一種用于軍團(tuán)菌快速檢測(cè)與分型的試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于軍團(tuán)菌快速檢測(cè)與分型的試 劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 軍團(tuán)菌（Ze知〇化?心3)是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，廣泛存在于自然界、人工水體 和±壤環(huán)境中。目前已經(jīng)確認(rèn)的軍團(tuán)菌屬有58種，包括有70多個(gè)血清型，并不斷有新 的菌種從環(huán)境中分離出來?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，約有一半的軍團(tuán)菌種與人類疾病有關(guān)，其中 約90%軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌（Ze知〇打6心3 /wey曲口如j7a)引起，其中W血清型1 型的嗜肺軍團(tuán)菌（Ze知oneiia/we歴OjOAiiaserogroupl)感染居多，占所有軍團(tuán)菌感染 病例的85%左右。除此之外，約10%的軍團(tuán)菌感染由非嗜肺軍團(tuán)菌導(dǎo)致。在非嗜肺軍 團(tuán)菌感染中，60%的感染病例由麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌（Zegioneiia曲如泌沁。引起，其次為杜氏 軍團(tuán)菌任6知〇/?6心3沁曲〇/巧從博茲曼軍團(tuán)菌（Ze知oneiia 長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌 任6知o"e77。7〇。幼eacAsey)和菲氏軍團(tuán)菌任6知o"e77。/ee7eiiy)等弓I起。
[0003] 盡管在全球范圍內(nèi)的非嗜肺軍團(tuán)菌感染病例中，大部分由麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌感染引起， 但是長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌感染在一定的區(qū)域內(nèi)占據(jù)主導(dǎo)，如澳大利亞，新西蘭，泰國(guó)，日本等地軍團(tuán) 菌感染病例中長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌感染占所有軍團(tuán)菌感染病例的30-50%。軍團(tuán)菌通過空氣W氣溶膠 的形式感染人，引起軍團(tuán)菌性肺炎，嚴(yán)重威脅人類的健康。因此，建立一種能檢測(cè)軍團(tuán)菌并 能將檢出的軍團(tuán)菌分型為常見致病性軍團(tuán)菌的方法具有重要的臨床意義。
[0004] 目前軍團(tuán)菌感染及軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法主要有血清抗體檢測(cè)、尿可溶性抗原檢測(cè)、 軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)等。但是上述的檢測(cè)方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、培養(yǎng)基的配置復(fù)雜和 價(jià)格昂貴的缺陷，不利于軍團(tuán)菌的快速檢測(cè)。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展為微生物的分類鑒 定工作提供了較簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的方法。多重PCR方法具有很高的特異性與敏感性，其主要是 通過檢測(cè)軍團(tuán)菌中的特異基因，W達(dá)到快速檢測(cè)軍團(tuán)菌的目的。
[0005] 中國(guó)專利CN102140514B公開了一種檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌多種血清型致病菌特異性引 物及試劑盒，所述試劑盒可同時(shí)檢測(cè)5種血清型嗜肺軍團(tuán)菌，而且該檢測(cè)方法周期短、速度 快、可操作性強(qiáng)，其檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)提取得到的DNA作為模板擴(kuò)增所得的結(jié)果一致，是一種理 想的嗜肺軍團(tuán)菌多種血清型致病菌的檢測(cè)方法。但是，該檢測(cè)方法的檢測(cè)對(duì)象只針對(duì)嗜肺 軍團(tuán)菌，不利于對(duì)非嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)。
