專利名稱：水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻功能基因組學(xué)應(yīng)用方法，特別涉及一種水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo) 蛋白基因克隆的方法。
背景技術(shù)：
水稻是三大糧食作物之一，超過世界人口總數(shù)三分之一的人將其作為食 物的主要來源，它在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。隨著世界人口的不斷 增加以及對(duì)糧食需求的加大，每年對(duì)水稻的需求量都在不斷的上升，在土地 面積日趨縮小的今天，如何使水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)以緩解因人口的增加給水稻生 產(chǎn)帶來的壓力是世界范圍內(nèi)所面臨的難題，也是擺在科研工作者面前的一個(gè) 重大科研課題。盡管傳統(tǒng)的遺傳研究和常規(guī)育種已經(jīng)為水稻的產(chǎn)量提高和品 質(zhì)改善作出了重要貢獻(xiàn)，但是由于稻屬種質(zhì)資源及常規(guī)育種方法的局限性， 給水稻進(jìn)一步的遺傳改良帶來一定的困難。隨著分子生物學(xué)、分子標(biāo)記育種、 基因組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展和水稻基因組計(jì)劃的實(shí)施，給水稻的生產(chǎn) 和育種帶來了新機(jī)遇。但是嚴(yán)重缺乏擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要功能基因是嚴(yán) 重制約我國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種高水平發(fā)展的一個(gè)"瓶頸"。目前水稻基因組序列 的測(cè)定和水稻功能基因組研究的成果將對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮重要影響，加快
農(nóng)作物品種的更新?lián)Q代。國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃啟動(dòng)于1998年，由政府和 其它公共資金支持，中國(guó)、日本、美國(guó)、法國(guó)等ll個(gè)國(guó)家和地區(qū)共同發(fā)起并 承擔(dān)了這項(xiàng)龐大的科研任務(wù)。這是繼人類基因組計(jì)劃后的又一重大國(guó)際合作 的基因組研究項(xiàng)目[Takuji Sasaki da/.， 2000]。水稻基因組相對(duì)于玉米、小麥 等禾谷類作物小，約420-460M個(gè)堿基，基因數(shù)約3-5萬(wàn)個(gè)，被國(guó)際上廣泛選為 模式作物，進(jìn)行基因組測(cè)序和功能基因組研究。隨著去年水稻全基因組測(cè)序 草圖的完成和精確測(cè)序的完成[JunYu"a/., 2002; Stephen A.Goff"a/.， 2002; QiFeng， "a/.， 2003; SasakiT&a/.， 2003]，水稻的研究重點(diǎn)由結(jié)構(gòu)基因組
4學(xué)開始向功能基因組學(xué)轉(zhuǎn)移，功能基因組學(xué)的研究現(xiàn)已經(jīng)成為全球研究的重 點(diǎn)，由于基因組序列研究成果的國(guó)際共享性，為人們利用該研究成果進(jìn)入水 稻基因資源的竟?fàn)幪峁┝诵碌臋C(jī)遇。特別是，這樣的局面為中國(guó)開展功能基 因組研究，發(fā)現(xiàn)重要功能基因，實(shí)現(xiàn)基因組研究的跨越式發(fā)展提供了千載難 逢的機(jī)會(huì)。誰(shuí)先克隆了基因，'誰(shuí)就享有該基因的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。反之，就喪失主 動(dòng)權(quán)，就會(huì)受治于人。為了在這場(chǎng)"基因大戰(zhàn)"中取得勝利，世界上一些發(fā)達(dá)國(guó)
家及大的跨國(guó)公司紛紛投巨資于這一領(lǐng)域的研究[HieterP""/.， 1997]。在美 洲，美國(guó)、加拿大投巨資于玉米、小麥基因的研究；在歐洲，英國(guó)JohnI皿es 研究中心從杜邦公司每年得到l-2千萬(wàn)英鎊從事小麥基因的研究；在亞洲，日 本、韓國(guó)等投巨資從事水稻基因研究；在澳洲，澳大利亞政府投巨資成立了 小麥分子育種合作研究中心，每年投入上千萬(wàn)澳元從事小麥分子育種研究。 人們預(yù)計(jì)，在未來的10-20年時(shí)間內(nèi)，國(guó)際上的"基因大戰(zhàn)"將會(huì)愈演愈烈。在 功能基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的研究領(lǐng)域，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)一批 具有重要生理活性和開發(fā)應(yīng)用前景的功能基因是未來工作和研究的重點(diǎn)，從 而為我國(guó)以基因和基因表達(dá)產(chǎn)物為基礎(chǔ)的動(dòng)植物遺傳改良奠定基礎(chǔ)，更有力 地推動(dòng)我國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。隨著2002年全球水稻基因組測(cè)序 計(jì)劃的完成和水稻全基因組序列的公布，水稻功能基因組學(xué)的研究現(xiàn)已成為 世界范圍內(nèi)研究的重點(diǎn)，了解這些基因在生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用越來越受到人 們的關(guān)注。
