專利名稱：用于定量檢測(cè)K-ras突變的試劑盒的制作方法
用于定量檢測(cè)κ-ras突變的試劑盒
背景技術(shù)：
κ-ras基因?qū)儆趓as癌基因家族，因其編碼21kD的ras蛋白又名p21基因。K_ras 基因是EGFR信號(hào)通路的重要分子之一，其編碼產(chǎn)物處在EGFR通路的下游，在腫瘤細(xì)胞的生 長(zhǎng)、增殖、血管生成等過程中起著重要的“開關(guān)”作用。發(fā)生突變時(shí)，K-ras蛋白處于持續(xù)活性 狀態(tài)，失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的正常調(diào)控，可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)、阻止細(xì)胞凋亡。不同腫瘤組織中 K-ras基因突變率不同，其中胰腺癌82%，結(jié)腸癌43%，肺癌30%，甲狀腺癌四％，膀胱、肝、 腎和子宮癌 10% 或低于 10% (BosJ.L.et al，Cancer Res, 1989,49(17) :4682-4689)。由 于突變K-ras的持續(xù)激活與EGFR活性是否被抑制無關(guān)，使得患者不能從抗EGFR治療中獲 益(Amado R. G. et al,J. Clin. Oncol. ,2008,26(10) :1626-1634 ；Lievre A. et al, J. Clin. Oncol.，2008 ；26(3) :374-379)。因此通過對(duì)K_ras基因的突變檢測(cè)，可以對(duì)抗EGFR藥物的 治療效果做出一定的前瞻性評(píng)估，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而達(dá)到良好的預(yù)后。目前K-ras基因突變點(diǎn)主要集中于第12、13位氨基酸密碼子(張健杰等，西安交 通大學(xué)學(xué)報(bào)，2005, ) =349-351 ；何曉文等，中華消化雜志，2002，22 (1) :26- )，其中12 密碼子GGT堿基突變?yōu)镚TT或GAT堿基為最常見的突變類型。本發(fā)明通過實(shí)時(shí)定量PCR方 法檢測(cè)分子靶向抗腫瘤藥療效相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因K-ras 12、13密碼子5種類型的突變情 況，來預(yù)測(cè)愛必妥等分子靶向藥物的治療效果。本發(fā)明采用的檢測(cè)方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化。其它方法如 等位基因特異的寡核苷酸探針雜交法，對(duì)雜交的條件非常敏感，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件；限 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性實(shí)驗(yàn)需投入相當(dāng)?shù)娜肆Σ僮?，且不能定量。?shí)驗(yàn)周期短，2小時(shí)內(nèi)就可 以完成。不需要測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果，而直接測(cè)序法與高分辨溶解曲線分析需要4天-2周。敏感 度高，我們通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，突變檢測(cè)的敏感度可達(dá)到1 %，而直接測(cè)序法敏感度 20-50%。特異性高，免疫組化方法假陽(yáng)性與假陰性率高，且不能確定點(diǎn)突變的位置和類型； 定量準(zhǔn)確，這是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法最獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，通過絕對(duì)定量法處理數(shù)據(jù)，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，精確測(cè)定樣本中野生型與突變型基因的含量，進(jìn)而得到突變型基因所占比例，輔助臨床 診斷和用藥。另外，本發(fā)明安全無毒性，其它方法如錯(cuò)配堿基的化學(xué)斷裂法需要用到同位素 和劇毒化學(xué)試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種K-ras基因突變的定量檢測(cè)試劑盒。定量檢測(cè) K-ras 基因 12 密碼子(SEQ ID NO 1 ；SEQ ID NO 2) 2155 位 GGT 堿基突變?yōu)?GTT、AGT、GAT 或TGT堿基；13密碼子(SEQ IDNO 1 ；SEQ ID NO :2)GGC堿基突變?yōu)镚AC堿基的情況。為解決上述問題，本發(fā)明提供包含Taq酶、10 X Taq緩沖液、MgCl2, dNTP混合液及 可特異性擴(kuò)增K-ras基因突變位點(diǎn)序列的PCR引物與可特異性識(shí)別野生型與突變型序列的 探針的定量檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法(1)分別在K-ras基因12、13密碼子突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)上下游引物，以及根據(jù)每個(gè) 突變位點(diǎn)的突變情況設(shè)計(jì)特異性的探針，該探針可與K-ras特定位點(diǎn)的野生型或欲檢測(cè)的突變型序列特異性結(jié)合，從而確定該位點(diǎn)有無發(fā)生所檢測(cè)的基因突變。(2)為精確定量所測(cè)K-ras突變比例，本發(fā)明設(shè)計(jì)了標(biāo)準(zhǔn)品。(3)對(duì)待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。(4)由標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果得到用于定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)樣品 核酸的K-ras基因突變占總體K-ras基因的比例。所述步驟(1)之前還包括對(duì)待測(cè)樣品中的核酸進(jìn)行提取、純化和濃度測(cè)定。熒光定量PCR檢測(cè)所用探針在適宜的PCR條件下與K-ras基因突變位置的堿基序 列特異性結(jié)合。所述探針優(yōu)選在5’端連接有熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)。