專利名稱：玉米的pcr鑒定引物及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及對玉米生物資源進行檢測用引物及PCR 方法。
背景技術(shù)：
玉米Zea mays屬禾本科玉米屬。全世界玉米播種面積僅次于小麥、水稻而居第三 位。我國的玉米產(chǎn)量居世界第二位。在我國玉米的播種面積很大，分布也很廣，是我國北方 和西南山區(qū)及其它旱谷地區(qū)人民的主要糧食之一。玉米具有很高營養(yǎng)價值和保健作用，其 除了含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、胡蘿卜素外，還含有核黃素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。這些 物質(zhì)對預防心臟病、癌癥等疾病有很大的好處。玉米中所含的胡蘿卜素，被人體吸收后能轉(zhuǎn) 化為維生素A，它具有防癌作用；植物纖維素能加速致癌物質(zhì)和其他毒物的排出；天然維生 素E則有促進細胞分裂、延緩衰老、降低血清膽固醇、防止皮膚病變的功能，還能減輕動脈 硬化和腦功能衰退。此外，多吃玉米還能抑制抗癌藥物對人體的副作用，剌激大腦細胞，增 強人的腦力和記憶力此外。我國是一個玉米屬植物種質(zhì)資源十分豐富的國家，有許多優(yōu)良 品種，這些品種已成為我國許多地區(qū)生產(chǎn)上大量栽培的品種，大大地促進了我國玉米相關(guān) 產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著改革開放以來畜牧業(yè)的大發(fā)展，人民生活水平的提高，玉米工業(yè)的發(fā)展， 玉米已成為糧食、飼料、工業(yè)原料和出口商品的多用途作物。為防止我國玉米種質(zhì)資源的流 失，對我國的社會生產(chǎn)力造成難以估量的損失，應該加大對我國玉米資源的保護與研究工 作。 現(xiàn)代生物技術(shù)的出現(xiàn)，使基因資源更多的是以非活體的遺傳物質(zhì)形式攜帶出境， 使得口岸查驗更加困難，因而研究及建立有效的遺傳資源出境檢驗鑒定方法以及相關(guān)的能 力建設(shè)就顯得極為必要。 目前國內(nèi)外對于Zea mays的識別僅限于形態(tài)上，利用分子標記技術(shù)進行品種鑒定 的研究很多，但是在種的水平上未見分子檢測方法的研究。 本發(fā)明應用PCR方法對玉米的分子檢測方法進行研究，通過trnL序列設(shè)計特異引 物，建立了對玉米穩(wěn)定、高效的鑒定方法、成本低，可根據(jù)對擴增產(chǎn)物的普通瓊脂糖電泳判 定是否有玉米核酸存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于玉米PCR檢測的引物及方法。 本發(fā)明通過分析玉米與其近緣種等禾本科植物葉綠體trnL基因序列的基礎(chǔ)上，
設(shè)計特異引物，能夠快速、準確地對Zea mays進行定性檢測。 本發(fā)明提供的檢測引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和2所示。 以樣品總DNA為模板，上述的引物進行PCR擴增，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物判定樣品是否
為玉米。即檢測PCR產(chǎn)物中是否存在230bp的特異性擴增。具體地說，可以利用瓊脂糖凝
膠電泳進行檢測，根據(jù)是否存在230bp的特異性條帶，來判斷樣品是否為陽性。
PCR25iiL反應體系樣 品DNA 1 ii L (1 0 _5 0 n g) ， 1 0 X P CRbuffer(Mg2+free)2. 5ii L，25mM MgCL2 2 ii L， 10mM d證s 2 ii L， 10 ii MPrimers 1 ii L/l ii L，5U/ ii L Taq DNA polymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。 反應條件預變性95。C 5min，再經(jīng)95。C變性30sec，45。C退火30sec，72。C延伸lmin，30循環(huán)，最后72。C延伸5min。 可以將本發(fā)明引物以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。 本發(fā)明建立了適合口岸應用的簡便的檢測方法，即直接從進、出境的禾本科類材料上檢測玉米，操作快捷、結(jié)果準確，避免了用傳統(tǒng)的形態(tài)分類學和細胞學方法所產(chǎn)生的耗費時間和易疏漏的缺陷，順應了當今口岸檢測工作的特點。


圖1是PCR法對玉米的特異性檢測結(jié)果； 其中，M為DL2， OOODNA分子量標準；1玉米，2小傘，3粗山羊草，4黑麥，5栽培一粒，6肯農(nóng)18， 7日本晴，8中國春，CK水對照。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1引物的設(shè)計根據(jù)玉米trnL序列，利用軟件和Primer 3設(shè)計引物及，經(jīng)過多輪篩選，意外發(fā)現(xiàn)以下引物的特異性顯著優(yōu)于其它引物，該引物序列為
正向5' -GATCTCGAAAACAATGAA-3'
反向5' -AAAGGAAAAGGATAGGTG-3'。
實施例2總DNA的提取 (1)取0. 2 0. 3g植物組織，用硅膠保存，剪碎后置研缽中加液氮研成粉末狀，移至已滅菌的1. 5mL離心管，一般加到離心管的1/3體積。 (2)在離心管中加入已在65t:預熱500 y LCTAB提取液(20g/LCTAB， 1. 4M NaCl，
