)的結(jié)合活性。圖9為通過(guò)細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)來(lái)比較hA20與其他抗⑶20 Ab (包 括rituximab和鼠類Bi)的結(jié)合活性的研究。在存在濃度變化(0. 2_700ηΜ)的競(jìng)爭(zhēng) Ab、hA20(三角形)、mBl(倒三角形)或rituximab (正方形)的情況下，將恒定數(shù)量 (100，OOOcpm, ^ 10iCi/ig)的 125I 標(biāo)記的 rituximab 與 Raji 細(xì)胞于 4°C溫育 1-2 小時(shí)。圖10描繪了交聯(lián)的hA20和其他⑶20 Ab對(duì)于培養(yǎng)的淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
8通過(guò)(A)錐蟲藍(lán)染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)或者(B)MTT測(cè)定來(lái)測(cè)量總細(xì)胞和存活細(xì)胞群體。圖11為使用多種抗⑶20和其他Ab的體內(nèi)治療研究的圖。將Raji細(xì)胞以靜脈內(nèi) 注射方式給予SCID小鼠，從而形成播散性疾病的Raji淋巴瘤模型。圖12為描繪了使用hA20和hLL2的體內(nèi)治療的圖。將Raji細(xì)胞以靜脈內(nèi)注射方 式給予SCID小鼠，從而形成播散性疾病的Raji淋巴瘤模型。發(fā)明詳述1.總述正如上面所討論的，未綴合或用治療性放射性核素標(biāo)記的抗CD20抗體不能在具 有中間或侵染性形式的B-細(xì)胞淋巴瘤的患者中提供高比率的客觀和持續(xù)的反應(yīng)。本發(fā)明 提供了用于治療哺乳動(dòng)物受試者(人和家養(yǎng)動(dòng)物)的人源化、嵌合型和人抗CD20抗體及 其抗體融合蛋白，它們作為綴合物單獨(dú)施用，或者與其他治療試劑(包括其他裸露的抗體 和抗體治療綴合物)聯(lián)合施用。 本發(fā)明的抗⑶20 MAb含有特異性鼠類⑶R或者來(lái)自多于一種鼠的鼠類⑶R組合， 或者含有對(duì)于CD20抗原具有特異性的嵌合型抗CD20MAb。本發(fā)明的抗CD20 MAb是人源化、 嵌合型或人MAb,它們具有鼠類抗CD20 MAb的CDR的氨基酸，并基本上保持了鼠類抗CD20 MAb對(duì)B-細(xì)胞和B-細(xì)胞淋巴瘤以及白血病細(xì)胞的定向?？笴D20 MAb的輕鏈可變區(qū)的CDR 具有含有氨基酸RASSSVSYIH、RASSSLSFMH或RASSSVSYMH的CDRl，含有氨基酸ATSNLAS的 CDR2，和含有氨基酸 QQWTSNPPT、HQffSSNPLT 或 QQSFSNPPT 的 CDR3 ；抗 CD20MAb 的重鏈可變 區(qū)的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDRl，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有 氨基酸 STYYG⑶WYFDV、STYYG⑶WYFNV、SHYGSNYVDYFDV 或 VVYYSNSYWYFDV 的 CDR3。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化和嵌合型MAb或其片段不具有含有STYYGGDWYFNV的重 鏈可變區(qū)的⑶R3。更優(yōu)選地，當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶R3含有HQWSSNPLT并且重鏈可變區(qū)的⑶R3 含有SHYGSNYVDYFDV時(shí)，輕鏈可變區(qū)的CDRl不含有RASSSLSFMH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng) 輕鏈可變區(qū)的CDRl含有RASSSLSFMH時(shí)并且當(dāng)重鏈可變區(qū)的CDR3含有SHYGSNYVDYFDV時(shí)， 輕鏈可變區(qū)的⑶R3不含有HQWSSNPLT。在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl 含有RASSSLSFMH并且輕鏈可變區(qū)的⑶R3含有HQWSSNPLT時(shí)，重鏈可變區(qū)的⑶R3不含有 SHYGSNYVDYFDV。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶R3含有QQSFSNPPT并且重鏈可 變區(qū)的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV時(shí)，輕鏈可變區(qū)的CDRl不含有RASSSVSYMH。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl含有RASSSVSYMH并且重鏈可 變區(qū)的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV時(shí)，抗CD20單克隆抗體(MAb)或其片段不含有氨基酸為 QQSFSNPPT的輕鏈可變區(qū)的CDR3。另外，當(dāng)輕鏈可變區(qū)的CDRl含有RASSSVSYMH并且輕鏈 可變區(qū)的CDR3含有QQSFSNPPT時(shí)，抗CD20MAb不含有氨基酸為VVYYSNSYWYFDV的重鏈可變 區(qū)的CDR3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化抗CD20(hCD20)單克隆抗體或其抗原結(jié)合片 段含有至少一種鼠類抗⑶20 MAb可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和至少一種人MAb可變區(qū)的 構(gòu)架區(qū)(FR)，其中該人源化抗CD20MAb或其片段基本上保持了該鼠類抗CD20 MAb對(duì)B-細(xì) 胞和B-細(xì)胞淋巴瘤以及白血病細(xì)胞的定向。人源化抗體的可變區(qū)可以含有輕鏈可變區(qū)、重 鏈可變區(qū)或者輕鏈和重鏈可變區(qū)。人源化抗體或其片段可以進(jìn)一步含有至少一種人抗體的 輕鏈和重鏈恒定區(qū)。
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本發(fā)明的人源化抗⑶20 MAb或其片段含有鼠類抗⑶20 MAb的⑶R和人抗體 輕鏈和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)，同時(shí)基本上保持了親代鼠類抗CD20 MAb對(duì)B-細(xì)胞和 B-細(xì)胞淋巴瘤以及白血病細(xì)胞的定向，其中鼠類抗CD20 MAb的輕鏈可變區(qū)的CDR具有含 有氨基酸RASSSVSYIH的⑶Rl，含有氨基酸ATSNLAS的⑶R2，和含有氨基酸QQWTSNPPT的 ⑶R3 ；鼠類抗⑶20 MAb的重鏈可變區(qū)的⑶R具有含有氨基酸SYNMH的⑶Rl，含有氨基酸 AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有氨基酸STYYG⑶WYFDV的CDR3。但是，人源化抗CD20 MAb或其片段可以在抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的FR中進(jìn)一步含有至少一種來(lái)自鼠類MAb的相 應(yīng)FR的氨基酸。人源化MAb可以進(jìn)一步含有人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)。特別地，人源化 抗⑶20 MAb或其片段含有選自圖4A中標(biāo)示為hA20VHl或hA20VH2的鼠類重鏈可變區(qū)的1、 5、27、30、38、48、67、68、70、95、155和116位氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基，和含有選 自圖4B中標(biāo)示為hA20Vk的鼠類輕鏈可變區(qū)的4、21、35、38、45、46、59、99、104和106位氨 基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基。如果需要保持與CD20抗原的適當(dāng)結(jié)合或者增強(qiáng)與CD20 抗原的結(jié)合，可以在輕鏈和重鏈可變鏈的人FR區(qū)域中保留一個(gè)或多個(gè)鼠類氨基酸序列。更 優(yōu)選地，本發(fā)明的人源化抗⑶20 MAb或其片段含有圖4B的hA20Vk和圖4A的hA20VHl。最 優(yōu)選地，本發(fā)明的人源化抗⑶20 MAb或其片段含有圖4B的hA20Vk和圖4A的hA20VH2。該 后者序列在VH2鏈的FR內(nèi)比VHl含有更多的人氨基酸序列，因此是更加人源化的。本發(fā)明的優(yōu)選的嵌合型抗⑶20 (c⑶20) MAb或其片段含有鼠類抗⑶20 MAb的⑶R 和鼠類抗CD20 MAb的輕鏈和重鏈可變區(qū)的FR區(qū)域(即親代鼠類MAb的Fv)，還含有人抗體 的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，其中嵌合型抗CD20 MAb或其片段基本上保持了鼠類抗CD20 MAb對(duì) B-細(xì)胞和B-細(xì)胞淋巴瘤以及白血病細(xì)胞的定向，其中嵌合型抗CD20 MAb的輕鏈可變區(qū)的 CDR 具有含有氨基酸 RASSSVSYIH、RASSSLSFMH 或 RASSSVSYMH 的 CDRl，含有氨基酸 ATSNLAS 的 CDR2，和含有氨基酸 QQWTSNPPT、HQWSSNPLT 或 QQSFSNPPT 的 CDR3 ；嵌合型抗 CD20 MAb 的 重鏈可變區(qū)的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDRl，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2， 和含有氨基酸 STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV 或 VVYYSNSYWYFDV 的 CDR3，前 提是，(a)其中當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl含有氨基酸RASSSVSYIH，輕鏈可變區(qū)的⑶R2含有 氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區(qū)的⑶R3含有氨基酸QQWTSNPPT，重鏈可變區(qū)的⑶Rl含有氨基 酸SYNMH，并且重鏈可變區(qū)的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時(shí)，重鏈可變區(qū)的CDR3 不含有 STYYGGDWYFNV ；(b)其中當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl含有氨基酸RASSSLSFMH，輕鏈可變區(qū)的⑶R2含有 氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區(qū)的⑶R3含有氨基酸HQWSSNPLT，重鏈可變區(qū)的⑶Rl含有氨基 酸SYNMH，并且重鏈可變區(qū)的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時(shí)，重鏈可變區(qū)的CDR3 不含有 SHYGSNYVDYFDV ；禾口(c)其中當(dāng)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl含有氨基酸RASSSVSYMH，輕鏈可變區(qū)的⑶R2含有 氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區(qū)的⑶R3含有氨基酸QQSFSNPPT，重鏈可變區(qū)的⑶Rl含有氨基 酸SYNMH，并且重鏈可變區(qū)的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時(shí)，重鏈可變區(qū)的CDR3 不含有 VVYYSNSYWYFDV。更優(yōu)選地，嵌合型抗⑶20 MAb或其片段含有鼠類抗⑶20 MAb的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR) 和鼠類抗CD20 MAb的輕鏈和重鏈可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)，還含有人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)，其中嵌合型抗CD20 MAb或其片段基本上保持了鼠類抗CD20 MAb對(duì)B-細(xì)胞和B-細(xì)胞 淋巴瘤以及白血病細(xì)胞的定向，其中嵌合型抗CD20 MAb的輕鏈可變區(qū)的CDR具有分別顯示 在圖4B和4A中并標(biāo)示為cA20Vk和cA20VH的CDR。最優(yōu)選地，嵌合型抗CD20 MAb或其片 段含有分別顯示在圖4B和4A中并標(biāo)示為cA20Vk和cA20VH的鼠類抗CD20 MAb的輕鏈和
重鏈可變區(qū)。本發(fā)明也包括人抗CD20 MAb或其片段，它們含有人抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)與恒 定區(qū)，其中該⑶20 MAb基本上保持了鼠類抗⑶20MAb對(duì)B-細(xì)胞和B-細(xì)胞淋巴瘤以及白血 病細(xì)胞的定向和細(xì)胞結(jié)合特性，其中人抗CD20 MAb的輕鏈可變區(qū)的CDR具有與上面對(duì)于 嵌合型和人源化抗CD20 MAb所提及的同樣的CDR，其顯示在圖4A和4B中。本發(fā)明也想要包括抗體融合蛋白或其片段，它們含有至少兩個(gè)上述的抗CD20 MAb 或其片段。本發(fā)明的抗體融合蛋白或其片段也想要包括這樣的抗體融合蛋白或其片段，即 它們含有至少一種第一種上述的抗CD20 MAb或其片段，和含有至少一種除了上述的抗⑶20 MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段。更優(yōu)選地，該第二種MAb為與⑶4、⑶5、⑶8、 CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、 CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、PlGF、 癌基因、癌基因產(chǎn)物或其組合反應(yīng)的MAb，甚至是不同于此處描述的抗⑶20 MAb的抗⑶20 MAb。本發(fā)明的抗體融合蛋白可以由一個(gè)CD20 MAb和一個(gè)或多個(gè)用于提供對(duì)于不同抗原的 特異性的第二種MAb所組成，它們?cè)谙旅鎸⑦M(jìn)行更詳細(xì)的描述。人源化、嵌合型和人抗CD20抗體可以具有增強(qiáng)的與表位結(jié)合的親和性以及抗腫 瘤和抗B-細(xì)胞活性，這是CDR突變和對(duì)于CDR與可變區(qū)中的其他序列進(jìn)行操作的結(jié)果，從 而獲得優(yōu)良的治療試劑以用于治療B-細(xì)胞紊亂，包括B-細(xì)胞淋巴瘤和白血病以及自身免 疫病。對(duì)于抗體的結(jié)合特異性和親和性或親和力所進(jìn)行的修飾是已知的，并在W098/44001 中進(jìn)行了描述，這種修飾稱之為親和力成熟，該申請(qǐng)概括了修飾的方法，在此處以其整體進(jìn) 行引用作為參考。也可希望修飾本發(fā)明的抗體以改善效應(yīng)物功能，例如以致增強(qiáng)拮抗物的依賴抗原 的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)和/或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。在Fc區(qū)域中可以取代一個(gè) 或多個(gè)氨基酸或者引入半胱氨酸，由此改善內(nèi)化能力和/或增加的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷能 力禾口 ADCC。見(jiàn) Caron 等人，J. Ex. Med. 176 1191-1195 (1991) ^P Shopes, B. J. Immunol. 148 2918-2022(1992)，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考?？梢灾苽溥@樣的抗體融合蛋白，即 其含有具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解和ADCC能力的雙重Fc區(qū)域。本發(fā)明也涉及含有編碼選自下組的MAb或其片段的核酸的DNA序列(a)此處描述的抗⑶20 MAb或其片段，(b)含有至少兩種抗⑶20 MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，(c)含有至少一種含有此處描述的抗⑶20 MAb或其片段的第一種MAb或其片段和 至少一種除了抗CD20 MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段， 和(d)含有至少一種含有抗⑶20 MAb或其片段的第一種MAb或其片段和至少一種 第二種MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中第二種MAb為與⑶4、⑶5、⑶8、⑶14、 CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基 因、癌基因產(chǎn)物或其組合反應(yīng)的MAb。本發(fā)明也包括含有DNA序列的表達(dá)載體。在載體用于制備人源化、嵌合型和人抗 ⑶20 MAb或者其抗體融合蛋白或其片段的情況下，這些載體含有人免疫球蛋白輕鏈和重鏈 恒定區(qū)以及鉸鏈區(qū)。在需要的時(shí)候，這些載體另外含有用于在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)MAb 的啟動(dòng)子以及免疫球蛋白增強(qiáng)和信號(hào)或引導(dǎo)序列。在本發(fā)明中特別有用的載體為pdHL2或 GS，特別是當(dāng)用于表達(dá)嵌合型、人源化或人抗體如gig時(shí)，載體在此編碼IgGl的重鏈和輕 鏈恒定區(qū)以及鉸鏈區(qū)。更優(yōu)選地，輕鏈和重鏈恒定區(qū)以及鉸鏈區(qū)來(lái)自人EU骨髓瘤免疫球蛋 白，在此任選將至少一個(gè)同種異型位置上的氨基酸改變?yōu)樵诓煌腎gGl同種異型中發(fā)現(xiàn) 的氨基酸，其中可以任選將基于EU編號(hào)系統(tǒng)的EU重鏈的253位氨基酸用丙氨酸進(jìn)行取代。 見(jiàn)Edelman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 :78_85 (1969)，此處以其整體進(jìn)行引用作為 參考。本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明的抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段 的DNA序列的宿主細(xì)胞，或者含有具有這些DNA序列的載體的宿主細(xì)胞。特別有用的宿主 細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更特殊的是淋巴細(xì)胞，例如骨髓瘤細(xì)胞，這將在下面進(jìn)行更詳細(xì)的討 論。本發(fā)明也包括具有下列步驟的表達(dá)抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其 片段的方法(a)用編碼抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的DNA序列轉(zhuǎn)染 哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和(b)培養(yǎng)用DNA序列轉(zhuǎn)染從而能夠分泌抗CD20 MAb或其片段或者抗體融 合蛋白或其片段的細(xì)胞?？梢允褂迷谳d體上具有選擇標(biāo)記的已知方法，從而能夠容易地選 擇出表達(dá)MAb和標(biāo)記的宿主細(xì)胞。本發(fā)明特別地包括定向于B淋巴瘤細(xì)胞與白血病細(xì)胞的診斷或治療綴合物，其具 有含有本發(fā)明的與B淋巴瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞結(jié)合的抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合 蛋白或其片段的抗體組分，該抗體組分與至少一種診斷或至少一種治療試劑結(jié)合。診斷綴合物具有含有抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的抗體組 分，其中診斷試劑含有至少一種光活診斷試劑，更優(yōu)選地其中標(biāo)記為具有60-4，OOOkeV的 能量的放射性標(biāo)記或者非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記優(yōu)選地為發(fā)射Y射線、β射線和正電 子的同位素，其選自 125I、131I、123I、124I、86Y、186Re、188Re、62CU、64CU、mIn、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、 18F^m76Br及其組合。本發(fā)明的診斷綴合物也使用診斷試劑，例如造影劑如錳、鐵或釓。本發(fā)明的治療綴合物具有含有抗體融合蛋白或其片段的抗體組分，其中每個(gè)該 MAb或其片段與至少一種治療試劑結(jié)合。治療綴合物的治療試劑優(yōu)選地選自放射性標(biāo)記、免 疫調(diào)節(jié)劑、激素、光活治療試劑、可以為藥物或毒素的細(xì)胞毒性試劑及其組合。在本發(fā)明中 使用的藥物為那些具有選自下組的藥物特性的藥物抗有絲分裂、抗激酶、烷基化、抗代謝、 抗生素、生物堿、抗血管生成、細(xì)胞凋亡試劑及其組合。更特別地，這些藥物選自氮芥、氮丙 啶衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類 似物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬配位復(fù)合物、長(zhǎng)春花生物堿、取代的脲、甲基胼衍生物、腎 上腺皮質(zhì)抑制劑、拮抗劑、內(nèi)他丁(endostatin)、紫杉醇、喜樹堿、蒽環(huán)類、紫杉烷和它們的 類似物以及其組合。