專利名稱：用干擾素誘導(dǎo)蛋白esat6修飾禽流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用反向遺傳操作技術(shù)體外對禽流
感病毒進行修飾、加工的方法，以獲得新的修飾病毒，用于其在抗感染免疫機理研究及免疫 預(yù)防方面的用途。
背景技術(shù)：
禽流感病毒不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失，對人類公共衛(wèi)生健康也有巨大威脅。摸 清禽流感病毒與機體相互作用機制，對于預(yù)防禽流感有重要意義。禽流感病毒屬于正粘病 毒科，流感病毒屬A型病毒，是有囊膜、多形態(tài)的單股負(fù)鏈RNA病毒，其病毒基因組由8個節(jié) 段組成，編碼11種蛋白。其中，血凝素蛋白HA、神經(jīng)氨酸酶NA、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是病毒的主 要毒力基因，變異性也較大。機體抗禽流感病毒感染主要體現(xiàn)在抗HA/NA中和抗體及各類 細(xì)胞因子，而細(xì)胞因子因不同禽流感病毒有很大差異。部分高致病力毒株感染機體后會產(chǎn) 生大量促炎細(xì)胞因子，而導(dǎo)致機體產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，而使機體迅速衰竭死亡；部分低致病 力禽流感病毒又會出現(xiàn)免疫抑制的現(xiàn)象，促使機體極易發(fā)生繼發(fā)感染。而特異性免疫反應(yīng) 與機體產(chǎn)生的固有免疫反應(yīng)類型有很大關(guān)系，其中，固有免疫反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFNs有 重要作用。目前，圍繞禽流感病毒、甲型H1N1流感病毒與剌激機體產(chǎn)生IFNs機理研究成為 一個熱點和難點。我們試圖利用干擾素誘導(dǎo)蛋白體外修飾禽流感病毒入手，用修飾病毒感 染敏感動物，觀察IFN及其他天然免疫路徑的差異以及對特異性免疫應(yīng)答的影B向，從另一 個視角來觀察和探索禽流感病毒及流感病毒機體抗感染免疫機制，為開發(fā)更好的藥物和疫 苗奠定基礎(chǔ)。 體外修飾禽流感病毒或流感病毒技術(shù)源于流感病毒反向遺傳操作技術(shù)，起初，人 們?yōu)榱烁玫罔b別和篩選從體外培養(yǎng)細(xì)胞中拯救獲得的流感病毒，將標(biāo)記基因CAT整合到 流感病毒基因中，與輔助病毒共同感染獲得。利用這一技術(shù)，人們也開始嘗試用一些功能基 因標(biāo)記或以病毒為載體，表達外源蛋白。如HIV-1病毒gpl20蛋白的gp41蛋白胞內(nèi)域中高 度保守的片段插入在流感病毒HA片段的抗原位點上，從而誘導(dǎo)出對于外源片段的免疫反 應(yīng)。有的是將目的基因和流感病毒的基因進行物理連接，在這種方法中外源基因的轉(zhuǎn)錄和 翻譯是作為流感病毒基因的一部分進行的。另一種方法是將外源基因作為一個獨立的片段 進行表達。近十年中，流感病毒反向遺傳技術(shù)、標(biāo)記技術(shù)和外源蛋白修飾技術(shù)都取得了很大 進步，不再依賴輔助病毒，可以完全用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞，即可獲得病毒。但在這十年的嘗 試中，人們發(fā)現(xiàn)，利用現(xiàn)在的12質(zhì)粒系統(tǒng)或8質(zhì)粒系統(tǒng)進行體外修飾并不容易。因此，能夠 獲得修飾病毒的依然是鳳毛麟角。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是通過分子生物學(xué)技術(shù)，將已經(jīng)構(gòu)建的禽流感病毒反向遺傳操作 系統(tǒng)，用外源基因修飾禽流感病毒基因(對病毒部分基因進行缺失、修飾)的方法，獲得新 的修飾病毒，為進一步闡述禽流感病毒感染免疫機理、開發(fā)更好的藥物或疫苗打好基礎(chǔ)。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用干擾素誘導(dǎo)蛋白ESAT6修 飾禽流感病毒的方法，它是采用結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶ESAT6基因?qū)η萘鞲胁《?進行修飾。 進一步的技術(shù)措施是上述用干擾素誘導(dǎo)蛋白ESAT6修飾禽流感病毒的方法，是
在建立禽流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上，拼接入外源DNA。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著的進步和突出的特點 1、選用ESAT6蛋白，該蛋白基因僅為288bp，分子量小，容易實施操作。 2、所選用的ESAT6蛋白，是具有T細(xì)胞多功能表位的分泌蛋白，其主要功能是剌激