0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA， pH 8.0)混勻，置于65。C水浴鍋保溫30分鐘。 (3)將樣品從水浴鍋中取出，加入與提取液等體積的氯仿/異戊醇(24 : l)，上下
顛倒離心管充分混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。 (4)吸取上清液置于另一已滅菌的1. 5mL離心管。 (5)再加入等體積的氯仿/異戊醇(24 : l)，重復步驟(3)， (4)。 (6)加入等體積或兩倍體積的無水乙醇(已在_201:預冷)，輕輕顛倒離心管混勻，
置于_201:冰箱，放置30分鐘。 (7) 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，倒去上清液，保留沉淀.此時的沉淀物主要為DNA。 (8)加入400iiL70X乙醇，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集沉淀。置于37。C或50。C烘箱烘干。(9)加入100 ii L TE (或者滅菌水)溶解DNA，再加2 y LRNA酶(10mg/ml)，37。C保溫30分鐘。 (10) 1. 0%瓊脂糖電泳檢測DNA濃度及質(zhì)量。
實施例3PCR擴增方法的建立
1、PCR反應體系 以總DNA為模板，進行PCR反應，25 ii L反應體系中有樣品樣品DNA1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2iiL，10mM dNTPs 2 ii L，10 ii M Primers 1 u L/1 u L， 5U/ u L TaqDNA polymerase 0. 1 u L， ddH20 15. 4 u L。
2、PCR反應條件 將樣品管放入ABI 7900PCR儀后，設(shè)置如下條件進行反應預變性95t: 5min，再經(jīng)95。C變性30sec，45。C退火30sec，72。C延伸lmin， 30循環(huán)，最后72。C延伸5min。反應結(jié)
束后擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
實施例4玉米PCR方法的特異性確定 以玉米與其近緣種等8個植物總DNA為模板，以水為陰性對照，通過PCR反應結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳230bp的特異性擴增條帶判定陽性結(jié)果。
試驗結(jié)果 只有玉米的PCR擴增產(chǎn)物出現(xiàn)陽性擴增，而其它近緣材料和陰性對照均沒有擴增
信號，結(jié)果見圖1。
序列表〈110〉中國檢驗檢疫科學研究院〈120〉玉米的PCR鑒定引物及鑒定方法〈130〉KHP09113381.6〈160>2〈170>PatentIn version 3. 5〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1GATCTCGAAA ACAATGAA〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2AAAGGAAAAG GATAGGTG
權(quán)利要求
一種玉米鑒定用引物，其核苷酸序列為正向5’-GATCTCGAAAACAATGAA-3’反向5’-AAAGGAAAAGGATAGGTG-3’。
2. —種檢測玉米的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求l所述的引物進行 PCR擴增，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物判定樣品是否為玉米。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生 230bp的特異性擴增條帶則判定陽性結(jié)果。反應結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR的反應程序為預變性95°C 5min， 再經(jīng)95。C變性30sec，45。C退火30sec，72。C延伸lmin，30循環(huán)，最后72。C延伸5min。
5. 含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種玉米PCR鑒定用引物及方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本發(fā)明還進一步提供了玉米鑒定的PCR檢測方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，反應結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖電泳判定結(jié)果。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度好，為玉米物種資源的鑒定提供了檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101701256SQ200910238018
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者徐濤, 許瑾 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院