一類抗CD20-Flex雙功能融合蛋白、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一類抗CD20雙功能融合蛋白、其制備方法及其在制備抗體腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的抗CD20雙功能融合蛋白，具有類似全抗體結(jié)構(gòu)與功能的CD20-Flex雙功能融合蛋白，既可以與CD20結(jié)合，又具有Flt3配體的功能。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤尤其是惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在各種疾病中所致死亡中居第二位。而且近年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后多不佳。目前臨床上所采用的常規(guī)治療方法如放療、化療和手術(shù)治療雖然在很大程度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進(jìn)一步提聞。
[0003]抗體靶向性藥物具有特異性好、副作用小、半衰周期長等優(yōu)點，現(xiàn)今已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于腫瘤的臨床治療?？贵w藥物在臨床治療中已經(jīng)取得了令人鼓舞的治療效果。但是，由于腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的異質(zhì)性和復(fù)雜性，單個靶點的抗體靶向藥物僅僅特異性的靶向一個目標(biāo)蛋白來發(fā)揮殺傷、阻斷等效應(yīng)，很難更加有效的殺傷腫瘤細(xì)胞、激發(fā)機(jī)體免疫、克服腫瘤復(fù)發(fā)。因此，目前抗體研究領(lǐng)域主要集中在提高抗體的親和力、發(fā)現(xiàn)新的抗體靶標(biāo)以及制備多靶向抗體等方面。采用計算機(jī)輔助設(shè)計以及文庫技術(shù)提高抗體親和力的方法已經(jīng)非常成熟，采用蛋白組學(xué)技術(shù)配合使用質(zhì)譜檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，也已經(jīng)得以實現(xiàn)?，F(xiàn)今的方法已經(jīng)能夠快速制備親和力達(dá)到InM的抗體，新的藥物靶標(biāo)也在不斷的進(jìn)行臨床前及臨床試驗中。然而，目前制備多價抗體的方法主要是將抗體可變區(qū)改造成單鏈抗體，這種方法獲得的多價抗體普遍抗體親和力不高，療效也沒有達(dá)到預(yù)期的效果。最近出現(xiàn)的DVD抗體是將兩種抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)分別對應(yīng)進(jìn)行融合，形成HVl-1inker-HV2以及LVl-linker-LV2的結(jié)構(gòu)。這種DVD抗體雖然克服了單鏈抗體親和力低的缺點，但是由于分子量過大、抗體結(jié)構(gòu)變化較大，會導(dǎo)致其表達(dá)量不高；而且，當(dāng)靶蛋白分子量較大或者在細(xì)胞膜上形成較大復(fù)合物時，會影響DVD抗體對雙靶點的結(jié)合。
[0004]Rituximab (利妥昔單抗)商品名為美羅華，是一種抗⑶20的嵌合單克隆抗體，1997年由美國FDA批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，與CHOP聯(lián)合應(yīng)用可用于治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等其他B細(xì)胞淋巴瘤。
[0005]雖然對抗體治療腫瘤機(jī)理的不然深入研究，目前認(rèn)為:抗體通過⑶C、ADCC以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡能夠顯著的殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤的增長，但是越來越多的證據(jù)表明抗體誘導(dǎo)的機(jī)體特異性免疫殺傷在克服腫瘤復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮重要的作用。
[0006]Flt3配體胞外區(qū)(Flex)不僅能使骨髓增加生產(chǎn)DC的數(shù)量，而且可使DC的功能趨向成熟，使后者具有更強(qiáng)的抗原遞呈和抗腫瘤作用，更重要的是，F(xiàn)lex還能夠使成熟的DC從骨髓釋放出來進(jìn)入外周組織，體內(nèi)實驗證實應(yīng)用Flex后，小鼠脾臟、骨髓、淋巴結(jié)、肝臟中DC呈時間依賴性增加。因此，制備一類在具有殺傷性同時能有效激發(fā)機(jī)體腫瘤特異性免疫的抗體，是目前抗體研究的一個熱點。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】
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為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了長期研究，經(jīng)大量試驗，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一類具有類似全抗體結(jié)構(gòu)與功能的CD20-Flex雙功能融合蛋白，該雙功能融合蛋白既可以與⑶20結(jié)合，又具有Flt3配體的功能。
[0008]本發(fā)明公開了:
1.一種具有類似全抗體結(jié)構(gòu)與功能的CD20-Flex雙功能融合蛋白，其特征是，既可以與⑶20抗原結(jié)合，又具有Flt3配體的功能。
[0009]2.上述的雙功能融合蛋白，由三條肽鏈構(gòu)成，分別為Flex-CL-Hinge-CH2_CH3(SEQID NO: 18 ) rituximab 重鏈 knob 突變體(SEQ ID NO: 16 )rituximab 輕鏈(SEQ ID NO:10 )。
[0010]3.一種分離的核苷酸分子，編碼上述的三條肽鏈，具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9所述核苷酸序列。
[0011]4.一種載體，含有上所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，其中載體可以為 pDRl, pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZE0 ( + )，pDHFR 之一。
[0012]5.上述載體，為 pcDNA3.1 ( + )或 pcDNA3.1/ZE0 ( + )。
[0013]6.一種宿主細(xì)胞，含有上述的載體，為真核細(xì)胞。
[0014]7.上述宿主細(xì)胞，為哺乳動物細(xì)胞。
[0015]8.上述宿主細(xì)胞，為CHO細(xì)胞。
[0016]9.一種制備上述⑶20-Flex雙功能融合蛋白，該方法包括:
a)分別克隆0)20抗體rituximab可變區(qū)與Flt3配體膜外區(qū)；
