專利名稱：一種柱式高純度動物mtDNA的提取及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)核酸提取純化技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種高純度動物線粒 體DNA的提取及純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的動物線粒體DNA提取技術(shù)主要是堿變性法。該技術(shù)采用差速離心法提取線 粒體；SDS堿變性法裂解線粒體；酚抽提法純化mtDNA。該技術(shù)的突出特點(diǎn)是簡便快速，因此 該技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。 由于應(yīng)用該技術(shù)提取的線粒體DNA常有殘留核DNA、 RNA及苯酚等問題，不能滿足 要求高的分子生物學(xué)研究，如PGR擴(kuò)增、酶切及測序等。另外，苯酚等是腐蝕性藥品，長期使 用對環(huán)境、對操作人有害。因此，只有在此技術(shù)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，提高產(chǎn)品的純度、消除苯 酚殘留，才能滿足高水平分子生物學(xué)研究的需要，為我國生物學(xué)領(lǐng)域的研究與國際接軌提 供保障。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高純度的動物線粒體DNA提取及 純化方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種高純度的動物線粒體DNA提取及純化方法，在堿變 性法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，增加了 DNaseI消化步驟，以消除核DNA的殘留；增加了 RNase消化 步驟，以去除RNA的殘留；由柱層析法代替酚抽提法純化mtDNA，解決了苯酚的毒害及其殘 留問題。具體步驟如下 (1)勻漿取動物組織于SE液中漂洗、剪碎，加2-50mlSE液，用電動勻漿器1500r/ min慢檔上下勻漿20-30s，(或加液氮研磨)； (2)分離線粒體將勻漿物以1000-1500r/min離心10-15min，取上清液；在(TC條 件下，12000r/min離心15min，沉淀即為線粒體。加10mlSE液懸浮沉淀，重復(fù)離心一次(即 為較純的線粒體)。加入10mlSTM液懸浮線粒體，加溶液IV使終濃度為100 y g/ml (以去除 核DNA) ， 37。C溫浴，30min， 12000r/min離心10min，棄上清液；加4mlSE液懸浮線粒體，再轉(zhuǎn) 入4個1. 5ml Eppendorf管中，每管lml ; (3)裂解線粒體12000r/min離心8-10min，棄上清液，每管加入150iU溶液I，將 沉淀懸浮后，各加入300 iU新配制的溶液II，混勻，冰浴10min后，再各加225iU4t:的溶 液III，混勻，冰浴25-40min， 12000r/min離心6min ; (4)純化線粒體DNA :吸取300iil上清液至UNIQ-10Column中，上下顛倒混勻3次， 室溫靜置3min，使DNA與UNIQ-10柱膜結(jié)合，3000r/min離心3min，取下UNIQ-10Column，倒 掉管中廢液，將UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min離 心30s，重復(fù)洗滌一次，取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將柱放回收集管中，lOOOOr/ min離心30s，以除去殘留洗液，將柱放入另一潔凈的1.5ml離心管中，在柱中央加入50Elution Buffer,室溫放置2min， 10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為mtDNA ;
(5)加入溶液V，使終濃度為20 ii g/ml，(或37。C溫浴60min，重復(fù)步驟 )，可立 即使用或保存于-2(TC備用。所述SE液(勻漿緩沖液)0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， 10mmo1/ L Na2EDTA，2. 5mmol/L CaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液0. 25mol/L蔗糖，10mmol/LTris-HCl， 0. 5mmol/LMgCl2， pH :8. 0 ;溶液I (TEN) :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA， 0. 15mol/L NaCl， pH :8. 0 ;溶液II :1% SDS含0. 2N NaOH(用時用10% SDS禾P INNaOH新配制)；溶液 III :KAc溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ;溶液IV :DNaseI溶液，用 TE緩沖液配制，濃度5mg/mL ;溶液V :RNaseA溶液，用TE緩沖液溶解RNaseA，以lmg/mL的 濃度配制100mL，煮沸10-15min，分成500ii 1/管，存于-20°C。 Wash Solution :80%的異 丙醇；Elution Buffer :預(yù)熱(60 70°C )的超純水或1XTE緩沖液。
