一種鏈霉菌er1396菌株及用圖
【專利說(shuō)明】-種鏈霉菌ER1396菌株及用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種微生物及用途，更具體地說(shuō)設(shè)及一種鏈霉菌（Str巧tomyces angustmyceticus)菌株、用途及其制劑的制備方法，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[000引 由刺盤抱菌屬（Colletotrichumspp.)真菌侵染引發(fā)的炭痘病，是夏季草替育苗、 葡萄采收期發(fā)生的主要病害。當(dāng)前，炭痘病的防治主要用化學(xué)藥劑來(lái)防控，常用的殺菌劑有 甲氧基丙締酸醋怕01)類殺菌劑（喀菌醋，離菌醋），醬醇生物合成抑制劑（SBIs)類殺菌劑 (苯離甲環(huán)挫，咪酷胺），班巧酸脫氨酶抑制劑（SDHI)類殺菌劑（晚酷菌胺，氣化菌酷胺，化 唾菌胺，氣挫菌酷胺）和抑制細(xì)胞有絲分裂的苯并咪挫（MBC)類殺菌劑（多菌靈、苯菌靈、 甲基硫菌靈）等。由于農(nóng)戶常年多頻次、多劑量飽和施用化學(xué)藥劑，造成該類植物病原菌對(duì) 化學(xué)藥劑都產(chǎn)生了不同程度的抗（耐）藥性，時(shí)有防治失敗造成絕收的事例發(fā)生。
[0003] 目前成功用于防治炭痘病菌的生物農(nóng)藥專用制劑還沒(méi)有在生產(chǎn)上登記應(yīng)用?，F(xiàn) 有文獻(xiàn)報(bào)道生物防治控制病害的生防菌屬（種）主要有木霉菌屬真菌（Trichoderma spp.)中的綠色木霉（Trichodermaviride)和哈茨木霉（Trichodermaharzianum); 芽抱桿菌屬細(xì)菌炬acillusspp.)中的枯草芽抱桿菌炬acillussubtilis)、多粘芽抱 桿菌炬acilluspolymyxa)、巨大芽抱桿菌炬acillusmegaterium)和解淀粉芽抱桿菌 炬acillusamyloliquefaciens)等；假單胞菌屬細(xì)菌（Pseudomonasspp.)中的巧光假 單胞細(xì)菌（Pseudomonasfluorescens);鏈霉菌屬細(xì)菌中的黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii)等。防治炭痘病菌相關(guān)的授權(quán)發(fā)明專利有化201210354630.X和 化201210354628. 2。目前，有關(guān)鏈霉菌的生防制劑均用其發(fā)酵代謝產(chǎn)物，而直接利鏈霉菌的 活體抱子加工而成制劑的鮮有報(bào)道。
[0004] 草替和葡萄等是炭痘病主要為害的經(jīng)濟(jì)作物，而該類作物大都是應(yīng)時(shí)鮮果類，多 為即采即食，在化學(xué)防治時(shí)對(duì)藥劑的選擇有很大的局限性。因此，對(duì)炭痘病等經(jīng)濟(jì)作物病害 的生物防治制劑的研發(fā)成為迫切需求。本發(fā)明提供的可有效防治炭痘病的生防細(xì)菌及其活 抱子體制劑，在現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有提及和公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一株新分離自鶴腸道可培養(yǎng)微生物的鏈 霉菌；鏈霉菌（Str巧tomycesangustmyceticus化R1396菌株，用于防治由刺盤抱菌屬 (Colletotrichumspp.)侵染引發(fā)的草替和葡萄炭痘病。同時(shí)本發(fā)明還提供用該鏈霉菌 ER1396菌株的活性抱子加工成可長(zhǎng)期常溫保存的可溶性粉劑的制備方法。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明的鏈霉菌（拉了文學(xué)名為Streptomycesangustmyceticus化R1396菌株， 已于2014年10月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、保藏，保藏號(hào) 為；CGMCCNo. 9871。本發(fā)明的菌種具有如下特征；
