專利名稱：一種擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)的引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對嗜肺軍 團(tuán)菌(Legionella pneumophila)中g(shù)yrB基因(DNA gyrase B subunit gene，以下簡稱gyrB)的特異的核苷酸，特別是涉及對嗜肺軍團(tuán)菌中的 gyrB特異的寡核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
軍團(tuán)菌屬于革蘭陰性桿菌，是廣泛存在于自然界的土壤和水環(huán)境中的一種條件致 病菌。軍團(tuán)菌可以引發(fā)軍團(tuán)菌病，它是一種以呼吸道感染癥狀為主，伴全身中毒癥狀的細(xì)菌 感染性疾病。自1976年首次在美國發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)病以來，該病已呈現(xiàn)出世界性分布及病死率高 的兩大特點。軍團(tuán)菌有42個種，64個血清型，其中至少有22個種與人類疾病有關(guān)，與人類 關(guān)系最密切的是嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)。嗜肺軍團(tuán)菌是引發(fā)軍團(tuán)菌病的主 要致病菌種在軍團(tuán)菌病例中，由嗜肺軍團(tuán)菌引發(fā)的病例占致病性軍團(tuán)菌引發(fā)病例的95%以 上，它的生長與繁殖與環(huán)境因素密切相關(guān)，集中空調(diào)的冷卻塔冷卻水、冷凝水以及溫泉水是 軍團(tuán)菌在外界適宜的生存環(huán)境。當(dāng)環(huán)境水中的軍團(tuán)菌繁殖到一定濃度，則會形成氣溶膠進(jìn) 而感染人。宿主感染主要受其易感性和細(xì)菌毒力的影響，任何年齡均可發(fā)生，但中老年、基 礎(chǔ)免疫較差者、長途旅行者、吸煙者為高危人群，并以醫(yī)院、賓館、大型建筑工地等公共場所 好發(fā)。目前，細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法對疾病的診斷具有良好的敏感性和特異性，可以作為臨床確 診和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。但是由于軍團(tuán)菌不易分離培養(yǎng)，而且種類又繁多。利用細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法對 其進(jìn)行鑒定需要價格昂貴的特殊培養(yǎng)基，而且細(xì)菌生長比較緩慢，要3 7d以上才能出結(jié) 果，不利于臨床的快速診斷，同時要求實驗人員要有比較高的技術(shù)，費時費力。近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，近年來，越 來越多的分子技術(shù)用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，包括特定基因序列分析、隨機(jī)擴(kuò) 增長度多態(tài)性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等。和傳統(tǒng)檢 測技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子檢測技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、 純培養(yǎng)等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點。DNA鏈或染色體高級結(jié)構(gòu)的變化是需要拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase)參與的，包 括I型和II型。DNA解螺旋酶gyrase是一種II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，最早是在E. coli中發(fā)現(xiàn) 的，它由A、B兩個亞基形式組成，gyrB就是編碼B亞基的基因。和16S rRNA 一樣，gyrB和 ISR均廣泛存在于各種細(xì)菌細(xì)胞中，是細(xì)胞生命過程所必須的基因，但gyrB的進(jìn)化速率卻 是16S rRNA的3 6倍，ISR的進(jìn)化速率也比16S rRNA更快，可以作為細(xì)菌分子進(jìn)化和系 統(tǒng)分析的模式分子，近年來，人們已經(jīng)開始使用它來區(qū)分、鑒定和檢測許多用16S rRNA無能 為力區(qū)分的細(xì)菌，相關(guān)報道及文獻(xiàn)也越來越多。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))作為微生物 檢測的技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特 異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點，只需對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測樣品 中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過程僅需2個小時。這對檢驗檢疫部 門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)中 gyrB基因(DNA gyrase B subunit gene，以下簡稱gyrB)特異區(qū)的引物；本發(fā)明的另一個目的是提供一種包括擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)的引物的 PCR試劑盒，并利用該PCR試劑盒檢測嗜肺軍團(tuán)菌的存在。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種對嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB的特異核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸 序列。所述的SEQ ID NO 1所示的分離的核苷酸，全長為2418個堿基；上述的一種對嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB高度特異的核苷酸為源于gyrB的寡核苷酸，具 有SEQ ID NO 4的序列，是位于SEQ ID NO 1中的1404至1423的堿基。其中SEQ ID NO: 權(quán)利要求
一種擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)的引物，其特征在于a)該引物具有SEQ ID NO2 SEQ ID NO3所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)核苷酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基，仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于所述嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)核苷酸序列。
3.—種權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)的引物的制備方法，其特征 在于包括下述步驟1)基因組的提??；2)通過PCR擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌中的gyrB基因；3)構(gòu)建gyrB基因的克??；4)gyrB基因克隆的測序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特異引物的篩選。
4.權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因的引物在制備PCR試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌的PCR試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增嗜 肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的PCR試劑盒，其特征在于還包括dNTP、緩沖液和DNA聚合酶。
7.權(quán)利要求5所述的PCR試劑盒在檢測嗜肺軍團(tuán)菌中的應(yīng)用。
8.一種利用權(quán)利要求5-7中任一項所述的PCR試劑盒檢測嗜肺軍團(tuán)菌的PCR檢測方 法，其特征在于包括以下步驟1)提取待測樣品的DNA模板；2)在PCR管中加入dNTP、MgCl2UOX酶特異性反應(yīng)緩沖液、Taq聚合酶、引物、待測樣 品DNA模板和ddH20，混勻；3)將步驟2)中混勻的PCR管在PCR儀上擴(kuò)增；4)在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果；5)分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)中g(shù)yrB基因(DNA gyrase B subunit gene，以下簡稱gyrB)特異區(qū)的引物，還提供了一種包括擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因特異區(qū)的引物的PCR試劑盒，利用該PCR試劑盒對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測，簡便快速、特異性好、靈敏度高，可用于水體和臨床樣品的監(jiān)督和檢測、飲用水中病原菌檢測、細(xì)菌學(xué)分類及流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有深遠(yuǎn)的社會效益和較大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12P19/34GK101967474SQ200910152070
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者周光朋, 曹勃陽, 楊磊, 王磊 申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司