專利名稱：固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞及d(-)-酒石酸或其鹽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工 程菌細(xì)胞的制備方法，以及使用固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞 制備D (-)-酒石酸或其鹽的方法。
背景技術(shù)：
D(-)-酒石酸，又名(2S，3S)-2，3-二羥丁烷-1，4-二羧酸，是天然L(+)-酒石 酸的同型異構(gòu)體，在自然界中極少存在，在制藥行業(yè)中它主要作為手性合成的 手性源及拆分劑。目前D(-)-酒石酸的需求量正在逐年遞增，迫切需要提高產(chǎn)量， 以滿足國內(nèi)外的需求。
當(dāng)前生產(chǎn)D(-)-酒石酸的方法有化學(xué)拆分法、生物拆分法、生物轉(zhuǎn)化法。 化學(xué)拆分法是指利用拆分劑實現(xiàn)DL-酒石酸分離得到D(-)-酒石酸和L(+)-酒石 酸，但這類手性拆分劑價格昂貴， 一次性拆分后對映體光學(xué)純度和得率較低， 且后續(xù)分離純化工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本居高不下；生物拆分法是指利用特殊的微 生物將DL-酒石酸中的L (+)-酒石酸耗竭而得到D (-)-酒石酸，但產(chǎn)物D (-)-酒 石酸的得率最高只有50%，制備成本高；生物轉(zhuǎn)化法是指利用微生物分泌表達的 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶("r印oxysuccinate hydrolase, ESH)將順式環(huán)氧琥 珀酸或其鹽催化水解為D(-)-酒石酸或其鹽，它具有酶立體專一性好、酶促反應(yīng) 快、產(chǎn)品光學(xué)純度和產(chǎn)品得率高、產(chǎn)品分離純化簡單易行，經(jīng)濟環(huán)保等特點， 已成為D(-)-酒石酸生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展方向。
中國專利文獻CN101481681A公開了利用重組技術(shù)構(gòu)建基因工程菌 pET22b-ESH-E. coli BL21 (DE3)的方法。其中ESH酶基因(GenBank登記號為 EU053208)來源于博得特氏菌BK-52 (Bo油tella sp. BK-52，保藏單位中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心；菌種保藏號為CGMCC No. 2075; 保藏日期2007年6月11日)，將該ESH酶基因插入pET22b載體中，在大腸桿 菌細(xì)胞中以胞內(nèi)酶的形式實現(xiàn)了高效表達，這是生物轉(zhuǎn)化法工業(yè)生產(chǎn)D (-)-酒石 酸的重大突破。但是用游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D(-)-酒石酸存在以下幾個問題(1) 基因工程菌細(xì)胞利用率低下。高順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力的基因工 程菌細(xì)胞只能使用一次，成本高，污染大。
(2) 基因工程菌細(xì)胞的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力偏低， 一般為3278 U/g。
由于順式環(huán)氧琥珀酸水解酶屬于胞內(nèi)酶，與底物接觸的機會受制于細(xì)胞膜的通 透性，導(dǎo)致其催化活性的降低。
(3) 產(chǎn)物雜質(zhì)多。在利用游離基因工程菌細(xì)胞催化順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽 生成D(-)-酒石酸或其鹽的反應(yīng)體系中存留有大量的菌體、蛋白等雜質(zhì)，增加了 后續(xù)產(chǎn)物分離純化工藝的負(fù)擔(dān)。
固定化微生物細(xì)胞是20世紀(jì)60年代酶學(xué)領(lǐng)域崛起的新技術(shù)，在化工、醫(yī) 藥、發(fā)酵、能源、食品等行業(yè)中實際運用效果顯著。它是利用化學(xué)或物理的手 段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，以利于細(xì)胞內(nèi)的一種酶或多種酶進行生 物催化，并保持細(xì)胞活性,可反復(fù)使用的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)游離細(xì)胞相比，固定
化細(xì)胞有如下優(yōu)點單位體積的菌體密度高、菌體易回收、酶活力高等。但目
前國內(nèi)外還沒有關(guān)于固定化細(xì)胞生產(chǎn)D(-)-酒石酸的報道。因此利用細(xì)胞固定化 技術(shù)生產(chǎn)D (-)-酒石酸具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的 方法，用以提高細(xì)胞內(nèi)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力和細(xì)胞使用率。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用上述固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基 因工程菌細(xì)胞生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了如下固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基
因工程菌細(xì)胞的方法在k -卡拉膠溶液中加入順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程 菌細(xì)胞充分混合均勻，將上述混合溶液冷卻直至充分凝固后再在氯化鉀溶液中 固定，然后將凝膠取出切成小塊，依次用蒸餾水和生理鹽水洗滌。
進一步地，本發(fā)明所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞為pET-ESH-￡ co/i，該基因工程菌細(xì)胞與所述k-卡拉膠溶液在42-45。C的條件下均勻混合， 冷卻溫度為4-10 。C ，所述氯化鉀溶液的濃度為0.1-0.5 mol/L，所述固定的 溫度為4-10。C，固定的時間為4-16 h。
進一步地，本發(fā)明所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞與k -卡拉膠 溶液在42 。C的條件下均勻混合，冷卻溫度為4 °C ，所述氯化鉀溶液的濃度為0.3 mol/L，所述固定的溫度為4 。C，固定的時間為10 h。