所 述的熒光發(fā)射基團(tuán)選自FAM、ΤΕΤ、HEX、R0X;所述的熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、TAMARA。優(yōu)選 地，所述熒光發(fā)射基團(tuán)為FAM，所述的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。所述探針的序列優(yōu)選為SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28。所述標(biāo)準(zhǔn)品至少包括質(zhì)粒、基因組DNA或化學(xué)合成序列中的一種。優(yōu)選地，所述標(biāo) 準(zhǔn)品包含野生型質(zhì)粒和/或突變型質(zhì)粒，其中野生型質(zhì)粒包含K-ras基因野生型序列，突變 型質(zhì)粒包含κ-ras基因突變型序列。更優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)品由野生型質(zhì)粒和/或突變型質(zhì) 粒組成。所述待檢樣品包括新鮮組織、石蠟包埋組織、細(xì)胞株、血液、胸腔積液、腹腔積液、 唾液、消化液、尿液、唾液、糞便。所述引物由上游引物與下游引物組成。所述引物優(yōu)選為SEQ ID N0:4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO :6,SEQ ID NO:7。所述的K-ras基因突變的定量檢測(cè)試劑盒包括選自以下的試劑如上所述的 引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品。所述試劑盒優(yōu)選還包括Taq酶、10XTaq緩沖液、MgCl2, dNTP混合 液。優(yōu)選的引物與探針的比例為2 1-10 1，優(yōu)選的正向與反向引物之間的比例為 1:3-3: 1。標(biāo)準(zhǔn)品包括以上所述的質(zhì)粒按一定比例的混合，野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒的 含量的比例分別為0% -100%。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例2所用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建方法示意圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2野生型質(zhì)粒圖譜，箭頭所指即為載體中插入野生型PCR產(chǎn) 物序列的位置。圖3是本發(fā)明實(shí)施例I-ras野生型質(zhì)粒測(cè)序4是本發(fā)明實(shí)施例2突變型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序結(jié)果圖，箭頭所指為堿基突變位點(diǎn)。 其中圖A是K-ras 12密碼子GGT — GTT突變質(zhì)粒測(cè)序圖，圖B是K_ras 12密碼子GGT —AGT 突變質(zhì)粒測(cè)序圖，圖C是K-rasl2密碼子GGT — GAT突變質(zhì)粒測(cè)序圖，圖D是K_ras 12密 碼子GGT — TGT突變質(zhì)粒測(cè)序圖，圖E是K-ras 13密碼子GGC — GAC突變質(zhì)粒測(cè)序5是本發(fā)明實(shí)施例3的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖，其中圖A是K-ras野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 品擴(kuò)增曲線，圖B是K-ras 12密碼子GGT — GTT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，圖C是K_ras 12密碼子GGT — AGT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，圖D是K_ras 12密碼子GGT — GAT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，圖E是K-ras 12密碼子GGT — TGT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，圖F是 K-ras 13密碼子GGC — GAC突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線。圖6是根據(jù)圖4繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中圖A是K-ras野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖B 是K-ras 12密碼子GGT —GTT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖C是K-ras 12密碼子GGT — AGT突 變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖D是K-ras 12密碼子GGT — GAT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖E是K_ras 12 密碼子GGT — TGT突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖F是K-ras 13密碼子GGC — GAC突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7是本發(fā)明實(shí)施例3檢測(cè)的石蠟包埋組織樣本K-ras 12密碼子野生型(圖A) 與GGT —TGT突變型(圖B)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖，新鮮組織樣本K-ras 12密碼子野 生型(圖C)與GGT —GTT突變型(圖D)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖，全血樣本13密碼子野 生型(圖E)與GGC —GAC突變型(圖F)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖，細(xì)胞系樣本K_ras 12 密碼子野生型(圖G)與GGT — AGT突變型(圖H)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖。圖8是本發(fā)明的定量方法示意圖。