機體產(chǎn)生IFN，這在研究病毒抗感染免疫機理路徑中具有獨特性。 3、采用的DNA修飾禽流感病毒技術(shù)，是在建立禽流感病毒反向遺傳八質(zhì)粒操作系 統(tǒng)基礎(chǔ)上進行的，選擇的剪切、拼接位點具有獨特性。 4、在DNA修飾禽流感病毒基因后，修飾病毒拯救時，既不影響禽流感病毒蛋白的 轉(zhuǎn)錄、翻譯和病毒包裝，又能同時產(chǎn)生ESAT6蛋白。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作更加詳盡的描述。
圖1是本發(fā)明修飾方案的第一種實施例；
圖2是本發(fā)明修飾方案的第二種實施例；
圖3是本發(fā)明修飾方案的第三種實施例。
具體實施例方式
1.ESAT6基因的克隆 ①結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組的提取在P3實驗室生物安全柜中操作，取
500ul結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv培養(yǎng)物于1. 5ml管中，加入lml無水乙醇，密封。取出，放
于-2(TC過夜，4t:，12000rpm離心，去上清，空干，將沉淀用100ul滅菌水溶解，煮沸10min，
再按常規(guī)操作提取細(xì)菌基因組DNA。 ②取細(xì)菌基因組DNA進行PCR 在25uL體系中， 10 X buffer 2. 5uL Mg2+ 1.5uL(25mM)， dNTP luL(25mM) 修飾DNA1 luL(10pmol/mL) 修飾DNA2 luL (10pmol/mL) TaqDNA聚合酶lu (5u/uL) 加入制備的DNA模板25ng 最后用無菌去離子水補至25uL。95°C 3min，50。C 30s，72。C 30s， 30循環(huán)后，72°C 8min。獲得產(chǎn)物在2%凝膠上進行 電泳，有預(yù)期帶，測序，序列進行blast驗證。
修飾方案一
4
圖l示出了修飾方案的第一種實施例先將ESAT6基因獲得后，用PCR引物直接擴 增的方法，在ESAT6基因5'末端加入禽流感病毒NA基因組5' NCR序列，在ESAT6基因3' 端用具有蛋白切割活性的口蹄疫病毒2A酶基因修飾；同時用PCR方法將禽流感病毒NA基 因cDNA5' NCR部分去除，裸露5' 0RF起始序列；再用融合PCR方法將ESAT6-2A與NA基因
兩段序列進行拼接。 1.ESAT6基因的修飾 獲得的ESAT6基因，通過PCR方法，在ESAT6基因5'末端加入禽流感病毒NA基因
組5'端NCR序列，在ESAT6基因3'端連接具有蛋白切割活性的口蹄疫病毒2A酶基因。 在25uL體系中， 10 X buffer 2. 5uL Mg2+ 1.5uL(25mM)， dNTP luL(25mM) 修飾DNA3 luL (10pmol/mL) 修飾DNA4 luL (10pmol/mL) TaqDNA聚合酶lu (5u/uL) 加入制備的DNA模板25ng 最后用無菌去離子水補至25uL。95°C 3min，58。C 30s，72。C 30s， 30循環(huán)后，72°C 8min。獲得產(chǎn)物在2%凝膠上進行 電泳，有預(yù)期帶，測序，序列進行blast驗證。
TCCGACGTGGG
TTTCGCGGGCC ACGGCGCGCAAGGGTTTTTCG
CCGGCCACGTG
ggagacgttga
gtccaaccccggg
2.改造修飾序列的拼接 將ESAT6-2A基因及NA基因分別用T4聚合酶作用和T4連接酶作用，再將連接產(chǎn) 物用修飾DNA1和修飾DNA4作為引物，進行PCR擴增，獲得圖l所示人工修飾拼接的基因 ESAT6-2A-NA。 T4聚合酶作用體系及程序為
10 X buffer 5uL
1%0BSA 5uL
dATP luL(10mM)
加入制備的DNA模板3ug
最后用無菌去離子水補至45uL
70°C lOmin后冰浴 加入T4DNA聚合酶5u (5u/uL) 12°C 20min，95。C 3min滅活。獲得產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在以下體系中進行連接 10 X buffer luLESAT6-2A基因lOOng NA基因 lOOng T4聚合酶0. 5uL 用無菌去離子水補至lOuL 置于16"連接2h，取luL連接產(chǎn)物進行PCR 在25uL體系中， 10 X buffer 2. 5uL Mg2+ 1.5uL(25mM)， d證luL(25mM) 修飾DNA1 luL(10pmol/mL) 修飾DNA4 luL(10pmol/mL) TaqDNA聚合酶lu (5u/uL) 加入制備的DNA模板luL 最后用無菌去離子水補至25uL。95 。C 3min，58。C 30s，72。C 30s， 30循環(huán)后，72 。C 8min。獲得產(chǎn)物在1%凝膠上 進行電泳，有預(yù)期帶，測序，序列進行blast驗證。獲得圖1所示人工修飾拼接的基因 ESAT6-2A-NA。
TCCGACGTGGG
TTTCGCGGGCC
TGGGTCAGCAT
ttcgacctcct caagttggcgggagacgttgagtccaaccccgggA TGAATCCA。。。。。。
AAAAAAACTCCTTGTTTCTACT 修飾方案二 圖2示出了修飾方案的第二種實施例先將ESAT6基因獲得后，用PCR引物直接擴 增的方法，在ESAT6基因5'端用具有蛋白切割活性的口蹄疫病毒2A酶基因修飾，用PCR方 法將禽流感病毒NS基因組中NS1末端部分序列去除，形成兩段序列，利用T4聚合酶外切酶 活性將3個片段兩兩拼接，最終形成NS-ESAT6-NS片段。
