專利名稱：紫薇微衛(wèi)星分子標記及在紫薇遠緣雜交后代鑒定中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及DNA分子標記技術(shù)，具體地說，涉及一種紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記以及 利用該標記鑒定紫薇與尾葉紫薇遠緣雜交后代的方法。
背景技術(shù)：
紫薇(Lagerstroemia indica)，屬千屈菜科(Lythraceae)落葉灌木或小喬木,樹 皮光滑，花淡紅、紫色或白色，徑3-4厘米，圓錐花序，花瓣6，皺縮，具長爪，花期6-9月，果期 9-12月。紫薇花期長，觀賞性強，盛開在夏季，有長達1600多年的栽培歷史。目前全世界約 有紫藏品禾中 260 個(DIX，2005，Cultivars and names ofLagerstroemia, http: //www. usna. usda.gov/ ；ZHANG,1991,Studies oncultivars of Crape-Myrtle(Lagerstroemia indica) and their uses in urbangreening，Journal of Beijing Forestry University,13 (4) 59 68 ；張啟翔等，2008，我國紫薇品種調(diào)查研究，中國園藝學會觀賞園藝專業(yè)委員會學術(shù) 年會論文集，56 65)，大多花色鮮艷、開花繁密，但未見有關培育芳香紫薇品種或早花紫 薇品種的報道。尾葉紫薇(Lcaudata)為紫薇屬落葉大喬木，花期4_5月，花芳香。利用尾 葉紫薇與紫薇進行遠緣雜交，可培育出具有花香、早花性狀的紫薇品種。研究表明紫薇具有一定的自交親和性(POUNDERS等，2006，Comparison of self—and cross-pollination on pollen tube growth, seeddevelopment, and germination in crapemyrtle, HortScience, 41 (3) :575 578),因此雜交后代可能混雜有 部分自交后代。另外，尾葉紫薇和部分紫薇品種的播種實生苗開花需要2 3年時間，這些 因素導致紫薇育種工作進展緩慢。利用分子標記手段對雜交后代進行早期鑒定可以提高后 代選擇效率、縮短育種周期。簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR), 也稱微衛(wèi)星 DNAOiiicrosatellite)，是一種由2 5個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復的長達幾十甚至幾百 個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上，每個座位重復單位 的數(shù)量可能不完全相同，因而形成多態(tài)性。由于其具有多態(tài)性豐富、重復性高、共顯性遺傳 等優(yōu)點，被廣泛應用于植物的雜種后代鑒定、遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等領域。有研 究者利用SSR標記對紫薇和大花紫薇(L. speciosa)遠緣雜交后代進行親子鑒定(Pounders 等，2007, Evaluation ofInterspecific Hybrids between Lagerstroemia indica and L. speciosa. HORTSCIENCE, 42 (6) 1317 1322)。目前已發(fā)表的紫薇 SSR 位點只有 15 個， 無法利用這些SSR位點有效地開展紫薇和尾葉紫薇遠緣雜交的分子標記輔助育種工作。因 此，開發(fā)全新的、多態(tài)性高的SSR標記在紫薇育種方面具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記。本發(fā)明的另一目的是提供上述DNA分子標記的篩選方法。本發(fā)明的還一目的是提供上述DNA分子標記在鑒定紫薇與尾葉紫薇遠緣雜交后代中的應用。本發(fā)明的再一目的是提供上述DNA分子標記在紫薇篩選或輔助育種中的應用。本發(fā)明更進一步的目的是提供紫薇品種‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴 蝶’、‘多花粉’與尾葉紫薇雜交后代的DNA分子標記。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記，其中擴增所述分 子標記的引物選自如下引物對1)CI3F F 5' -GAATCAATTACTTTGGGTTG-3‘CI3F R 5' -TGCCTTGTCTACGGTTTT-3‘2)CI5D F 5' -GATTCCCTCCTCCCATTC-3‘CI5D R 5' -TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3‘3)CI5G F 5' -CTCTCAAATGACCCTCTT-3‘CI5G R 5' -TTGAGTAATAACAAGTCCC-3‘4)CI6H F 5' -GAGTTCATGCAGTTAGGT-3‘CI6H R 5' -ATATCGGATTTATCTTCC-3‘5)CI7H F 5' -TCTACCTGGGAAATGTTA-3‘CI7H R 5' -GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3‘6)CII1A F 5' -GGAAGAGGGATTGGAACC-3‘CII1A R 5' -TCTCACTGAAAGAAACTA-3‘7)CII1C F 5' -ACGGTAGATAAGGTGAGC-3‘CII1C R 5' -GGTTTCGTATCGTCGTAG-3‘8)CII1D F 5' -TACTGGGTATCCGTTTCT-3‘CII1D R 5' -ACAGGTGCATTTACTTCC-3‘9)CII1E F 5' -TGATGGTGGTAATGCTGGTG-3‘CII1E R 