專利名稱：一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
絲孢類殺蟲真菌是重要的害蟲生防真菌，在自然條件下，其最主要的侵染途徑是通過體壁接觸感染而致死各類害蟲。此過程包括孢子在昆蟲體壁上吸附、萌發(fā)、穿透昆蟲體壁，然后菌絲在寄主血腔中快速繁殖，終因耗盡營養(yǎng)而導(dǎo)致寄主死亡。獨(dú)特的侵染方式使絲孢類殺蟲真菌成為防治剌吸式口器害蟲的首選生防因子。絲孢類殺蟲真菌的成員很多，如白僵菌(Beauveria)、綠僵菌(Metarhizium)及擬青毒(Paecilomyces)禾口輪枝菌(Verticillium)等屬的菌種，已被開發(fā)成多種制劑用于農(nóng)林害蟲的防治。目前全世界先后注冊登記的絲孢類真菌殺蟲劑60余種，正在成為無公害農(nóng)業(yè)可依托的害蟲防治新技術(shù)及產(chǎn)品來源。 盡管絲孢類殺蟲真菌防治害蟲持效性好，但殺蟲速度仍難盡如人意， 一直是影響此類真菌殺蟲劑應(yīng)用推廣的重要因素，也是國際上試圖通過攻關(guān)研究重點(diǎn)解決的技術(shù)難題之一。作為絲孢類殺蟲真菌典型代表的球包白僵菌對害蟲體壁的侵染通常發(fā)生在接種后的48小時(shí)。同時(shí)，由于球孢白僵菌沒有特異腸道毒力因子而依賴孢子穿透體壁的方式感染寄主，且被害蟲攝入孢子的部分可能因排泄而有所損失，從而導(dǎo)致經(jīng)腸道感染與致死的時(shí)程較長。滯后的殺蟲時(shí)間使得咀嚼式口器害蟲在染菌后仍可危害作物葉莖等部位，造成巨大的損失。如何有效提高球孢白僵菌對咀嚼式口器害蟲的快速毒殺能力始終受到生防界的關(guān)注。迄今，旨在提高菌株毒力和殺蟲速度的研究工作多基于增強(qiáng)球孢白僵菌對寄主體壁侵染過程中各個(gè)環(huán)節(jié)的作用和致病力，如通過調(diào)節(jié)孢壁表面的形態(tài)和疏水物質(zhì)增強(qiáng)孢子對寄主體壁的吸附；改善孢子內(nèi)貯營養(yǎng)促進(jìn)孢子在無外源營養(yǎng)的條件下萌發(fā)和形成芽管以及通過增強(qiáng)球孢白僵菌胞外水解酶的活力提高菌株的殺蟲速度。因此，有必要利用害蟲腸道毒力蛋白改造殺蟲真菌，使其不僅能有效經(jīng)體壁侵染，而且進(jìn)入腸道的孢子可釋放積累的及后續(xù)生長過程中產(chǎn)生的毒力蛋白直接快速抑制害蟲取食，破壞腸道內(nèi)膜，并導(dǎo)致病原真菌更易于侵襲和穿透害蟲腸道進(jìn)入血淋巴，從而達(dá)到增強(qiáng)殺蟲真菌毒力和提高殺蟲速度的目的。 眾所周知，Bt (Bacillus thuringiensis)在芽孢形成過程中產(chǎn)生稱為S -內(nèi)毒素(delta-endotoxin)的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)，這些蛋白具有很高的腸道毒性。在過去的幾十年中，Bt及其殺蟲晶體蛋白已被開發(fā)成多種制劑廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)、森林和衛(wèi)生害蟲。不僅如此，轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白基因的重要農(nóng)作物不斷出現(xiàn)和應(yīng)用，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。盡管如此，Bt制劑也存在殺蟲譜窄、毒力不高等問題。尤其，自上世紀(jì)80年代以來人們發(fā)現(xiàn)多種害蟲對殺蟲晶體蛋白及其轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)表現(xiàn)出不同水平的抗性，亟需安全有效的防治手段。然而，自上世紀(jì)九十年代以來，以Vip3A為代表的Bt營養(yǎng)期殺蟲蛋白的發(fā)現(xiàn)為Bt的研究和應(yīng)用開創(chuàng)了新紀(jì)元。Vip3是一類新型的殺蟲蛋白家族與ICPs不同。首先，Vip3是在Bt營養(yǎng)期分泌的，具有信號肽的蛋白。它從對數(shù)生長中期開始分泌，在穩(wěn)定前期達(dá)到最高峰。其次，Vip3的氨基酸序列與已知的晶體蛋白無任何同源性。最重要的差異是Vip3具有獨(dú)特的殺蟲機(jī)制。Vip3蛋白在pH低于7. 5便可溶解，其碳端無需切除，直接與敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞(主要是柱狀細(xì)胞)結(jié)合，誘發(fā)昆蟲細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核溶解，導(dǎo)致昆蟲死亡。Vip3對鱗翅目昆蟲具有較廣譜的殺蟲活性，甚至是一些對Bt殺蟲晶體蛋白有很強(qiáng)抗性的昆蟲，如Vip3A對小地老虎(Agrotisipsilon)的毒性要比CrylA高260倍。