因此，提供一種水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因克隆的方法，已成為該領(lǐng)域科 研人員急需研究開發(fā)的新課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基 因克隆的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 一種水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白 基因克隆的方法，其特征在于實(shí)施步驟如下 (1)水稻轉(zhuǎn)化受體的制備 水稻品種日本晴成熟后的種子脫殼，先用70%酒精浸泡1分鐘，然后用0.1%升汞溶液滅菌20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3次，吸干后接種到NBo培養(yǎng)基 上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度25士rC， l周后，挑取愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代2 周后，取出愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
(2) 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
挑取農(nóng)桿菌單菌落到含有50mg/L Kanamgcin和20mg/ L Rifampicin的 YEP液體培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，使菌液濃度達(dá)到OD值0.5，再 取lmL菌液加到含有同樣抗生素濃度的AB和0.5%蔗糖的100mL溶液中繼 續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)左右，使OD值達(dá)到0.8。將上述菌液置于50mL離心管中， 4000rpm離心20分鐘，去除上清，加入同原菌液等量的AAM培養(yǎng)基，重新 懸?。恢貜?fù)上述做法，再離心，去掉上清，再用AAM懸浮，使OD值約0.4; 將愈傷組織在農(nóng)桿菌液中浸泡30分鐘；然后將愈傷組織移至干燥的滅菌濾紙 上，吸去多余的菌液，最后將愈傷組織置于其培養(yǎng)培養(yǎng)基NA上，共培養(yǎng)一 般2-3天。待愈傷組織周圍出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌落后，用500mg/L的Cefotaximine 和200mg/Lampicillin溶液充分漂洗，以后再置于選擇培養(yǎng)基NBDH。
(3) 抗性愈傷的篩選和植株再生 愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約10-15天后，大部分愈傷變褐死亡，一
些新鮮的抗性愈傷就陸續(xù)死亡的愈傷表面出現(xiàn)，挑取抗性愈傷于選擇培養(yǎng)基 上繼代20天左右，選擇黃色質(zhì)地堅(jiān)硬的愈傷抗性愈傷再轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基 NBP上，25天后待愈傷變白后就可以轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基NBR上，3天就開始 有綠點(diǎn)產(chǎn)生，IO天左右苗就陸續(xù)出來，30天左右就可以移苗于1/2MS培養(yǎng)基 上生根，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至8cm以上時(shí)，練苗7天時(shí)間就可以移入溫室中的土里種 植。
(4) T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)插入后代的突變體篩選 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化日本晴，獲得T-DNA插入群體。通過對(duì)To代各個(gè)時(shí)
期的表型的觀察和接種實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行突變體篩選。共發(fā)現(xiàn)突變體208個(gè)，突變 率為11.3%，表型涉及株高、葉片、穗型、生育期、穎花、穎殼著色、抗病 等，其中出現(xiàn)株高矮化突變體，后代分離接近3: 1，株高37cm，莖桿細(xì)， 多分蘗，株高層次分明。
(5 ) Tail-PCR (熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR)
6根據(jù)pCAMBIA1301T-DNA右邊界設(shè)計(jì)的三個(gè)嵌套式的特異性引物SPl， SP2和SP3分別距T-DNA右邊界重復(fù)序列297 bp， 234 bp和48 bp。通過切 膠回收第三次擴(kuò)增所得到的比第二次小的片斷，連接到pGM-T Easy載體(一 種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體)上，然后采用電擊法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 DH5a,然后通過測(cè)序獲得基因序列。 (6)網(wǎng)上序列比對(duì)分析
① 突變體T-DNA插入水稻基因組的位置處在水稻4號(hào)染色體上，與已知 水稻BAC克隆(BAC clone: OSJNBa0084K01)序列同源性達(dá)到97%;
② 生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因序列，該基因沒有內(nèi)含子，大小為462個(gè)堿基序
列；
③ 功能預(yù)測(cè)，通過網(wǎng)上比對(duì)認(rèn)為該基因與擬南芥生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因同 源性達(dá)到71%;通過網(wǎng)上搜索水稻cDNA克隆，找到了T-DNA插入位點(diǎn)上游 基因-生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因的cDNA克隆，證明該基因是存在的；