5' -TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3‘10)CII6A F 5' -TCCGAGTCTGACAGAGGT-3‘CII6A R 5' -TATAACGGGTGTATGAAG-3‘11)CII7E F 5' -TTCTGACCCAGCAGTAAA-3‘CII7E R 5' -CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3‘12)CII12HF 5' -GGGAATTTGGGATATGGA-3‘CII12HR 5' -TAAAGAAACGACCGAGCC-3‘前述的DNA分子標記，其選自編號分別為CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、 CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H 的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 12 所示。本發(fā)明的一種紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記的篩選方法，其包括以下步驟(1)提取紫薇基因組DNA，用內(nèi)切酶Rsa I進行酶切，得到大小為300 lOOObp的 DNA片段；(2)將寡核苷酸 SuperSNX24F(5，-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3，)和末端磷酸化 的 SuperSNX24R(5，-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3，)等摩爾混合，形成接頭；(3)將步驟⑵的接頭與步驟(1)的酶切產(chǎn)物連接；
4
(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產(chǎn)物為模板，進行PCR反應，富集大小 為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成 3，Biotin 標記的探針 20 種，分為三組，按照[Group2 = (AG)12, (TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8] 等體積混合，其中所有探針濃度均為100 μ M，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)的三組探針進行雜交；(7)向雜交后的溶液中加入磁珠，洗滌磁珠；(8)向洗滌后的磁珠中加入ΤΕ，得到含有微衛(wèi)星DNA片段的上清液；(9)以SuperSNX24F為引物，步驟⑶的上清液為模板，進行PCR反應，得到目的片 段；(10)將步驟(9)的擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，篩選轉(zhuǎn)化子，進行菌液PCR擴增， 將產(chǎn)物大小為500 1200bp的菌液測序，得到35個微衛(wèi)星序列，其中包含微衛(wèi)星位點39 個；(11)根據(jù)微衛(wèi)星位點兩端的側(cè)翼序列設計引物并以8株紫薇個體基因組DNA為模 板進行SSR-PCR擴增，產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠結(jié)合銀染檢測，篩選具有多態(tài)性的引物；(12)得到紫薇微衛(wèi)星多態(tài)標記12個，其編號分別為CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、 CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 12所示。利用本發(fā)明的紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記鑒定紫薇與尾葉紫薇雜交后代的真實性， 具體方法為(1)分別對 CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、 CII7E、CII12H位點的特異性引物的正向序列的5’端進行6-FAM或JOE標記；(2)提取紫薇與尾葉紫薇雜交后代的基因組DNA ；(3)分別用 CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、 CII7E、CII12H位點的特異性引物，擴增紫薇與尾葉紫薇雜交后代的基因組DNA ；所述特異性引物的序列分別為CI3F F 5' -6^fam GAATCAATTACTTTGGGTTG-3‘CI3F R5' -TGCCTTGTCTACGGTTTT-3‘CI5D F 5' -6^fam GATTCCCTCCTCCCATTC-3‘CI5D R 5' -TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3‘CI5G F 5' -6^fam CTCTCAAATGACCCTCTT-3‘CI5G R5' -TTGAGTAATAACAAGTCCC-3‘CI6H F 5' -J0E GAGTTCATGCAGTTAGGT-3‘CI6H R5' -ATATCGGATTTATCTTCC-3‘CI7H F 5' -6^fam TCTACCTGGGAAATGTTA-3‘CI7H R 5' -GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3‘CIIlA F 5' -6^fam GGAAGAGGGATTGGAACC-3‘CIIlA R 5' - TCTCACTGAAAGAAACTA-3‘
CIIlC F 5' -J0EACGGTAGATAAGGTGAGC-3‘CIIlCR 5' -GGTTTCGTATCGTCGTAG-3‘