本發(fā)明包括的毒素選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)如onconase、DNA酶I、葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素-A、美洲商陸 抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。本發(fā)明的有用的治療試劑為選自下組的免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素及 其組合。特別有用的為淋巴毒素如腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子如白細(xì)胞介素(IL)、集落 刺激因子如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾 素如干擾素-α、-β或-γ和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子如稱為“Si因子”的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。更 特別地，免疫調(diào)節(jié)劑如 IL-I、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、 TNF-α或其組合在本發(fā)明中是可用的。特別有用的治療綴合物含有一種或多種具有60-700keV的能量的放射性標(biāo)記。這 種放射性標(biāo)記選自 225AC、67Ga、9°Y、mIn、131I、125I、186Re、188Re、177LU、32P、64CU、67CU、212Bi、213Bi、 211At及其組合。其他有用的治療綴合物為光活治療試劑，如發(fā)色團(tuán)或染料。其他有用的治療綴合物含有寡核苷酸，特別是反義寡核苷酸，其優(yōu)選地導(dǎo)向B-細(xì) 胞惡性腫瘤的癌基因和癌基因產(chǎn)物如bcl-2。本發(fā)明特別地包括在受試者中治療B-細(xì)胞淋巴瘤或白血病細(xì)胞疾病或者自身免 疫病的方法，例如哺乳動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)或伴侶寵物如狗和貓，該方法包括將治療有效量 的本發(fā)明的抗CD20 MAb或其片段施用于受試者，該抗CD20 MAb或其片段配制在可藥用的 載體之中。該治療使用沒(méi)有結(jié)合治療試劑的“裸露的抗體”。“裸露的抗CD20抗體”的施用 可以通過(guò)同時(shí)或順次將治療有效量的另一種“裸露的抗體”施用于受試者來(lái)補(bǔ)充，另一種 “裸露的抗體”可與靶細(xì)胞表面上的另一種抗原結(jié)合或反應(yīng)，或者具有其他功能如MAb的Fc 部分中的效應(yīng)物功能，這種功能是治療性的，這些在此處進(jìn)行了討論。優(yōu)選的附加MAb為至 少一種選自下組MAb的人源化、嵌合型、人或鼠類(在非人動(dòng)物的情況下)MAb 與CD4、CD5、 CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、 CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUCl、la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基 因、癌基因產(chǎn)物或其組合反應(yīng)的MAb，并將其配制在可藥用的載體之中。單獨(dú)用裸露的抗CD20或者聯(lián)合上面討論的其他裸露的MAb進(jìn)行治療可以進(jìn)一步 地通過(guò)同時(shí)或順次施用治療有效量的至少一種治療試劑來(lái)補(bǔ)充，它們配制在可藥用的載體 之中。正如此處所討論的，治療試劑可以包括細(xì)胞毒性試劑、放射性標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)劑、激 素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。在另一種治療方法中，單獨(dú)用裸露的抗CD20或者聯(lián)合上面討論的其他裸露的MAb 進(jìn)行治療可以進(jìn)一步地通過(guò)同時(shí)或順次施用治療有效量的至少一種治療綴合物來(lái)補(bǔ)充， 它們?cè)诖颂庍M(jìn)行了描述并配制在可藥用的載體之中。治療綴合物的抗體組分含有至少一 種選自下組MAb的人源化、嵌合型、人或鼠類(對(duì)于非人的受試者)MAb 與CD4、CD5、CD8、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、 CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、ΗΜ1· 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、 P1GF、癌基因、癌基因產(chǎn)物或其組合反應(yīng)的MAb，并將其配制在可藥用的載體之中。正如此處 所討論的，治療試劑可以包括細(xì)胞毒性試劑、放射性標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、光活治療試劑 或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。正如此處所描述的，本發(fā)明特別地包括在受試者中治療B-細(xì)胞淋巴瘤或白血病
13或者自身免疫病的方法，該方法包括將治療有效量的抗體融合蛋白或其片段施用于受試 者，該抗體融合蛋白或其片段含有至少兩個(gè)本發(fā)明的抗CD20 MAb或其片段，或者含有至少 一種本發(fā)明的抗⑶20 MAb或其片段和至少一種附加的MAb，附加的MAb優(yōu)選地選自與⑶4、 CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、 CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、la、HMl. 24、HLA-DR、腱 生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產(chǎn)物或其組合反應(yīng)的MAb，它們配制在可藥用的載體之 中。該治療方法可以進(jìn)一步通過(guò)同時(shí)或順次將治療有效量的至少一種配制于可藥用 的載體之中的治療試劑施用于受試者來(lái)補(bǔ)充，其中治療試劑優(yōu)選地為細(xì)胞毒性試劑、放射 性標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。此外，抗體融合蛋白可以治療有效量的治療綴合物的形式同時(shí)或順次施用于受試 者，治療綴合物含有至少一種與至少一種治療試劑結(jié)合的MAb，其中綴合物的該MAb組分優(yōu) 選地含有至少一種選自下組MAb的人源化、嵌合型、人或鼠類(對(duì)于非人的受試者)MAb 與 CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19, CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HMl. 24,HLA-DR, 腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產(chǎn)物或其組合反應(yīng)的MAb，它們配制在可藥用的載體 之中?？贵w融合蛋白本身可以與治療試劑綴合，從而提供了一種載體來(lái)將多于一個(gè)的治療 試劑與抗體組分相連，這些治療試劑可以為不同的所述試劑的聯(lián)合或者同樣試劑的聯(lián)合， 例如兩個(gè)不同的治療放射性標(biāo)記。本發(fā)明也包括在受試者中診斷B-細(xì)胞淋巴瘤或白血病 的方法，該方法包括將含有本發(fā)明的與淋巴瘤或白血病細(xì)胞結(jié)合的抗CD20MAb或其片段或 者抗體融合蛋白或其片段的診斷綴合物施用于受試者的方法，例如哺乳動(dòng)物，包括人以及 家養(yǎng)和伴侶寵物如狗、貓、兔、豚鼠，其中抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段 與至少一種診斷試劑結(jié)合，它們配制在可藥用的載體之中。此處描述了有用的診斷試劑。2.定義在下面的描述中，使用了許多術(shù)語(yǔ)和提供了下面的定義來(lái)使得能夠容易理解本發(fā) 明。此處所述的抗體是指全長(zhǎng)的(即天然存在的或者通過(guò)正常免疫球蛋白基因片段 重組過(guò)程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或者免疫球蛋白分子的具有免疫活性 (即特異性結(jié)合)的部分如抗體片段?？贵w片段是抗體的一部分，例如F (ab丨)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等等。不 管結(jié)構(gòu)，抗體片段與被完整抗體所識(shí)別的同樣的抗原結(jié)合。例如，抗CD20單克隆抗體片段 與CD20的表位結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”也包括任何合成的或經(jīng)遺傳工程改造的蛋白質(zhì)，它們 像抗體一樣通過(guò)與特異性抗原結(jié)合從而形成復(fù)合物來(lái)起作用。例如，抗體片段包括分離得 到的由可變區(qū)組成的片段，如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段；重組單鏈多肽分子， 其中輕鏈和重鏈可變區(qū)由肽連接體相連(“scFv蛋白”)；和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基所 組成的最小識(shí)別單位?？寐兜目贵w一般是未與治療試劑綴合的完整抗體。之所以如此，是因?yàn)榭贵w分子 的Fc部分提供了效應(yīng)物功能如補(bǔ)體結(jié)合和ADCC(依賴抗體的細(xì)胞毒性)，其將機(jī)制轉(zhuǎn)化為 可能導(dǎo)致細(xì)胞裂解的作用?？墒?，F(xiàn)c部分可能對(duì)于具有其他機(jī)制的治療功能是不需要的，
14例如正在起作用的凋亡。裸露的抗體包括多克隆和單克隆抗體以及某些重組抗體，例如嵌 合型、人源化或人抗體。嵌合型抗體是含有包括來(lái)自一個(gè)物種的抗體互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)在內(nèi)的可變區(qū)的 重組蛋白質(zhì)，該抗體優(yōu)選為嚙齒動(dòng)物抗體，而抗體分子的恒定區(qū)來(lái)自人抗體的恒定區(qū)。對(duì) 于獸醫(yī)應(yīng)用，嵌合型抗體的恒定區(qū)可以來(lái)自其他物種，例如貓或狗。人源化抗體是重組蛋白質(zhì),其中將來(lái)自一個(gè)物種的抗體如嚙齒動(dòng)物抗體的⑶R從 嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移至人重鏈和輕鏈可變區(qū)中?？贵w分子的恒定區(qū)來(lái)自 人抗體的恒定區(qū)。人抗體是從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的抗體,這種小鼠已經(jīng)“經(jīng)過(guò)工稈改造”而可產(chǎn)生 對(duì)于抗原激發(fā)進(jìn)行反應(yīng)的特異性人抗體。在該技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件導(dǎo)入 來(lái)自這樣的胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中，即該胚胎干細(xì)胞系具有內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的 定向破裂。轉(zhuǎn)基因小鼠能夠合成對(duì)于人抗原特異的人抗體，這些小鼠可以用于產(chǎn)生分泌人 抗體的雜交瘤。用于從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法由下列學(xué)者進(jìn)行了描述，Green等 人，Nature Genet. 7 :13 (1994) ；Lonberg 等人，Nature 368:856(1994)；和 Taylor 等人， Int. Immun. 6 =579(1994)。完整的人抗體也可以通過(guò)遺傳或染色體轉(zhuǎn)染方法以及噬菌體 展示技術(shù)來(lái)構(gòu)建，這些技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。見(jiàn)例如，McCafferty等人，Nature 348 552-553(1990)描述了在體外從來(lái)自未免疫的供體的免疫球蛋白可變區(qū)基因庫(kù)中生產(chǎn)人抗 體和其片段。在該技術(shù)中，將抗體可變區(qū)基因按閱讀框架克隆進(jìn)絲狀噬菌體的主要或次要 的外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上作為功能性抗體片段進(jìn)行展示。因?yàn)榻z狀顆粒含 有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致對(duì)于編碼顯示出那 些特性的抗體的基因進(jìn)行選擇。以這種方式，噬菌體模擬了一些B-細(xì)胞的特性。噬菌體 展示可以多種形式來(lái)實(shí)施，對(duì)于其概況，見(jiàn)例如Johnson和Chiswell，Current Opinionin Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗體也可以由體外活化的B-細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。見(jiàn)U. S.專利號(hào)5，567，610和 5，229，275，在此以其整體進(jìn)行引用作為參考。治療試劑是與抗體部分分別、同時(shí)或順次施用或者與抗體部分綴合而講行施用的 分子或原子，抗體部分即為抗體或抗體片段或亞片段，這些試劑在疾病的治療中是有用的。 治療試劑的例子包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼化 合物、光活試劑或染料和放射性同位素。診斷試劑是與抗體部分綴合而講行施用的分子或原子，抗體部分即為抗體或抗 體片段或亞片段，這些試劑在通過(guò)定位含有抗原的細(xì)胞來(lái)診斷疾病中是有用的。有用的診 斷試劑包括放射性同位素、染料(例如具有生物素-鏈霉抗體生物素蛋白復(fù)合物)、造影 劑、熒光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑(例如順磁性離子)，但并不局限 于此。U.S.專利號(hào)6，331，175描述了 MRI技術(shù)和與MRI增強(qiáng)劑綴合的抗體的制備，在此 將其以整體進(jìn)行引用作為參考。優(yōu)選地，診斷試劑選自放射性同位素、用于磁共振成像的 增強(qiáng)劑和熒光化合物。為了向抗體組分加載放射性金屬或順磁性離子，可能需要將抗體與 具有長(zhǎng)尾的試劑進(jìn)行反應(yīng)，在長(zhǎng)尾上附加了多個(gè)用于結(jié)合離子的螯合基團(tuán)。這樣的尾可以 是聚合物，例如聚賴氨酸、多糖或者其他具有側(cè)鏈的衍生或可衍生的鏈，在這些側(cè)鏈上可以 結(jié)合螯合基團(tuán)如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、雙硫縮氨基脲、聚肟等等已知用于該目的的基團(tuán)。螯合物通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法與肽抗原偶 聯(lián)。螯合物通常通過(guò)能夠以最小的免疫反應(yīng)性損失和最小的聚合和/或內(nèi)部交聯(lián)與分子 形成鍵的基團(tuán)而與抗體相連。其他更不常見(jiàn)的用于將螯合物與抗體綴合的方法和試劑公開 于Hawthorne的U. S.專利4，824，659中，題目為“抗體綴合物”，其于1989年4月25日出 版，此處以其整體引用了該公開內(nèi)容作為參考。特別有用的金屬-螯合劑組合包括與位于 60-4，OOOkev的通常能量范圍內(nèi)的診斷同位素一起使用的2-芐基-DTPA和其單甲基與環(huán) 己基類似物，這些同位素例如為 125I、131I、123I、124I、62CU、64CU、18F、mIn、67Ga、68Ga、99mTC、94mTC、 "(:、13Ν、15Ο、76Βγ以用于放射性成像。當(dāng)與本發(fā)明的抗體一起使用時(shí)，與非放射性金屬如錳、 鐵和釓復(fù)合的同樣的螯合物可用于MRI。大環(huán)螯合物如ΝΟΤΑ、DOTA和TETA可使用多種金 屬和放射性金屬，最特別地分別使用鎵、釔和銅的放射性核素。這種金屬-螯合劑復(fù)合物可 以通過(guò)將環(huán)大小適合目標(biāo)金屬的大小而非常穩(wěn)定地形成。本發(fā)明也包括其他環(huán)型螯合物如 大環(huán)聚醚，其對(duì)于穩(wěn)定地結(jié)合核素如223Ra與RAIT具有重要的影響。免疫綴合物是抗體組分和治療或診斷試劑的綴合物。診斷試劑可以含有放射性或 非放射性標(biāo)記、造影劑(例如用于磁共振成像、計(jì)算斷層X(jué)射線照相法或者超聲波)，放射性 標(biāo)記可以為發(fā)射Y射線、β射線、α射線、俄歇電子或正電子的同位素。表汰載體是含有在宿主細(xì)胞中表汰的基因的DNA分子。通常地，將基因表達(dá)置于 某些調(diào)節(jié)元件的控制之下，包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)節(jié)元件和增強(qiáng)子。稱 這樣的基因“可操作地”與調(diào)節(jié)元件相連。重組宿主可以為任何含有克隆載體或表達(dá)載體的原核或真核細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包 括那些這樣的原核或真核細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，即它們經(jīng)過(guò)遺傳工程改造而在宿主細(xì)胞的 染色體或基因組或者宿主細(xì)胞的細(xì)胞中含有克隆基因。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括骨 髓瘤細(xì)胞如SP2/0細(xì)胞和NSO細(xì)胞，以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、雜交瘤細(xì)胞系和其他 用于表達(dá)抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。也是特別有用于表達(dá)MAb和其他融合蛋白的細(xì)胞為 WO 0063403Α2中所公開的人細(xì)胞系PER. C6，其與常規(guī)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如CH0、C0S、Vero、 Hela.BHK和SP2-細(xì)胞系相比可產(chǎn)生2-200倍更多的重組蛋白。具有經(jīng)修飾的免疫系統(tǒng)的 特殊轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)于產(chǎn)生完整的人抗體是特別有用的。在此處使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)抗體融合蛋白是重組產(chǎn)牛的抗原結(jié)合分子，在其中連接具有 相同或不同特異性的兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同的單鏈抗體或者抗體片段。融合蛋白的價(jià)表 明融合蛋白具有多少個(gè)與單個(gè)抗原或表位結(jié)合的臂或位點(diǎn)；即單價(jià)的、二價(jià)的、三價(jià)的或多 價(jià)的?？贵w融合蛋白的多價(jià)表示其能夠利用多重相互作用與抗原結(jié)合，因此增強(qiáng)與抗原結(jié) 合的親和力。特異性表明抗體融合蛋白能夠結(jié)合多少種抗原或表位；即單特異性的、雙特異 性的、三特異性的、多特異性的。使用這些定義，天然抗體如IgG是二價(jià)的，因?yàn)槠渚哂袃蓚€(gè) 結(jié)合臂，但是其是單特異性的，因?yàn)槠浣Y(jié)合一種表位。單特異性、多價(jià)融合蛋白對(duì)于一個(gè)表 位具有多于一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)，但是只結(jié)合一種表位，例如雙抗體具有兩個(gè)與同樣抗原反應(yīng) 的結(jié)合位點(diǎn)。融合蛋白可以含有單個(gè)抗體組分、不同抗體組分的多價(jià)或多特異性組合或者 同樣抗體組分的多重拷貝。融合蛋白可以附加地含有抗體或抗體片段和治療試劑。適合于 這種融合蛋白的治療試劑的例子包括免疫調(diào)節(jié)劑(“抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白”)和毒素 (“抗體-毒素融合蛋白”)。優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選為重組RNA酶。多特異件抗體是這樣的抗體，即其能夠同時(shí)結(jié)合至少兩個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)的目標(biāo),例如兩個(gè)不同的抗原、同一抗原上的兩個(gè)不同的表位或者半抗原和/或抗原或表位。一 種特異性可以是對(duì)于B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞抗原或表位。另一種 特異性可以是對(duì)于同一細(xì)胞類型上的不同抗原，例如B-細(xì)胞上的⑶20、⑶19、⑶21、⑶23、 ⑶46、⑶80、HLA-DR、⑶74、MUCl和⑶22。多特異性、多價(jià)抗體為具有多于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的 結(jié)構(gòu)物，這些結(jié)合位點(diǎn)具有不同的特異性。例如雙抗體，在其中一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與一個(gè)抗原反 應(yīng)，另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與其他抗原反應(yīng)。