由此可見，Vip3蛋白對于延緩害蟲對Bt晶體殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性及克服目前抗蟲轉(zhuǎn)基因植物和構(gòu)建重組殺蟲微生物存在的殺蟲基因種類單一、殺蟲譜窄等難題提供新的解決方案，展示了極為廣闊的前景。迄今，Vip蛋白已成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因殺蟲植物的構(gòu)建，得到高效抗蟲多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米。此外，構(gòu)建Vip蛋白融合蛋白以及利用其與殺蟲晶體蛋白的協(xié)同作用增加殺蟲速度。同理，Vip蛋白有望成為增強(qiáng)絲孢類殺蟲真菌腸道毒力的有效因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株，它是利用
基因工程結(jié)合具有獨(dú)特殺蟲機(jī)制和高殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因以
提高殺蟲效力的生防真菌菌株。為此本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它為含有蘇云金芽孢桿菌
營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因的轉(zhuǎn)基因菌株(其拉丁學(xué)名為Beauveria bassiana)，其保藏編號為
CGMCC NO. 3283，它的保藏時(shí)間為2009年9月16日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理
委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。 本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株的方法，它包括來自蘇
云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis， Bt)的Vip3A蛋白基因的獲得和真菌表達(dá)質(zhì)粒
pAN52-lN的擴(kuò)增和提取，在上述步驟的基礎(chǔ)上它還依次包括以下步驟Vip3A蛋白基因雙
元載體的構(gòu)建；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建的Vip3A蛋白基因雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，
獲得重組生防真菌。 Vip3蛋白基因的獲得根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)Nco I和BamH I的引物，用PCR方法擴(kuò)增獲得Vip3蛋白基因。 在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN52-lN。 Vip3蛋白基因雙元載體的構(gòu)建用內(nèi)切酶Nco I和BamH I分別切開Vip3蛋白基因PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pAN52-lN，將Vip3基因與質(zhì)粒連接。從而使抗逆相關(guān)基因分別置于構(gòu)巢曲霉(Aspergillius nidulans) 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子Pgpd和色氨酸基因的終止子TtrpC之間，然后分別與生防真菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因Bar表達(dá)元件串聯(lián)成真菌表達(dá)載體。
重組生防真菌的獲得利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將構(gòu)建的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，
篩選獲得組成型表達(dá)Vip3蛋白基因的殺蟲效力增強(qiáng)的重組生防真菌菌株。 本發(fā)明將Bt中的Vip3蛋白基因克隆，并將其置于真菌組成型啟動(dòng)子之下構(gòu)建真
菌表達(dá)質(zhì)粒，并利用遺傳轉(zhuǎn)化體系將真菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入生防真菌，獲得組成型表達(dá)Vip3蛋
白基因的重組菌株，通過Vip3蛋白獨(dú)特高效的腸道毒力作用，從而增強(qiáng)生防真菌對害蟲的