CIIlD F 5' -J0E TACTGGGTATCCGTTTCT-3‘CIIlD R 5' -ACAGGTGCATTTACTTCC-3‘CIIlE F 5' -J0E TGATGGTGGTAATGCTGGTG-3‘CIIlE R 5' -TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3‘CII6A F 5' -J0E TCCGAGTCTGACAGAGGT-3‘CII6A R 5' -TATAACGGGTGTATGAAG-3‘CII7E F 5' -6^fam TTCTGACCCAGCAGTAAA-3‘CII7E R 5' -CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3‘CII12HF 5' -J0E GGGAATTTGGGATATGGA-3‘CII12HR 5' -TAAAGAAACGACCGAGCC-3‘(4)分析 PCR 產(chǎn)物；(5)為了對得到的雜交子代進行DNA分子鑒定，首先篩選出在父母本中擴增出不 同譜帶類型的SSR引物作為雜種鑒定的標記，然后對子代連同親本進行PCR擴增，當子代顯 示出雙親的譜帶類型時，可鑒定為真實雜種。利用本發(fā)明的紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記可以進行紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜 構(gòu)建和分子標記輔助育種。利用本發(fā)明的紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記鑒定紫薇品種‘俏佳人’、‘白云映霞’、 ‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾葉紫薇雜交后代的真實性，從中篩選出2個適用于鑒定 紫薇品種‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾葉紫薇雜交后代的DNA 分子標記CI3F和CII7E。利用兩對在父母本中擴增出不同譜帶類型的SSR引物對子代連同 親本一起進行了 PCR擴增。其中每個雜交組合選擇8 16株，結(jié)果如圖1 圖5所示。由 圖1 圖5可以看出，這兩對引物在父母本中擴增出不同的譜帶，而子代群體分別顯示出雙 親的譜帶，即為雜種類型。本發(fā)明的優(yōu)點在于，提供了 12個紫薇的微衛(wèi)星位點及擴增該12個微衛(wèi)星位點的 引物序列和擴增方法，建立了紫薇的微衛(wèi)星DNA分子標記技術(shù)體系，并利用這些標記進行 紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和分子標記輔助育種，在紫薇與尾葉紫薇育種實踐中， 利用這些DNA分子標記可以快速鑒定種間雜交后代的真實性，有利于高效地獲得雜種后 代，加快紫薇雜交育種進程，重復性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。


圖1為紫薇‘俏佳人’與尾葉紫薇雜交后代在CII7E位點上的STR分型圖；圖2為紫薇‘白云映霞’與尾葉紫薇雜交后代在CII7E位點上的STR分型圖；圖3為紫薇‘XTSC3’與尾葉紫薇雜交后代在CII7E位點上的STR分型圖；圖4為紫薇‘粉蝴蝶’與尾葉紫薇雜交后代在CI3F位點上的STR分型圖；圖5為紫薇‘多花粉’與尾葉紫薇雜交后代在CI3F位點上的STR分型圖；其中，圖1 圖5中1代表尾葉紫薇；2代表‘俏佳人’ ；3代表‘白云映霞’ ；4代 表‘XTSC3’ ；5代表‘粉蝴蝶’ ；6代表‘多花粉’，其它為相應雜交組合的后代個體；圖中橫坐標代表擴增產(chǎn)物大小，縱坐標代表擴增強度。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1紫薇與尾葉紫薇雜交后代的獲得 選擇紫薇(Lagerstroemia indica)品種‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴 蝶’、‘多花粉’與尾葉紫薇(Lcaudata)進行雜交?；ㄋ幧⒎矍?，將紫薇、尾葉紫薇長、短雄 蕊的花藥混采后置于變色硅膠中干燥6h，用80目分子篩收集花粉，置4°C保存。授粉前采用 懸滴法測定各親本花粉的活力，培養(yǎng)基為150g/L蔗糖+20mg/L硼酸+20mg/L氯化鈣+IOOg/ L PEG4000，培養(yǎng)條件為25°C，6h。各親本花粉的活力大于35%時方可用于授粉。選擇當天開花量大的花序，于早5:00 7:00剖開即將開放的花朵，去掉花冠、花 藥和未開的花蕾，套袋隔離。早9:00 10:30進行授粉，授粉采用常規(guī)柱頭授粉法，授粉后 繼續(xù)套袋，一周后去除套袋。授粉于7 8月進行。果實成熟后，外果皮木質(zhì)化。此時采集雜交果實，保存于21°C。果實開裂后收集 種子，播種前將種子去翅，點播于裝有泥炭基質(zhì)(0 20mm)的288孔穴盤中，播種后孔穴內(nèi) 再覆蓋一層基質(zhì)。將穴盤置于33°C/21°C (晝/夜)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天澆水1次，保持基 質(zhì)濕潤，一個月后種子萌發(fā)。待實生苗長出3對真葉后移栽至營養(yǎng)缽(ScmXScm)中，每隔 2天澆水1次，每周澆1次Hogland營養(yǎng)液。實施例2紫薇微衛(wèi)星文庫的構(gòu)建包括如下步驟(1)提取紫薇基因組DNA(DNA secure Plant Kit，購自天根生物)，用內(nèi)切酶Rsa I和Xmn I進行酶切，酶切體系為2. 5yL連接緩沖液(NEB)，0. 25yL 100XBSA(NEB), 0· 25 μ L NaCl (5Μ)，1 μ LRsa I (NEB)，1 μ L Xmn I (NEB)，20 μ L DNA(100ng/L)，于 37°C，酶切 40小時，得到大小為300 IOOObp的DNA片段；(2)將 10 μ M 寡核苷酸 SuperSNX24F (5，-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3，)和末端 磷酸化的 SuperSNX24R(5，-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA_3，)等體積混合，95°C變性 10分鐘，緩慢冷卻至室溫，形成接頭；(3)將步驟(2)的接頭7 μ L、T4DNA連接酶(NEB) 2 μ L和10 X連接緩沖液1 μ L混 合后，加入到(1)的酶切產(chǎn)物中，22°C連接2小時后，置于4°C連接40小時以上；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產(chǎn)物為模板，進行PCR反應，反應體系 為 2.5yL 10XPCR 緩沖液，2· 5μ L BSA, 1. 