實(shí)施例以下的實(shí)施例用于為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員提供有關(guān)如何實(shí)施和使用本發(fā)明 的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對(duì)發(fā)明人所認(rèn)為的發(fā)明范圍進(jìn)行限制，亦非意 指下文的實(shí)驗(yàn)是被實(shí)施的全部實(shí)驗(yàn)而且是僅可實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí) 驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版(Sambrook J.)，或按照廠商所 建議的條件。實(shí)施例1 人類新鮮腫瘤組織、石蠟包埋組織、外周血、胸水、人類細(xì)胞系基因組 DNA抽提我們所測(cè)試的人類癌細(xì)胞系包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) (A549, H460、H838和 H1703)、乳腺癌(MCF-7、BT474 和 HuL 100)、惡性多間皮瘤細(xì)胞系(H513、H2052、H290、 MS-I和H28)、結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480)、頭頸癌細(xì)胞系(U87)、子宮頸癌(Hela)、肉瘤細(xì)胞系 (Mes-SA,Saos-2 和 A204)。所測(cè)試的人類新鮮腫瘤組織、外周血、石蠟包埋組織包括NSCLC、間皮瘤、結(jié)腸癌、 惡性黑素瘤、腎癌、食道癌、甲狀腺癌、惡性毒瘤和卵巢癌。標(biāo)本DNA抽提可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取試劑盒提取樣本基 因組DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量測(cè)量?jī)x檢測(cè)所提DNA濃度與純度 (0D260/0D280約為1. 8，0D260/0D230大于2. 0)。下面以使用Promega公司的DNA提取試 劑盒為例介紹樣本DNA提取步驟1.新鮮組織DNA抽提(1)用剪刀切取約黃豆粒大小的組織，置于研缽中，將組織剪碎，加液氮研成粉末。(2)加入600 μ 1預(yù)冷的裂解液于研缽中，用Iml大槍頭吹打6次，盡量使組織粉末 與裂解液混勻，轉(zhuǎn)移混合物到1. 5ml EP管中，上下顛倒6次混勻后65°C水浴20分鐘。(3)力卩3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37 °C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后13，000*g，室溫離心4分鐘。(5)轉(zhuǎn)移上清至事先加600 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13，000*g，室溫離心1分鐘。(6)棄上清，加600μ1 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻后 13，000*g，室溫離心1分鐘。(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時(shí)或4°C過夜。2.石蠟包埋組織DNA抽提(1)將Img或少于Img的組織放入1. 5ml離心管內(nèi)。(2)加入新鮮制備的100 μ 1溫育緩沖液/蛋白酶K溶液。根據(jù)樣品的類型，56°C 溫育過夜。(3)取出溫育的樣品管，加入兩倍體積的裂解緩沖液。(4)高速渦旋振蕩樹脂10秒鐘至樹脂完全懸浮，加入7 μ 1完全懸浮的樹脂。高速 渦旋振蕩3秒鐘后室溫溫育5分鐘。(5)高速渦旋振蕩2秒鐘，將管子放在MagneSphere 磁分離架上。磁分離立刻 進(jìn)行。(6)小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂。(7)加入100 μ 1裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘。(8)將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液。(9)加入100 μ 1配制的Ix洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘。(10)將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液。(11)重復(fù)步驟9和10兩次，共3次洗滌，并確保在最后一次洗滌后，除去所有的液 體。(12)打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥5分鐘。(13)加入25 μ 1洗脫液。(14)蓋上管蓋并高速渦旋振蕩2秒鐘。65°C溫育5分鐘。(15)取出溫育的管子，高速渦旋振蕩2秒鐘。立即放到磁分離架上。(16)將DNA溶液小心地轉(zhuǎn)移到選定的容器中。3.全血DNA抽提(1)收集抗凝全血300 μ 1，加入900 μ 1細(xì)胞裂解液，用Iml槍頭吹打混勻6次，盡 量使全血與細(xì)胞裂解液混勻，室溫放置10分鐘，期間用Iml槍頭吹打混勻3次。(2) 13，000*g，室溫離心20秒后棄上清，劇烈震蕩，加入300 μ 1預(yù)冷的裂解液，用 Iml槍頭吹打混勻至沉淀完全溶解。(3)加1. 5 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37°C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，加100 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13，000*g，室溫離心4分鐘。(5)轉(zhuǎn)移上清至事先加300 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13，000*g，室溫離心1分鐘。
(6)棄上清，加Iml 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻13，000*g，室 溫離心1分鐘。(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時(shí)或4°C過夜。4.胸水DNA抽提(1)收集胸水5ml，2000rpm室溫離心10分鐘，取上清加入Iml細(xì)胞裂解液，顛倒混 勻6次，室溫放置10分鐘。(2) 13，000*g，室溫離心20秒后棄上清，劇烈震蕩，加入Iml預(yù)冷的裂解液，混勻至