前述的提取方法，優(yōu)選的方案在于，步驟(5)加入溶液V(終濃度20ii g/mL)，加溶 液E，37t:，溫浴60min，重復(fù)步驟(4)，以更加有效地去除RNA。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)異效果在于
1、提取得到的線粒體DNA純度高。 2、電泳檢測顯示電泳條帶為清晰、整齊、均勻的一條帶；背景清晰，未見點(diǎn)樣孔 附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情況。 3、0D值分析顯示0D260/0D280值為1. 78-1. 82，能滿足線粒體DNA的酶切及測序 分析等研究的要求。 4、提取得到的線粒體DNA溶液內(nèi)沒有苯酚殘留。


圖1.實(shí)施例1所得線粒體DNA的電泳圖。 圖2.動物線粒體DNA提取及純化方法的簡易流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例、附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但本發(fā)明不受 這些具體實(shí)施例的限制。若大規(guī)模實(shí)施，可等比例放大。 實(shí)施例中所用原料(或設(shè)備)均為本領(lǐng)域常規(guī)用品，其均可從市場購買。具體 說明如下SE液(勻槳緩沖液)0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， 10mmol/L Na2EDTA， 2. 5,l/LCaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L 蔗糖，10,l/LTris-HCl， 0. 5,1/L MgCl2， pH :8. 0 ;溶液I (TEN) :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA，0. 15mol/L NaCl， pH : 8. 0 ;溶液II :1% SDS含0. 2N NaOH(用時用10% SDS禾P INNaOH新配制)；溶液III :KAc 溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至lOOOmL， pH :5. 5 ;溶液IV :DNaseI溶液，用TE緩沖 液配制，濃度5mg/mL ;溶液V :RNaseA溶液，用TE緩沖液溶解RNaseA，以lmg/mL的濃度配 制100mL，煮沸10-15min，分成500ii 1/管，存于-20。C。 Wash Solution :80%的異丙醇; Elution Buffer :預(yù)熱(60 70°C )的超純水或1XTE緩沖液。 其中TE緩沖液:即Tris-EDTA buffer (10mM Tris， ImM EDTA， pH8. 0)，購自上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，配制KAc溶液所用KAc購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。 實(shí)施例1 :蛙線粒體DNA的提取 (1)取2 15g黑斑蛙的肝臟、性腺或肌肉于少量SE勻漿緩沖液中剪碎，加約20 30mLSE液，以電動勻漿器1500r/min上下勻漿30秒，過濾后，將勻漿吸入離心管中。
(2) 1500r/min離心15min吸取上清液。12000r/min離心20min取沉淀，加10mlSE 液懸浮沉淀，重復(fù)離心一次，加入10mlSTM液懸浮線粒體，加溶液IV使終濃度為100 y g/ml， 37t:溫浴，30min， 12000r/min離心10min，棄上清液，加4mlSE液懸浮線粒體，然后轉(zhuǎn)至4個 1. 5ml Eppendorf管，每管lml 。 (3) 12000r/min離心8min棄上清液，每管加150 yl溶液I將沉淀吹打均勻后 加300 iil新制的溶液II，混勻，冰浴10min，各加225 yl冷溶液III，混勻，冰浴60min， 12000r/min離心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下顛倒混勻3次，室溫靜置3min， 使DNA與UNIQ-10柱膜結(jié)合。3000r/min離心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中廢 液。將UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min離心30s， 重復(fù)洗滌一次。取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，10000r/min 離心30s，以除去殘留洗液。將柱放入另一潔凈的1. 5ml離心管中，在柱中央加入50 y 1 ElutionBuffer，室溫放置2min， 10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為mtDNA。
(5)加溶液V(終濃度為20ii g/ml)，37t:，溫浴60min，重復(fù)步驟④，可立即使用或 保存于-2(TC備用。 本實(shí)施例所得粒體DNA的0D260/0D280值為1. 79，能滿足線粒體DNA的PCR擴(kuò)增、 酶切及測序分析等研究的要求。 圖1為本實(shí)施例所提取和純化的mtDNA的電泳圖，由圖1可以看出電泳條帶為清 晰、整齊、均勻的一條帶；背景清晰，未見點(diǎn)樣孔附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情況。 說明提取的線粒體DNA中未見核DNA和RNA殘留。