本發(fā)明在利用T-DNA標(biāo)簽法進(jìn)行水稻功能基因組研究時(shí)，獲得一個(gè)株 高矮小的水稻突變體，通過利用TAIL-PCR技術(shù)對(duì)突變體的側(cè)臨序列進(jìn)行研 究，同時(shí)經(jīng)過網(wǎng)上NCBI和TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)該突變體T-DNA插入水 稻基因組的位置處在水稻4號(hào)染色體上，并且已找到該位點(diǎn)所在的水稻BAC 克隆(OSJNBa0084K01)。經(jīng)過對(duì)該克隆的分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插在該克隆兩 個(gè)基因的中間位置。通過網(wǎng)上序列比對(duì)預(yù)測(cè)與BAC克隆編碼氨基酸序列同 源性很高的已知功能的基因。T-DNA插入位于大小為2699bp上游基因2.5kb 處，位于大小為462bp下游基因1.3kb處；通過網(wǎng)上比對(duì)分析，上游基因與 玉米4， 5， 7-三羥黃垸酮加雙氧酶基因同源性達(dá)到85%。下游基因與已知擬 南芥生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因同源性達(dá)到71%。通過對(duì)下游生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因 網(wǎng)上搜索，找到了該基因的cDNA克隆(002-148-C10),證明該基因是存在 的，通過cDNA與預(yù)測(cè)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因沒有內(nèi)含子， 大小為462bp。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明在研究突變體T-DNA插入側(cè)臨序列時(shí)，通 過TAIL-PCR獲得側(cè)臨序列，經(jīng)過網(wǎng)上NCBI和TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)T-DNA 插入水稻基因組的位置處在水稻4號(hào)染色體上，并且已找到該位點(diǎn)所在的水稻BAC克隆(OSJNBa0084K01)。經(jīng)過對(duì)該克隆的分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插在該克隆 兩個(gè)基因的中間位置。通過生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)該側(cè)臨序 列所在的一個(gè)基因與擬南芥上生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因同源性高達(dá)71%。該方法 實(shí)施步驟簡(jiǎn)單易行，實(shí)施條件寬松，效果非常顯著。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施步驟詳述如下
(1) 水稻轉(zhuǎn)化受體的制備 水稻品種日本晴成熟后的種子脫殼，先用70%酒精浸泡1分鐘，然后用
0.1%升汞溶液滅菌20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3次，吸干后接種到NBD培養(yǎng)基 上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度25士rC, l周后，挑取愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代2 周后，取出愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
(2) 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
挑取農(nóng)桿菌單菌落到含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP液體 培養(yǎng)基中，28"C振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，使菌液濃度達(dá)到OD值0.5，再取lmL菌 液加到含有同樣抗生素濃度的AB和0.5%蔗糖的lOOmL溶液中繼續(xù)培養(yǎng)17 小時(shí)左右，使OD值達(dá)到0.8。將上述菌液置于50mL離心管中，4000rpm離 心20分鐘，去除上清，加入同原菌液等量的AAM培養(yǎng)基，重新懸浮；重復(fù) 上述做法，再離心，去掉上清，再用AAM懸浮，使OD值約0.4;將愈傷組 織在農(nóng)桿菌液中浸泡30分鐘；然后將愈傷組織移至干燥的滅菌濾紙上，吸去 多余的菌液，最后將愈傷組織置于其培養(yǎng)培養(yǎng)基NA上，共培養(yǎng)一般2-3天。 待愈傷組織周圍出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌落后，用500mg/L的頭孢霉素和200mg/L氨節(jié) 青霉素溶液充分漂洗，以后再置于選擇培養(yǎng)基NBDH。
(3) 抗性愈傷的篩選和植株再生
愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約10-15天后，大部分愈傷變褐死亡，一 些新鮮的抗性愈傷就陸續(xù)死亡的愈傷表面出現(xiàn)，挑取抗性愈傷于選擇培養(yǎng)基 上繼代20天左右，選擇黃色質(zhì)地堅(jiān)硬的愈傷抗性愈傷再轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基 NBP上，25天后待愈傷變白后就可以轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基NBR上，3天就開始 有綠點(diǎn)產(chǎn)生，IO天左右苗就陸續(xù)出來，30天左右就可以移苗于1/2MS培養(yǎng)基 上生根，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至8cm以上時(shí)，練苗7天時(shí)間就可以移入溫室中的土里種植。 .