進一步地，本發(fā)明所述k -卡拉膠的濃度為20-60 g/L;相對于每升k -卡 拉膠溶液，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的添加量為20-120 g。
進一歩地，本發(fā)明所述k -卡拉膠的濃度為30-50 g/L;相對于每升ic -卡 拉膠溶液，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的添加量為40-100 g。
進一步地，本發(fā)明所述k -卡拉膠的濃度為40-50 g/L;相對于每升k -卡 拉膠溶液，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的添加量為60-80 g。
本發(fā)明使用固定化基因工程菌細(xì)胞制備D(-)-酒石酸或其鹽的方法是在順 式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液中加入固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞 進行酶促反應(yīng)，生成D(-)-酒石酸或其鹽。
進一步地，本發(fā)明所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞為pET-ESH-E coh'，所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的濃度為0.5-1.0mol/L，所述順式環(huán)氧 琥珀酸或其鹽溶液的pH值為6.0-8.0，所述酶促反應(yīng)的反應(yīng)溫度為30-40 °C。
進一步地，本發(fā)明所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的濃度為0.5mol/L，所 述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的pH值為7. O，所述酶促反應(yīng)的反應(yīng)溫度為30°C。
本發(fā)明所涉及的順式環(huán)氧琥珀酸鹽為順式環(huán)氧琥珀酸與各種陽離子形成的 鹽，陽離子包括但不僅限于銨離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子和鈣離子等。
本發(fā)明涉及順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-￡ BL21(DE3)，其制備方法已在中國專利文獻CN101481681A中公開，其中pET22b 為表達載體，ESH為順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，EcoJiBL21(DE3)為宿主細(xì)胞。該 專利文獻同時公開了一種用于編碼本發(fā)明所涉及的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的核 苷酸序列，其來源于分離純化的博德特氏菌(^^ofe"Jis sp.)，優(yōu)選為在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心保藏的保藏號為CGMCC No. 2075 的微生物。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所取得的有益效果在于
1. 本發(fā)明的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的順式環(huán)氧琥珀 酸水解酶活力為游離順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的4倍以上。
2. 填補了國內(nèi)外關(guān)于利用固定化基因工程菌細(xì)胞生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽技術(shù) 的空白。
3. 本發(fā)明利用固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞制備D(-)-酒石 酸或其鹽的方法，與游離基因工程菌細(xì)胞相比，具有細(xì)胞利用率高、酶活力高的優(yōu)點，具體體現(xiàn)在以下幾個方面
(1) 固定化技術(shù)使基因工程菌細(xì)胞的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力有了大幅 度的提高；
(2) 固定化技術(shù)使基因工程菌細(xì)胞得以循環(huán)利用；
(3) 本發(fā)明所涉及的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞重復(fù)使 用10批后，D(-)-酒石酸產(chǎn)品光學(xué)純度和得率高。
生物材料樣品的保藏信息
保藏的生物材料樣品博德特氏菌(A rofe&Ws Sp.);
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC); 保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所
(郵編100101); 保藏日期2007年6月11日；
保藏登記號CGMCC No. 2075
具體實施例方式
在本發(fā)明的以下實施例中，有關(guān)的檢測方法如下
(1) 游離基因工程菌細(xì)胞順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力檢測方法0. 1 g經(jīng)
4 。C高速離心(5000Xg， 10 min)收獲的基因工程菌細(xì)胞用10 ml 0.5 mol/L 順式環(huán)氧琥珀酸鈉(pH7.0)懸浮后，30。C下震蕩反應(yīng)l h后，測定反應(yīng)液中 酒石酸的含量。酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下，1 g經(jīng)4 。C高速離心(5000 Xg， 10 min)收獲的基因工程菌細(xì)胞l h催化生成l Mraol酒石酸所需的酶量， 單位用U/g表示。
(2) 固定化基因工程菌細(xì)胞順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力檢測方法取由0. 1 g經(jīng)4 。C高速離心(5000Xg， 10 min)收獲的基因工程菌細(xì)胞制備而成的固定 化基因工程菌細(xì)胞(3*3*3腿3凝膠方塊)，用10 ml 0.5 mol/L順式環(huán)氧琥珀 酸鈉(pH7.0)懸浮后，3(TC下震蕩反應(yīng)lh后，測定反應(yīng)液中酒石酸的含量。 酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下，由lg經(jīng)4。C高速離心(5000Xg， 10min) 收獲的基因工程菌細(xì)胞制備而成的固定化基因工程菌細(xì)胞1 h催化生成1 Mmol 酒石酸所需的酶量，單位用U/g表示。