3μ L SuperSNX24F (10 μ Μ), 1. 5 μ L dNTPs (各 2. 5mM), 2 μ L MgCl2 (25mM), 13 μ L dH20,0. 2μ L Taq 酶(5U/μ L)，2 μ L連接產(chǎn)物；反應程序 為 95°C 2min ； 95 °C 20sec,60°C 20sec，72°C 1. 5min，35 個循環(huán)反應；15°C 保溫，用 2% 的瓊 脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物，富集大小為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin標記的探針20種，分為三組，分別按照[Group2 = (AG)12, (TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8]等體積混合(所有探針濃度均為100 μ M)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)三組探針進行雜交；雜交過程為將25 μ L 2 X雜交溶液(12XSSC，0.2% SDS)，10 μ L生物素標記的一組探針，10 μ L步驟(4) 的DNA片段，5 μ L dH20混合，在PCR儀中進行雜交；雜交程序為95°C 5min,然后迅速降溫 到70°C，再以0. 040C /sec的速率降溫到50°C，然后在50°C保溫lOmin，再以0. 1°C /sec的 速率降溫到40°C，最后迅速降溫到15°C保溫；(7)加入 50 μ L 平衡后的磁珠(10mg/mL，Dynabeads M-280，Invitrogen)，室溫輕 搖30分鐘，使磁架分離，去除溶液；(8)用400 μ L Wl洗液(2XSSC，0. 1% SDS)的清洗磁珠2次，棄溶液；用400 μ L W2洗液(1XSSC，0. SDS)清洗磁珠2次，棄溶液；加入400 μ L W2洗液，40°C輕搖2分 鐘，棄溶液；加入400μ LW2洗液，50°C輕搖2分鐘，棄溶液；加入400 μ L W2洗液，45°C輕搖 2分鐘，棄溶液；(9)重復步驟(7) —次； (10)加入200 μ L TE，95°C保溫5min，磁架分離后，得到含有微衛(wèi)星DNA片段的上
清液；(11)以SuperSNX24F為引物，步驟(10)的上清液為模板，按照步驟(4)的反應體 系和反應程序進行PCR反應，得到目的片段；(12)將步驟(11)的擴增產(chǎn)物連接到 pCR2. l-T0P0(InvitrogenT0P0 Cloning Kit)載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有 50 μ g/mL氨芐青霉素和40mg/mLX-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進行藍白斑篩選。實施例3含紫薇微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序以及紫薇微衛(wèi)星引物的設計包括如下步驟(1)用牙簽挑取136個白色菌落并接種到含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 370C，150rmp培養(yǎng)40小時。以菌液為模板，進行PCR反應；PCR 反應體系為2. 5μ L 250 μ g/mL BSA,2. 5μ L 10 X PCR 緩沖液，1 μ L IOmM 引 物M13F 5‘-GTAAAACGACGGCCAG-3‘, 1 μ L IOmM 引物M13R 5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，，2 μ L 25mM MgCl2,1. 5 μ L 2. 5mM dNTP，0. 2 μ L TaqDNA聚合酶，L 5 μ L菌液，12. 8 μ LdH2O ；反應程 序95°C 3min ；35 個循環(huán)反應，95°C 20sec，50°C 20sec，72°C 1. 5min, 15°C保溫；(2)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物，選取PCR條帶單一，產(chǎn)物大小為 500 1200bp的菌液進行測序，得到35個微衛(wèi)星序列，其中包含微衛(wèi)星位點39個；(3)根據(jù)微衛(wèi)星位點兩端的側(cè)翼序列設計引物并以8株紫薇個體基因組DNA為 模板進行SSR-PCR擴增，10 μ L反應體系為包括IOng基因組DNA，1 X PCR緩沖液(IOmM Tris-HCl, 50mM KCl，pH8. 3)，dNTPs (各 250 μ Μ) ,MgCl2 (1. 5mM)，正、反向引物(各 0. 5 μ Μ)， Taq 酶(0. 5U)，反應程序為 95 °C 3min ；95°C 30sec，最佳退火溫度(48 52 °C )30sec, 72°C lmin,30個循環(huán)反應；72°C 5min, 15°C保溫，將各PCR產(chǎn)物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠 上檢測各引物多態(tài)性，篩選出非特異性條帶擴增少、結(jié)果穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記12 個，分別為 CI3F、CIOT、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 12所示。