一種鑒定三七的特異引物對(duì)及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥材鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定三七的特異引物對(duì)及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 五加科人參屬Panax主要藥用植物為：人參Panax ginseng C. A. Mey.、西洋參 Panax quinquefolium L.和三七 Panax notoginseng(Burkill)F. H. Chen ex C. Chow&ff. G. Huang;人參主要產(chǎn)于我國(guó)東北三省和朝鮮，被譽(yù)為"百藥之王"；西洋參原產(chǎn)于美國(guó)威斯 康辛州和加拿大安大略?。晃覈?guó)市場(chǎng)上的西洋參為進(jìn)口與引進(jìn)種植兩種。三七主產(chǎn)于云 南、廣西，為五加科（Araliaceae)人參屬（Panax)植物三七 Panax notoginseng (Burkill) F.H. Chen的干燥根，是常用名貴中藥材，性溫，味甘、微苦，具有止血散瘓、消腫定痛的功能， 其提取物三七皂苷具有強(qiáng)心、活血、促進(jìn)血液循環(huán)等作用，臨床用于出血、跌打損傷、胸腹刺 痛及癰疽腫毒等，在中醫(yī)骨傷科、外科、婦科等具有廣泛的用途和獨(dú)特的療效，加之其價(jià)格 昂貴。市場(chǎng)上經(jīng)常出現(xiàn)與其形態(tài)相似的偽品充作三七，不僅造成了藥材市場(chǎng)的混亂，而且偽 品不僅不具有藥理作用，甚至可能產(chǎn)生毒副作用，對(duì)臨床用藥安全帶來危害。
[0003]二者都是我國(guó)常用的珍貴藥材，人參、二七自1963年起歷版《中國(guó)藥典》均有收 載，西洋參自《中國(guó)藥典2000年版一部》起有收載。上述三者由于來源于同科同屬不同種植 物的相同部位，因而其內(nèi)部組織構(gòu)造、所含化學(xué)成分均有很大相似之處，給實(shí)際工作中的鑒 定增加了難度，對(duì)于鑒別單味及成方制劑，難度就更大。目前HPLC法是最常用的鑒別方法， 但常出現(xiàn)基線漂移較大、峰分布不均、分離度差或分離出的峰數(shù)較少等問題，難以達(dá)到理想 的鑒定效果。且市場(chǎng)存在相互混用的情況，由于三者藥性和藥效有很大區(qū)別，而傳統(tǒng)的分析 鑒別方法，是根據(jù)形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)成分上鑒別，王賀等采用溶血實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn) 行鑒別；崔秀明等采用HPLC指紋圖譜鑒定；而這些傳統(tǒng)的鑒別方法干擾因素較多，易受環(huán) 境和植物本身的影響和限制；故要求采用先進(jìn)的鑒定技術(shù)進(jìn)行區(qū)分，從而保證患者的用藥 安全，建立一種用于鑒別三七的方法就具有非常重要的意義。
[0004] 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能從分子水平上客觀地反映物種的基因片段差異，克服了傳 統(tǒng)鑒別方法主觀性大、易受干擾等缺點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、所需檢樣量小 等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)傳統(tǒng)中藥鑒別方法進(jìn)行補(bǔ)充，將先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)研宄結(jié)合起來， 是中藥研宄現(xiàn)代化的重要手段，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2010年版一部采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，作 為烏梢蛇、蘄蛇炮制品的質(zhì)量評(píng)定方法，標(biāo)志著分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)作為法定的中藥鑒定 方法之一，擴(kuò)充了中藥鑒定的科學(xué)內(nèi)涵。本發(fā)明通過特異性PCR的方法實(shí)現(xiàn)了三七的快速、 準(zhǔn)確鑒別。目前，尚未有任何公開或報(bào)道過本發(fā)明所提及的引物對(duì)及方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定三七的特異引物對(duì)及方法。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0007] 所述引物對(duì)包括引物F1和引物F2 :
[0008] 引物 F1 的序列為 5' -TmTTTAAATAAATTAAATAAAITTAAAG-3'（SEQ ID NO. 1)，
[0009] 引物 F2 的序列為 5' -ITCATCATTAITTCTTTCTTATCTT-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0010] 所述鑒定三七的方法包括如下步驟：
[0011] (1)采用常規(guī)方法提取待測(cè)樣品的DNA，然后采用本發(fā)明所述的引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣 品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] 5XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus) 5. 0 y L，dNTPs mixture (2. 5mM) 2. 5 y L，鑒別 引物FI (10 yM) 0.75 yL，引物F2 (10 yM) 0.75 yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara， 2. 5U/ y L) 0. 25 y L，DNA模板1. 0 y L，無菌雙蒸水補(bǔ)充體系至25 y L。
[0013] PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)如下：95°C預(yù)變性3min，98°C變性10s，47°C退火15s，72°C延伸 lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸7min。
[0014] (2)電泳所述擴(kuò)增產(chǎn)物，若存在分子量約為241bp的特異條帶，則確定待測(cè)樣品為 二七。
[0015] 關(guān)于本發(fā)明特異引物對(duì)設(shè)計(jì)的說明：
[0016] 一、三七、人參、西洋參鑒別引物所錨定的序列具有種內(nèi)高度保守的特點(diǎn)，且三者 之間存在較小的差異，因此設(shè)計(jì)出一對(duì)能鑒別三七的特異性引物的難度相當(dāng)大：
[0017] 1.人參、西洋參和三七分別在NCBI進(jìn)行Blast相似度比較，具有95%以上的相似 度，差別極?。喝藚⑴c西洋參序列Blast比較，相似度98%;人參和三七序列Blast比較，相 似度96% ;西洋參和三七序列Blast比較，相似度95%。
[0018] 2.采用DNAMAN軟件對(duì)三者進(jìn)行相似度比較，一致性98. 82 %。
[0019] 二、發(fā)明人在三七、人參、西洋參鑒別引物設(shè)計(jì)的前后過程長(zhǎng)達(dá)2年，前期一共設(shè) 計(jì)了 30余對(duì)引物試圖能將三七、人參、西洋參鑒別出來，現(xiàn)略舉數(shù)例以說明引物設(shè)計(jì)的艱 難篩選過程：
[0020] 1、UP 5' -TCGGCGATAGTCACATTG-3'（SEQ ID N0. 3)
[0021] L0 5' -TCGGCGATAGATGCAGTATA-3'（SEQ ID NO. 4)
[0022] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、三七各2個(gè)樣本，無特異條帶。采用 Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)熱啟動(dòng)酶，人參、西洋參、三七各2個(gè)樣本，退火溫 度46 °C，無特異條帶。
[0023] 2、UP 5' -CGCCCTTCTCATAAGATGTTG-3'（SEQ ID N0. 5)
[0024] L0 5, -CCCTTCATCGAAAGAGTAGGC-3，（SEQ ID NO. 6)
[0025] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、三七各2個(gè)樣本，無特異條帶。采用 Takara(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)熱啟動(dòng)酶，人參4個(gè)樣本、西洋參4個(gè)樣本、三七 10個(gè)樣本，退火溫度56°C，從圖中可知，西洋參也出現(xiàn)相同的條帶，所以，不能鑒別三七。
[0026] 3、UP 5, -AGCAGGTCAAGAAGTGGATTG-3,（SEQ ID N0. 7)
[0027] L0 5' -GAAAGAGTAGGCGGTTGAAAG-3'（SEQ ID NO. 8)
[0028] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人參、西洋參、三七各2個(gè)樣本，無特異條帶