(4) T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)插入后代的突變體篩選 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化日本晴，獲得T-DNA插入群體。通過對(duì)T。代各個(gè)時(shí) 期的表型的觀察和接種實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行突變體篩選。共發(fā)現(xiàn)突變體208個(gè)，突變 率為11.3%，表型涉及株高、葉片、穗型、生育期、穎花、穎殼著色、抗病 等，其中出現(xiàn)株高矮化突變體，后代分離接近3: 1，株高37cm，莖桿細(xì)， 多分蘗，株高層次分明。
(5 ) Tail-PCR (熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR) 根據(jù)pCAMBIA1301T-DNA右邊界設(shè)計(jì)的三個(gè)嵌套式的特異性引物SP1， SP2和SP3分別距T-DNA右邊界重復(fù)序列297 bp， 234 bp和48bp。通過切 膠回收第三次擴(kuò)增所得到的比第二次小的片斷，連接到pGM-T Easy載體(一 種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體)上，然后采用電擊法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 DH5a，然后通過測(cè)序獲得基因序列。
(6)網(wǎng)上序列比對(duì)分析由上面分析可知P1424突變體T一DNA插入水 稻基因組的位置處在水稻4號(hào)染色體上，與已知水稻BAC克隆(BAC clone: OSJNBa0084K01 )序列同源性達(dá)到97%;通過分析發(fā)現(xiàn)該克隆含有兩個(gè)基因， T-DNA插在距上游基因1.3kb與下游基因2.7kb之間的位置上；通過分析插入 位點(diǎn)上游基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與未知功能基因的氨基酸序列同源性達(dá) 到75%，通過網(wǎng)上比對(duì)認(rèn)為該基因與擬南芥生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因同源性達(dá)到 71%，因此預(yù)測(cè)該基因的功能為生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因；同時(shí)對(duì)下游距離插入位 點(diǎn)較遠(yuǎn)的基因通過網(wǎng)上氨基酸序列比對(duì)，下游基因與水稻未知功能基因同源 性達(dá)到96%，與玉米4,5,7-三羥黃垸酮力tf雙氧酶基因同源性達(dá)到85%;為了 更進(jìn)一步證明所預(yù)測(cè)的基因到底是否存在，通過網(wǎng)上搜索水稻cDNA克隆， 找到了 T-DNA插入位點(diǎn)上游基因-生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因的cDNA克隆，證明該基 因是存在的，該cDNA序列與基因序列完全一致，說明該基因沒有內(nèi)含子， 大小為462個(gè)堿基序列。
上述參照實(shí)施例對(duì)水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因克隆的方法進(jìn)行的詳細(xì)描 述，是說明性的而不是限定性的，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和 修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因克隆的方法，其特征在于實(shí)施步驟如下(1)水稻轉(zhuǎn)化受體的制備水稻品種日本晴成熟后的種子脫殼，先用70％酒精浸泡1分鐘，然后用0.1％升汞溶液滅菌20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3次，吸干后接種到NBD培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度25±1℃，1周后，挑取愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代2周后，取出愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(2)水稻遺傳轉(zhuǎn)化挑取農(nóng)桿菌單菌落到含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)14小時(shí)，使菌液濃度達(dá)到OD值0.5，再取1mL菌液加到含有同樣抗生素濃度的AB和0.5％蔗糖的100mL溶液中繼續(xù)培養(yǎng)17小時(shí)，使OD值達(dá)到0.8；將上述菌液置于50mL離心管中，4000rpm離心20分鐘，去除上清，加入同原菌液等量的AAM培養(yǎng)基，即含有乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基，重新懸??