實施例4利用紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記鑒定紫薇與尾葉紫薇雜交后代的真實性具體方法為(1)分別對 CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H位點的特異性引物的正向引物的5’端進行6-FAM或JOE標記；(2)提取紫薇與尾葉紫薇雜交后代的基因組DNA(DNA securePlant Kit，購自天根 生物)；(3)分別用 CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、 CII7E、CII12H位點的特異性引物，擴增紫薇與尾葉紫薇雜交后代的基因組DNA。IOyL反應 體系為包括 IOng基因組DNA，IXPCR緩沖液(IOmM Tris-HCl, 50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 μ Μ)，MgCl2 (1. 5mM)，正、反向引物(各 0· 5 μ Μ)，Taq 酶(0· 5U)，反應程序為 95°C 3min ； 30 個循環(huán)反應，95°C 30sec，最佳退火溫度(48 52°C )30sec，72°C Imin ；72°C 5min, 15°C 保溫；所述特異性引物的序列分別為
CI3F F 5' -6_famGAATCAATTACTTTGGGTTG_3‘CI3F R5' -TGCCTTGTCTACGGTTTT-3‘CI5D F 5' -6_famGATTCCCTCCTCCCATTC-3‘CI5D R5' -TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3‘CI5G F 5' -6_famCTCTCAAATGACCCTCTT-3‘CI5G R5' -TTGAGTAATAACAAGTCCC-3‘CI6H F 5' -J0EGAGTTCATGCAGTTAGGT-3‘CI6H R5' -ATATCGGATTTATCTTCC-3‘CI7H F 5' -6_famTCTACCTGGGAAATGTTA-3‘CI7H R5' -GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3‘CIIlA F 5' -6_famGGAAGAGGGATTGGAACC_3‘CIIlA R 5' -TCTCACTGAAAGAAACTA-3‘CIIlC F 5' -J0EACGGTAGATAAGGTGAGC-3‘CIIlC R 5' -GGTTTCGTATCGTCGTAG-3‘CIIlD F 5' -J0ETACTGGGTATCCGTTTCT-3‘CIIlD R 5' -ACAGGTGCATTTACTTCC-3‘CIIlE F 5' -J0ETGATGGTGGTAATGCTGGTG-3‘CIIlE R 5' -TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3‘CII6A F 5' -J0ETCCGAGTCTGACAGAGGT-3‘CII6A R 5' -TATAACGGGTGTATGAAG-3‘CII7E F 5' -6-famTTCTGACCCAGCAGTAAA_3‘CII7E R 5' -CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3‘CII12HF 5' -J0EGGGAATTTGGGATATGGA-3‘CII12HR 5' -TAAAGAAACGACCGAGCC-3‘所述特異性引物的退火溫度分別為50°C、50 °C、48 °C、48 °C、48 °C、48 °C、52 V、 50°C、52°C、52°C、50°C、52°C。(4)將PCR產(chǎn)物用ABI377遺傳分析儀(Applied Biosystem公司)進行STR基因 分型，使用GeneMapper 4. 0軟件(Applied Biosystem公司)判讀等位基因的具體數(shù)值；(5)為了對得到的雜交子代進行DNA分子鑒定，首先篩選出在父母本中擴增出不同譜帶類型的SSR引物作為雜種鑒定的標記，然后對子代連同親本進行PCR擴增，當子代顯 示出雙親的譜帶類型時，可鑒定為真實雜種。利用紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記鑒定紫薇品種‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉 蝴蝶’、‘多花粉’和尾葉紫薇雜交后代真實性的結(jié)果如圖1 圖5所示，由圖1 圖5可見， 本發(fā)明篩選出的2個微衛(wèi)星序列CI3F(如SEQ ID No. 1所示)和CII7E(如SEQ ID No. 11 所示)可以鑒定出紫薇品種和尾葉紫薇遠緣雜交的真實雜種。由此可見，本發(fā)明的微衛(wèi)星 標記能夠用于紫薇和尾葉紫薇的雜種鑒定，是一種可靠有效的分子標記。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表 <110>北京林業(yè)大學<120>紫薇微衛(wèi)星分子標記及在紫薇遠緣雜交后代鑒定中的應用<130>KHP09113882. 2<160>40<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>440<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>1ttctgatgac aaaaggtgca aaagagaata agaagacgta agcatgtgaa tcaattactt 60tgggttgaaa gagaataaac catgcaggat ttacatgtaa accctttaaa aaagaaagaa 120agaaagaaag aaattagcta gagagcaggt atattggaat ttgacaataa tttgcgattt 180atcttcagga gctaaatgat aggaattcat caatagccac caaggagtga aaatccatat 240accaaaaatg aaagattaaa agccatttct