Mfimi^是能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)的目標(biāo)的抗體。雙特異性抗體 (bsAb)和雙特異性抗體片段(bsFab)具有至少一個(gè)特異地與例如B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、骨髓細(xì) 胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞抗原或表位結(jié)合的臂，和至少一個(gè)特異地與具有治療或診斷試劑的 可定向綴合物結(jié)合的其他臂。多種雙特異性融合蛋白可以通過(guò)分子工程來(lái)產(chǎn)生。在一種形 式中，雙特異性融合蛋白是單價(jià)的，其由例如具有對(duì)于一個(gè)抗原的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的scFv與 具有對(duì)于第二種抗原的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段組成。在另一種形式中，雙特異性融合蛋 白是二價(jià)的，其由例如具有對(duì)于一個(gè)抗原的結(jié)合位點(diǎn)的IgG與具有對(duì)于第二種抗原的兩個(gè) 結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)scFv組成。狗源化或貓?jiān)椿贵w為這樣的重組蛋白，即在其中將單克降抗體的嚙齒動(dòng)物(或 其他物種)互補(bǔ)決定區(qū)從嚙齒動(dòng)物(或其他物種)免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)中分別 轉(zhuǎn)移至狗或貓的免疫球蛋白可變區(qū)中。家養(yǎng)動(dòng)物包括大型動(dòng)物如馬、牛、綿羊、山羊、駱駝、羊駝和豬以及伴侶動(dòng)物。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，家養(yǎng)動(dòng)物是馬。伴侶動(dòng)物包括作為寵物飼養(yǎng)的動(dòng)物。這些動(dòng)物主要是狗和貓，雖然正如類人的靈 長(zhǎng)類動(dòng)物如猴包括在內(nèi)一樣，小型動(dòng)物如豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠和雪貂也包括在內(nèi)，。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，伴侶動(dòng)物為狗或貓。3.包括嵌合型、人源化和人抗體的單克隆抗體的制備單克隆抗體(MAb)對(duì)于特殊抗原的同型類群的抗體，這種抗體只含有一種類型的 抗原結(jié)合位點(diǎn)和只結(jié)合抗原決定簇上的一個(gè)表位。對(duì)于特異的抗原的嚙齒動(dòng)物單克隆抗 體可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法來(lái)獲得。見(jiàn)例如，Kohler和Milstein，Nature 256 :495 (1975)，和 Coligan 等人(編者)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, 2. 5. 1-2. 6. 7 頁(yè)(John ffiley&Sons 1991)[在下文中稱為 “Coligan” ]。簡(jiǎn)要地，單克隆抗 體可以通過(guò)下列步驟來(lái)獲得，即給小鼠注射含有抗原的組合物，通過(guò)取得血清樣品來(lái)證實(shí) 抗體產(chǎn)生的存在，摘除脾以獲得B-淋巴細(xì)胞，將B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交 瘤，克隆雜交瘤，選擇出產(chǎn)生抗抗原的抗體的陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生抗抗原的抗體的克隆，和 從雜交瘤培養(yǎng)物中分離得到抗體。MAb可以用多種完全確立的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化出來(lái)。這種分離 技術(shù)包括使用A蛋白瓊脂糖凝膠的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。見(jiàn)例如， Coligan在2. 7. 1-2. 7. 12頁(yè)和2. 9. 1-2. 9. 3頁(yè)所述。也可見(jiàn)Baines等人，免疫球蛋白G的純 化(Purification of Immunoglobulin G(IgG)),METHODS IN M0LECULARBI0L0GY,VOL. 10， 79-104 頁(yè)(Humana 出版社，1992)。在起始形成對(duì)于免疫原的抗體之后，抗體可以進(jìn)行測(cè)序并隨后用重組技術(shù)來(lái)制 備。鼠類抗體和抗體片段的人源化和嵌合化對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。 例如，人源化單克隆抗體通過(guò)下列步驟來(lái)產(chǎn)生，即將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)從小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)中轉(zhuǎn)移至人可變區(qū)中，然后在鼠類對(duì)應(yīng)物的構(gòu)架區(qū)中用人殘基取代。來(lái) 自人源化單克隆抗體的組分的使用避免了與鼠類恒定區(qū)的免疫原性相聯(lián)系的潛在問(wèn)題。已描述了用于克隆鼠免疫球蛋白樣可變區(qū)的一般技術(shù)，例如Orlandi等人，Proc. Nat，1 Acad. Sci.USA 86:3833(1989)的發(fā)表，此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。用于構(gòu) 建嵌合型抗體的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員是熟知的。作為一個(gè)例子，Leimg等人， Hybridoma 13 =469(1994)描述了它們是如何通過(guò)下列方法產(chǎn)生LL2嵌合體的，即將編碼 LL2單克隆抗體(抗CD22抗體)的Vk和Vh區(qū)域的DNA序列分別與人κ和IgG1恒定區(qū)區(qū) 域結(jié)合在一起。該文獻(xiàn)也提供了分別標(biāo)示為Vk和Vh的LL2輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序 列。已描述了產(chǎn)生人源化MAb的技術(shù)，例如Jone等人，Nature 321:522(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332:323(1988) ；Verhoeyen 等人，Science239 1534 (1988) ；Carter 等 人，Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA 89 4285(1992) ；Sandhu 等人，Crit. Rev. Biotech. 12 437(1992)；和Singer等人，J. Immun. 150 :2844 (1993)，在此處引用了其中的每一個(gè)文獻(xiàn) 作為參考。嵌合型抗體是這樣的重組蛋白，即其含有包括來(lái)自一種動(dòng)物如嚙齒動(dòng)物抗體的 CDR的可變區(qū)，而抗體分子的其余部分即恒定區(qū)來(lái)自人抗體。因此，嵌合型單克隆抗體也可 以通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)不同的人FR取代嵌合型MAb的可變區(qū)中的鼠類FR序列來(lái)進(jìn)行人源 化。特別地，將小鼠CDR從小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)中轉(zhuǎn)移至人抗體的相應(yīng)可 變區(qū)。因?yàn)楹?jiǎn)單地將小鼠⑶R轉(zhuǎn)移至人FR中常常導(dǎo)致抗體親和性的降低或者甚至是喪失， 所以可能需要附加的修飾以恢復(fù)鼠類抗體的原始親和性。這能夠伴隨著在FR區(qū)域中將一 個(gè)或多個(gè)人殘基用它們的鼠類對(duì)應(yīng)物進(jìn)行取代，以便獲得對(duì)于其表位具有良好的結(jié)合親和 性的抗體。見(jiàn)例如，Tempest 等人，Biotechnology 9 266(1991)和 Verhoeyen 等人，Science 239 =1534(1988) 0此外，人源化、嵌合型和人MAb對(duì)于特異表位的親和性可以通過(guò)⑶R的誘 變而得到增加，因此較低劑量的這種抗體可以與較高劑量的誘變之前的較低親和性MAb — 樣有效。見(jiàn)例如W00029584A1。用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的另一種方法為在轉(zhuǎn)基因家畜的乳汁中生產(chǎn)。見(jiàn)例如， Colman,A.，Biochem. Soc. Symp. ,63 :141_147，1998 ；U. S.專利 5，827，690，這兩個(gè)文獻(xiàn)以其 整體進(jìn)行引用作為參考。制備兩個(gè)DNA構(gòu)建體，其分別含有編碼成對(duì)的免疫球蛋白重鏈和 輕鏈的DNA片段。將DNA片段克隆進(jìn)表達(dá)載體中，該表達(dá)載體含有優(yōu)先地在乳腺上皮細(xì)胞 中表達(dá)的啟動(dòng)子序列。例子包括來(lái)自下列基因的啟動(dòng)子，即兔、奶牛和綿羊酪蛋白基因、奶 牛α-乳球蛋白基因、綿羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸性蛋白基因，但并不局限于此。 優(yōu)選地，插入片段在其3' —側(cè)與來(lái)自乳腺特異性基因的同源基因組序列相接。這提供了聚 腺苷酸化位點(diǎn)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的序列。將表達(dá)盒共注射進(jìn)受精的哺乳動(dòng)物卵細(xì)胞的原核中，然 后將卵細(xì)胞移植入受體雌性的子宮中并進(jìn)行孕育。在出生之后，通過(guò)Southern分析來(lái)確定 兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的存在以對(duì)于后代進(jìn)行篩選。為了產(chǎn)生抗體，重鏈和輕鏈基因必須在同一個(gè)細(xì) 胞中同時(shí)表達(dá)。用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法對(duì)于來(lái)自轉(zhuǎn)基因雌性動(dòng)物的乳汁進(jìn)行分 析，以確定抗體或抗體片段的存在和功能性。抗體可以用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從乳汁 中純化出來(lái)。本發(fā)明的完整的人抗體，即人抗CD20 MAb，或者其他與人源化、嵌合型或人抗 ⑶20抗體進(jìn)行聯(lián)合治療的人抗體，例如抗⑶22、抗⑶19、抗⑶23或抗⑶21 MAb，它們可以從轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物中獲得。見(jiàn)例如，Mendez等人，Nature Genetics，15 146-156 (1997)； U.S.專利號(hào)5，633，425，它們以其整體進(jìn)行引用作為參考。例如，人抗體可以從具有人免疫 球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中重新獲得。通過(guò)讓內(nèi)源免疫球蛋白基因失活和導(dǎo)入人免疫球 蛋白基因座而將小鼠體液免疫系統(tǒng)人源化。人免疫球蛋白基因座是極其復(fù)雜的，其具有大 量的不連續(xù)片段，這些片段在一起占據(jù)了人基因組的大約2%。為了確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn) 生足夠的抗體的所有組成部分，大部分的人重鏈和輕鏈基因座必須導(dǎo)入小鼠基因組中。這 在逐步的過(guò)程中來(lái)完成，該過(guò)程的開始是形成酵母人工染色體(YAC)，其在種系構(gòu)型中含有 人重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座。因?yàn)槊總€(gè)插入物的大小為大約1Mb，所以YAC的構(gòu)建需要 覆蓋免疫球蛋白基因座的片段的同源重組。將兩個(gè)YAC即一個(gè)含有重鏈基因座的YAC和一 個(gè)含有輕鏈基因座的YAC分別導(dǎo)入小鼠中，這是通過(guò)將含有YAC的酵母球芽和小鼠胚胎干 細(xì)胞融合來(lái)進(jìn)行的。然后將胚胎干細(xì)胞克隆微注射進(jìn)小鼠胚泡中。將結(jié)果所得的嵌合型雄 性根據(jù)它們通過(guò)其種系傳遞YAC的能力進(jìn)行篩選，并將它們與在鼠類抗體產(chǎn)生上有缺陷的 小鼠進(jìn)行交配。將兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行交配，即一個(gè)含有人重鏈基因座的品系和另一個(gè)含 有人輕鏈基因座的品系，從而形成可產(chǎn)生對(duì)于免疫作出反應(yīng)的人抗體的后代。更新近的用于產(chǎn)生雙特異性MAb的方法包括經(jīng)工程改造的重組MAb，其含有附 加的半胱氨酸殘基從而它們可比更普通的同型免疫球蛋白交聯(lián)得更加牢固。見(jiàn)例如， FitzGerald 等人，Protein Eng. 10(10) 1221-1225，1997。另一個(gè)方法為對(duì)于重組融合蛋 白進(jìn)行工程改造，該重組融合蛋白連接了兩個(gè)或更多個(gè)不同的具有所需的雙特異性的單鏈 抗體或抗體片段。見(jiàn)例如，Coloma等人，Nature Biotech. 15 159-163，1997。多種雙特異 性融合蛋白可以通過(guò)分子工程來(lái)產(chǎn)生。在一種形式中，雙特異性融合蛋白是單價(jià)的，其例 如由具有單個(gè)對(duì)于一個(gè)抗原的結(jié)合位點(diǎn)的scFv和具有單個(gè)對(duì)于第二種抗原的結(jié)合位點(diǎn)的 Fab片段組成。在另一種形式中，雙特異性融合蛋白是二價(jià)的，其例如由具有兩個(gè)對(duì)于一個(gè) 抗原的結(jié)合位點(diǎn)的IgG和具有兩個(gè)對(duì)于第二種抗原的結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)scFv組成。連接兩個(gè)或更多個(gè)不同的單鏈抗體或抗體片段的雙特異性融合蛋白以簡(jiǎn)單的方 式產(chǎn)生?？梢允褂弥亟M方法來(lái)產(chǎn)生多種融合蛋白。例如可以產(chǎn)生含有源自人源化單克隆抗 ⑶20抗體的Fab片段和源自鼠類抗diDTPA的scFv的融合蛋白。易彎曲的連接體如GGGS 將scFv與抗⑶20抗體的重鏈恒定區(qū)相連接。作為另一種選擇，scFv可以與另一個(gè)人源化 抗體的輕鏈恒定區(qū)相連接。將合適的對(duì)于重鏈Fd與scFv的框內(nèi)連接所必需的連接體序列 通過(guò)PCR反應(yīng)導(dǎo)入VL和VK區(qū)域中。然后將編碼scFv的DNA片段連接入含有編碼CHl區(qū) 域的DNA序列的分階段載體中。切除結(jié)果所得的scFv-CHl構(gòu)建體，并將其連接入另一個(gè)載 體中，該載體含有編碼抗CD20抗體的VH區(qū)域的DNA序列。4.抗體片段的產(chǎn)生識(shí)別特異表位的抗體片段可以用已知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。抗體片段為抗體的抗原結(jié) 合部分，例如F(ab' )2、Fab'、Fab、Fv、sFv等等。其他抗體片段包括可以通過(guò)用胃蛋白 酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab)' 2片段，和可以通過(guò)還原F(ab)' 2片段的二硫橋而產(chǎn)生 的Fab'片段，但并不局限于此。作為另一種選擇，可以構(gòu)建Fab'表達(dá)文庫(kù)(Huse等人， 1989，Science, 246 1274-1281)以使得能夠快速和容易地鑒定具有所希望的特異性的單 克隆Fab'片段。本發(fā)明包括抗體和抗體片段。單鏈Fv分子(scFv)具有VL區(qū)域和VH區(qū)域。VL和VH區(qū)域聯(lián)合在一起而形成靶結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)區(qū)域進(jìn)一步地用肽連接體(L)共價(jià)連接在一起。scFv分子在如果VL區(qū) 域?yàn)閟cFv分子的N末端部分時(shí)標(biāo)示為VL-L-VH，或者在如果VH區(qū)域?yàn)閟cFv分子的N末 端部分時(shí)標(biāo)示為VH-L-VL。用于制造scFv分子和設(shè)計(jì)合適的肽連接體的方法在下列文獻(xiàn) 中進(jìn)行了描述，即US專利號(hào)4，704, 692 ；US專利號(hào)4，946，778 ；R. Raag和M. Whitlow，單鏈 Fv (Single Chain Fvs), FASEB Vol 9:73-80(1995)；和 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker，單鏈抗體 可變區(qū)(Single ChainAntibody Variable Regions)，TIBTECH Vol 9:132-137(1991)。在 此處引用這些文獻(xiàn)作為參考?？贵w片段可以通過(guò)完整長(zhǎng)度的抗體的蛋白酶水解或者通過(guò)在大腸桿菌(E. coli) 或其他宿主中表達(dá)編碼該片段的DNA來(lái)制備。抗體片段可以常規(guī)方法通過(guò)完整長(zhǎng)度的抗體 的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化來(lái)獲得。例如，抗體片段可以此方式來(lái)產(chǎn)生，即用胃蛋白酶 酶切抗體從而提供標(biāo)示為F(ab'片段。該片段可以進(jìn)一步進(jìn)行切割，此時(shí)使用 硫醇還原試劑，和任選使用用于由于切割二硫鍵所產(chǎn)生的巰基的實(shí)心基團(tuán)，從而產(chǎn)生3. 5S Fab'單價(jià)片段。作為另一種選擇，使用木瓜蛋白酶的酶切直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和 Fc片段。已經(jīng)描述了這些方法，例如Goldenberg，U.S.專利號(hào)4，036，945和4，331，647 和其中所包含的文獻(xiàn)，在此處以其整體引用這些專利作為參考。此外，見(jiàn)Nisonoff等人， Arch Biochem. Biophys. 89 230 (1960) ；Porter, Biochem. J. 73 119 (1959) ；Edelman 等人， METHODS IN ENZYMOLOGYVol. 1,422 頁(yè)(Academic 出版社 1967)；禾口 Coligan, 2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 頁(yè)?？贵w片段的另一種形式為編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR是抗體可變區(qū) 的片段，其在結(jié)構(gòu)上與抗體所結(jié)合的表位是互補(bǔ)的，并比可變區(qū)的其他部分更加具有可變 性。因此，⑶R有時(shí)稱為高變區(qū)。一個(gè)可變區(qū)具有三個(gè)⑶R?？梢酝ㄟ^(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體 的CDR的基因來(lái)獲得CDR肽。這種基因可用下列方法來(lái)制備，例如使用聚合酶鏈反應(yīng)從 產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA來(lái)合成可變區(qū)。見(jiàn)例如，Larrick等人，Methods :A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991) ；Courtenay-Luck，單克隆抗體的遺傳操作(Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies), MONOCLONAL ANTIBODIES :PR0DUCTI0N, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(編者)，166-179頁(yè)(劍橋大學(xué)出版 社，1995)；和 Ward 等人，抗體的遺傳操作和表達(dá)(Genetic Manipulation and Expression of Antibodies) ,MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(編 者)，137-185 頁(yè)(Wiley-Liss 出版社，1995)。其他切割抗體的方法例如重鏈從單價(jià)輕-重鏈片段中的分離、片段的進(jìn)一步的切 割或者其他酶、化學(xué)或遺傳技術(shù)也可以使用，只要片段可與完整抗體所識(shí)別的抗原結(jié)合。5.多特異性和多價(jià)抗體也可以將此處描述的抗CD20抗體以及用于聯(lián)合治療的其他具有不同特異性的抗 體制成多特異性抗體(具有至少一個(gè)對(duì)CD20表位或者抗原的結(jié)合位點(diǎn)，和至少一個(gè)對(duì)CD20 上的另一個(gè)表位或者另一個(gè)抗原的結(jié)合位點(diǎn))和多價(jià)抗體(具有多個(gè)對(duì)于同一個(gè)表位或抗 原的結(jié)合位點(diǎn))。多價(jià)靶結(jié)合蛋白在US系列號(hào)09/911，610 (Leung等人)中進(jìn)行了描述， 在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。