(3) 酒石酸含量的檢測方法取2.5 ml 10 g/L的偏釩酸銨于25 ml的容
7量瓶中，依次加入一定體積的酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1 ml 1 mol/L硫酸溶液，振 搖顯色，并用蒸餾水定容至刻度，測定顯色液在480 nm處的吸光度值，以酒石 酸加入量對顯色液480 nm處的吸光度值作線性回歸圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。依上述 步驟，以一定體積的樣品溶液替代一定體積的酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即可得樣品 顯色液在480 nm處的吸光度值，根據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算得到樣品溶液中 酒石酸的含量。
(4)固定化基因工程菌細(xì)胞機械強度測定方法將固定化基因工程菌凝膠 切制成10*10*10 mm3的立方體，置于天平上，用適當(dāng)重量的砝碼對其正面逐漸 均勻加壓直至壓扁不再彈回或破裂時，用破裂時天平上的數(shù)值表征固定化基因 工程菌細(xì)胞的平均機械強度，單位用g/cm2表示。
實施例1:
根據(jù)中國發(fā)明專利申請CN101481681A所揭示的方法制備得到順式環(huán)氧琥珀 酸水解酶基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-￡ coh' BL21 (DE3)。將1 g經(jīng)4 。C高速 離心(5000 Xg， 10 min)收獲的游離基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-￡ BL21(DE3)(游離基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-A coh'BL21 (DE3)的順式環(huán)氧琥 珀酸水解酶活力為3278 U/g)加入到10 ml 30 g/lk -卡拉膠溶液中，于42 。C 的條件下混合均勻，4。C的條件下冷卻，凝固后用0.3mol/L氯化鉀溶液于4。C 的條件下固定10h。取部分凝膠，將凝膠切成3*3*3 mm3的小塊，依次分別用蒸 餾水和生理鹽水洗滌。結(jié)果顯示，上述固定化基因工程菌pET22b-ESH-￡ co7j' BL21 (DE3)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為29047 U/g，機械強度達1107 g/cm2。
實施例2:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為l g， k-卡拉膠濃度為20 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的 固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為22935 U/g，機械強度達1664 g/cm2。
實施例3:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為l g， k-卡拉膠濃度為40 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的
8固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為31777 U/g，機械強度達1019
g/cm2。
實施例4:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為1 g， k -卡拉膠濃度為50 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的 固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為31126 U/g，機械強度達1402 g/cm2。
實施例5:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為l g， k -卡拉膠濃度為60 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的 固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為27094 U/g，機械強度達2255 g/cm 。
實施例6:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為0.2 g， k-卡拉膠濃度為30 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為13885 U/g，機械強度達 759 g/cm2。
實施例7:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為0.4g， k -卡拉膠濃度為30 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為23570 U/g，機械強度達 1183 g/cm2。
實施例8:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為0.6 g， k-卡拉膠濃度為30 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為29325 U/g，機械強度達1383 g/cm2。 實施例9:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為0.7g， k-卡拉膠濃度為30 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為30729 U/g，機械強度達 1398g/cm2。
實施例10:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為0.8g， k-卡拉膠濃度為30 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為31151 U/g，機械強度達 1357 g/cm2。
實施例11:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為1.2g， k -卡拉膠濃度為30 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為23013 U/g，機械強度達 631 g/cm2。