cttgctcaat atgtctacca gagtatcctc 300aaaattcttt tatggctaac tgaaatttac tttacagtct ccacattaat aaataattgg 360atatccctgg gtattcaagt aaaaaccgta gacaaggcat agctccagta attcccaata 420aataatttca aagtatgatg440<210>2<211>294<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>2accaaaagca aaaggaaagg aaaggaaagg aaaggaaagg aaactccgca gcatcacatt 60ctattcttcc actcactgtc actgattccc tcctcccatt catacccaaa taattccttc 120atggttaatt agttctctct ctataccttt tttttttttt tttaaatttc attaaaaaat 180tccacttcat atctatctat ctatctatat catatcagcc agcctgccct gccactgggc 240ttcgcagaca cgagacggct caaatagtcc attttttacc caacccccgg cccc294
<210>3<211>360<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>3ctactctcaa atgaccctct tgagcatact tatctatcag attgggtcag cccattttga60ttaaaaaagg agcaaaagga tattcaaata aagaaaagaa agaaagaaag aaagataatg 120aaagttttga attacctaag cagcatggca ctgggaggga gcggcagtcc aagatagtgg 180agtccagagg aatgttggaa aagaaaccct ctgcataaaa agcaaaggca acactttatg 240ggacttgtta ttactcaaga aaaagatggg caaagaaagc attatacttt atgggagctc 300gcacagtgaa atcactcttc gactttggac aaaagctggt ctgctctcgg cacttttggt 360<210>4<211>267<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>4cgtcaaaggg gcaaaaactt tctacaaaat atcggtcaat atttccggga agaaatagat60gtgaaacttg agttcatgca gttaggttcg accgaccaat aaaactaaat ttttttttaa 120aaaatagaag tgaaaaaaaa atgaagaaga agaagaagaa gacaattaat gttttgaaat 180gggaagataa atccgatatt gttcttcagg taatttaaaa tgcatggtag agtctaaagt 240ttcgaaaatg tcaattaaat tattttt267<210>5<211>516<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>5caagcagatt atcaattcct gggcggtatg ccctgtgttg aattggatac atcacaatga60tctctattat catccccaaa gcaattgaac atatacagaa attcccgata gcagtcagca 120ccttcaacat catgaaacaa gaaatgatta gattaaaata aaaccttcaa gaaaataggc 180gcattattgg attactctac ctgggaaatg ttagaactgg aagctataca agatcactga 240aaacaacaac aacaacaaca acaacaacaa atatttacat agaaacgtaa tggctgttgg 300aagttgctga aaaagtggca attctttgat gtttaaaggg gtcattggtt tgcaatcagt 360cttcgctgag atcaacaaag tcccattcat ccatccaaaa aagacgagat aaagattgtc 420tcaggaagtc agcaatggaa cctctaaaac aaagcagggt taacagagga ggactcaaca 480ggatgcaaat gaatttgaaa ttaatctatt cagggt516<210>6<211>346<212>DNA <213>Lagerstroemia indica
<400>6actagacttc ttcttctctc ggaagcgcgt aactttttta tgcatctgtc tatatatatt 60gctctcatat atgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgttgctat tcatgaaacc ctagcatacg 120gccttttccg aactgaagca gaagagaaag aaaaggcgtg aggtccgaac ggtggacgag 180agagagaggg gtaagaaaga gacgggaaga gggattggaa cctctgtatc cattcagctc 240ccggtatctg atactctgga acatcgttaa tggaagaaat ggagattgtg aacgtctgag 300agagagaggg aggaggagga tagtttcttt cagtgagagc tgaaat346<210>7<211>306<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>7aattcgatct actattaaga aaactctcta atacataaat