[0008] (1化R1396菌株的細(xì)胞顯微形態(tài)、培養(yǎng)及生理生化特征（見表1、2)
[0009] 表1.邸1396菌株細(xì)胞培養(yǎng)特征
[0010]
[001引 （2)本發(fā)明的鏈霉菌邸1396菌株的16SrDNA基因序列為（即SEQIDNO:l);

[0015] 用于本發(fā)明的防治炭痘病的邸1396菌株制備的生防菌劑，其制備方法包括w下 步驟：
[0016] (1) 一級(jí)接種體的制備
[0017] 把邸1396菌株接種到含CYD培養(yǎng)基的斜面上，在25°C條件下培養(yǎng)到產(chǎn)抱，用10血 無(wú)菌蒸饋水洗下菌株的抱子做成懸浮液，用無(wú)菌蒸饋水調(diào)節(jié)抱子濃度在1X104-l〇5CFU/mL， 置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫摻臃N液即為一級(jí)接種體。所述CYD培養(yǎng)基的組成為；1L蒸饋水 中加0. 5g酪蛋白氨基酸，0.8g酵母提取物，0. 4g葡萄糖，2.Og馬冊(cè)〇4, 18g瓊脂，抑調(diào)至 7. 2-7. 4
[001引 （2)二級(jí)接種體的制備
[0019] 取上述一級(jí)接種體貶藏液lOmU接種到裝有l(wèi)OOmLYGM培養(yǎng)液的容積為250血的 =角瓶中，在25化pm、30°C條件下培養(yǎng)32-3化，該培養(yǎng)液命名為二級(jí)接種體，將二級(jí)接種體 貶藏于在4°C冰箱中備用。所述YGM培養(yǎng)基組成為：酵母提取物0.6% (W/V),葡萄糖1.0% (W/V)，礦物鹽（1LYGM培養(yǎng)液中加 5. 3g化2冊(cè)〇4, 1. 98gKH2PO4, 0. 2gM拆〇4. 7&0, 0. 2g 化C1，0. 05gCaCl2. 2&0)和微量元素液（1LYGM培養(yǎng)液中加1. 0血)，抑調(diào)至7. 1-7. 2。 微量元素液的組成為；1L無(wú)菌蒸饋水中溶有6.4g化S〇4. 5&0, 1.IgFeS〇4. 7H2〇,7.9g MnCls. 4馬0, 1. 5gZnS〇4. 7馬0。
[0020] (3)S級(jí)接種體的制備
[0021] 取上述二級(jí)接種體貶藏液lOOmU接種于裝有1.ILYGM培養(yǎng)液的容積為2.化的S 角瓶中，置于2(K)巧m，30°C條件下培養(yǎng)4她，置4°C貶藏備用，該培養(yǎng)液命名為=級(jí)接種體。
[0022] (4)發(fā)酵
[0023] 取=級(jí)接種體貶藏液7.化，接種于裝有40LYGM(P冊(cè).5)培養(yǎng)液的容積為60L發(fā)酵 罐（鎮(zhèn)江東方GUS-60)。發(fā)酵條件下為30化pm，30°C，發(fā)酵時(shí)間為72h。
[0024] (5)高濃度母菌粉的制備
[0025] 將上述發(fā)酵液離屯、8000巧m條件下離屯、lOmin，將沉淀物重新懸浮于化無(wú)菌蒸饋 水溶液（溶液中溶有750g乳糖和80g氯化錠），混合均勻后冷凍干燥（比朗抑-1D-80)，產(chǎn) 物過(guò)200目篩，獲得的菌粉為高濃度母菌粉，含量達(dá)l〇i2-l〇i4CFU/g，母菌粉置4°C低溫可長(zhǎng) 期保存。
[0026] (6)商用可溶性粉劑的制備
[0027] 取Ig高濃度母粉與16kg無(wú)菌滑石粉和2. 0kg無(wú)菌高嶺±充分混合，過(guò)200目篩， 檢測(cè)活性抱子的含量約為1. 0Xl〇9CFU/g。
[002引本發(fā)明的有益效果是：
