專利名稱：一種金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金線蓮組培苗與菌根真菌共生得到金線蓮共生苗的方法。
背景技術(shù)：
金線蓮屬于蘭科開唇蘭屬的多年生草本植物，是民間使用較廣的一種傳統(tǒng)珍貴藥 材，多用于治療肺結(jié)核、肺熱咳嗽、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。近幾年來，金線蓮用于治療高血壓、糖 尿病及腫瘤等疑難病癥所取得的成效，日益引起醫(yī)藥界的重視，特別在臺灣，金線蓮有“中 藥之王”之稱。然而，金線蓮在自然界資源非常稀少，其中原因除了它對生態(tài)環(huán)境的要求非?？?刻及受自然界小動物和人們的破壞外，更主要的是，金線蓮的種子非常小，沒有完整的胚供 其發(fā)育，在自然條件下，需要內(nèi)生真菌的侵染為其提供營養(yǎng)才能發(fā)育成苗，這也是蘭科植物 一個普遍的特征。內(nèi)生真菌除了可為金線蓮等蘭科植物提供營養(yǎng)物質(zhì)外，還可以促進(jìn)其對 礦物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生植物生長發(fā)育所需維生素及植物激素類物質(zhì)，增強(qiáng)植物抗逆性及抗病 力(參考周德平等發(fā)表在《上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》第2005. 21 (3)期《蘭科植物內(nèi)生真菌的功能及 應(yīng)用前景[J]》)。由此可見，采用金線蓮組培苗與菌根真菌共生的方法，有著可促進(jìn)植物生 長、增強(qiáng)植物抗逆性及抗病力等優(yōu)點(diǎn)，可以克服目前組培苗生長緩慢、抗逆性弱、死亡率高 等一些缺點(diǎn)。目前，已報(bào)道的蘭科植物共生方法通常是采用單株苗進(jìn)行共生培養(yǎng)(參考于 雪梅、郭順星發(fā)表在《中國中藥雜志》第2000. 25(2)期《金線蓮與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)體系 的建立》；袁莉杭等發(fā)表在《微生物學(xué)雜志》第2008. 28 (1)《春蘭菌根菌的分離及共生培養(yǎng) 體系的研究》)。采用組培苗全苗與菌根真菌共生，由于細(xì)胞天然的結(jié)構(gòu)屏障，導(dǎo)致侵入頻 率較低，且生產(chǎn)效率低下。而采用組培苗莖節(jié)與菌根真菌進(jìn)行共生培養(yǎng)的方法，通過損傷打 破細(xì)胞屏障，使菌根真菌順利的通過傷口侵入金線蓮莖節(jié)表層細(xì)胞，大大提高侵染頻率，同 時(shí)，該法還大大減少的組培苗的使用量，可提高生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金線蓮組培苗與菌根真菌共生得到金線蓮共生苗的 方法。本發(fā)明所述的方法包含如下步驟1).以絲核菌(Rhizoctonia spp.)作為內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)并制作菌絲瓊脂塊；2).金線蓮組培共生將無菌金線蓮組培苗去掉頂部葉芽，分成上下兩個莖段，然 后與絲核菌(Rhizoctonia spp.)菌絲瓊脂塊同時(shí)接到共生培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中，所述金線蓮組培共生的培養(yǎng)條件為在純培養(yǎng)條件下20 25°C培養(yǎng)，光照 強(qiáng)度為500 25001x，每天10 13小時(shí)，培養(yǎng)2 3個月。所述金線蓮組培苗的每個莖段上至少具有一個以上的莖節(jié)。所述的絲核菌(Rhizoctonia spp.)為由野生金線蓮根部分離所得到的、保藏在中 國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心、保藏編號為CGMCC N0. 3074、保藏日期為2009
3年 5 月 20 日的絲核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1。采用本發(fā)明所述的莖段共生式金線蓮組培共生培育方法，可以大大降低使用金線 蓮組培苗的成本，縮短生長周期，提高存活率，從而降低其生產(chǎn)成本，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為絲核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天的菌落形態(tài)；圖2為絲核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的菌核形態(tài)；圖3為絲核菌(Rhizoctonia sp. ) JSH-1個體形態(tài)及番紅0-K0H細(xì)胞核染色， 400 X ；圖4為接菌金線蓮莖段生長狀況；圖5為不接菌金線蓮莖段生長狀況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明。