ttatgaataa actcatcatt 60gtaataaaaa aaaattcaaa ttcatgttat catatgaact gtcacacggt agataaggtg 120agcacgggag caggtgatca gatcaaccac tatctctctc tctctctctc ttctgtgtct 180gtctgtctgt ctgtctatgg gtcagcagtg gcgacagaca gagaagacag agactgaccc 240taaagccttt gagctacgac gatacgaaac ccaaaaacct tacacagata tataaatatg 300gggccg306<210>8<211>354<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>8actacgttaa ccttgaatat actagcacta ctactgggta tccgtttctc aagcatccga 60gtagttgatt ttgcagtgag cattttgaca ctaggagcaa agttcaaaat gtatctcttc 120tttttaccag cagtaataat cgaaccgtgt caatcttcga gcaccaaata atgggatcca 180ggcaaaagtc atatatgttc agggttctta ctatatcaac gcagctcctc cacagtaatt 240actttatgtg acattttatc gtatgcatag gcccaagaga atctctctct ctctctctct 300ctctctccct ctctctctct cccccatccc ggaagtaaat gcacctgtct tttg354<210>9<211>370<212>DNA<213>Lagerstroemia indica<400>9tttctaatta acaattcaga tgctttatac tcaatcttac catgttgatt atattgttag 60caagacaagt ttccattttg acaggtccat ggatgacact gtagagagtg tcatttctaa 120agttcgccga gcgttgaaca tggacggact tgatggtggt aatgctggtg agctaccttt 180gcctaagcaa ttgttttctt tctttctttc tttcctagaa aaaaaagagt tccaaactag 240gaaactcatc tgagttaaag agcaggcctc tatgcactat ttcttgtccg gacaaaaccc 300
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<213>人工序列<400>13gtttaaggcc tagctagcag aatc24<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>14gattctgcta gctaggcctt<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>15gtaaaacgac ggccag16<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16caggaaacag ctatgac17<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17gaatcaatta ctttgggttg20<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>18tgccttgtct acggtttt18<210>19
<211>18<212>DNA<213>人工序列 <400>19gattccctcc tcccattc18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>20ttgagccgtc tcgtgtct18<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>21ctctcaaatg accctctt18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>22ttgagtaata acaagtccc19<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>23gagttcatgc agttaggt18<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>24atatcggatt tatcttcc18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列
<400>25tctacctggg aaatgtta18<210>26 <211>18<212>DNA<213>人工序列<400>26gttgagtcct cctctgtt18<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>27ggaagaggga ttggaacc18<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>28tctcactgaa agaaacta18<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>29acggtagata aggtgagc18<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>30ggtttcgtat cgtcgtag18<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>31tactgggtat ccgtttct18<210>32