實(shí)施例2 :魚線粒體DNA的提取。 (1)取5 6g魚的肝臟或性腺組織，于少量SE溶液中漂洗、剪碎，加約50mlSE，以 電動勻漿器1500r/min上下勻漿30s。 (2)將勻槳物以1000r/min離心15min吸取上清液，12000r/min離心20min，沉 淀即為線粒體。加入4mlSTM液懸浮線粒體，加溶液IV使終濃度為100iig/ml，37t:溫 浴，30min， 12000r/min離心10min，棄上清液；加4mlSE液懸浮線粒體，轉(zhuǎn)入4個1. 5ml Eppendorf管中。 (3) 12000r/min離心10min，棄上清液，每管加入150 yl溶液I，將沉淀懸浮后，各 加入300 ii 1新配制的溶液II混勻，冰浴10min后，再各加225 y 1冷溶液III (4°C )，混勻， 冰浴30min， 12000r/min離心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下顛倒混勻3次，室溫靜置3min， 使DNA與UNIQ-10柱膜結(jié)合。3000r/min離心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中廢液。 將UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min離心30s，重復(fù) 洗滌一次。取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，10000r/min離心 30s，以除去殘留洗液。將柱放入另一潔凈的1. 5ml離心管中，在柱中央加入50ii1 ElutionBuffer,室溫放置2min， 10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為mtDNA。 (5)加入溶液V(終濃度20 g/mL)，可立即使用或保存于-2(TC備用。本實(shí)施例所得粒體DNA的0D260/0D280值為1.81，能滿足線粒體DNA的PCR擴(kuò)增、
酶切及測序分析等研究的要求。 實(shí)施例3 :蜜蜂線粒體DNA提取純化 (1)取新鮮蜜蜂或酒精浸泡標(biāo)本，加液氮研磨，加約5 10mLSE液，混勻，過濾后， 將勻漿吸入離心管中。 (2) 1500r/min離心15min吸取上清液。12000r/min離心20min取沉淀，加 入2mlSTM液懸浮，加溶液IV使終濃度為lOOii g/ml，37。C溫浴，30min， 12000r/min離心 10min，棄上清液，加2mLSE液懸浮，然后轉(zhuǎn)至2個1. 5ml Eppendorf管，每管1ml 。
(3) 12000r/min離心8min棄上清液，每管加150 y L溶液I將沉淀吹打均勻后 加300iiL新制的溶液II，混勻，冰浴10min，各加225yL冷溶液III，混勻，冰浴60min， 12000r/min離心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下顛倒混勻3次，室溫靜置3min， 使DNA與UNIQ-10柱膜結(jié)合。3000r/min離心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中廢 液。將UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min離心30s， 重復(fù)洗滌一次。取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，10000r/min 離心30s，以除去殘留洗液。將柱放入另一潔凈的1. 5ml離心管中，在柱中央加入50 y 1 ElutionBuffer，室溫放置2min， lOOOOr/min離心lmin，離心管中的液體即為mtDNA。
(5)加入溶液V(終濃度20 g/mL)，可立即使用或保存于-2(TC備用。
實(shí)施例4 :跳蟲線粒體DNA提取純化 (1)取新鮮跳蟲或酒精浸泡標(biāo)本于少量SE勻漿緩沖液中剪碎，加約2 5mlSE液，
以電動勻漿器1500r/min上下勻漿20s，過濾后，將勻漿吸入離心管中。 (2) 1500r/min離心15min吸取上清液，再12000r/min離心20min取沉淀，加入
2mlSTM液懸浮線粒體，加溶液IV使終濃度為100ii g/ml，37。C溫浴，30min， 12000r/min離心
10min，棄上清液，加lmLSE液懸浮線粒體，然后轉(zhuǎn)至1個1. 5ml E卯endorf管中。 (3) 12000r/min離心8min棄上清液，每管加150 y L溶液I將沉淀吹打均勻后
加300iiL新制的溶液II，混勻，冰浴10min，各加225yL冷溶液III，混勻，冰浴60min，
12000r/min離心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下顛倒混勻3次，室溫靜置3min， 使DNA與UNIQ-10柱膜結(jié)合。3000r/min離心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中廢 液。將UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min離心30s， 重復(fù)洗滌一次。取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，10000r/min 離心30s，以除去殘留洗液。將柱放入另一潔凈的1. 5ml離心管中，在柱中央加入50 y 1 ElutionBuffer，室溫放置2min， 10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為mtDNA。加入 溶液V(終濃度20 ii g/ml)，可立即使用或保存于-2(TC備用。 本實(shí)施例所得粒體DNA的0D260/0D280值為1. 82，能滿足線粒體DNA的酶切及測 序分析等研究的要求。