本發(fā)明提供了雙特異性抗體或抗體片段，其具有至少一個(gè)特異地與被定向的細(xì)胞 標(biāo)記相結(jié)合的結(jié)合區(qū)域，和至少一個(gè)特異地與可定向綴合物相結(jié)合的其他結(jié)合區(qū)域。可定向綴合物含有載體部分，該載體部分具有或帶有至少一個(gè)被至少一個(gè)雙特異性抗體或抗體 片段的結(jié)合區(qū)域所識(shí)別的表位?？梢允褂枚喾N重組方法來(lái)產(chǎn)生上述的雙特異性抗體和抗體片段?？笴D20多價(jià)抗體也在本發(fā)明的考慮之內(nèi)。該多價(jià)靶結(jié)合蛋白通過(guò)締合第一種和 第二種多肽來(lái)構(gòu)建。第一種多肽含有第一種單鏈Fv分子，其共價(jià)地與優(yōu)選為免疫球蛋白輕 鏈可變區(qū)的第一種免疫球蛋白樣區(qū)域相連接。第二種多肽含有第二種單鏈Fv分子，其共價(jià) 地與優(yōu)選為免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的第二種免疫球蛋白樣區(qū)域相連接。第一種和第二種單 鏈Fv分子中的每一個(gè)形成一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)，第一種和第二種免疫球蛋白樣區(qū)域締合形成 第三個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)。具有VL-L-VH構(gòu)型(其中L是連接體)的單鏈Fv分子可以締合具有VH_L_VL構(gòu) 型的另一個(gè)單鏈Fv分子來(lái)形成二價(jià)二聚體。在這種情況下，第一種scFv分子的VL區(qū)域和 第二種scFv分子的VH區(qū)域締合形成一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)，而第一種scFv的VH區(qū)域和第二種 scFv的VL區(qū)域締合形成另一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為CD20雙特異性、三價(jià)定向蛋白，其含有兩條非共價(jià)連 接的異源多肽鏈從而形成三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于一個(gè)目標(biāo)具有親和性， 第三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于半抗原具有親和性，該半抗原可制造出來(lái)并附著于用于診斷和/治療 試劑的載體上。優(yōu)選地，結(jié)合蛋白具有兩個(gè)CD20結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)CD22結(jié)合位點(diǎn)。雙特異 性、三價(jià)靶試劑具有兩個(gè)不同的scFv，一個(gè)scFv含有兩個(gè)Vh區(qū)域，該Vh區(qū)域來(lái)自一個(gè)通過(guò) 短連接體與另一個(gè)抗體的\區(qū)域相連的抗體，第二種scFv含有兩個(gè)\區(qū)域，該\區(qū)域來(lái) 自通過(guò)短連接體與其他抗體的Vh區(qū)域相連的第一種抗體。用于產(chǎn)生來(lái)自V1^n \區(qū)域的多 價(jià)、多特異性試劑的方法提供了，在宿主生物體中從DNA質(zhì)粒合成的單獨(dú)的鏈完全由 域組成(Vh-鏈)或者完全由\區(qū)域組成鏈)，以這種方式因此任何具有多價(jià)和多特異 性的試劑可以通過(guò)一個(gè)\-鏈和一個(gè)Vf鏈的非共價(jià)連接來(lái)產(chǎn)生。例如，為了形成三價(jià)、三 特異性試劑，Vh-鏈將由三個(gè)Vh區(qū)域的氨基酸序列組成，每個(gè)Vh區(qū)域來(lái)自具有不同特異性的 抗體，并且它們用可變長(zhǎng)度的肽連接體連接在一起；和鏈將由互補(bǔ)的\區(qū)域組成，它們 用與用于Vh-鏈的那些類似的肽連接體連接在一起。因?yàn)榭贵w的Vh和\區(qū)域以反平行的 方式締合，因此本發(fā)明中的優(yōu)選方法為鏈中的\區(qū)域以與Vh-鏈中的Vh區(qū)域相反的順 序排列。6.雙抗體、三抗體和四抗體本發(fā)明的抗⑶20抗體也可以用于制備功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)，也稱為 雙抗體，其可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用重組方法來(lái)產(chǎn)生。見(jiàn)例如，Mack等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :7021-7025，1995，此處引用了此文獻(xiàn)。例如，bscAb可通過(guò)此方法產(chǎn)生，即用重組 方法通過(guò)甘氨酸_絲氨酸連接體來(lái)連接兩個(gè)單鏈Fv片段。用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法來(lái)分離兩個(gè) 目標(biāo)抗體的V輕鏈(\)和V重鏈(Vh)區(qū)域。然后連接從每個(gè)雜交瘤中獲得的\和Vh cDNA 以在兩步融合PCR中形成單鏈片段。第一個(gè)PCR步驟導(dǎo)入(Gly4-Ser1)3連接體，第二個(gè)步 驟連接\和Vh擴(kuò)增子。然后將每個(gè)單鏈分子克隆進(jìn)細(xì)菌表達(dá)載體中。在擴(kuò)增之后，將一個(gè) 單鏈分子切除并亞克隆進(jìn)含有第二種目標(biāo)單鏈分子的另一個(gè)載體中。將結(jié)果所得的bscAb 片段亞克隆進(jìn)真核生物表達(dá)載體中。功能蛋白的表達(dá)可以通過(guò)將載體轉(zhuǎn)染進(jìn)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 細(xì)胞中來(lái)獲得。雙特異性融合蛋白以類似的方式制備。雙特異性單鏈抗體和雙特異性融合
21蛋白包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，人源化、嵌合型或人抗CD20單克隆抗體可以用于產(chǎn)生抗原特異性雙抗體、 三抗體和四抗體。單特異性雙抗體、三抗體和四抗體選擇性地結(jié)合靶抗原，由于分子上的 結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量增加了，因此對(duì)于靶細(xì)胞的親和力增加了，并且在所期望的位置上觀察到 更長(zhǎng)的保留時(shí)間。對(duì)于雙抗體來(lái)說(shuō)，使用這樣的兩條鏈，即其含有通過(guò)五個(gè)氨基酸殘基連接 體與人源化CD20 MAb的Vk多肽相連接的人源化CD20 MAb的Vh多肽。每條鏈形成人源化 CD20雙抗體的一半。在三抗體的情況下，使用這樣的三條鏈，即其含有不通過(guò)連接體與人源 化⑶20 MAb的Vk多肽相連接的人源化⑶20 MAb的Vh多肽。每條鏈形成h⑶20三抗體的 三分之一。此處描述的雙特異性雙抗體的最基本用途是預(yù)定向CD20陽(yáng)性腫瘤，以便隨后特 異地遞送診斷或治療試劑。這些雙抗體選擇性地結(jié)合靶抗原，這使得能夠增加親和力和在 所希望位置上出現(xiàn)更長(zhǎng)的保留時(shí)間。此外，將未結(jié)合抗原的雙抗體快速地從身體中清除，從 而將正常組織的暴露減少至最小。用于增加清除率的雙特異性抗體的點(diǎn)突變可以在Qu等 人的US臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/361，037中找到，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。用于親和力 增強(qiáng)的雙特異性雙抗體公開于US申請(qǐng)?zhí)?0/270, 071 (Rossi等人)、10/270，073 (Rossi等 人)和10/328，190 (Rossi等人)中，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。診斷和治療試劑 可以包括同位素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、綴合物、放射性核素和金屬。例如， 用于磁共振成像(MRI)的釓金屬。放射性核素的例子為225AC、18F、68Ga、67Ga、9°Y、86Y、mIn、 131I、125I、123I、99mTC、94mTC、186Re、188Re、177LU、62CU J4Ciu67Ciu212BL213Bd11C^ 13N、150、76Br 和 211At。其他放射性核素也可用作診斷和治療試劑，特別是那些在60-4，OOOkeV的能量范圍 內(nèi)的放射性核素。更近來(lái)的一段時(shí)間，也報(bào)道了具有雙特異性的四價(jià)串聯(lián)雙抗體(稱為tandab) (Cochlovius 等人，Cancer Research (2000) 60 :4336_4341)。雙特異性 tandab 是兩個(gè)同樣 的多肽的二聚體，每個(gè)多肽含有兩個(gè)不同抗體的四個(gè)可變區(qū)(VH1、VL1, VH2、Vj，它們以這樣 的方向進(jìn)行連接，即使得在自締合時(shí)容易形成兩個(gè)對(duì)于兩個(gè)不同特異性中的每個(gè)特異性的 潛在結(jié)合位點(diǎn)。7.綴合的多價(jià)和多特異性抗⑶20抗體在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，為綴合的多價(jià)抗C920抗體。附加的氨基酸殘基可 以添加至第一種或第二種多肽的N-或C-末端。附加的氨基酸殘基可以含有肽標(biāo)記、信號(hào) 肽、細(xì)胞因子、酶(例如激活前體藥物的酶)、激素、肽毒素如假單胞菌外毒素、肽藥物、細(xì)胞 毒性蛋白或其他功能蛋白。在此處使用時(shí)，功能蛋白是具有生物功能的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物、毒素、放射性化合物、酶、激素、細(xì)胞毒性蛋白、螯合物、 細(xì)胞因子和其他功能試劑可以與多價(jià)靶結(jié)合蛋白綴合，優(yōu)選地通過(guò)與多價(jià)靶結(jié)合蛋白的氨 基酸殘基側(cè)鏈的共價(jià)結(jié)合來(lái)進(jìn)行，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羥基基團(tuán)。多種常規(guī)的連接體 可以用于此目的，例如二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、雙(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳化二亞胺、 馬來(lái)酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等等。試劑與多價(jià)蛋白質(zhì)的綴合優(yōu)選地不會(huì)明顯 地影響蛋白質(zhì)與其目標(biāo)的結(jié)合特異性或親和性。在此處使用時(shí)，功能試劑是具有生物功能 的試劑。優(yōu)選的功能試劑為細(xì)胞毒性試劑。在另外其他的實(shí)施方案中，由雙特異性抗體引導(dǎo)的治療劑或前體藥物聚合物向體
22內(nèi)目標(biāo)的遞送可以與放射性核素的雙特異性抗體遞送相聯(lián)合，因此獲得聯(lián)合的化療和放射 免疫治療。每個(gè)治療劑可以與可定向的綴合物相綴合和同時(shí)施用，或者核素可以作為第一 種可定向綴合物的一部分而給予，并且藥物可以作為第二種可定向綴合物的一部分而在后 面的步驟中給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性試劑可以與聚合物載體綴合，該聚合物載體可以 隨后與多價(jià)靶結(jié)合蛋白綴合。對(duì)于此目的，見(jiàn)Ryser等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,75 3867-3870，1978 ；US專利號(hào)4，699，784 ；和US專利號(hào)4，046，722，此處引用這些文獻(xiàn)作為參 考。綴合優(yōu)選地不會(huì)明顯地影響多價(jià)結(jié)合蛋白的結(jié)合特異性和親和性。8.對(duì)于治療和診斷的人源化、嵌合型和人抗體的使用人源化、嵌合型和人單克隆抗體即此處描述的抗CD20 MAb和其他MAb，根據(jù)本發(fā) 明它們適合用于治療方法和診斷方法。因此，本發(fā)明考慮了作為裸露的抗體單獨(dú)施用本發(fā) 明的人源化、嵌合型和人抗體，或者作為多模式治療進(jìn)行施用，這是在時(shí)間上依照給藥方案 來(lái)完成的，而不是與治療試劑相綴合。裸露的抗CD20 MAb的效能可以通過(guò)下列方法來(lái)增 強(qiáng)，也就是說(shuō)通過(guò)補(bǔ)充一種或多種其他裸露的抗體，即對(duì)于特異抗原如⑶4、⑶5、⑶8、⑶14、 CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD 37、CD 38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、 CD74、CD80、CD126、B7、MUCK la、HMl. 24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產(chǎn) 物或其組合的MAb ；用一種或多種抗CD20或?qū)τ谶@些所述抗原的抗體的免疫綴合物，它們 綴合了治療試劑，包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、治療放射性核素等等；用一種或多種 治療試劑，包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、治療放射性核素等等，其根據(jù)規(guī)定的給藥方 案與MAb同時(shí)或順次施用。優(yōu)選的B-細(xì)胞抗原包括那些等同于人⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、 ⑶23、⑶46、⑶52、CD74、⑶80和⑶5抗原的抗原。優(yōu)選的T-細(xì)胞抗原包括那些等同于人 ⑶4、⑶8和⑶25 (IL-2受體)抗原的抗原。等同于HLA-DR抗原的等同物可以用于治療 B-細(xì)胞和T-細(xì)胞紊亂。特別優(yōu)選的B-細(xì)胞抗原為那些等同于人⑶19、⑶22、⑶21、⑶23、 ⑶74、⑶80和HLA-DR抗原的抗原。特別優(yōu)選的T-細(xì)胞抗原為那些等同于人⑶4、⑶8和 CD25抗原的抗原。CD46是癌細(xì)胞表面上的抗原，其阻斷依賴補(bǔ)體的裂解(CDC)。此外，本發(fā)明考慮了在B-細(xì)胞淋巴瘤和其他疾病或紊亂中施用免疫綴合物以用 于診斷和治療。在此處使用時(shí)，免疫綴合物為含有抗體組分和治療或診斷試劑的分子，包括 可以承載診斷或治療試劑的肽。免疫綴合物保持了抗體組分的免疫反應(yīng)性，即抗體部分在 綴合之后具有與綴合之前大致同樣的或輕微減弱的結(jié)合同類抗原的能力。許多種診斷和治療試劑可以有利地與本發(fā)明的抗體綴合。此處所述的治療試劑是 那些也可用于與上述裸露的抗體分開施用的試劑。治療試劑例如包括化療藥物如長(zhǎng)春花 生物堿、蒽環(huán)類、表鬼白毒素、紫杉烷、抗代謝試劑、烷基化試劑、抗激酶試劑、抗生素、Cox-2 抑制劑、抗有絲分裂試劑、抗血管生成試劑和細(xì)胞凋亡試劑，特別是阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉 醇、CPT-11、喜樹堿，和其他來(lái)自這些和其他類型的抗腫瘤試劑的試劑等等。其他可用于制 備免疫綴合物和抗體融合蛋白的癌癥化療藥物包括氮芥、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、 葉酸類似物、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉬配位復(fù)合物、激素等等。合適的化 療試劑描述于下列文獻(xiàn)中，即REMINGTON，SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack出版 公司，1995)，和 GOODMAN AND GILMAN' S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 第7版(Ma cMillan出版公司，1985)，以及這些出版物的修改版本。其他合適的化療試劑例如實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。另外，螯合劑例如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或者合適的肽，在其上可以綴合可檢 測(cè)的標(biāo)記如熒光分子或者細(xì)胞毒性試劑如中金屬或放射性核素。例如，治療上有用的免 疫綴合物可以通過(guò)將光活試劑或染料與抗體合成物綴合而獲得。熒光組合物，例如熒光 染料和其他發(fā)色團(tuán)或染料如對(duì)于可見(jiàn)光敏感的卟啉，它們已經(jīng)用于通過(guò)將合適的光導(dǎo)向 病灶來(lái)檢測(cè)和治療損傷。在治療上，這稱為光輻射、光治療或光動(dòng)態(tài)治療(Jori等人(編 者)，PH0T0DYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHERDISEASES(Libreria Progetto 1985)； van den Bergh, Chem. Britain 22:430(1986))。此外，單克隆抗體已經(jīng)與光活化染料進(jìn) 行偶聯(lián)以獲得光治療。Mew 等人，J. Immunol. 130 =1473(1983)；同作者，CancerRes. 45 4380 (1985) ；Oseroff 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 8744 (1986)；同作者，Photochem. Photobiol. 46 83 (1987) ；Hasan 等人，Prog. Clin. Biol. Res. 288 471 (1989) ；Tatsuta 等 人，Lasers Surg. Med. 9 422(1989) ；Pelegrin 等人，Cancer 67 :2529 (1991)。可是，這些早 期的研究沒(méi)有包括內(nèi)窺鏡治療應(yīng)用的使用，尤其是在使用抗體片段或亞片段的情況下。因 此，本發(fā)明考慮了含有光活試劑或染料的免疫綴合物的治療使用。本發(fā)明也考慮了使用放射性和非放射性試劑作為診斷試劑。合適的非放射性診 斷試劑為適合于磁共振成像、計(jì)算斷層X(jué)射線照相法或者超聲波的造影劑。磁成像試劑 例如包括非放射性金屬如錳、鐵和釓，當(dāng)它們單獨(dú)與本發(fā)明的抗體一起使用時(shí)，它們以含有 2-芐基-DTPA和其單甲基與環(huán)己基類似物的金屬_螯合劑組合形式進(jìn)行復(fù)合。見(jiàn)在2001 年10月10日提交的U. S.系列號(hào)09/921，290，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。此外，放射性標(biāo)記的抗體或免疫綴合物可以含有用于診斷成像的發(fā)射Y射線的 放射性同位素或者正電子放射體。合適的放射性同位素特別是在60-4，OOOkeV的能量范 圍內(nèi)的放射性同位素包括 131I、123I、124I、^,^,^^"in.^Ga.^Ga.^Tc.^Tc,18F^11C, 13N^15Oj5Br等等。見(jiàn)例如，標(biāo)題為“用鎵-68標(biāo)記定向試劑(Labeling TargetingAgents with Gallium-68)，，的U. S.專利申請(qǐng)(U. S.臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/342，104)，其發(fā)明者為 G. L. Griffiths和W. J. McBride,此文獻(xiàn)公開了用于成像目的的正電子放射體如18F、68Ga、 94mTc等等，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。特別有用的治療放射性核素包括32P、33P、 47Sc^64Ciu67Ciu67GdlllAgjllIrK125LmLi42PiN153SnK161TlK 166Dy、166Ho、177Liu 186Re、188Re、 189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac,但并不局限于此。特別有用的診斷/檢測(cè)放射性核 素包括 18F、52Fe、62CU、64CU、67CU、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTC、94TC、99mTC、mIn、123I、124I、125I、131I、 154_158Gd、32P、9°Y、188Re 和 175Lu,但并不局限于此。毒素例如假單胞菌外毒素也可以與本發(fā)明抗CD20抗體的抗體融合蛋白的治療 試劑部分進(jìn)行復(fù)合或形成治療試劑部分。在制備這種綴合物或其他融合蛋白中適合使 用的其他毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒 素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。見(jiàn) 例如，Pastan 等人，Cell 47:641(1986)；和 Goldenberg 等人，CA-A Cancer Journal for Clinicians 44 :43 (1994)。另外適合于在本發(fā)明中使用的毒素對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)是已知的，并公開于U. S.專利6，077，499之中，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。免疫調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞因子也可以與抗體融合蛋白的治療試劑部分進(jìn)行綴合或形成 治療試劑部分，或者與本發(fā)明的人源化抗CD20抗體一起施用。用于本發(fā)明的合適的細(xì)胞因子包括下述的干擾素和白細(xì)胞介素，但并不局限于此。