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>32acaggtgcat ttacttcc18<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>33tgatggtggt aatgctggtg20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34tcttctatag gcccatgcag20<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>35tccgagtctg acagaggt18<210>36<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>36tataacgggt gtatgaag18<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>37ttctgaccca gcagtaaa18<210>38<211>20<212>DNA
<213>人工序列
<400>38cgtatctcat ctgtagcgta20<210>39
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>39gggaatttgg gatatgga18<210>40<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>40taaagaaacg accgagcc18
權(quán)利要求
一種紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記，其特征在于，擴增所述分子標記的引物選自如下引物對1)CI3F F5′-GAATCAATTACTTTGGGTTG-3′CI3F R5′-TGCCTTGTCTACGGTTTT-3′2)CI5D F5′-GATTCCCTCCTCCCATTC-3′CI5D R5′-TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3′3)CI5G F5′-CTCTCAAATGACCCTCTT-3′CI5G R5′-TTGAGTAATAACAAGTCCC-3′4)CI6H F5′-GAGTTCATGCAGTTAGGT-3′CI6H R5′-ATATCGGATTTATCTTCC-3′5)CI7H F5′-TCTACCTGGGAAATGTTA-3′CI7H R5′-GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3′6)CII1A F5′-GGAAGAGGGATTGGAACC-3′CII1A R5′-TCTCACTGAAAGAAACTA-3′7)CII1C F5′-ACGGTAGATAAGGTGAGC-3′CII1C R5′-GGTTTCGTATCGTCGTAG-3′8)CII1D F5′-TACTGGGTATCCGTTTCT-3′CII1D R5′-ACAGGTGCATTTACTTCC-3′9)CII1E F5′-TGATGGTGGTAATGCTGGTG-3′CII1E R5′-TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3′10)CII6A F5′-TCCGAGTCTGACAGAGGT-3′CII6A R5′-TATAACGGGTGTATGAAG-3′11)CII7E F5′-TTCTGACCCAGCAGTAAA-3′CII7E R5′-CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3′12)CII12HF5′-GGGAATTTGGGATATGGA-3′CII12HR5′-TAAAGAAACGACCGAGCC-3′
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子標記，其選自如SEQID No. 1至SEQ ID No. 12所示的 核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記在鑒定紫薇與尾葉紫薇遠緣雜交后 代中的應用。
4.如權(quán)利要求3所述的紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記在鑒定紫薇品種‘俏佳人’、‘白云映 霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’和‘多花粉’與尾葉紫薇雜交后代中的應用。
5.權(quán)利要求1或2所述的紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記在紫薇篩選或輔助育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記，其包括12個紫薇的微衛(wèi)星位點。本發(fā)明還提供了該紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記的篩選方法及其在鑒定紫薇與尾葉紫薇遠緣雜交后代中的應用。此外，本發(fā)明還提供了擴增該12個紫薇微衛(wèi)星位點的引物序列和擴增方法，同時篩選出2個適用于鑒定紫薇品種‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾葉紫薇雜交后代的DNA分子標記，建立了紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記技術(shù)體系，在紫薇與尾葉紫薇育種實踐中，利用這些DNA分子標記可以快速鑒定種間雜交后代的真實性，提高紫薇種質(zhì)創(chuàng)新和雜交育種效率，重復性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。
文檔編號C12N15/11GK101845490SQ200910244438
公開日2010年9月29日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者孫明, 宋平, 張啟翔, 潘會堂, 王學鳳, 王敏, 田苗, 程堂仁, 蔡明 , 高亦珂 申請人:北京林業(yè)大學