具體實(shí)施例先將絲核菌(Rhizoctonia sp. ) JSH-1從低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)入 PDA平板，28 °C黑暗培養(yǎng)3 5天備用。用已滅菌的打孔器(直徑為0. 5 1cm)或用灼燒過的接種針在菌落邊緣上打塊 或挑取邊長0. 4 0. 7cm的菌絲瓊脂塊。選取高度為5士0. 5cm較粗壯的無菌臺灣金線蓮組培苗，去掉頂部，用滅菌的解剖 刀切成2 4個莖段，每個莖段保證1個以上的莖節(jié)，然后接到共生培養(yǎng)基中，每個瓶子接 入4個莖段。最后挑取絲核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1菌絲瓊脂塊置于四個莖段中間，同 時(shí)設(shè)有對照，即不接菌。上述所有操作過程均在無菌超凈臺上操作。培養(yǎng)條件溫度25°C ；光照強(qiáng)度15001x，光照時(shí)間12h/d ；培養(yǎng)時(shí)間80天。結(jié)果分析本發(fā)明絲核菌(Rhizoctonia sp.)JSH-1對金線蓮組培苗原球莖生長 有顯著促進(jìn)作用。具體表現(xiàn)為10天后接菌金線蓮莖段逐漸變得粗壯，15天左右開始出現(xiàn) 原球莖，兩個半月后單株原球莖個數(shù)高達(dá)9個，并且許多已經(jīng)分化成非常粗壯的幼苗(圖 4)。而對照基本沒有生長，沒有任何原球莖的出現(xiàn)(圖5)。因此，采用本發(fā)明所述的莖段共生式金線蓮組培共生培育方法，可以大大降低使 用金線蓮組培苗的成本，縮短生長周期，提高存活率，從而降低其生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
一種金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包含如下步驟1).以絲核菌(Rhizoctonia spp.)作為內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)并制作菌絲瓊脂塊；2).金線蓮組培共生將無菌金線蓮組培苗去掉頂部葉芽，分成莖段，然后與絲核菌(Rhizoctonia spp.)菌絲瓊脂塊接種到共生培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，通過菌絲侵入莖部切口，刺激莖節(jié)葉芽發(fā)育成類原球莖，進(jìn)而發(fā)育成共生苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述金線蓮組培共 生的培養(yǎng)條件為在純培養(yǎng)條件下20 25°C培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為500 25001x，每天光照 10 13小時(shí)，培養(yǎng)2 3個月。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述金線蓮組培苗 的每個莖段上至少具有一個以上的莖節(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述共生真菌的接 種時(shí)間為與金線蓮組培苗莖節(jié)同時(shí)接種或提前3 7天接種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的絲核菌 (Rhizoctonia spp.)為由野生金線蓮根部分離所得到的保藏編號為CGMCC N0. 3074的絲核 菌(Rhizoctonia sp.)JSH-l。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金線蓮共生苗的生產(chǎn)方法。該方法包含如下步驟1)內(nèi)生真菌的培養(yǎng)將由野生金線蓮根部分離所得到的保藏編號為CGMCC NO.3074的絲核菌(Rhizoctonia sp.)JSH-1從低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)入PDA平板，28℃黑暗培養(yǎng)2～4天；然后制作菌絲瓊脂塊；2)金線蓮組培共生將無菌金線蓮組培苗去掉頂部葉芽，采用無菌操作，從兩莖節(jié)中部切斷，得到2～4個莖段，然后與絲核菌(Rhizoctonia sp.)JSH-1菌絲瓊脂塊同時(shí)接到共生培養(yǎng)基共同培養(yǎng)2～3個月。采用本發(fā)明所述的莖段共生式金線蓮組培共生培育方法，可以大大降低使用金線蓮組培苗的成本，縮短生長周期，提高存活率，從而降低其生產(chǎn)成本，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK101855994SQ200910210058
公開日2010年10月13日 申請日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者張善信, 方祥, 江綺晴, 陳春滿 申請人:東莞市生物技術(shù)研究所;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)