寡核苷酸，例如在U. S. 5，734，033 (Reed)中所述的抑制bcl_2表達(dá)的反義分子，在 此處以其整體引用該文獻(xiàn)作為參考，這些寡核苷酸也可以與抗體融合蛋白的治療試劑部分 進(jìn)行綴合或形成治療試劑部分，或者與本發(fā)明的人源化抗CD20抗體一起施用。9.免疫綴合物的制備任何本發(fā)明的抗體或抗體融合蛋白可以與一個(gè)或多個(gè)治療或診斷試劑綴合。一般 地，一種治療或診斷試劑附著于每個(gè)抗體或抗體片段上，但多于一種的治療試劑或診斷試 劑可以附著于同一個(gè)抗體或抗體片段上。本發(fā)明的抗體融合蛋白含有兩個(gè)或更多個(gè)抗體或 其片段，每個(gè)構(gòu)成該融合蛋白的抗體可以含有治療試劑或診斷試劑。另外，一個(gè)或多個(gè)抗體 融合蛋白的抗體可以附著多于一種的治療或診斷試劑。此外，治療試劑不需要是同樣的，而 可以是不同的治療試劑。例如，可以在同一個(gè)融合蛋白上附著藥物和放射性同位素。特別 地，IgG可以用131I進(jìn)行放射性標(biāo)記并附著在藥物上?？梢詫?31I引入IgG的酪氨酸中，和 將藥物連接到IgG賴氨酸的ε氨基上。治療和診斷試劑也可以連接至還原的SH基團(tuán)和糖 側(cè)鏈上。適合用于處理疾病組織的放射性核素基本上通過(guò)放射β-粒子來(lái)衰變，其包括 32P, 33P, 47Sc, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 75Se, 77As, 89Sr, 90Y, 99Mo, 105Rh,109Pd^111Ag,125!,1311,142Pr,143Pr, 149Pm、153Sm、161Tb、166H0、169Er、177LU、186Re、188Re、189Re、194Ir、198AU、199AU、211Pb、212Pb 和 213Bi, 但并不局限于此。有用的放射粒子的核素的最大衰變能量?jī)?yōu)選為20-5，OOOkeV，更 優(yōu)選為100-4，OOOkeV,最優(yōu)選為500-2，500keV。基本上通過(guò)放射俄歇粒子進(jìn)行衰變的 核素也是優(yōu)選的。例如，58Co、67Ga、80mBr,99mTc, 103mRh, 109Pt,111 In,119Sb,1251,161Ho, 189mOs 和 192Ir。有用的放射俄歇粒子的核素的衰變能量?jī)?yōu)選為< 1，OOOkeV，更優(yōu)選為< lOOkeV， 最優(yōu)選為<70keV?；旧贤ㄟ^(guò)產(chǎn)生α-粒子來(lái)進(jìn)行衰變的核素也是優(yōu)選的。這種核素 包括 152Dy、211At、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、225Ac、221Fr、217At、213Bi 和 255Fm,但并不局限于 此。有用的放射α-粒子的放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選為2，000-10，OOOkeV，更優(yōu)選為 3，000-8，OOOkeV，最優(yōu)選為 4，000-7，OOOkeV0利用Y-射線檢測(cè)而用作診斷試劑的放射性核素包括51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、 67Ga、75Se、97RU、99mTC、mIn、114mIn、123I、125I、131I、169yb、197Hg 和 2(I1T1，但并不局限于此。有用的 發(fā)射Y -射線的放射性核素的衰變能量?jī)?yōu)選為20-2，OOOkeV,更優(yōu)選為60-600keV，最優(yōu)選 為 100-300keV。用于正電子放射型斷層X(jué)射線照相法的放射性核素包括18F、51Mn、52mMru52Fe、55Co、 62CU、64CU、68Ga、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、89Zr,94mTc,110In,120I 和 1241，但并不局限于此。 有用的發(fā)射正電子的放射性核素的總衰變能量?jī)?yōu)選為< 2，OOOkeV，更優(yōu)選為< 1，OOOkeV， 最優(yōu)選為< 700keV。本發(fā)明的雙特異性抗體可用于預(yù)定向方法中，其提供了一種優(yōu)選的方式來(lái)將兩 個(gè)治療試劑或兩個(gè)診斷試劑遞送給受試者。U. S.系列號(hào)09/382，186和09/337，756公開 了用雙特異性抗體進(jìn)行預(yù)定向的方法，其中雙特異性抗體用125I進(jìn)行標(biāo)記并遞送給受試 者，隨后遞送用99mTc標(biāo)記的二價(jià)肽，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。預(yù)定向方法也描 述于下列文獻(xiàn)中，即US系列號(hào)09/823，746 (Hansen等人)和10/150，654 (Goldenberg等 人)，以及2003年1月31日提交的US臨時(shí)申請(qǐng)，其標(biāo)題為“用于治療和診斷試劑的施用白勺方法禾口組合物(Methods andCompositions for Administration of Therapeutic and DiagnosticAgents) ”，代理記錄號(hào)018733/1103 (McBride等人)，這些文獻(xiàn)也都在此處以其 整體進(jìn)行引用作為參考。遞送導(dǎo)致對(duì)于125I和99mTc的良好的腫瘤/正常組織比例，因此顯 示出兩個(gè)診斷放射性同位素的效用。已知的治療試劑或診斷試劑的任何聯(lián)合可以用于標(biāo)記 抗體和抗體融合蛋白。MAb綴合物的抗體組分的結(jié)合特異性、治療試劑或診斷試劑的效能 和抗體Fc部分的效應(yīng)物活性可以通過(guò)綴合物的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試來(lái)測(cè)定。本發(fā)明涉及用于在患有B-細(xì)胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中預(yù)定向 細(xì)胞的方法，其包括(i)施用具有多特異性的抗體融合蛋白或其片段，其具有至少一個(gè)特異地結(jié)合 細(xì)胞的臂和至少另一個(gè)特異地結(jié)合可定向綴合物的臂；(ii)任選，向患者施用清除組合 物，從而使得能夠讓該組合物從循環(huán)系統(tǒng)中清除未結(jié)合抗原的抗體融合蛋白或其片段；和 (iii)向患者施用含有載體部分的可定向綴合物，載體部分具有或帶有至少一個(gè)可被抗體 融合蛋白或其片段的至少另一個(gè)臂所識(shí)別的表位，并將載體部分與至少一種第一治療或診 斷試劑綴合。本發(fā)明的抗體融合蛋白應(yīng)當(dāng)是多特異性的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體 為雙特異性抗體，并可以為雙抗體。第一治療試劑選自放射性標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、光活 治療試劑、細(xì)胞毒性試劑、寡核苷酸及其組合，和其中的第一診斷試劑為放射性標(biāo)記、光活 診斷試劑或非放射性標(biāo)記中的至少一種。抗體融合蛋白或其片段也可以與第二治療試劑綴 合，例如至少一種放射性標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、光活治療試劑、細(xì)胞毒性試劑、寡核苷酸 及其組合，或者可以與第二診斷試劑綴合，例如放射性標(biāo)記、光活診斷試劑或非放射性標(biāo)記 中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二治療試劑或診斷試劑是相同的。治療或診斷試劑可以通過(guò)二硫鍵的形成而附著于還原的抗體組分的鉸鏈區(qū)。作 為另一種選擇，這樣的肽可以通過(guò)使用異雙功能交聯(lián)劑而附著于抗體組分上，例如N-琥 珀?；?3-(2_ 吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。Yu 等人，Int. J. Cancer 56:244(1994)。用 于這種綴合的一般性技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。見(jiàn)例如，Wong，CHEMISTRY 0FPR0TEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC 出版社，1991) ；Upeslacis 等人，用化學(xué)方法修飾 抗體(Modification of Antibodiesby Chemical Methods)，MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS，Birch 等人(編者)，187-230 頁(yè)(Wiley-Liss 公司，1995)； Price，合成月太來(lái)源的抗體的產(chǎn)生禾口表征(Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies)， MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter等人(編者)，60-84頁(yè)(劍橋大學(xué)出版社，1995)。作為另 一種選擇，治療或診斷試劑可以通過(guò)抗體Fc區(qū)域中的糖部分進(jìn)行綴合。糖基團(tuán)可以用于增 加與硫羥基結(jié)合的同樣肽的加載，或者糖部分可以用于結(jié)合不同的肽。通過(guò)抗體糖部分將肽與抗體組分綴合的方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟 知的。見(jiàn)例如，Shih 等人，Int. J. Cancer 41:832(1988) ；Shih 等人，Int. J. Cancer 46: 1101(1990)；和Shih等人，U.S.專利號(hào)5，057，313，所有這些文獻(xiàn)在此處以其整體進(jìn)行引 用作為參考。一般的方法包括將具有氧化的糖部分的抗體組分與載體聚合物反應(yīng)，該載體 聚合物具有至少一個(gè)游離胺功能基團(tuán)并加載大量的肽。該反應(yīng)導(dǎo)致起始的席夫堿(亞胺) 鍵，其可以通過(guò)還原成二級(jí)胺而穩(wěn)定下來(lái)，從而形成最終的綴合物。如果用作免疫綴合物的抗體組分的抗體是抗體片段，那么Fc區(qū)域是不存在的。可
26是，向完整長(zhǎng)度的抗體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)中引入糖部分是可能的。見(jiàn)例如，Leimg等 人，J. Immunol. 154 :5919 (1995) ；Hansen 等人，U. S.專利號(hào) 5，443，953 (1995) ；Leung 等人， U.S.專利號(hào)6，254，868，所有這些文獻(xiàn)在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。經(jīng)工程改造的 糖部分用于附著治療或診斷試劑。10.可藥用的賦形劑將要遞送給受試者的人源化、嵌合型和人抗CD20 MAb可以由單獨(dú)的MAb、免疫綴 合物、融合蛋白組成，或者可以含有一種或多種藥物上合適的賦形劑、一種或多種附加成分 或者這些的一些聯(lián)合。本發(fā)明的免疫綴合物或裸露的抗體可以根據(jù)已知用于制備藥物上有用的組合物 的方法來(lái)進(jìn)行配制，其中將免疫綴合物或裸露的抗體結(jié)合入具有藥物上合適的賦形劑的混 合物中。無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥物上合適的賦形劑的一個(gè)例子。其他合適的賦形劑對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。見(jiàn)例如，Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第五版(Lea&Febiger 1990)；和 Gennaro (編者)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack出版公司，1990)；以及它們的修改版本。本發(fā)明的免疫綴合物或裸露的抗體可以配制成用于通過(guò)例如快速注射或持續(xù)輸 注的靜脈內(nèi)施用。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體在小于大約4小時(shí)的期間內(nèi)進(jìn)行輸注，更優(yōu)選地在 小于大約3小時(shí)的期間內(nèi)進(jìn)行輸注。例如，第一次25-50mg可以在30分鐘內(nèi)進(jìn)行輸注，優(yōu) 選地甚至在15分鐘內(nèi)，剩余的在接下來(lái)的2-3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行輸注。用于注射的配劑可以存在 于單位劑量形式中，例如存在于安瓿或多次劑量容器中，其中具有添加的防腐劑。組合物可 以采取這樣的形式，即在油性或含水載體中的懸浮液、溶液或乳濁液，并且可以含有配制試 劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/分散劑。作為另一種選擇，活性成分可以存在于粉末形式中，并在 使用之前與合適的載體如經(jīng)滅菌的無(wú)熱原的水進(jìn)行組合?？梢允褂昧硗獾乃帉W(xué)方法來(lái)控制治療或診斷試劑或者裸露的抗體的作用持續(xù)時(shí) 間。可控釋放制劑可以通過(guò)使用聚合物來(lái)復(fù)合或吸收免疫綴合物或者裸露的抗體而進(jìn)行制 備。例如生物相容的聚合物包括聚(亞乙基-共_乙酸乙烯酯)的基質(zhì)，和硬脂酸二聚體與 癸二酸的聚酸酐共聚物的基質(zhì)。Sherwood等人，Bio/Technology 10:1446(1992)。免疫綴 合物或抗體從這種基質(zhì)上的釋放速率取決于免疫綴合物或抗體的分子量、基質(zhì)中免疫綴合 物或抗體的數(shù)量和分散顆粒的大小。Saltzman等人，Biophys. J. 55 =163(1989) ；Sherwood 等人，如上。其他固體的劑量形式描述于下列文獻(xiàn)中，即Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第五版(Lea&Febiger 1990)；和 Gennaro (編 者)，REMINGTON，SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版(Mack 出版公司，1990)；以及它們的 修改版本。免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸露的抗體也可以經(jīng)過(guò)皮下或者甚至經(jīng)過(guò)其他腸胃 外途徑施用于哺乳動(dòng)物。此外，施用可以是持續(xù)的輸注或單次或多次快速注射。優(yōu)選地， 本發(fā)明的抗體在小于大約4小時(shí)的期間內(nèi)進(jìn)行輸注，更優(yōu)選地在小于大約3小時(shí)的期間內(nèi) 進(jìn)行輸注。這優(yōu)選地通過(guò)在開始時(shí)緩慢地進(jìn)行輸注來(lái)實(shí)施。例如，在15-30分鐘內(nèi)輸注 25-50mg的劑量，和在2-3小時(shí)以內(nèi)的期間內(nèi)輸注剩余的劑量。一般地，施用于人的免疫綴 合物、融合蛋白或裸露的抗體的劑量會(huì)依賴于這些因素而變化，即患者的年齡、體重、身高、 性別、通常的醫(yī)學(xué)狀況和以前的醫(yī)療史。通常地，希望提供接受一定劑量的免疫綴合物、融合蛋白或裸露的抗體的受體，該劑量在單次靜脈內(nèi)輸注時(shí)位于大約lmg/kg-20mg/kg的范 圍內(nèi)，雖然當(dāng)情況要求時(shí)更低或更高的劑量也是可以進(jìn)行施用的。因此，對(duì)于70kg的患 者施用l_20mg/kg的劑量，例如對(duì)于1. 7m的患者施用70_1，400mg或41_824mg/m2的劑量。 當(dāng)需要時(shí)該劑量可以重復(fù)，例如，在4-10周內(nèi)每周一次，優(yōu)選地在8周內(nèi)每周一次，更優(yōu)選 地在4周內(nèi)每周一次。也可以更少的頻率進(jìn)行施用，例如在幾個(gè)周內(nèi)每隔一周一次。更特 別地，本發(fā)明的抗體如裸露的抗⑶20可以每2或3周一劑進(jìn)行施用，并總共重復(fù)至少3齊IJ。 本發(fā)明的抗體可以在4-8周內(nèi)每周施用一次，這也是優(yōu)選的。換句話說(shuō)也就是，如果劑量減 少至大約200-300mg/m2 (即對(duì)于1. 7m的患者每劑有340mg，或者對(duì)于70kg的患者以4. 9mg/ kg進(jìn)行施用)，可以在4-8周內(nèi)每周施用一次。作為另一種選擇，劑量計(jì)劃表可以減少，即 在2-3個(gè)月內(nèi)每2或3周施用一次；例如，如果劑量為300-500mg/m2(即對(duì)于1. 7m的患者 施用510-850mg，或者對(duì)于70kg的患者以7. 3_12mg/kg進(jìn)行施用)。給藥計(jì)劃表可以任選 以其他的間隔進(jìn)行重復(fù)，劑量可以通過(guò)多種腸胃外途徑而給予，這是在伴隨著劑量和計(jì)劃 表的適當(dāng)調(diào)整的情況下進(jìn)行的。對(duì)于治療目的，將免疫綴合物、融合蛋白或裸露的抗體以治療有效量施用于哺乳 動(dòng)物。對(duì)于本發(fā)明合適的受試者通常是人，雖然非人的動(dòng)物受試者也在考慮之內(nèi)。如果所施 用的數(shù)量在生理上是顯著的，那么將抗體制劑稱為以“以治療有效量”進(jìn)行施用。如果一種 試劑的存在導(dǎo)致受體哺乳動(dòng)物生理上的可檢測(cè)的變化，那么該試劑在生理上是顯著的。特 別地，如果本發(fā)明的抗體制劑的存在引起抗腫瘤反應(yīng)或者減輕自身免疫病狀態(tài)的病征和癥 狀，那么其在生理上是顯著的。生理上顯著的效應(yīng)也可以是在受體哺乳動(dòng)物中激發(fā)體液和 /或細(xì)胞免疫反應(yīng)。11.治療方法本發(fā)明考慮了將本發(fā)明的裸露的抗CD20抗體用作用于治療B-細(xì)胞紊亂和其他疾 病的的主要組合物。特別地，此處描述的組合物對(duì)于治療下列疾病是特別有用的，即多種自 身免疫病，以及無(wú)痛感形式的B-細(xì)胞淋巴瘤、侵染形式的B-細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白 血病、急性淋巴細(xì)胞白血病和Wa 1 dens t Γδιη，s巨球蛋白血癥。例如，人源化抗⑶20抗體 組分和免疫綴合物可以用于治療無(wú)痛感和侵染形式的非Hodgkin’ S淋巴瘤。用于治療的組合物單獨(dú)含有至少一種人源化、嵌合型或人單克隆抗CD20抗體，或 者還聯(lián)合含有其他抗體如其他人源化、嵌合型或人抗體、治療試劑或者免疫調(diào)節(jié)劑。特別 地，用完整的人抗體進(jìn)行聯(lián)合治療也在考慮之內(nèi)，其是通過(guò)上述的方法來(lái)進(jìn)行的。對(duì)于相同或不同的表位或抗原的裸露或綴合的抗體也可以與一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明 的抗體聯(lián)合。例如，人源化、嵌合型或人裸露的抗CD20抗體可以與另一個(gè)裸露的人源化、裸 露的嵌合型或裸露的人抗CD20抗體聯(lián)合，人源化、嵌合型或人裸露的抗CD20抗體可以與抗 CD20免疫綴合物聯(lián)合，裸露的抗CD20抗體可以與抗CD22放射性綴合物聯(lián)合，或者裸露的抗 CD22抗體可以與人源化、嵌合型或人抗CD20抗體聯(lián)合，該人源化、嵌合型或人抗CD20抗體 綴合了同位素或者一個(gè)或多個(gè)化療試劑、細(xì)胞因子、毒素或其組合。在本發(fā)明中也可以使用 人源化、嵌合型或人CD20抗體和毒素或免疫調(diào)節(jié)劑的融合蛋白，或者至少兩個(gè)不同的B-細(xì) 胞抗體(例如CD20和CD22 MAb)的融合蛋白。上面已經(jīng)列出了許多不同的抗體組合，它們 指向至少兩個(gè)不同的B-細(xì)胞紊亂相關(guān)抗原，可以將它們以下列形式進(jìn)行構(gòu)建，即裸露的抗 體或者部分裸露和部分與治療試劑或免疫調(diào)節(jié)劑綴合，或者只與另一個(gè)治療試劑聯(lián)合，例