[0029] 本發(fā)明提供的菌株是從食草動(dòng)物腸道放線菌中篩選而得的，能有效抑制多種植 物病原真菌的生防菌株。本發(fā)明中所用的生防菌劑均由該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)加工制備 而成。本發(fā)明詳細(xì)提供了利用ER1396菌株制備菌劑的加工技術(shù)、菌劑的施用方法及制劑 的助劑成份含量。由該發(fā)明提供的加工技術(shù)所得的商用粉劑中的活菌體菌落數(shù)（colony 化rmingunits，CFU)經(jīng)檢測(cè)達(dá)到108CFU/g。該制劑在低溫6°C)儲(chǔ)藏條件下可W長(zhǎng)期保 存（3年），在常溫儲(chǔ)藏條件下保存12個(gè)月的抱子成活率達(dá)80%W上。按本發(fā)明的鏈霉菌 活抱子制劑，大大降低了W往利用鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物生產(chǎn)生物農(nóng)藥的成本，具有廣闊的 應(yīng)用前景。
[0030]本發(fā)明的鏈霉菌ER1396 (拉了文學(xué)名為Streptomycesangustmyceticus 邸1396)，已于2014年10月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱 CGMCC，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所）保藏，保藏號(hào)為；CGMCC No.9871〇
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例
[00對(duì)本發(fā)明的鏈霉菌邸1396(拉了文學(xué)名為Streptomyces angustmyceticusER1396)，已于2014年10月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中屯、保藏，保藏號(hào)為；CGMCCNo. 9871。本發(fā)明的菌株的細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)及生理生化特 征見"
【發(fā)明內(nèi)容】
"部分表1和表2。本實(shí)施例的鏈霉菌邸1396菌株的16SrDNA基因序列見 "
【發(fā)明內(nèi)容】
"部分。
[003引用本發(fā)明的防治炭痘病的邸1396菌株制備的生防菌劑，其制備方法包括W下步 驟：
[0034] (1)一級(jí)接種體的制備
[003引把邸1396菌株接種到含CYD培養(yǎng)基的斜面上，在25°C條件下培養(yǎng)到產(chǎn)抱，用10血 無(wú)菌蒸饋水洗下菌株的抱子做成懸浮液，用無(wú)菌蒸饋水調(diào)節(jié)抱子濃度在1 X 104-l05CFU/mL， 置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫摻臃N液即為一級(jí)接種體。所述CYD培養(yǎng)基的組成為；1L蒸饋水 中加0.5g酪蛋白氨基酸，0.8g酵母提取物，0.4g葡萄糖，2.Og馬冊(cè)04,18g瓊脂，抑調(diào)至 7. 2-7. 4
[0036] (2)二級(jí)接種體的制備
[0037] 取上述一級(jí)接種體貶藏液lOmU接種到裝有l(wèi)OOmLYGM培養(yǎng)液的容積為250血的 =角瓶中，在25化pm、30°C條件下培養(yǎng)32-3化，該培養(yǎng)液命名為二級(jí)接種體，將二級(jí)接種體 貶藏于在4°C冰箱中備用。所述YGM培養(yǎng)基組成為：酵母提取物0.6% (W/V),葡萄糖1.0% (W/V)，礦物鹽（1LYGM培養(yǎng)液中加 5. 3g化2冊(cè)〇4, 1. 98gKH2PO4, 0. 2gM拆〇4. 7&0, 0. 2g 化C1，0. 05gCaCl2. 2&0)和微量元素液（1LYGM培養(yǎng)液中加1. 0血)，抑調(diào)至7. 1-7. 2。 微量元素液的組成為；IL無(wú)菌蒸饋水中溶有6.4g化S〇4. 5&0, 1.IgFeS〇4. 7H2〇,7.9