權(quán)利要求
一種柱式高純度動物mtDNA的提取及純化方法，其特征在于，在堿變性法的基礎(chǔ)上增加DNaseI消化步驟，以消除核DNA的殘留；增加RNase消化步驟，以去除RNA的殘留；由柱層析法代替酚抽提法純化mtDNA，解決苯酚的毒害及殘留問題。
2. 權(quán)利要求1所述的提取及純化方法，其特征在于，具體步驟如下(1) 勻漿取動物組織于SE液中漂洗、剪碎，加2-50mlSE液，用電動勻漿器1500r/min慢檔上下勻漿20-30s ;(2) 分離線粒體將勻槳物以1000-1500r/min離心10-15min，取上清液；在0°C條件下，12000r/min離心15min，沉淀即為線粒體。加10mlSE液懸浮沉淀，重復(fù)離心一次即得較純的線粒體，加入10mlSTM液懸浮線粒體，加溶液IV使終濃度為lOOii g/ml，37t:溫浴，30min， 12000r/min離心10min，棄上清液；加4mlSE液懸浮線粒體，再轉(zhuǎn)入4個1. 5mlEppendorf管中，每管lml ;(3) 裂解線粒體:12000r/min離心8-10min，棄上清液，每管加入150 yl溶液I，將沉淀懸浮后，各加入300 iU新配制的溶液II，混勻，冰浴10min后，再各加225iU4t:的溶液III，混勻，冰浴25-40min， 12000r/min離心6min ;(4) 純化線粒體DNA :吸取300 ii 1上清液至UNIQ-10Column中，上下顛倒混勻3次，室溫靜置3min，使DNA與UNIQ-10柱膜結(jié)合，3000r/min離心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中廢液，將UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min離心30s，重復(fù)洗滌一次，取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將柱放回收集管中，lOOOOr/min離心30s，以除去殘留洗液，將柱放入另一潔凈的1.5ml離心管中，在柱中央加入50Elution Buffer,室溫放置2min， 10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為mtDNA ;(5) 加入溶液V，使終濃度為20ii g/ml，可立即使用或保存于-2(TC備用；所述SE液0.25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl，10mmol/L Na2EDTA， 2. 5mmol/L CaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L蔗糖，10,1/LTris-HCl， 0. 5mmol/L MgCl2， pH :8. 0 ;溶液I :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA， 0. 15mol/L NaCl， pH :8. 0 ;溶液II : 1 % SDS含0. 2N Na0H ;溶液III :KAc溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ;溶液IV :DNaseI溶液，用TE緩沖液配制，濃度5mg/mL ;溶液V :RNaseA溶液，用TE緩沖液溶解RNaseA，以lmg/mL的濃度配制lOOmL，煮沸10-15min，分成500 ii 1/管，存于_20°CWash Solution :80%的異丙醇;Elution Buffer :預(yù)熱(60 70°C )的超純水或1XTE緩沖液。
3. 權(quán)利要求2所述的提取及純化方法，其特征在于，步驟(1)勻漿也可以取動物組織加液氮研磨。
4. 權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟(5)加溶液E使終濃度20ug/mL，在37t:溫浴60min，再重復(fù)操作步驟(4)，產(chǎn)品-2(TC凍存?zhèn)溆谩?br> 5. 權(quán)利要求2所述的提取及純化方法，其特征在于，所述步驟(1)中動物組織為黑斑蛙的肝臟、性腺或肌肉。
6.權(quán)利要求5所述的提取及純化方法，其特征在于，所述動物組織為魚的肝臟或性腺組織。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柱式高純度的動物線粒體DNA提取及純化方法，在堿變性法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，增加了DNaseI消化步驟，以消除核DNA的殘留；增加了RNase消化步驟，以去除RNA的殘留；由柱層析法代替酚抽提法純化mtDNA，解決了苯酚的毒害及其殘留問題。本方法提取得到的線粒體DNA純度高。電泳檢測顯示電泳條帶為清晰、整齊、均勻的一條帶；背景清晰，未見點(diǎn)樣孔附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情況。
文檔編號C12N15/10GK101717773SQ20091023127
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者杜廷廣, 閆華超 申請人:聊城大學(xué)