28如細(xì)胞毒性藥物或具有放射性的試劑。在此處使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素如腫 瘤壞死因子(TNF)和造血因子如白細(xì)胞介素(例如白細(xì)胞介素-I(IL-l)、IL-2、IL-3、IL-6、 IL-10、IL-12、IL-21和IL-18)、集落刺激因子(例如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì) 胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、-β和-Y)、稱為“Si因 子”的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素和血小板生成素。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的例子包括 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α 等等。作為另一種選擇，受試 者可以接受裸露的抗CD20抗體和分開施用的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以在施用裸露的 抗CD20抗體之前、同時(shí)或之后進(jìn)行施用。正如上面所討論的，抗CD20抗體也可以與免疫調(diào) 節(jié)劑綴合。免疫調(diào)節(jié)劑也可以與雜交抗體綴合，雜交抗體由一個(gè)或多個(gè)與不同的抗原結(jié)合 的抗體組成。本發(fā)明的多模式治療進(jìn)一步包括使用裸露的抗CD20抗體的免疫治療，并通過(guò)以 裸露的抗體、融合蛋白的形式或作為免疫綴合物來(lái)施用抗CD22、抗CD19、抗CD21、抗CD74、 抗⑶80、抗⑶23、抗⑶46或HLA-DR(包括不變鏈)抗體而加以補(bǔ)充。裸露的抗⑶20抗體 或其片段也可以用裸露的抗MUCl抗原的抗體來(lái)補(bǔ)充，MUCl抗原在某些B-細(xì)胞上表達(dá)。這 些抗體包括多克隆、單克隆、嵌合型、人或人源化抗體，它們識(shí)別至少一個(gè)在這些抗原決定 簇上的表位?？笴D19和抗CD20抗體對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。見(jiàn)例如， Ghetie 等人，Cancer Res. 48 2610 (1988) ；Hekman 等人，Cancer Immunol. Immunother. 32 364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 353 (1996) ^P U.S.專利號(hào) 5，798，554 和 6，187，287，在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。在另一種形式的多模式治療中，受試者聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的癌癥化療而接受裸露的抗CD20 抗體和/或免疫綴合物。例如，“CVB”(1.5g/m2環(huán)磷酰胺、200-400mg/m2表鬼臼毒素和 150-200mg/m2亞硝基脲氮芥)為用于治療非Hodgkin，s淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur. J. Haematol. 51 18 (1993)。其他合適的聯(lián)合型化療方案對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟 知的。見(jiàn)例如，F(xiàn)reedman 等人，非 Hodgkin，s 淋巴瘤(Non-Hodgkin' s Lymphomas),CANCER MEDICINE, VOL. 2,第三版，Holland 等人(編者)，2028-2068 頁(yè)(Lea&Febiger 1993)。作 為舉例說(shuō)明，第一代用于治療中級(jí)非Hodgkin’ s淋巴瘤(NHL)的化療方案包括C-MOPP(環(huán) 磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、甲基芐胼和強(qiáng)的松)和CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)。 有用的第二代化療方案為m-BAC0D(氨甲蝶呤、博來(lái)霉素、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、 地塞米松和甲酰四氫葉酸)，而合適的第三代方案為MACOP-B (氨甲蝶呤、阿霉素、環(huán)磷酰 胺、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松、博來(lái)霉素和甲酰四氫葉酸)。另外的有用的藥物包括丁酸苯酯和 brostatin-l0在優(yōu)選的多模式治療中，化療藥物和細(xì)胞因子與根據(jù)本發(fā)明的抗體、免疫綴 合物或融合蛋白進(jìn)行共施用。細(xì)胞因子、化療藥物和抗體或免疫綴合物可以任何順序或一 起進(jìn)行施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用下列方法治療NHL或自身免疫病，即以每周200_400mg/ m2的劑量每周4次輸注人源化抗CD20抗體，并持續(xù)4個(gè)連續(xù)的周(靜脈注射2_6小時(shí))， 如果需要在接下來(lái)的月/年中進(jìn)行重復(fù)。優(yōu)選地，人源化抗⑶20抗體以200-300mg/m2的 劑量和以每隔一周一次的方式進(jìn)行施用，持續(xù)4-8次注射。同樣也是優(yōu)選的為，通過(guò)如上 述每周4次注射或者頻率更少的注射來(lái)治療NHL，但是在同樣的這些天中以360mg/m2的劑
29量聯(lián)合施用^ratuzuMAb (抗⑶22人源化抗體)，印ratuzuMAb是在抗⑶20單克隆抗體輸 注之前、期間或之后通過(guò)靜脈輸注1小時(shí)來(lái)給予的?；蛘撸诼?lián)合治療中所使用的抗體也 可以交替的順序進(jìn)行輸注，因此在不同的周中交替進(jìn)行輸注，這導(dǎo)致對(duì)于4-8或更多個(gè)劑 量單位中的每一個(gè)的總注射順序來(lái)說(shuō)每個(gè)劑量單位每隔一周給予一次。然后將這些給藥計(jì) 劃表以不同的間隔進(jìn)行重復(fù)，例如3-6周，這取決于患者的臨床狀態(tài)和對(duì)于每個(gè)治療方案 的反應(yīng)。更優(yōu)選的是，通過(guò)如上述每周4次輸注抗CD20抗體或者頻率更少的輸注來(lái)治療 NHL，其聯(lián)合了一次或多次注射用治療性同位素如釔_90(總劑量為5-35mCi/m2的Y-90，在 幾個(gè)周或幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行一次或多次注射)進(jìn)行放射性標(biāo)記的CD22 MAb。US系列號(hào) 09/590，284 (Goldenberg等人)公開了使用抗CD22抗體的自身免疫紊亂的免疫療法，在此 處以其整體進(jìn)行引用作為參考。另外，本發(fā)明的治療組合物可以含有裸露的單克隆抗CD20抗體的混合物或雜交 分子，這些抗⑶20抗體導(dǎo)向不同的、非實(shí)心的⑶20表位。因此，本發(fā)明考慮了這樣的治療 組合物，其含有與至少兩個(gè)CD20表位結(jié)合的單克隆抗CD20抗體的混合物。另外，此處所描 述的治療組合物可以含有具有變化的CDR序列的抗CD20抗體的混合物。雖然裸露的抗⑶20抗體是用于治療B-細(xì)胞淋巴瘤和自身免疫病的主要治療 組合物，但是這種抗體治療的效能可以通過(guò)使用補(bǔ)充的試劑來(lái)對(duì)于裸露的抗體進(jìn)行補(bǔ)充 而得到增強(qiáng)，例如免疫調(diào)節(jié)劑，如干擾素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，白細(xì)胞介素包括 IL-I、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21，和細(xì)胞因子包括 G-CSF 和 GM-CSF。因此， CD20抗體不僅可以與抗體和細(xì)胞因子聯(lián)合，這是以與抗CD20抗體的混合物(分開給予或 者以某一預(yù)定的給藥方案來(lái)給予)或者綴合物或融合蛋白的形式來(lái)進(jìn)行的，而且可以與 藥物的聯(lián)合形式來(lái)給予。例如，抗CD20抗體可以與CHOP聯(lián)合而作為4種藥物化療方案。 另外，裸露的抗CD20抗體可以與裸露的抗CD22抗體和CHOP或氟達(dá)拉濱聯(lián)合而作為用于 NHL治療的藥物聯(lián)合。使用抗CD22抗體的B-細(xì)胞惡性腫瘤的免疫療法描述于US專利號(hào) 6，183，744 (Goldenberg 等人)和 US 系列號(hào) 09/307，816 (Goldenberg 等人)，在此處以其 整體進(jìn)行引用作為參考。補(bǔ)充的治療組合物可以在施用抗CD20抗體之前、同時(shí)或之后進(jìn)行 施用。正如上面所討論的，本發(fā)明的抗體可以用于治療B-細(xì)胞淋巴瘤和白血病以及其 他的B-細(xì)胞疾病或紊亂。例如，抗CD20抗體可以用于治療B-細(xì)胞相關(guān)的自身免疫病，包 括III型自身免疫病，例如免疫介導(dǎo)的血小板減少癥如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢 性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥、Sydenham's舞蹈病、重癥 肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多腺綜合征、大皰性類天皰 瘡、糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、鏈球菌感染后腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、Takayasu’ s動(dòng)脈炎、 Addison' s病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng) 脈炎、強(qiáng)直性脊柱炎、Goodpasture' s綜合征、血栓閉塞性脈管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋 本氏甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常型 天皰瘡、Wegener’ s肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎/多肌痛、 惡性貧血、快速進(jìn)展性腎小球腎炎和纖維化肺泡炎。抗⑶20抗體也可以在表達(dá)⑶20抗原的細(xì)胞中引起凋亡。在文獻(xiàn)中提供了這一誘 導(dǎo)的證據(jù)。例如，證明了用這樣的淋巴樣細(xì)胞可以引起凋亡，即該淋巴樣細(xì)胞具有與交聯(lián)CD20 MAb 的 IgGl-Fc 反應(yīng)的 Fc 受體。見(jiàn) Shan 等人，Cancer Immunol. Immunother. 48(12) 673-683(2000)。此外，還報(bào)道了嵌合型⑶20MAb的凝集體即同聚合體可引起凋亡。見(jiàn) Ghetie 等人，Blood 97(5) 1392-1398 (2000)；和 Ghetie 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(14) 7509-7514(1997)。可以將對(duì)于B-細(xì)胞的CD20表面抗原具有特異性的抗體注射入哺乳動(dòng)物受試者 中，然后這些抗體與正常的和惡性的B-細(xì)胞的⑶20細(xì)胞表面抗原結(jié)合。哺乳動(dòng)物受試者包 括人和家養(yǎng)動(dòng)物，包括寵物如狗和貓。當(dāng)存在對(duì)于CD20抗原的物種交叉反應(yīng)時(shí)，本發(fā)明的 即人源化、嵌合型、人、狗源化和貓?jiān)椿目笴D20 MAb和甚至是鼠類抗CD20 MAb可以用于 治療非人哺乳動(dòng)物受試者。見(jiàn)下面的施例10和11。在人中具有免疫原性的鼠類MAb在非 人哺乳動(dòng)物受試者中通常具有較弱的免疫原性。與CD20表面抗原結(jié)合的抗CD20抗體導(dǎo)致 成瘤性B-細(xì)胞的破壞和清除。因?yàn)檎５暮蛺盒缘腂-細(xì)胞都表達(dá)CD20抗原，因此抗CD20 抗體將會(huì)導(dǎo)致B-細(xì)胞死亡。可是，只有正常的B-細(xì)胞會(huì)再增殖，而惡性的B-細(xì)胞會(huì)被根 除或者明顯地減少。另外，可以將具有破壞腫瘤的潛在能力的化學(xué)試劑或放射性標(biāo)記與抗 CD20抗體綴合，從而這些試劑特異地定向于成瘤性B-細(xì)胞。12.表達(dá)載體將編碼人源化、嵌合型或人抗⑶20 MAb的DNA序列通過(guò)重組工程而置于多種已知 的提供核酸復(fù)制的宿主載體中。可以用已知的方法來(lái)設(shè)計(jì)這些載體從而含有對(duì)于在其遞 送進(jìn)的細(xì)胞中指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者所必需的元件?？梢允褂靡阎姆椒▽W(xué)來(lái)產(chǎn)生 表達(dá)構(gòu)建體，其具有可操作地與合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)相連接的編碼蛋白質(zhì)的序列。 這些方法包括體外重組DNA技術(shù)和合成技術(shù)。例如，見(jiàn)Sambrook等人，1989，MOLE⑶LAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(New York) ；Ausubel 等人，1997，CURRENT PROTOCOLS IW0LECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons (New York)。在本發(fā)明中也提供了不 與載體相聯(lián)系的載體的遞送。適合在本發(fā)明中使用的載體可以是病毒的或非病毒的。病毒載體的特殊例子包括 腺病毒、AAV、單純皰疹病毒、慢病毒、和逆轉(zhuǎn)錄病毒。非病毒載體的例子為質(zhì)粒。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，載體為質(zhì)粒。在此處使用時(shí)，表達(dá)載體為含有在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的多核苷酸。通常地，將 基因表達(dá)置于某些調(diào)節(jié)元件的控制之下，包括組成型或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)節(jié) 元件和增強(qiáng)子。這樣的基因被稱為“可操作地”與調(diào)節(jié)元件相連。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)載體含有編碼人源化、嵌合型或人抗⑶20MAb的DNA序列， 該抗CD20 MAb包含有重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。可是，可以使用兩個(gè)表達(dá)載體，一個(gè)具 有重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，另一個(gè)具有輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。更優(yōu)選地，表達(dá)載體進(jìn)一步含有 啟動(dòng)子。因?yàn)榭梢允褂萌魏螐?qiáng)的啟動(dòng)子，因此可以含有編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列、編碼人 IgGl重鏈恒定區(qū)的基因組序列、Ig增強(qiáng)子元件和至少一個(gè)編碼選擇標(biāo)記的DNA序列。在此處也考慮了表達(dá)人源化抗⑶20 MAb的方法，其包括(i)使至少一種含有編碼 人源化、嵌合型或人抗CD20 MAb的DNA序列線性化，(ii)用至少一種該線性化載體轉(zhuǎn)染哺 乳動(dòng)物細(xì)胞，(iii)挑選出表達(dá)標(biāo)記基因的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(iv)鑒定從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分泌 人源化抗⑶20 MAb的細(xì)胞。13.制備抗⑶20抗體的方法
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一般地，抗⑶20 MAb的Vk (可變輕鏈)和Vh (可變重鏈)序列可以通過(guò)多種分子 克隆程序如RT-PCR、5，-RACE和cDNA文庫(kù)篩選來(lái)獲得。特別地，抗CD20 MAb的V基因可 以通過(guò)PCR擴(kuò)增而從表達(dá)鼠類或嵌合型抗CD20 MAb的細(xì)胞中獲得，并進(jìn)行測(cè)序。為了確 定它們的真實(shí)性，可以如 Orlandi 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833(1989))所述 將經(jīng)克隆的\和Vh基因在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)為嵌合型Ab，此處引用該文獻(xiàn)作為參考?；?于V基因序列，然后可以如Leung等人所述(Mol. Immunol. 32 =1413(1995))設(shè)計(jì)和構(gòu)建人 源化抗⑶20 MAb，此處引用該文獻(xiàn)作為參考?？梢酝ㄟ^(guò)通常的分子克隆技術(shù)(Sambrook等 人，MOLECULAR CLONING =A LABORATORY MANUAL，第二版(1989))從任何已知的產(chǎn)生鼠類或 嵌合型抗CD20 MAb的雜交瘤系或轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中制備出cDNA。MAb的Vk序列可以用引物 VK1BACK 禾口 VK1F0R(Orlandi 等人，1989)或 Leung 等人(Biotechniques, 15 286(1993))所 描述的延生引物組來(lái)擴(kuò)增，此處引用這些文獻(xiàn)作為參考，而Vh序列可以用引物對(duì)VH1BACK/ VH1F0R(Orlandi 等人，1989，上述)或 Leung 等人(Hybridoma，13 :469 (1994))所描述的 與鼠類IgG恒定區(qū)退火的引物來(lái)擴(kuò)增，此處引用這些文獻(xiàn)作為參考。PCR反應(yīng)混合物含有 10μ 1 第一條鏈 cDNA 產(chǎn)物、10μ 1 IOXPCR 緩沖液[500mM KClUOOmMTris-HCl (pH 8.3)、 15mM MgCl2 和 0. 01% (w/v)明膠](Perkin ElmerCetus, Norwalk, CT)、250 μ M 每種 dNTP、 200nM引物和5個(gè)單位TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)，將該P(yáng)CR反應(yīng)混合物進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)的PCR。每個(gè)PCR循環(huán)優(yōu)選地由下列步驟組成，即于94°C變性1分鐘、于50°C退火 1. 5分鐘和于72°C聚合化1. 5分鐘。擴(kuò)增出的Vk和Vh片段可以在2%的瓊脂糖(BioRad， Richmond, CA)上進(jìn)行純化。類似地，如 Leung 等人(Mol. Immunol. 32 1413 (1995))所述， 人源化V基因可以通過(guò)將長(zhǎng)寡核苷酸模板合成和PCR擴(kuò)增聯(lián)合而進(jìn)行構(gòu)建。在實(shí)施例3中 可見(jiàn)在自動(dòng)RNA/DNA合成儀(Applied Biosystems, foster City, CA)上合成寡聚體A和聚 體B以用于構(gòu)建人源化V基因的方法。對(duì)于Vk的PCR產(chǎn)物可以亞克隆進(jìn)分階段載體中，例如基于pBR327的分階段載體 VKpBR，其含有Ig啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和方便的用于使得VkPCR產(chǎn)物的框內(nèi)連接變得容易的 限制位點(diǎn)。對(duì)于￥11的？0 產(chǎn)物可以亞克隆進(jìn)類似的分階段載體中，如基于？8111^(^1 {的 VHpBS。含有各自PCR產(chǎn)物的單個(gè)克隆可以用例如Sanger等人的方法來(lái)進(jìn)行測(cè)序(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 :5463 (1977))，此處引用此文獻(xiàn)作為參考。此處描述的DNA序列將會(huì)被認(rèn)為是包括了其所有的等位基因、突變體和變異體， 而不論它們是天然發(fā)生的還是誘導(dǎo)產(chǎn)生的。含有Vk和Vh以及啟動(dòng)子與信號(hào)肽序列的表達(dá)盒可以分別從VKpBR和VHpBS中切 除，這是通過(guò)雙限制酶切消化為HindIII-BamHI片段而進(jìn)行的。然后可以將Vk 表達(dá)盒 分別連接入合適的表達(dá)載體中，例如PKh和pGlg (Leung等人，Hybridoma，13 :469(1994))。 表達(dá)載體可以共轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的細(xì)胞中，例如骨髓瘤Sp2/0-Agl4(ATCC，VA)，這是由潮霉素 抗性所選擇出的集落，并對(duì)上清液進(jìn)行監(jiān)測(cè)以確定嵌合型或人源化抗CD20MAb的產(chǎn)生，例 如通過(guò)ELISA測(cè)定，這在下面進(jìn)行了描述。作為另一種選擇，可以將Vk 表達(dá)盒分別裝 配入經(jīng)修飾的分階段載體VKpBR2和VHpBS2中，然后分別作為Xbal/BamHI和XhoI/BamHI 片段而切除，并亞克隆進(jìn)單個(gè)表達(dá)載體如pdHL2中，這些Gilles等人(J. Immunol. Methods 125 191(1989))進(jìn)行了描述，以及還在 Losman 等人，Cancer,80 2660(1997)中顯示了 Sp2/0-Agl4細(xì)胞中的表達(dá)。在本發(fā)明中有用的另一種載體為Barnes等人，Cytotechnology