；重復(fù)上述做法，再離心，去掉上清，再用AAM懸浮，使OD值為0.4；將愈傷組織在農(nóng)桿菌液中浸泡30分鐘；然后將愈傷組織移至干燥的滅菌濾紙上，吸去多余的菌液，最后將愈傷組織置于其培養(yǎng)基NA上，共培養(yǎng)一般2-3天；待愈傷組織周圍出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌落后，用500mg/L的頭孢霉素和200mg/L氨芐青霉素溶液充分漂洗，以后再置于選擇培養(yǎng)基NBDH；(3)抗性愈傷的篩選和植株再生愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約10-15天后，大部分愈傷變褐死亡，一些新鮮的抗性愈傷就陸續(xù)死亡的愈傷表面出現(xiàn)，挑取抗性愈傷于選擇培養(yǎng)基上繼代20天左右，選擇黃色質(zhì)地堅(jiān)硬的愈傷抗性愈傷再轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基NBP上，25天后待愈傷變白后就可以轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，3天就開始有綠點(diǎn)產(chǎn)生，10天左右苗就陸續(xù)出來，30天左右就可以移苗于1/2MS培養(yǎng)基上生根，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至8cm以上時(shí)，練苗7天時(shí)間就可以移入溫室中的土里種植；(4)T-DNA，即轉(zhuǎn)移DNA插入后代的突變體篩選通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化日本晴，獲得T-DNA插入群體；通過對(duì)T0代各個(gè)時(shí)期的表型的觀察和接種實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行突變體篩選；共發(fā)現(xiàn)突變體208個(gè)，突變率為11.3％，表型涉及株高、葉片、穗型、生育期、穎花、穎殼著色、抗病等，其中出現(xiàn)株高矮化突變體，后代分離接近3∶1，株高37cm，莖桿細(xì)，多分蘗，株高層次分明；(5)Tail-PCR，即熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR根據(jù)質(zhì)粒pCAMBIA1301 T-DNA右邊界設(shè)計(jì)的三個(gè)嵌套式的特異性引物SP1，SP2和SP3分別距T-DNA右邊界重復(fù)序列297bp，234bp和48bp；通過切膠回收第三次擴(kuò)增所得到的比第二次小的片斷，連接到pGM-T Easy載體上，即一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，然后通過電擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，然后通過測(cè)序獲得基因序列；(6)進(jìn)行網(wǎng)上序列比對(duì)分析由上面分析可知P1424突變體T-DNA插入水稻基因組的位置處在水稻4號(hào)染色體上，與已知水稻BAC克隆(BAC cloneOSJNBa0084K01)序列同源性達(dá)到97％；通過分析發(fā)現(xiàn)該克隆含有兩個(gè)基因，T-DNA插在距上游基因1.3kb與下游基因2.7kb之間的位置上；通過分析插入位點(diǎn)上游基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與未知功能基因的氨基酸序列同源性達(dá)到75％，與擬南芥生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因同源性達(dá)到71％，因此預(yù)測(cè)該基因的功能為生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因；同時(shí)對(duì)下游距離插入位點(diǎn)較遠(yuǎn)的基因通過網(wǎng)上氨基酸序列比對(duì)，下游基因與水稻未知功能基因同源性達(dá)到96％，與玉米4，5，7-三羥黃烷酮加雙氧酶基因同源性達(dá)到85％；為了更進(jìn)一步證明所預(yù)測(cè)的基因到底是否存在，通過網(wǎng)上搜索水稻cDNA克隆，找到了T-DNA插入位點(diǎn)上游基因-生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因的cDNA克隆，證明該基因是存在的，該cDNA序列與基因序列完全一致，說明該基因沒有內(nèi)含子，大小為462個(gè)堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因克隆的方法，其特征在于實(shí)施步驟包括(1)水稻轉(zhuǎn)化受體的制備；(2)水稻遺傳轉(zhuǎn)化；(3)抗性愈傷的篩選和植株再生；(4)T-DNA插入后代的突變體篩選；(5)Tail-PCR；(6)網(wǎng)上序列比對(duì)分析。本發(fā)明在利用T-DNA標(biāo)簽法進(jìn)行水稻功能基因組研究時(shí)，獲得一個(gè)株高矮小的水稻突變體，通過利用TAIL-PCR技術(shù)對(duì)突變體的側(cè)臨序列進(jìn)行研究，同時(shí)經(jīng)過網(wǎng)上NCBI和TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)該突變體T-DNA插入水稻基因組的位置處在水稻4號(hào)染色體上，并且已找到該位點(diǎn)所在的水稻BAC克隆(OSJNBa0084K01)。經(jīng)過對(duì)該克隆的分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插在該克隆兩個(gè)基因的中間位置。通過網(wǎng)上序列比對(duì)預(yù)測(cè)與BAC克隆編碼氨基酸序列同源性很高的已知功能的基因。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101492671SQ200810052139
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者孫守鈞, 李子芳, 峰 羅, 裴忠有 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院