b)在抗體Fe區(qū)域分別構(gòu)建knob突變體:T366ff,S354C ；hole突變體:T366S, L368A,Y407V 和 Y394C ；
c)將Flt3配體膜外區(qū)與抗體輕鏈恒定區(qū)融合構(gòu)建Flex-CL融合片斷；
d)分別將rituximab重鏈可變區(qū)與knob突變體融合,Flex-CL與hole突變體融合,裝入表達(dá)載體；
e)將構(gòu)建好的兩個表達(dá)載體與裝有rituximab輕鏈基因的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)行表達(dá)，分離純化。
[0017]10.一種組合物，含有上述⑶20-Flex雙功能融合蛋白，和藥學(xué)上可接受的載體。
[0018]11.上述⑶20-Flex雙功能融合蛋白在制備抗體腫瘤藥物中的用途。
[0019]12.上述組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
[0020]13.上述任一用途，還包括和其他的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
[0021]本發(fā)明的目的是提供一類具有類似全抗體結(jié)構(gòu)與功能的CD20-Flex雙功能融合蛋白，既可以與CD20結(jié)合，又具有Flt3配體的功能。該類抗體既保留了類似抗體的結(jié)構(gòu)和大小，具有和親本抗體類似的親和力和半衰期，也保留了 CD20抗體殺傷腫瘤相似的CDC、ADCC和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力，又結(jié)合了 Flt3配體能夠在腫瘤附近誘導(dǎo)DC和NK細(xì)胞的增殖和成熟，激發(fā)機(jī)體腫瘤特異性免疫，克服腫瘤的復(fù)發(fā)。
[0022]本發(fā)明對抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入理解，在此基礎(chǔ)上，建立了一種既保留類似抗體的結(jié)構(gòu)與功能又具有Flt3配體功能的融合蛋白，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。為了證明該方法具有比rituximab抗體與Flex-1g聯(lián)合用藥更好的療效,本發(fā)明進(jìn)行后續(xù)蛋白抗腫瘤作用的實驗。原則上，本發(fā)明的方法能夠廣泛的應(yīng)用于各種抗體與Flex構(gòu)建雙功能融合蛋白，加速研發(fā)具有生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義的融合蛋白。同時，將抗體可變區(qū)與Flex相結(jié)合構(gòu)建雙功能融合蛋白的方法，為以后進(jìn)行雙功能融合蛋白的設(shè)計提供一種新的思路。
[0023]本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，可以為pDRl，pcDNA3.l( + )，pcDNA3.1/ZE0( + )，pDHFR之一，表達(dá)載體中包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的融合DNA序列。
[0024]哺乳動物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于本發(fā)明的雙功能融合蛋白的表達(dá)，COS，CHO, NSO，sf9及sf21等細(xì)胞均可適用于本發(fā)明。
[0025]可用的宿主細(xì)胞為含有上述載體的原核細(xì)胞，可以為DH5a，BL21 (DE3)，TGl之一。
[0026]本發(fā)明中公開的具有抗體結(jié)構(gòu)與功能優(yōu)勢的雙功能融合蛋白的制備方法為在表達(dá)條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)雙功能融合蛋白，分離或純化所述的雙功能融合蛋白。
[0027]可以利用親和層析的方法對本發(fā)明公開的雙功能融合蛋白進(jìn)行分離純化，根據(jù)所利用的親和柱的特性，可以使用常規(guī)的方法例如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的雙功能融合蛋白。
[0028]利用上述方法，可以將雙功能融合蛋白純化為基本均一的物質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上為單一條帶。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，一類雙功能融合蛋白包含rituximab的抗原結(jié)合區(qū)及Flt3配體胞外區(qū)。
[0030]一類雙功能融合蛋白具有抗體結(jié)構(gòu)與功能優(yōu)勢，其制備方法包括以下步驟:
1)分別克隆rituximab抗體重鏈可變區(qū)和Flt3配體胞外區(qū)基因；
2)將Flt3配體胞外區(qū)的基因與抗體輕鏈恒定區(qū)進(jìn)行融合，構(gòu)建Flex-CL融合片段；
3)分別對抗體Fe區(qū)域構(gòu)建knob突變體:T366W,S354C ；hole突變體:T366S，L368A,Y407V 和 Y394C ；
4)分別將rituximab重鏈可變區(qū)與knob突變體融合,Flex-CL與hole突變體融合,裝入表達(dá)載體；
5)將上述表達(dá)載體與rituximab抗體輕鏈進(jìn)行共轉(zhuǎn)表達(dá),通過分離純化得到雙功能融合蛋白。
[0031]將上述構(gòu)建好的完整的重、輕鏈基因分別裝入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 ( + )(Invitrogen公司產(chǎn)品)。上述質(zhì)粒一起用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞(ATCC),并用含600 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)雙功能融合蛋白的細(xì)胞克隆。利用Protein A層析柱，通過親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清中純化得到雙功能融合蛋白。
[0032]上述雙功能融合蛋白或制劑在制備抗癌的藥物中應(yīng)用，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
[0033]本發(fā)明公開上述雙功能融合蛋白，可以和藥學(xué)上可以接受的輔料一起組成藥物制劑組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，這些制劑可以保證本發(fā)明公開的雙功能融合蛋白氨基酸核心序列的構(gòu)像完整性，同時還要保護(hù)蛋白質(zhì)的多官能團(tuán)防止其降解(包括但不限于凝聚、脫氨或氧化)。通常情況下，對于液體制劑，通?？梢栽?° C-8° C條件下保存至少穩(wěn)定一年，對于凍干制劑，在30° C至少六個月保持穩(wěn)定。在這里制劑可為制藥領(lǐng)