殺蟲效力。本發(fā)明為延緩害蟲對Bt晶體殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性及克服目前抗蟲轉(zhuǎn)基因植物和構(gòu)建重組殺蟲微生物存在的殺蟲基因種類單一、殺蟲譜窄等難題提供了新的解決方案，展 示了極為廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1 :構(gòu)建殺蟲效力增強(qiáng)的球孢白僵菌重組菌株。 本發(fā)明中Vip3A基因一般直接來源于Bt，它是蘇云金芽孢桿菌在營養(yǎng)生長對數(shù)中 期分泌產(chǎn)生的一類新型殺蟲蛋白。Vip3A廣泛存在于Bt中，與晶體殺蟲蛋(Insecticidal CrystalProteins， ICPs)沒有任何同源性，不具有多樣性，在遺傳上比較保守。
(1)Vip3蛋白基因的獲得。根據(jù)GenBank DQ539887. 1提供的序列自行合成vip3Aa基因。針對Bt的Vip3A蛋
白(GenBank accession number :AAC37036. 1)基因，在其首尾添加酶切位點(diǎn)Nco I禾P BamH
I，酶切位點(diǎn)如下(其中斜體的堿基為引入的酶切位點(diǎn)序列)Vip3aF:5' -CTGCCATGGACAAGAACAACACC-3' (NcoI)，vip3aR:5' -GCTGGATCCCTACTTGATGCTCACGTCGT-3' (BamHI)。 (2)在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN52-lN。 用內(nèi)切酶Nco I和BamH I分別切開vip3Aa基因產(chǎn)物和質(zhì)粒pAN52-lN。pAN52-lN質(zhì)粒的擴(kuò)增與提取將于_70°C 25%甘油中保存的含有質(zhì)粒pAN52-lN
的大腸桿菌(E. coli)DH5a菌種在LB (Luria-Bertani)平板上劃線活化，37。C培養(yǎng)12h至
單克隆長出。挑取活化后的單克隆于2ml LB液體培養(yǎng)基中37t:搖床200rpm培養(yǎng)10h至對
數(shù)生長期。取1. 5ml菌液于干凈的1. 5ml印pendorf離心管中，室溫10000g離心lmin收集
菌體后用Omega(Doraville， GA， USA)的小量質(zhì)粒抽提試劑盒按試劑盒說明書中標(biāo)準(zhǔn)步驟
抽提質(zhì)粒pAN52-lN。最后用50iU DEPC水溶解質(zhì)粒。 (3)Vip3蛋白基因雙元載體的構(gòu)建。 首先，用Vip3aF和Vip3aR引物，以自行合成的vip3Aa序列為模版，用PCR方法將 Ncol和BamHI酶切位點(diǎn)分別引入該基因的5'和3'端。按標(biāo)準(zhǔn)用量50ul體系，PCR具體程 序94。C預(yù)熱2min，然后按94°C 30s、60。C 30s、72。C 2. 5min的步驟循環(huán)35次，最后72。C延 伸7min后4°C①。接著，將PCR產(chǎn)物用試劑盒回收，回收產(chǎn)物經(jīng)Ncol和BamHI (NEB)雙酶切 后用T4連接酶與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pAN52-lN相連接，將vip3Aa基因引入pAN52-lN中 的構(gòu)巢曲霉(Aspergillius nidulans) 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子Pgpd和色氨酸 基因的終止子TtrpC之間得到質(zhì)粒pAN52-Vip3A并經(jīng)測序確認(rèn)。然后，將含有bar基因表 達(dá)元件的質(zhì)粒pET29b-bar(Ying&Feng 2006)用酶XbaI消化，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳分離 酶切產(chǎn)物并以凝膠回收試劑盒回收得到bar基因表達(dá)元件片段并將其與同樣經(jīng)Xbal消化 過的質(zhì)粒pAN52-Vip3A相連，得到含具有相同轉(zhuǎn)錄方向的vip3Aa基因和bar基因表達(dá)元件 的雙元載體pAN52-Vip3A-bar。上述各酶切反應(yīng)均以NEB (北京)網(wǎng)站(http:〃www. neb. com)上提供的各種酶切反應(yīng)溫度，按標(biāo)準(zhǔn)酶切反應(yīng)體系和步驟進(jìn)行。
(4)重組生防真菌的獲得.。 將步驟(3)獲得的質(zhì)粒pAN52-vip3A-Bar經(jīng)芽生孢子轉(zhuǎn)化體系介導(dǎo)轉(zhuǎn)入球孢白僵 菌基因組DNA中。篩選出Vip3A蛋白組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)化子BBV28(保藏號CGMCC NO. 3283)。