3232 109-123 (2000)所描述的GS載體，其優(yōu)選地在NSO細(xì)胞系和CHO細(xì)胞中表達(dá)。其他合 適的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)描述于Werner等人，Arzneim. -Forsch. /Drug Res. 48 (II)，Nr. 8， 870-880(1998)之中。共轉(zhuǎn)染和用ELISA測(cè)定分泌抗體的克隆可以如下所述來(lái)進(jìn)行。根據(jù)Co等人， J. Immunol.，148 1149 (1992)所述，大約 10 μ g 的 VKpKh(輕鏈表達(dá)載體)和 20 μ g 的 VHpGlg (重鏈表達(dá)載體)可以用于通過(guò)電穿孔(BioRad，Richmond，CA)轉(zhuǎn)染5 X IO6的SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞，此處引用該文獻(xiàn)作為參考。在轉(zhuǎn)染之后可以讓細(xì)胞于37°C和5% CO2的條件 下在96孔微量滴定板中并于完全HSFM培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Grand Island, NY)中進(jìn)行生長(zhǎng)。選擇程序可以在添加潮霉素終濃度為500單位/ml的潮霉素選擇性培養(yǎng) 基(Calbiochem，San Diego, CA)之后兩天開始進(jìn)行。集落通常在電穿孔之后2-3個(gè)周出 現(xiàn)。然后可以讓培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)展以用于進(jìn)一步分析。對(duì)于嵌合型或人源化重鏈的分泌呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)染瘤克隆可以通過(guò)ELISA測(cè)定來(lái)鑒 定。簡(jiǎn)短地說(shuō)就是，將來(lái)自轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物的上清液樣品(約100μ 1)分三次加入到用山羊抗 人(GAH)_IgG、F(ab' ) 2 片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch, West Grove，PA)預(yù)包 裹的ELISA微量滴定板中。將平板于室溫溫育1小時(shí)。通過(guò)用洗滌緩沖液(含有0.05%聚 山梨酸酯20的PBS)洗滌三次來(lái)去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。向孔中加入與GAH-IgG、Fc片段特 異性抗體(Jackson ImmunoResearch)綴合的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，(將100 μ 1的抗體原 料稀釋IO4倍，并用未綴合的抗體補(bǔ)充至1. 0μ g/ml的終濃度)。在溫育1小時(shí)之后，洗滌平 板，一般是三次。向孔中加入反應(yīng)溶液[100 μ 1，其在PBS中含有167 μ g的鄰苯二胺(OPD) (Sigma, St. Louis,MO)、0· 025%過(guò)氧化氫]。在暗處進(jìn)行成色30分鐘。在自動(dòng)ELISA閱讀 器(Bio-Tek儀器，Winooski，VT)中測(cè)量490nm的吸收之前，通過(guò)向每個(gè)孔中添加50 μ 1的 4Ν HCl溶液來(lái)終止反應(yīng)。然后，相對(duì)于不相關(guān)的嵌合型抗體標(biāo)準(zhǔn)(可從Scotgen有限公司， Edinburg, Scotland獲得)來(lái)測(cè)定結(jié)合的嵌合型抗體。抗體可以如下述從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來(lái)。使轉(zhuǎn)染瘤培養(yǎng)物適合于無(wú)血清培養(yǎng) 基。為了產(chǎn)生嵌合型抗體，讓細(xì)胞在滾瓶中用HSFM以500ml培養(yǎng)物進(jìn)行生長(zhǎng)。將培養(yǎng)物離 心，并將上清液通過(guò)0.2μ的膜進(jìn)行過(guò)濾。將經(jīng)過(guò)濾的培養(yǎng)基以Iml/分鐘的流速通過(guò)A蛋 白柱(IX3cm)。然后用大約10個(gè)柱體積的PBS洗滌樹脂，隨后用含有IOmM EDTA的0. IM 甘氨酸緩沖液(pH 3.5)從柱上洗脫下A蛋白結(jié)合的抗體。在含有10μ1的3M Tris (ρΗ 8.6)的管中收集1.0ml的組分，并由在280/260nm的吸收來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。匯集峰組分 并逆PBS進(jìn)行透析，然后例如用Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA)來(lái)濃縮抗體。如前述 用ELISA來(lái)測(cè)定抗體濃度，并用PBS將其濃度調(diào)整至大約lmg/ml。向樣品中適宜地加入 0.01% (w/v)疊氮化鈉作為防腐劑。序列表是用于制備抗CD20抗體的引物的核苷酸序列。通過(guò)下面的實(shí)施例而對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，提供這些實(shí)施例只是用于舉例說(shuō) 明。本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)包括明顯來(lái)自此處提供的教導(dǎo)的所有變化形 式。
實(shí)施例實(shí)施例1.人源化抗⑶20抗體的構(gòu)建分別使用Orlandi 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 3833(1989))所描述的引物對(duì) VH1BACK/VH1F0R 和 VK1BACK/VK1F0R 而通過(guò) RT-PCR 來(lái)獲得抗 CD20 抗體 A20 的 Vh 和 Vk基因。對(duì)多個(gè)獨(dú)立的克隆進(jìn)行測(cè)序以排除由于PCR反應(yīng)所產(chǎn)生的可能錯(cuò)誤。將作為最 終PCR產(chǎn)物的克隆鼠類V1^P Vk序列分別標(biāo)示為A20Vk(圖1A)和A20VH(圖1B)。構(gòu)建出 嵌合型A20(cA20)抗體，并在Sp2/0細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。cA20的Vk和VH序列顯示在圖2中。 讓cA20抗體與Raji細(xì)胞結(jié)合，并與從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化出的放射性標(biāo)記的 A20進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)(圖3)。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所克隆的V基因的真實(shí)性。設(shè)計(jì)和構(gòu)建編碼人源化抗hCD20 (hA20)抗體的單個(gè)輕鏈和兩個(gè)重鏈可變區(qū)序列。 人REI框架序列用于Vk (圖1A)，EU與NEWM框架序列的聯(lián)合用于Vh (圖1B)。當(dāng)與起始人抗 體框架相比較時(shí)，在CDR區(qū)域之外的每條鏈中有許多氨基酸改變。與人EU框架相比，hA20、 hA20VHl的重鏈有9個(gè)改變，而hA20VH2有3個(gè)改變(圖4A)。hA20VH2是優(yōu)選的，因?yàn)槠浔?hA20VHl含有更多的來(lái)自人抗體構(gòu)架區(qū)的氨基酸。與人REI框架相比，hA20、hA20VK的輕鏈 有7個(gè)氨基酸改變(圖4B)。實(shí)施例2. hA20抗體的構(gòu)建方法每條可變鏈以兩部分進(jìn)行構(gòu)建，即5’ -和3’ -半個(gè)部分，分別標(biāo)示為“A”和“B”。 每半個(gè)部分通過(guò)使用Taq聚合酶對(duì)于合成的單鏈寡核苷酸模板與兩個(gè)短側(cè)翼引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增而產(chǎn)生出來(lái)。首先將擴(kuò)增出的片段克隆進(jìn)來(lái)自Invitrogen (Carlsbad，CA)的pCR4 TA 克隆載體中，并進(jìn)行DNA測(cè)序。模板和引物對(duì)列于下面模板 引物 VkA-反向/VkA-正向 VkB-反向/VkB-正向 VHA-反向/VHlA-正向 VHlB-反向/VHB-正向 VHA-反向/VH2A-正向 VH2B-反向/VHB-正向


VKA VKB VHlA VHlB VH2A VH2B 輕鏈
為了構(gòu)建人源化Vk序列的全長(zhǎng)DNA，在自動(dòng)RNA/DNA合成儀(Applied Biosystems)上合成寡聚體 hA20VKA (120 聚體)和 hA20VKB (130 聚體)。hA20VKA 和 B 分另Ij 代表了 hA20 Vk的核苷酸26-145和166-195 (見(jiàn)圖5A)。將寡聚體hA20VKA和B從支持物 上切除，并通過(guò)用濃縮的氫氧化銨處理而去保護(hù)。在將樣品進(jìn)行真空干燥并重懸于100 μ 1 水中之后，通過(guò)經(jīng)過(guò)ChormaSpin-IOO柱(Clontech，Palo Alto, CA)進(jìn)行離心而去除不完 整的寡聚體(小于100聚體)。所有側(cè)翼引物類似地進(jìn)行制備，只是使用ChormaSpin-30 柱來(lái)去除合成的副產(chǎn)物。將1 μ 1用ChormaSpin柱純化的hA20VKA以100 μ 1反應(yīng)體積進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增，該反應(yīng)體系含有 10XPCR 緩沖液[500mM KClUOOmM Tris-HCl (pH8. 3)、15mM MgCl2*0.01% (ff/v)明膠](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、250 μ M 每種 dNTP、200nM VkA-反向與VkA-正向和5個(gè)單位TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)。將該反應(yīng)混合 物進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的由下列步驟組成的PCR反應(yīng)，即于94°C變性1分鐘、于50°C退火1. 5分 鐘和于72°C聚合化1. 5分鐘。hA20VKB在類似的條件下用引物對(duì)VkB-反向和VkB-正向進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增出的VKA和VKB片段在2%瓊脂糖(BioRad，Richmond，CA)上進(jìn)行純化。 在每個(gè)片段的末端設(shè)計(jì)唯一的限制位點(diǎn)以便能夠容易地通過(guò)DNA連接而連接在一起。擴(kuò)增出的VKA片段在其5’-末端含有PvuII限制位點(diǎn)即CAGCTG，和在3’-末端含有BstBI限制 位點(diǎn)即TTCGAA。擴(kuò)增出的VKB片段在其5’ -末端含有BstBI限制位點(diǎn)，和在3’ -末端含 有BglII限制位點(diǎn)即AGATCT。全長(zhǎng)Vk鏈的裝配通過(guò)下列步驟來(lái)完成，即用合適的5’ -和 3’ -酶對(duì)于每個(gè)片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切消化，然后連接入預(yù)先用PvuII和BclI (BclI 消化的末端與BglII消化的末端相匹配)消化的VKpBR2載體中。結(jié)果所得的連接產(chǎn)物含 有與PvuII位點(diǎn)相連接的A片段、與BclI位點(diǎn)相連接的B片段和在BstBI位點(diǎn)連接在一起 的A與B片段(圖5A)。VKpBR2是VKpBR的經(jīng)修飾的分階段載體(Leung等人，Hybridoma 13 :469(1994))，在其中于翻譯起始密碼子上游14個(gè)堿基處導(dǎo)入了 XbaI限制位點(diǎn)。通過(guò) DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)正確的可讀框，將完整的鏈作為XbaI-BamHI片段從VKpBR2中切除，并連接 入pdHL2表達(dá)載體中。將只含有Vk序列的載體標(biāo)示為hA20VKpdHL2。pdHL2含有表達(dá)盒， 該表達(dá)盒包括在IgH增強(qiáng)子和MT1啟動(dòng)子控制之下的人IgGl C1、C2、C3和鉸鏈區(qū)(圖7A) 以及人κ鏈Ck(圖7B)，還包括由弱SV40啟動(dòng)子控制的小鼠dhfr基因，其作為用于轉(zhuǎn)染 子的選擇和轉(zhuǎn)基因的共擴(kuò)增的標(biāo)記(Gillies等人，J. Immunol. Methods 125:191(1989)； Losman等人，Cancer，80 :2660 (1997))。通過(guò)置換pdHL2的Vk和Vh片段可以表達(dá)出不同 的嵌合型或人源化Ab。重鏈為了構(gòu)建hA20VHl，如上所述合成寡聚體VHlA (121聚體)和VHlB (151聚體)，它們 分別代表了核苷酸23-143和179-329 (見(jiàn)圖5B)。類似地，對(duì)于hA20VH2，制備寡聚體VH2A 和VH2B。這些寡聚體用實(shí)施例2中所列出的它們各自的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)于Vh 的兩種類型施行與對(duì)于1所施行的同樣的構(gòu)建方法，但具有下列修飾A片段的5’ -末端 限制位點(diǎn)為PstI (CTGCAG)和B片段的3，-末端限制位點(diǎn)為BstEII (GGTCACC)。將這些片 段連接在一起并于共同的NciI位點(diǎn)(CCCGG)連接入VHpBS2載體中，從而導(dǎo)致形成全長(zhǎng)Vh 序列(圖5B和5C)，并通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。VHpBS2是VHpBS的經(jīng)修飾的分階段載體 (Leung等人，Hybridoma 13 :469 (1994))，在其中于翻譯起始密碼子上游16個(gè)堿基處導(dǎo)入 了 XhoI限制位點(diǎn)。將裝配出的Vh基因作為XhoI-BamHI限制片段亞克隆進(jìn)含有Vk序列的 表達(dá)載體M20V κ pdHL2中。因?yàn)閜dHL2的重鏈區(qū)域缺乏BamHI限制位點(diǎn)，因此該連接需要 使用HNB連接體來(lái)在可變鏈的BamHI位點(diǎn)和存在于pdHL2載體中的HindIII位點(diǎn)之間提供 一個(gè)橋。將結(jié)果產(chǎn)生的表達(dá)載體標(biāo)示為hA20-lpdHL2和hA20_2pdHL2。HNB 連接體 5，-AGCTTGCGGCCGC-3，3， -ACGCCGGCGCTAG-5，實(shí)施例3. hA20抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)將大約3(^8用于1^20的表達(dá)載體通過(guò)用SalI消化而線性化，并通過(guò)電穿孔 (450V和25 μ F)而轉(zhuǎn)染進(jìn)Sp2/0-Agl4細(xì)胞中。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于96孔平板中2天，然 后通過(guò)以0. 025 μ M的終濃度向培養(yǎng)基中添加MTX而用藥物抗性進(jìn)行選擇。MTX抗性集落于 2-3周之后在孔中出現(xiàn)。來(lái)自在選擇中存活的集落的上清液通過(guò)ELISA測(cè)定而對(duì)于人Ab分 泌進(jìn)行篩選。簡(jiǎn)短地說(shuō)就是，將ΙΟΟμΙ上清液加入到用GAH-IgG、F(ab' )2片段特異性Ab 預(yù)包裹的微量滴定板的孔中，并于室溫溫育1小時(shí)。通過(guò)用洗滌緩沖液(含有0.05%多山 梨酸酯20的PBS)洗滌三次來(lái)去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。向孔中加入綴合HRP的GAH-IgG、Fc 片段特異性Ab。在溫育1小時(shí)之后，洗滌平板。在添加含有4mM OPD和0. 04% H2O2的底物
35溶液之后，通過(guò)讀取A490nm而揭示出結(jié)合的綴合HRP的Ab。讓陽(yáng)性細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)展，并 從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中通過(guò)在A蛋白柱上進(jìn)行親和層析而純化出hA20-l和hA20-2。實(shí)施例4.抗⑶20抗體的結(jié)合活性施行競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞結(jié)合測(cè)定以評(píng)測(cè)hA20相對(duì)于親代cA20和抗⑶20Ab c2B8的免疫 反應(yīng)性。在存在濃度變化(0. 2-700nM)的hA20_l、_2、鼠類A20、cA20、或c2B8的情況下，將 恒定數(shù)量的125I標(biāo)記的鼠類A20或c2B8 (100，OOOcpm,約10 μ Ci/μ g)與Raji細(xì)胞于4°C 溫育1-2小時(shí)。通過(guò)在PBS中洗滌細(xì)胞而去除未結(jié)合的Ab。在洗滌之后測(cè)定與細(xì)胞相關(guān) 的放射活性。如圖6中所示，當(dāng)和125I-A20或125I-c2B8與Raji細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，人 源化A20MAb、hA20-l和hA20_2顯示出可與A20、鼠類抗CD20MAb、cA20和c2B8 (嵌合型抗 ⑶20MAb)相比較的結(jié)合活性。通過(guò)放射性標(biāo)記的MAb與Raji細(xì)胞的直接結(jié)合和Scatchard制圖分析，與對(duì)于 C2B8的3. 9nM的解離常數(shù)相比，測(cè)量到對(duì)于cA20和hA20的解離常數(shù)分別為2. 9和4. 2nM。 用山羊抗人IgG、Fc片段特異性抗體與這些抗體進(jìn)行復(fù)合的體外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)顯示出在cA20和 hA20以及C2B8之間的類似的Raji NHL細(xì)胞殺傷力。實(shí)施例5.患有復(fù)發(fā)性中級(jí)非Hodgkin’ s淋巴瘤的患者的治療患有中級(jí)非Hodgkin’ s淋巴瘤的患者已經(jīng)對(duì)于前面的侵襲性化療沒(méi)有反應(yīng)了，該 化療由下面的部分組成，即CH0PX6，其導(dǎo)致完全地緩解4個(gè)月；另一個(gè)CH0PX6過(guò)程，其導(dǎo) 致進(jìn)一步的改善；D-M0PPX2，其導(dǎo)致穩(wěn)定疾病3個(gè)月；和與外周干細(xì)胞移植一起的CVB，其 導(dǎo)致部分緩解5個(gè)月?；颊咴陬i部淋巴結(jié)中呈現(xiàn)出復(fù)發(fā)性淋巴瘤，其可以通過(guò)計(jì)算機(jī)化斷 層X(jué)射線照相法和觸診來(lái)測(cè)量?；颊咴诘?、14、28和42天用450mg人源化CD20單克隆抗體A20于3小時(shí)之內(nèi)進(jìn) 行輸注，而沒(méi)有在輸注期間或緊接著之后注意到嚴(yán)重的反作用。8個(gè)周之后，頸部淋巴結(jié)增 大的觸診顯示出可測(cè)量到的大約50%的減少。在治療之后20周所進(jìn)行的繼續(xù)測(cè)量沒(méi)有在 頸部和其他任何地方之中顯示出疾病的跡象，這一點(diǎn)也由身體的計(jì)算斷層X(jué)射線照相法研 究進(jìn)行了確認(rèn)。因?yàn)樵谄渌胤經(jīng)]有檢測(cè)到新疾病，所以認(rèn)為患者的病情得到了完全的緩 解。每10-12周進(jìn)行繼續(xù)的研究以確認(rèn)在治療之后至少10個(gè)月的完全緩解。實(shí)施例6.患有慢性原發(fā)性血小板減少性紫癜的患者的治療一位患有慢性原發(fā)性血小板減少性紫癜的45歲女性已經(jīng)用強(qiáng)的松、Y球蛋白和 高劑量的地塞米松進(jìn)行了治療，但是疾病仍在發(fā)展。她經(jīng)過(guò)了脾切除術(shù)，但還是不能穩(wěn)定 疾病。她的血小板跌至小于30，000/μ1，并且出血事件的頻率增加了。然后患者用人源 化⑶20A20MAb進(jìn)行治療，在第一周于靜脈內(nèi)施用500mg，隨后每隔一周一次給予250mg， 并總共進(jìn)行4次注射。在最后一次給予A20之后10周，觀察到血小板數(shù)量的顯著增加至 150，000/μ 1，并且出血事件消失了。在最后一次抗體輸注之后5個(gè)月，疾病得到了緩解。實(shí)施例7.患有進(jìn)展性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的治療患有嚴(yán)重的指關(guān)節(jié)、腕和肘進(jìn)展性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一位70歲女性對(duì)于用氨甲 蝶呤的治療已經(jīng)沒(méi)有反應(yīng)了，當(dāng)進(jìn)行Enbrel治療時(shí)只獲得較小的緩解。然后該患者用Α20 人源化CD20 MAb進(jìn)行治療，其每個(gè)周于靜脈內(nèi)施用300mg，并持續(xù)4周。在3個(gè)月之后，在 疾病活動(dòng)度的測(cè)量中觀察到40%的改善并保持了 5個(gè)月。患者再次用A20以同樣的劑量和 頻率進(jìn)行治療?；颊呃^續(xù)得到改善，并在第二次A20 MAb治療之后6個(gè)周觀察到60%的改善。在A20治療期間或之后的任何時(shí)候沒(méi)有觀察到人抗A20抗體。雖然從血液中去除了正 常的B-細(xì)胞，但是沒(méi)有觀察到感染并發(fā)癥或者其他藥物相關(guān)的嚴(yán)重毒性。實(shí)施例8.患有重癥肌無(wú)力的患者的治療一位65歲的男性已經(jīng)對(duì)于用于重癥肌無(wú)力的常規(guī)療法沒(méi)有了反應(yīng)，并被送進(jìn)了 神經(jīng)學(xué)重癥治療病室中。通過(guò)血漿交換和靜脈內(nèi)給予免疫球蛋白來(lái)減少抗乙酰膽堿受體抗 體的滴度而穩(wěn)定了患者的病情?；颊呃^續(xù)臥床不起，然后用A20人源化CD20 MAb進(jìn)行治療， 其每隔一周一次于靜脈內(nèi)施用400mg，并持續(xù)10周。在最后一次給予A20之后1周，沒(méi)有能 夠檢測(cè)到血液B-細(xì)胞，并觀察到抗乙酰膽堿抗體的滴度的顯著降低。在最后一次施用A20 MAb之后4個(gè)月，患者可以活動(dòng)了并出了院。實(shí)施例9.在淋巴結(jié)和骨髓中患有侵襲性非Hodgkin's B-細(xì)胞淋巴瘤的狗的治療一只65磅重、7歲大的雄性金毛獵犬被診斷為患有擴(kuò)散性大細(xì)胞侵襲性淋巴瘤。 將該狗進(jìn)行使用長(zhǎng)春新堿、環(huán)磷酰胺、強(qiáng)的松和阿霉素的聯(lián)合化療，其具有良好的反應(yīng)?？?是，狗隨后表現(xiàn)出這樣的特征，即具有進(jìn)展性淋巴結(jié)病，并在此之后7個(gè)月被發(fā)現(xiàn)具有骨髓 的擴(kuò)展性淋巴瘤滲透，和頸部、胸部、腹部、骨盆的淋巴結(jié)病，以及肝脾大。給予該狗使用1F5嵌合型單克隆抗體的治療。狗用120mg 1F5抗體進(jìn)行靜脈內(nèi)輸 注，并在該起始治療之后于4周內(nèi)每周重復(fù)這一治療。在最后一次給予1F5之后4個(gè)月，患 畜的計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)射線照相法掃描沒(méi)有顯示出淋巴瘤的跡象，并且疾病的所有病征和癥 狀不明顯了。實(shí)施例10.