1.ESAT6基因的修飾 獲得的ESAT6基因，通過PCR方法，在ESAT6基因5'末端加入口蹄疫病毒2A基因。
在25uL體系中，
10 X buffer 2. 5uL
Mg2+ 1.5uL(25mM)，
dNTP luL(25mM)
修飾DNA7 luL (10pmol/mL)
修飾DNA8 luL(10pmol/mL)
TaqDNA聚合酶lu (5u/uL)
加入制備的DNA模板25ng
最后用無菌去離子水補至25uL。95°C 3min，58。C 30s，72。C 30s， 30循環(huán)后，72°C 8min。獲得產(chǎn)物在2%凝膠上進行 電泳，有預(yù)期帶，測序，序列進行blast驗證。
修飾后的ESAT6為
aacttcgacctcc1 AACCCGGGAGC
CAGCAAAACAA
CGGGGCTGCAG
GACCAGGCCAT
CGCGGGCTTGTTC
2.NS基因的切割 NS基因序列反向擴增，獲得中間部分缺失的序列(1-408， 528-890)
Pl:AGCAAAAGCAGGGTG
P2 :CGTCTTTATCCATTATTG
P3 :GACATACTGAAGAGGATGTC
P4 :TTAGTAGAAACAAGGGTG
擴增體系及程序與方案一中相同，Tm值50°C
獲得兩段序列，分別為
①
TTTGGCATGTC
TCCCTAAGAGG
TCTGGAAGAAG
TTGAGGAAATG
GCAATAATGGA0115] 0116] 0117] 0118] 0119] 0120] 0121] 0122] 0123] 0124] 0125] 0126] 0127]
TAAAGACG
TTCTACT
3. T4聚合酶的外切酶和T4連接酶，拼接三段序列，獲得如下修飾序列 T4聚合酶作用體系及程序同方案一。 T4連接酶體系同方案一。
將連接產(chǎn)物進行PCR擴增，獲得產(chǎn)物在2%凝膠上進行電泳，有預(yù)期帶，測序，序列 進行blast驗證。 0128] 最終獲得拼接修飾基因 0129] 修飾方案三
0130] 圖3示出了修飾方案的第三種實施例將獲得的ESAT6基因兩端直接用禽流感病 毒NS基因組NCR部分進行拼接、修飾，獲得能夠組裝入禽流感病毒基因組的ESAT6基因。 0131] 在100uL體系中， 0132] 10X buffer 10uL 0133] Mg2+ 6uL(25mM)， 0134] d證 luL(25mM) 0135] 修飾DNA5 4uL(10pmol/mL) 0136] 修飾DNA6 4uL(10pmol/mL) 0137] TaqDNA聚合酶lu (5u/uL) 0138]加入制備的DNA模板100ng 0139] 最后用無菌去離子水補至100uL。
0140]95°C 3min，52。C 30s，72。C 30s， 30循環(huán)后，72°C 8min。獲得產(chǎn)物在2%凝膠上進行 電泳，有預(yù)期帶，測序，序列進行blast驗證。 0141] 0142]
AAATGCGCTGC
0143] AGGGGCTCATT
0144]
ATCGCGGGCTT
0145] GTTCAAAAAACACCCTTGTTTCTACT
權(quán)利要求
一種用干擾素誘導(dǎo)蛋白ESAT6修飾禽流感病毒的方法，其特征在于，采用結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶ESAT6基因?qū)η萘鞲胁《具M行修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用干擾素誘導(dǎo)蛋白ESAT6修飾禽流感病毒的方法，其特征在 于，在建立禽流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上，拼接入外源DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用干擾素誘導(dǎo)蛋白ESAT6修飾禽流感病毒的方法。它是采用結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶ESAT6基因?qū)η萘鞲胁《具M行修飾，是在建立禽流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)基礎(chǔ)上，拼接入外源DNA的方法。所選用的ESAT6蛋白，是具有T細(xì)胞多功能表位的分泌蛋白，其主要功能是刺激機體產(chǎn)生IFN，這在研究病毒抗感染免疫機理路徑中具有獨特性。在DNA修飾禽流感病毒基因后，修飾病毒拯救時，既不影響禽流感病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和病毒包裝，同時又可產(chǎn)生ESAT6蛋白。
文檔編號C12R1/93GK101792775SQ20091019389
公開日2010年8月4日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者羅琴芳, 郭霄峰, 黃韌 申請人:廣東省實驗動物監(jiān)測所;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院