以球孢白僵菌Bb2860菌株為例，具體說明芽生孢子轉(zhuǎn)化方法如下取一管制備好 的球孢白僵菌Bb2860菌株的芽生孢子感受態(tài)，冰上融化后于4°C 5000 X g離心5min，棄上 清后，依次加入以下物質(zhì)240iU 50% PEG 4000,36 ill 1M LiAc，25iU 4g/l變性的鮭魚 精DNA， 10 ii 1 HindlII線性化的質(zhì)粒pAN52-Vip3A-bar(0. 1 y g/yl)禾口 35 IM二硫蘇糖 醇(dithiothreitol，DTT)。將上述混合物用振蕩器充分混勻后冰浴30min，再于42。C水浴 熱激20min，冰上放置5min后于4t: 5000 X g離心5min收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞用500 yl 無菌水懸浮后，取100iil細(xì)胞懸液均勻涂布于含有200ii g/ml草胺膦(phosphinothricin， PPT)的查氏(CPZ)培養(yǎng)基平板上，于25士rC培養(yǎng)6d。將長出的克隆再挑入含有400iig/ ml PPT的CPZ培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選出長勢較好的轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明還可以利用其它遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、芽 生孢子轉(zhuǎn)化、電擊轉(zhuǎn)化等)，將構(gòu)建的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，篩選獲得組成型表達(dá) Vip3A蛋白基因的殺蟲活性增強(qiáng)的重組真菌。 實(shí)施例2 :球孢白僵菌孢子對斜紋夜蛾不同蟲齡幼蟲殺蟲活性的測定。
具體測試步驟如下將供試干燥孢子粉均勻懸浮于0. 02% Tween-80水溶液中制 成濃度為1X108個(gè)/ml的孢子懸液。將新鮮、干凈甘藍(lán)葉片剪成直徑為8cm的圓片浸入 孢子懸液中，然后在室內(nèi)空氣晾干表面多余水分。隨后，將葉片置于滅菌處理過的直徑為 15cm玻璃培養(yǎng)皿中，分別挑入健壯斜紋夜蛾二齡幼蟲各35頭，用paraf ilm封口后，置于
25士rc，L : D = i2h : 12h恒溫光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)7d，每日定時(shí)觀察記錄死亡蟲數(shù)，并將
死亡蟲及時(shí)移出。同時(shí)以無菌0.02% tween-80溶液處理為空白對照；野生菌株Bb2860孢 子粉處理為平行對照。每處理3次重復(fù)。 所獲生測數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件(唐啟義和馮明光，2002)進(jìn)行分析。利 用數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)值分析得出生防真菌高濃度孢子接種對斜紋夜蛾各齡幼蟲的半致死時(shí)間 LT5。，以此或7d累計(jì)死亡率作為生防菌株對各齡幼蟲的毒力指標(biāo)。 經(jīng)生物測定，重組菌株孢子(保藏號CGMCC NO. 3283)對一齡、二齡幼蟲的毒力比 野生菌株分別提高了 45. 3%、48. 3%和56. 0%。 實(shí)施例3 :不同劑量生防真菌孢子對斜紋夜蛾二齡幼蟲毒力的測定。
具體測試步驟如下將供試干燥孢子粉均勻懸浮于0. 02% Tween-80水溶液中 制成1 X 108個(gè)/ml， 2X 107個(gè)/ml和4X 106個(gè)/ml系列濃度的孢子懸液。用全自動(dòng)噴塔 (Potter Spray Tower， Burkard Scientific Ltd. ， Middx， UK)分別接禾中各濃度的抱子 懸液于干凈、新鮮甘藍(lán)葉片的兩面，每面接種lml。實(shí)際接種劑量用平放于葉片旁的蓋玻 片(20mmX20mm)收集孢子，棉蘭染色后在顯微鏡下鏡檢(0. 2165mm2/視野)孢子數(shù)來確 定。將接種過的葉片室內(nèi)空氣晾干后置入干凈的直徑為15cm的玻璃平皿中，其上挑入斜紋 夜蛾二齡初健壯幼蟲，每皿40頭。每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)皿用PE保鮮膜封口后，置于
25士rc，L : D=i2h : 12h的恒溫光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每日定時(shí)記錄死亡蟲數(shù)。以無菌
0. 02% Tween-80水溶液作為空白對照。野生菌株Bb2860孢子粉為平行對照。
所獲生測數(shù)據(jù)用時(shí)間_劑量_死亡率模型進(jìn)行模擬分析。利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 軟件進(jìn)行有關(guān)該模型生物學(xué)基礎(chǔ)、建模步驟、參數(shù)擬合及檢驗(yàn)、時(shí)間與劑量效應(yīng)(如LT5。和 LC5。)估計(jì)等模擬及運(yùn)算。 經(jīng)生物測定，重組菌株孢子在(保藏號CGMCCNO. 3283)對二齡幼蟲在孢子劑量為