實施例12:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞加入 量為0.7g， k -卡拉膠濃度為40 g/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到
的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為33545 U/g，機械強度達 1529 g/cm2。
實施例13:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞與k -卡拉膠溶液的混勻溫度為45。C，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的固定 化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為29000 U/g，機械強度達1107 g/cm2。實施例14:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中基因工程菌細(xì)胞與K -卡拉膠溶液混勻后，冷卻溫度為io。c，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到 的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為29007 U/g，機械強度達 1106 g/cm2。
實施例15:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中氯化鉀溶液的濃度為 0.1mol/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的固定化基因工程菌的順式 環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為29017 U/g，機械強度達1100 g/cm2。
實施例16:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中氯化鉀溶液的濃度為 0.5mol/L，其余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的固定化基因工程菌的順式 環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為29023 U/g，機械強度達1110 g/cm2。
實施例17:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中固定溫度為10。C，其 余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水 解酶活力為29013 U/g，機械強度達1106 g/cm2。
實施例18:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中固定時間為4h，其余 條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水解 酶活力為29021 U/g，機械強度達1105 g/cm2。
實施例19:
按實施例1的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞，其中固定時間為16 h，其 余條件不變。結(jié)果顯示，所制備得到的固定化基因工程菌的順式環(huán)氧琥珀酸水 解酶活力為29024 U/g，機械強度達1109 g/cm2。
ii對比例
用0. 1 g游離基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-& BL21 (DE3)于200 ml 0. 5 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉(pH7.0)中，30。C恒溫條件下，慢速攪拌轉(zhuǎn)化20 h， 轉(zhuǎn)化率達100%， D(-)-酒石酸對映體過量值(enantiomeric excess)為99. 9%。 反應(yīng)結(jié)束后，4 。C高速離心(5000Xg， 10 min)回收游離基因工程菌細(xì)胞，將 其重新投入200 ml 0.5 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉(pH 7.0)中，30 。C轉(zhuǎn)化20 h，轉(zhuǎn)化率為35%, D(-)-酒石酸對映體過量值為99. 7%。繼續(xù)重復(fù)以上步驟(過 濾回收游離基因工程菌細(xì)胞，于上述條件下轉(zhuǎn)化)8次后，即游離基因工程菌細(xì) 胞重復(fù)使用了10次后，轉(zhuǎn)化率基本為09L
實施例20:
按實施例12的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-A BL21(DE3)，取相當(dāng)于由0. 1 g游離基因工程菌細(xì)胞制備而成的固定化基因工 程菌細(xì)胞，將該固定化基因工程菌細(xì)胞加入到pH為7.0、濃度為0.5mol/L的 200 ml順式環(huán)氧琥珀酸鈉中，3(TC恒溫條件下，慢速攪拌轉(zhuǎn)化4 h，轉(zhuǎn)化率達 100%， D(-)-酒石酸對映體過量值為99.9%。反應(yīng)結(jié)束后，過濾回收固定化基因 工程菌細(xì)胞，將其重新投入200 ml 0. 5 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉(pH 7. 0)中， 30 。C轉(zhuǎn)化4 h，轉(zhuǎn)化率為99. 5%， D(-)-酒石酸對映體過量值為99. 8%。繼續(xù) 重復(fù)以上步驟(過濾回收固定化基因工程菌細(xì)胞，于上述條件下轉(zhuǎn)化)8次后， 即固定化基因工程菌細(xì)胞重復(fù)使用了 IO次后，轉(zhuǎn)化率為93%， D(-)-酒石酸對映 體過量值為99.6%。與對比例相比，轉(zhuǎn)化10批后，固定化基因工程菌細(xì)胞的底 物轉(zhuǎn)化率(93%)遠(yuǎn)高于游離基因工程菌細(xì)胞(0%)。
實施例21:
按實施例12的方法制備固定化基因工程菌細(xì)胞pET22b-ESH-￡ BL21(DE3)，取相當(dāng)于由O. 1 g游離基因工程菌細(xì)胞制備而成的固定化基因工程 菌細(xì)胞加入到200 ml 0.5 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉(pH 7.0)中，40 。C恒溫 條件下，慢速攪拌轉(zhuǎn)化4 h，轉(zhuǎn)化率為100%， D(-)-酒石酸對映體過量值為99. 9%。
實施例22:
12按實施例21的方法生產(chǎn)D(-)-酒石酸，其中順式環(huán)氧琥珀酸鈉的濃度為1. 0mol/L，體積為100 ml，其余條件不變，轉(zhuǎn)化率為95%， D(-)-酒石酸對映體過量值為99. 8%。