沉淀完全溶解。(3)加3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37 °C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13，000*g，室溫離心4分鐘。(5)轉(zhuǎn)移上清至事先加5ml異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13，000*g，室溫離心1分鐘。(6)棄上清，加Iml 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻13，000*g，室 溫離心1分鐘。(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時(shí)或4°C過夜。5.細(xì)胞系DNA抽提(1)收集至少約IX IO6的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中，13，000*g，室溫離心10
秒，如果是貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞前要用胰酶消化。(2)棄上清，加200μ 1 PBS洗細(xì)胞，13，000*g，室溫離心10秒后，棄上清，劇烈震蕩
至沉淀混懸。(3)加入600 μ 1預(yù)冷的裂解液，用Iml大槍頭吹打混勻至沒有肉眼可見的細(xì)胞塊。(4)力卩3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37 °C水浴20分鐘。(5)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13，000*g，室溫離心4分鐘。(6)轉(zhuǎn)移上清至事先加600 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13，000*g，室溫離心1分鐘。(7)棄上清，加600μ1 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻后 13，000*g，室溫離心1分鐘。(8)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(9)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時(shí)或4°C過夜。實(shí)施例2 含突變型與野生型檢測(cè)序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備1.野生型質(zhì)粒構(gòu)建(圖1，圖2)1. 1載體的準(zhǔn)備TA克隆載體pMD18-T購(gòu)自TAKARA公司。1. 2插入片段的準(zhǔn)備使用PCR方法制備插入片段，PCR的模板為經(jīng)步驟1提取的樣本基因組DNA，反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件如下表(表1、表2、表3)
表 1 :PCR 反應(yīng)體系(50 μ 1)
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，其在適宜的PCR條件下與κ-ras基因突變位置的上下游 200個(gè)以內(nèi)的核苷酸結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物與下游引物組成。
3.一種熒光定量PCR探針，其在適宜的PCR條件下與K-ras基因突變位置的堿基序列 特異性結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端 連接有熒光淬滅基團(tuán)。
5.一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含待檢測(cè)的K-ras基因野生型序列。
6.如權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包含的K-ras基因野生型序列為 SEQ ID NO :29。
7.一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含待檢測(cè)的K-ras基因突變型序列。
8.如權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包含的K-ras基因突變型序列為 SEQ ID NO 30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO 33 或 SEQ ID NO :34。
9.一種K-ras基因突變的定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括選自以下的 試劑如權(quán)利要求1或2所述的引物、權(quán)利要求3或4所述的探針、以及權(quán)利要求5和/或 7所述的質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，引物與探針的比例為2 1-10 1，正 向與反向引物之間的比例為1 3-3 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于定量檢測(cè)K-ras突變的試劑盒。具體地說，本發(fā)明涉及與分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的K-ras基因突變檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。尤其涉及一種在K-ras基因突變熱點(diǎn)區(qū)域檢測(cè)突變的熒光定量PCR檢測(cè)方法、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)K-ras基因特定位點(diǎn)的突變進(jìn)行檢測(cè)，并可對(duì)分子靶向抗腫瘤藥EGFR酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行療效預(yù)測(cè)，進(jìn)而對(duì)腫瘤患者的臨床個(gè)體化用藥方案提供指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102115782SQ20091021583
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者許軍普, 陳釗 申請(qǐng)人:北京雅康博生物科技有限公司