患有復(fù)發(fā)性中級(jí)非Hodgkin’ s淋巴瘤的狗的治療一只78磅重、9歲大的患有中級(jí)非Hodgkin’ s淋巴瘤的德國(guó)牧羊犬接受化療，其 起初導(dǎo)致完全緩解5個(gè)月，隨后進(jìn)行另一個(gè)化療過(guò)程，其導(dǎo)致穩(wěn)定疾病6個(gè)月。然后狗在胸 部和頸部淋巴結(jié)中表現(xiàn)出復(fù)發(fā)性淋巴瘤，它們可以分別通過(guò)計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)射線照相法和 觸診而進(jìn)行測(cè)量。患畜在2周內(nèi)每周用9°Y標(biāo)記的L243 (HLA-DR)單克隆抗體的免疫綴合物進(jìn)行輸 注，其放射劑量為50mg抗體蛋白中有8mCi，并聯(lián)合地以每次IOOmg的劑量每周輸注A20人 源化CD20抗體。3周之后，頸部淋巴結(jié)增大的觸診顯示出可測(cè)量的減少，而重復(fù)的胸部計(jì)算 機(jī)化斷層X(jué)射線照相法掃描顯示出腫瘤的明顯減少。于治療之后10周進(jìn)行的繼續(xù)測(cè)量顯 示出在頸部或胸部中疾病減少了大約60%的證據(jù)。因?yàn)樵谄渌胤經(jīng)]有檢測(cè)到新疾病，所 以認(rèn)為患畜的病情得到了部分的緩解。每10-12周進(jìn)行繼續(xù)的研究以確認(rèn)在治療之后至少 7個(gè)月的部分緩解。實(shí)施例11.患有復(fù)發(fā)性淋巴瘤的貓的治療一只10磅重、12歲大的家養(yǎng)短毛貓表現(xiàn)出單個(gè)下頌下淋巴結(jié)的增大。在切除之 后，在6個(gè)月時(shí)病灶重新出現(xiàn)了。再次切除病灶，但是隨后在6個(gè)月之后其又出現(xiàn)了。然后 在4周內(nèi)每周用131I標(biāo)記的抗CD20B1單克隆抗體的免疫綴合物治療貓，其放射劑量為45mg 抗體蛋白中有15mCi。在3個(gè)月之后重復(fù)進(jìn)行治療。當(dāng)在最后一次治療之后3個(gè)月進(jìn)行檢 查時(shí)，可以觸摸到明顯的減小。在1年的時(shí)間內(nèi)沒(méi)有觀察到疾病的復(fù)發(fā)。實(shí)施例12.在培養(yǎng)的或者異種移植入SCID小鼠的人NHL細(xì)胞中評(píng)測(cè)嵌合型和人 源化抗CD20 MAb。嵌合型(cA20)和人源化(hA20)CD20抗體的特性在NHL細(xì)胞系中進(jìn)行評(píng)測(cè)。結(jié)果證實(shí)cA20和hA20與rituximab類似地起作用，其沾染了多于99%的Raji、Ramos、RL、 Daudi和Su-DHL-6細(xì)胞，和與大約5%的淋巴細(xì)胞(所希望的B-細(xì)胞百分?jǐn)?shù))進(jìn)行反應(yīng)。 在所有的B-細(xì)胞系中，用MAb看到了特異的生長(zhǎng)抑制，但是抑制水平在細(xì)胞系之間變化， Su-DHL是最敏感的。在不存在交聯(lián)的情況下，鼠類抗CD20、cA20、hA20和rituximab都產(chǎn) 生77-90%的抑制。在有交聯(lián)的情況下，增殖的抑制在94-98%的范圍內(nèi)變化。在存在有交 聯(lián)了第二種單克隆抗體的情況下，rituXimab、CA20和hA20在它們于Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡 的能力上也是類似的。此外，在第0天，SCID小鼠用2. 5X IO6的Raji細(xì)胞進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。在第1天， 開始注射鼠類、嵌合型和人源化抗CD20抗體以及cA20F(ab' )2片段，其數(shù)量為每次注射 100#g完整抗體或者每次注射67#gF (ab' ) 2片段，并在2周內(nèi)每周注射5次，然后在3周 內(nèi)每周注射2次。在一項(xiàng)研究中，對(duì)照小鼠以腫瘤接種之后15天這一中間存活時(shí)間死于播 散性疾病，但是中間存活時(shí)間對(duì)于用cA20處理的小鼠延長(zhǎng)至38天、對(duì)于用hA20處理的小 鼠延長(zhǎng)至22. 5天和對(duì)于用鼠類抗⑶20處理的小鼠延長(zhǎng)至21天(所有這些數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)數(shù) 分級(jí)分析是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0. 005))。在另一項(xiàng)研究中，對(duì)照小鼠以腫瘤接種之后16. 5 天這一中間存活時(shí)間死于表現(xiàn)為CNS麻痹的播散性疾病，但是中間存活時(shí)間對(duì)于用cA20 處理的小鼠延長(zhǎng)至105天、對(duì)于用hA20處理的小鼠延長(zhǎng)至70天和對(duì)于用rituximab處理 的小鼠延長(zhǎng)至98天(所有這些數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)數(shù)分級(jí)分析是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(ρ < 0. 0001)，圖 11)。實(shí)施例13.競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞表面結(jié)合測(cè)定人源化抗CD20 Ab(cA20、hA20和clF5，通過(guò)A蛋白柱上的親和層析而純化)的Ag 結(jié)合特異性和親和性研究通過(guò)與鼠類2B8和rituximab (IDEC制藥公司，San Diego, CA)的 細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定來(lái)進(jìn)行評(píng)測(cè)。簡(jiǎn)短地說(shuō)就是，在存在濃度變化(0.2-700nM)的競(jìng) 爭(zhēng)Ab (cA20、hA20、m2B8、clF5或rituximab)的情況下，將恒定數(shù)量(100，000c pm，約 IOiCi/ ig)的125I標(biāo)記的(A)m2B8或(B)rituximab與Raji細(xì)胞于4°C溫育1-2小時(shí)。通過(guò)用PBS 洗滌細(xì)胞而去除未結(jié)合的Ab。在洗滌之后測(cè)定與細(xì)胞相關(guān)的放射活性。圖8(A)為cA20(正 方形)、hA20-2(三角形)和hA20-l(圓形)與m2B8(菱形)的結(jié)合活性的比較；圖8 (B)比 較了 cA20 (正方形)、clF5 (三角形)和rituximab (菱形)的結(jié)合活性。在另一項(xiàng)研究中，通過(guò)細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定比較了 hA20與其他的抗⑶20Ab、 rituximab和鼠類Bl的結(jié)合活性。簡(jiǎn)短地說(shuō)就是，在存在濃度變化(0. 2_700ηΜ)的競(jìng) 爭(zhēng)Ab即hA20(三角形)、mBl (倒三角形)或rituximab (正方形)的情況下，將恒定數(shù)量 (100，OOOcpm, ^ 10iCi/ig)的 125I 標(biāo)記的 rituximab 與 Raji 細(xì)胞于 4°C溫育 1-2 小時(shí)。通 過(guò)用PBS洗滌細(xì)胞而去除未結(jié)合的Ab。在洗滌之后測(cè)定與細(xì)胞相關(guān)的放射活性。計(jì)算出對(duì) 于這三個(gè)抗體的IC5tl值分別為6. 8、34和5。實(shí)施例14.交聯(lián)的hA20和其他⑶20 Ab對(duì)于 培養(yǎng)的淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)在存在交聯(lián)劑(抗人IgG、Fc片段特異性抗體)的情況下，用多種⑶20 Ab處理 Raji細(xì)胞以復(fù)合CD20抗體(圖10)。在使用20i g/ml交聯(lián)劑(紅色)、不使用交聯(lián)劑(橙色) 或者使用抗小鼠IgG、Fc片段特異性抗體(藍(lán)色)的情況下，將終濃度為5ig/ml的hA20、 cA20、rituximab或陽(yáng)性對(duì)照Ab hLLl與Raji細(xì)胞溫育48小時(shí)。通過(guò)(A)錐蟲藍(lán)染色和 細(xì)胞計(jì)數(shù)或者(B)MTT測(cè)定來(lái)測(cè)量總細(xì)胞和存活細(xì)胞群體。數(shù)據(jù)顯示出hA20和rituximab
38對(duì)于Raji NHL細(xì)胞的存活具有相似的效應(yīng)，并且該細(xì)胞毒性取決于抗體的特異性交聯(lián)。實(shí)施例15.使用hA20和hLL2的體內(nèi)療法將Raji細(xì)胞通過(guò)靜脈注射而施用于SCID小鼠，其數(shù)量為2. 5 X IO6細(xì)胞/100 μ 1/ 小鼠(圖12)。在第1-11天通過(guò)腹腔注射而施用MAb，隨后每周注射兩次MAb并持續(xù)大約 3周。每周測(cè)量動(dòng)物的體重，直至研究結(jié)束。每天檢查動(dòng)物后腿的麻痹。當(dāng)麻痹出現(xiàn)時(shí)，處 死動(dòng)物并進(jìn)行尸體剖檢以便肉眼檢查播散性腫瘤結(jié)節(jié)(特別是在肺、腎和卵巢中)。用對(duì)照 人源化IgGl Ab即hMN-14 (抗CEA抗體)處理的對(duì)照小鼠死于表現(xiàn)為CNS麻痹的播散性疾 病。中間存活時(shí)間為腫瘤靜脈注射接種之后13天。在用hA20處理的組中的中間存活時(shí)間 延長(zhǎng)至大約25天。該值表示了大約2倍于hA20的中間存活時(shí)間的增加。雖然單獨(dú)用hLL2 處理的組顯示出與對(duì)照小鼠相比同樣的中間存活時(shí)間，但是聯(lián)合hA20和hLL2進(jìn)行治療可 將小鼠的中間存活時(shí)間增加至大約30天。
hA20VKA
5' -CATCTCTGAG CGCATCTGTT GGAGATAGGG TCACTATGAC TTGTAGGGCC AGCTCAAGTG TAAGTTACAT CCACTGGTTC CAGCAGAAAC CAGGGAAAGC ACCTAAACCC TGGATTTATG-3‘ hA20VKB
5， -GGTGTCCCTG TCCGATTCTC TGGCAGCGGA TCTGGGACAGATTACACTTT CACCATCAGC TCTCTTCAAC CAGAAGACAT
TGCAACATATTATTGTCAGC AGTGGACTAG TAACCCACCC
ACGTTCGGTG-3，
hA20VKA-反向
5' -CAGCTGACCC AGTCTCCATC ATCTCTGAGC GCATCTGTTG-3， hA20VKA-正向
5' -AGGTTCGAAG TGGCATAAAT CCAGGGTTTA GGTGCT-3' hA20VKB-反向
5' -CACTTCGAAC CTGGCTTCTG GTGTCCCTGT CCGATTCTC-3’ hA20VKB-正向
5' -ACGTTAGATC TCCAGCTTGG TCCCTCCACC GAACGTGGGT GGGTTA-3， hA20VHA
5' -CTGAAGTCAA GAAACCTGGG TCATCGGTGA AGGTCTCCTG CAAGGCTTCT GGCTACACCT TTACTAGTTA CAATATGCAC TGGGTCAAGC AGGCACCTGG ACAGGGTCTG GAATGGATTG G-3' hA20VHB
5' -ATCAGAAGTT CAAGGGTAAA GCCACACTGA CTGCCGACGA ATCCACCAAT ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGCCTGAGG TCTGAGGACA CGGCATTTTA TTACTGTGCA AGATCGACTT ACTACGGCGG TGACTGGTAC TTCGATGTCT G-3' hA20VHA-反向
5' -CAGCTGCAGC AATCAGGGGC TGAAGTCAAG AAACCTGGG-3'
39hA20VHA-正向
5’ -TTCCGGGATA AATAGCTCCA ATCCATTCCA GACCCTG-3’ hA20VHB-反向
5’ -ATCCCGGAAA TGGTGATACT TCCTACAATC AGAAGTTCAA GGGTAAAGCC A-3’ hA20VHB-正向
5’ -GGAGACGGTG ACCGTGGTGC CTTGGCCCCA GACATCGAAG TACCAG-3，
hA20VH2A
5， -CTGAAGTCAA GAAACCTGGG TCATCAGTGA AGGTCTCCTG CAAGGCTTCT GGCTACACCT TTAGTAGTTA CAATATGCAC TGGGTCAGAC AGGCACCTGG ACAGGGTCTG GAATGGATGG G-3' hA20VH2B
5’ -ATCAGAAGTT CAAGGGTAGA GCCACAATAA CTGCCGACGA ATCCACCAAT ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGCCTGAGG TCTGAGGACA CGGCATTTTA TTTTTGTGCA AGATCGACTT ACTACGGCGG TGACTGGTAC TTCGATGTCT G-3' hA20VH2A-正向
5’ -TTCCGGGATA AATAGCTCCC ATCCATTCCA GACCCTG-3' hA20VH2B-反向
5’ -ATCCCGGAAA TGGTGATACT TCCTACAATC AGAAGTTCAA GGGTAGAGCC A-3'
40
權(quán)利要求
一種與CD20結(jié)合的嵌合、人源化或人單克隆抗體或者它們的抗原結(jié)合片段，所述抗體包含由選自RASSSVSYIH、RASSSLSFMH和RASSSVSYMH的序列組成的輕鏈可變區(qū)CDR1；由ATSNLAS序列組成的輕鏈可變區(qū)CDR2；和由選自QQWTSNPPT、HQWSSNPLT和QQSFSNPPT的序列組成的輕鏈可變區(qū)CDR3；以及所述抗體包含由SYNMH序列組成的重鏈可變區(qū)CDR1；由序列AIYPGNGDTSYNQKFKG組成的重鏈可變區(qū)CDR2，以及由選自STYYGGDWYFDV、SHYGSNYVDYFDV和VVYYSNSYWYFDV的序列組成的重鏈可變區(qū)CDR3。
2.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其與治療試劑綴合。
3.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑是放射性同位素。
4.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑是細(xì)胞毒性試劑。
5.權(quán)利要求4的抗體或其片段，其中所述細(xì)胞毒性試劑為藥物。
6.權(quán)利要求4的抗體或其片段，其中所述細(xì)胞毒性試劑為毒素。
7.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為免疫調(diào)節(jié)劑。
8.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為細(xì)胞因子。
9.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為干擾素。
10.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
11.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為紅細(xì)胞生成素。
12.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為淋巴毒素。
13.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
14.權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述治療試劑為集落刺激因子。
15.權(quán)利要求2-14任一項(xiàng)的抗體或其片段，其中所述重鏈可變區(qū)⑶R3由 STYYG⑶WYFDV序列組成。
16.權(quán)利要求2-14任一項(xiàng)的抗體或其片段，其中所述重鏈可變區(qū)⑶R3由 VVYYSNSYWYFDV 序列組成。
17.權(quán)利要求2-14任一項(xiàng)的抗體或其片段，其包含含hA20Vk和hA20VHl的與⑶20結(jié) 合的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
18.權(quán)利要求2-14任一項(xiàng)的抗體或其片段，其包含含hA20Vk和hA20VH2的與⑶20結(jié) 合的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
19.一種包含至少兩種單克隆抗體或者抗體片段的抗體融合蛋白，其中至少一種所述 抗體或片段為權(quán)利要求1的抗體或片段。
20.權(quán)利要求19的抗體融合蛋白，其包含至少一種靶向CD20以外的抗原的單克隆抗體 或片段。
21.權(quán)利要求19的抗體融合蛋白，其包含至少一種靶向CD22的單克隆抗體或片段。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)要求保護(hù)的抗體或片段或融合蛋白在制備用于治療患者B細(xì) 胞淋巴瘤或白血病的藥物中的用途。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述藥物通過(guò)腸胃外途徑給予。
24.權(quán)利要求22的用途，其中所述藥物通過(guò)靜脈內(nèi)途徑給予。
25.權(quán)利要求22的用途，其中所述藥物通過(guò)皮下途徑給予。
26.權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物的給藥劑量是約l-20mg/kg。
27.權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物的給藥劑量是約lmg/kg。
28.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物每周給予一次。
29.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中給予所述藥物4-8齊U。
30.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物隔周給予一次。
31.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物間隔1-2周給予一次，并且總共重復(fù) 至少3個(gè)劑量。
32.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中間隔1-2周給予一劑所述劑量，并且持續(xù)2_3 個(gè)月。
33.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中劑量之間的間隔至少兩個(gè)星期。
34.權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的用途，其中給予所述劑量的時(shí)間最長(zhǎng)是3個(gè)月。
35.權(quán)利要求22-34任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體或片段或融合蛋白包含hA20Vk和 hA20VHl。
36.權(quán)利要求22-34任一項(xiàng)的用途，其中所述抗體或片段或融合蛋白包含hA20Vk和 hA20VH2o
37.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)要求保護(hù)的抗體或片段或融合蛋白在制備用于治療患者 B-細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的藥物中的用途。
38.權(quán)利要求37的用途，其中所述藥物通過(guò)腸胃外途徑給予。
39.權(quán)利要求37的用途，其中所述藥物通過(guò)靜脈內(nèi)途徑給予。
40.權(quán)利要求37的用途，其中所述藥物通過(guò)皮下途徑給予。
41.權(quán)利要求37-40任一項(xiàng)的用途，包括所述藥物的給藥劑量約l-20mg/kg。
42.權(quán)利要求37-40任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物的給予劑量約lmg/kg。
43.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物每周給予一次。
44.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中給予所述藥物4-8劑。
45.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物隔周給予一次。
46.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物間隔1-2周給予一劑，并且總共重復(fù) 至少3劑。
47.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中間隔1-2周給予一劑并且持續(xù)療程2_3個(gè)月。
48.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中劑量之間的間隔至少兩個(gè)星期。
49.權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)的用途，其中給予所述劑量的時(shí)間最長(zhǎng)為3個(gè)月。
全文摘要
本發(fā)明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20抗體以及CD20抗體融合蛋白，它們與被稱為CD20的B-細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合，該B-細(xì)胞標(biāo)記可用于B-細(xì)胞紊亂如B-細(xì)胞惡性腫瘤和自身免疫病的治療和診斷，并且提供了治療和診斷的方法。
文檔編號(hào)C12N15/13GK101914158SQ20091015055
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月14日
發(fā)明者D·M·戈登伯格, H·漢森, Z·屈 申請(qǐng)人:免疫醫(yī)療公司