[0006] 中國(guó)專利申請(qǐng)201410607389.6公開了一種快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán) 菌的Ξ重PCR檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法主要是針對(duì)軍團(tuán)菌種屬、嗜肺軍團(tuán)菌種和嗜肺軍團(tuán) 菌I型的leSrRNA、dani和0RF9Ξ個(gè)基因的引物，對(duì)dNTPs和引物濃度比例W及退火溫度 進(jìn)行優(yōu)化，建立快速區(qū)分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團(tuán)菌的Ξ重PCR方法，該檢測(cè)方法可W 對(duì)分離培養(yǎng)到的軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行快速有效的判定。但是，該檢測(cè)方法只對(duì)特定軍團(tuán)菌菌株 進(jìn)行分型，檢測(cè)范圍較狹窄，而且特異性不強(qiáng)，不利于該檢測(cè)方法的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法存在檢測(cè)范圍窄、特異性不強(qiáng)的缺陷，本 發(fā)明提供了一種用于軍團(tuán)菌快速檢測(cè)與分型的試劑盒及其檢測(cè)方法，W解決上述問題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種用于軍團(tuán)菌快速檢測(cè)與分型的試劑盒，包括細(xì)菌基因組DNA提 取液、PCR反應(yīng)液、PCR引物混合液、陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液，所述PCR引物混合液、陽(yáng)性對(duì) 照液和陰性對(duì)照液含有包括軍團(tuán)菌屬特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌血清型 1型特異引物、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌特異引物、麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌特異引物、博茲曼軍團(tuán)菌特異引物、杜氏軍 團(tuán)菌特異引物和菲氏軍團(tuán)菌特異引物；所述軍團(tuán)菌屬特異引物為： Gk388F :5' -GGAGGGTTGATAGGTTMGAGC-3'(沈Q ID NO. 1)， 化-388R:5' -CCAACAGCTAGTTGACATCGT-3'(沈Q ID NO. 2); 所述嗜肺軍團(tuán)菌特異引物為： LP-229F :5' -TCCGATGGTCAAGTGCGT-3'(沈Q ID NO. 3)， LP-229R :5, - TGAAGGGACTTGATGTGGCA-3'(沈Q ID NO. 4); 所述嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型特異引物為： LPsgl-wzt-93F:5'-GCCACTGCCTTCATCCATT-3'(沈Q ID NO. 5)， LPsgl-wzt-93R: 5' -CGCAAAGCCCAGAAATGAT-3'(沈Q ID NO. 6); 所述長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌特異引物： llo0050-567F :5' -GCGCGCTGGTAATCCTAATA-3'(沈Q ID NO. 7)，llo0050-567R:5' -TTGCTGCACGTACTGTCTT-3'(沈Q ID NO. 8); 所述麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌特異引物為： Lmgy^-785F:5'-TGCATTTMCCATTCGTCGTAAC-3'GEQIDN0.9)， Lmgy巧-785R:5> -AGTCATTTCTCTTGCTTTGCGA-3'(沈Q ID NO. 10); 所述博茲曼軍團(tuán)菌特異引物為： 化gy巧-692F :5' -AATGCCTTATCCGAGGAAT-3'(沈Q ID NO. 11)， 化gy巧-692R:5' -TCAGCAACACTGGACTCAA-3'(沈Q ID NO. 12); 所述杜氏軍團(tuán)菌特異引物為： LdgyrB-471F :5, -TTCGGGTGTATGCATTCAC-3，（沈Q ID NO. 13)， LdgyrB-471FR:5, -TCAGCAACGCTGGATTCAA-3'（沈Q ID NO. 14); 所述菲氏軍團(tuán)菌特異引物為： Lfgy巧-293F :5, -CAGAAGAGTTACATCTATCGATTCA-3'(沈Q ID NO.巧）， Lfgy巧-293R :5, -AAAGGCCTGAATTCCTCCC-3'(沈Q ID NO. 16)。
[0009] 進(jìn)一步地，所述軍團(tuán)菌屬特異引物的祀基因?yàn)?6srRNA基因；所述嗜肺軍團(tuán)菌特 異引物的祀基因?yàn)?PP0267基因；所述嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型特異引物的祀基因?yàn)閣zt基 因；所述長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌特異引物的祀基因?yàn)?1〇0050基因；所述麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌特異引物、博茲曼 軍團(tuán)菌特異引物、杜氏軍團(tuán)菌特異引物和菲氏軍團(tuán)菌特異引物的祀基因均為gyrB基因。
[0010]進(jìn)一步地，所述細(xì)菌基因組DNA提取液的配方為：化elex 100 resin 5〇/〇; Tris-肥1 10 ml, P冊(cè).3;乙二胺四乙酸二鋼0.1 ml;疊氮鋼0.1 %;蛋白酶K 200 μ g/ml。