實施例23:
按實施例21的方法生產(chǎn)D(-)-酒石酸，其中順式環(huán)氧琥珀酸鈉的pH為6. 0，其余條件不變，轉(zhuǎn)化率為96%， D(-)-酒石酸對映體過量值為99.8%。
實施例24:
按實施例21的方法生產(chǎn)D(-)-酒石酸，其中順式環(huán)氧琥珀酸鈉的pH為8. 0，其余條件不變，轉(zhuǎn)化率為93%， D(-)-酒石酸對映體過量值為99.7%。
以上實施例所用的基因工程菌pET22b-ESH-《 乃'BL21(DE3)，其中，pET22b為表達載體，￡ coh'BL21(DE3)為宿主細(xì)胞。本發(fā)明還可采用其它表達載體，例如pET15b、 pET28a、 pET39b、 pPR。EX HTb或pGEX-4T-2等;宿主細(xì)胞還可以使用K DH5a、 ￡ JM109、 ￡ co/i TG1或f co7j' Top10
等。將構(gòu)建的這些順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌進行固定化實驗，實驗結(jié)果與以上實施例基本一致。
權(quán)利要求
1.一種固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的制備方法，其特征是在κ-卡拉膠溶液中加入順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞充分混合均勻，將上述混合溶液冷卻直至充分凝固后再在氯化鉀溶液中固定，然后將凝膠取出切成小塊，依次用蒸餾水和生理鹽水洗滌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的制備方法，其特征是所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞為pET-ESH-￡ co力'，該基因工程菌細(xì)胞與所述k-卡拉膠溶液在42-45 。C的條件下均勻混合， 冷卻溫度為4-10 。C ，所述氯化鉀溶液的濃度為0.1-0.5 mol/L，所述固定的 溫度為4-10。C，固定的時間為4-16 h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的 制備方法，其特征是所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞與k -卡拉膠 溶液在42 0C的條件下均勻混合，冷卻溫度為4。C ，所述氯化鉀溶液的濃度為 0.3 mol/L，所述固定的溫度為4 。C，固定的時間為10 h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì) 胞的制備方法，其特征是所述k -卡拉膠的濃度為20-60 g/L;相對于每升K -卡拉膠溶液，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的添加量為20-120 g。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的 制備方法，其特征是所述k -卡拉膠的濃度為30-50 g/L;相對于每升k -卡 拉膠溶液，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的添加量為40-100 g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的 制備方法，其特征是所述k-卡拉膠的濃度為40-50 g/L;相對于每升k-卡 拉膠溶液，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的添加量為60-80 g。
7. —種使用權(quán)利要求l的固定化基因工程菌細(xì)胞制備D(-)-酒石酸或其鹽的 方法，其特征是在順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液中加入固定化順式環(huán)氧琥珀酸 水解酶基因工程菌細(xì)胞進行酶促反應(yīng)，生成D(-)-酒石酸或其鹽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備D(-)-酒石酸或其鹽的方法，其特征是所述 固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞為pET-ESH-￡ h'，所述順式環(huán) 氧琥珀酸或其鹽溶液的濃度為0. 5-1. 0 mol/L，所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液 的pH值為6.0-8.0，所述酶促反應(yīng)的反應(yīng)溫度為30-40 °C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備D(-)-酒石酸或其鹽的方法，其特征是所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的濃度為0. 5 mol/L，所述順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽 溶液的pH值為7. 0，所述酶促反應(yīng)的反應(yīng)溫度為30 °C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞及D(-)-酒石酸或其鹽的制備方法。本發(fā)明固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的制備方法是在κ-卡拉膠溶液中加入順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞充分混合均勻，將上述混合溶液冷卻至充分凝固后再在氯化鉀溶液中固定，然后將凝膠取出切成小塊，依次用蒸餾水和生理鹽水洗滌。在順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液中加入上述固定化基因工程菌細(xì)胞進行酶促反應(yīng)，則生成D(-)-酒石酸或其鹽。本發(fā)明的固定化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞pET-ESH-E.coli的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力為游離順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌細(xì)胞的4倍以上，可循環(huán)利用，并使D(-)-酒石酸產(chǎn)品光學(xué)純度和得率提高。
文檔編號C12N11/00GK101649314SQ20091015248
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月14日
發(fā)明者張建國, 潘海峰, 謝志鵬, 鮑文娜 申請人:杭州寶晶生物化工有限公司