61373個(gè)/mm2時(shí)的LT5。比野生菌株縮短了 21. 5%，在第4天、第5天和第6天的LC5。分別比 野生菌株降低了 91. 2%、61. 3%和57. 9%。 綠僵菌、擬青霉與白僵菌是同屬絲孢綱的生防真菌，具有相似的生物學(xué)特性，遺傳
轉(zhuǎn)化方法類似，因而真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN52-vip3A-Bar也可以重組到綠僵菌、擬青霉等目標(biāo)
菌株，并在菌株中表達(dá)達(dá)到同樣的提高殺蟲效力的目的，用于農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治。 經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組球孢白僵菌菌株孢子害蟲的殺蟲毒力相比野生菌株有
了很大程度的提高，且致死害蟲的時(shí)間相比野生菌株有大大減少，從而緩解了現(xiàn)有的生防
真菌因殺蟲時(shí)間滯后所帶來的咀嚼式口器害蟲在染菌后仍可危害作物葉莖等部位的問題，
可以減小對農(nóng)業(yè)、林業(yè)等造成的巨大損失，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
權(quán)利要求
一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株，其特征在于它為含有蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因的轉(zhuǎn)基因菌株，其保藏編號為CGMCC NO.3283。
2. —種構(gòu)建如權(quán)利要求1所述增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株的方法，其特征在于它包 括來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的Vip3A蛋白基因的獲得和真菌表 達(dá)質(zhì)粒pAN52-lN的擴(kuò)增和提取，在上述步驟的基礎(chǔ)上它還依次包括以下步驟Vip3A蛋白 基因雙元載體的構(gòu)建；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建的Vip3A蛋白基因雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防 真菌，獲得重組生防真菌。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株的方法，其特征在于所述 Vip3A蛋白基因雙元載體經(jīng)芽生孢子轉(zhuǎn)化體系介導(dǎo)轉(zhuǎn)入生防真菌基因組中。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株的方法，其特征在于所述 Vip3A蛋白基因雙元載體的抗性基因?yàn)椴荻§⒖剐曰駼ar。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株，它為含有蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因的轉(zhuǎn)基因菌株，它的保藏編號為CGMCCNO.3283。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力的菌株的方法，它包括來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的Vip3A蛋白基因的獲得和真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN52-1N的擴(kuò)增和提取，它還依次包括Vip3A蛋白基因雙元載體的構(gòu)建；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建的Vip3A蛋白基因雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入生防真菌，獲得重組生防真菌。本發(fā)明為延緩害蟲對Bt晶體殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性及克服目前抗蟲轉(zhuǎn)基因植物和構(gòu)建重組殺蟲微生物存在的殺蟲基因種類單一、殺蟲譜窄等難題提供了新的解決方案，展示了極為廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/15GK101709270SQ20091022279
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日
發(fā)明者馮明光, 應(yīng)盛華, 秦毅 申請人:浙江大學(xué)