[0011]進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)液為2 XPCR反應(yīng)液，所述2 XPCR反應(yīng)液的組分及其組 分濃度為：〇. 1υ/μ1Eas5rTaq DNA聚合酶；500μΜdNTP;20ml Tris-肥1，P冊(cè).3;100ml KCl ;3 ml MgC12。
[0012] 進(jìn)一步地，所述16條引物同時(shí)存在于同一反應(yīng)體系中的濃度分別為：Gk388F、 化-388R、LP-229F和LP-229R的濃度為150-300nM ;LPsgl-wzt-93F、LPsgl-wzt-93R、 llo0050-567F、llo0050-567R、Lmgy巧-785F、Lmgy巧-785R、化gy巧-692F、化gy巧-692R、 Lfgy巧-293F、LfgyrB-293R和Ldgy巧-471F的濃度為200-350nM ;LdgyrB-471R的濃度為 400-600nM。
[0013] 更進(jìn)一步地，所述16條引物同時(shí)存在于同一反應(yīng)體系中的濃度分別為： 化-388F、化-388R、LP-229F和LP-229R的濃度為200nM ;LPsgl-wzt-93F、LPsgl-wzt-93R、 llo0050-567F、llo0050-567R、Lmgy巧-785F、Lmgy巧-785R、化gy巧-692F、化gy巧-692R、 LfgyrB-293F、LfgyrB-293R和Ldgy巧-471F的濃度為250nM ;LdgyrB-471R的濃度為500nM。
[0014] 進(jìn)一步地，所述陽(yáng)性對(duì)照液還包括嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型基因組DM、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌 基因組DNA、麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌基因組DNA、博茲曼軍團(tuán)菌基因組DNA、杜氏軍團(tuán)菌基因組DNA和菲 氏軍團(tuán)菌基因組DNA。
[0015]另外，本發(fā)明還提供了一種用于軍團(tuán)菌快速檢測(cè)與分型的檢測(cè)方法，包括如下步 驟： S1應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取液提取待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)菌基因組DNA; S2W細(xì)菌基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌屬特異引物、嗜肺軍團(tuán)菌特 異引物、嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型特異引物、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌特異引物、麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌特異引物、博 茲曼軍團(tuán)菌特異引物、杜氏軍團(tuán)菌特異引物和菲氏軍團(tuán)菌特異引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； S3將陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液同時(shí)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； S4將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1 :94°C3min;階段2 : 94°C25s;階段3:55°C25s;階段4:72°C40s;35個(gè)循環(huán)；階段5:72°C5min;在4°C膽存。
[0017] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中軍團(tuán)菌屬特異引物擴(kuò)增的序列為388bp，所述嗜肺軍團(tuán) 菌特異引物擴(kuò)增的序列為229bp，所述嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型特異引物擴(kuò)增的序列為93bp， 所述長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌特異引物擴(kuò)增的序列為56化P，所述麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌特異引物擴(kuò)增的序列為 78化P，所述博茲曼軍團(tuán)菌特異引物擴(kuò)增的序列為69化P，所述杜氏軍團(tuán)菌特異引物擴(kuò)增的 序列為47化P，所述菲氏軍團(tuán)菌特異引物擴(kuò)增的序列為293bp。
[0018] 其中，所述軍團(tuán)菌屬特異引物（Gk388F)-(化-388R)擴(kuò)增的序列為388bp，該序 列為軍團(tuán)菌屬16SrDNA基因一段保守序列，具體序列如下：
所述嗜肺軍團(tuán)菌特異性引物（LP-229F) -(LP-229R)引物對(duì)擴(kuò)增的序列為229bp，該序 列為