專利名稱：基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)試劑盒及方法，特別涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
鵝細(xì)小病毒(Goose Parvovirus,GPV)是細(xì)小病毒科(Parvoviridate)、細(xì)小病毒 屬(Parvovirus Genus)、無囊膜的單鏈DNA病毒，主要感染1月齡以內(nèi)雛鵝和雛番鴨引起細(xì) 小病毒病，又稱小鵝瘟。該病是一種高發(fā)病率和高死亡率的高度接觸性傳染病，已經(jīng)在世界 范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)鵝業(yè)造成嚴(yán)重危害和重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，鵝細(xì)小病毒的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)鑒定法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 和熒光定量PCR(FQ-PCR)法，但分離培養(yǎng)鑒定法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，PCR法和FQ-PCR法需要昂 貴的儀器和試劑，檢測(cè)成本高，不適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技術(shù)與其它 核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，可以在等溫條件下快速、高效、特異地?cái)U(kuò)增靶序列，且操作簡便，不需要 昂貴的儀器和試劑，成本低，已在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域顯示出廣闊的發(fā)展前景。但至今尚未 見基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)鵝細(xì)小病毒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于環(huán)介導(dǎo) 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒；目的之二在于提供一種使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝細(xì)小病毒的方法；靈敏度高，特異性好，操作簡便 快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)成本低，適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案1、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，含有以下4組特異性引物 中的任意1組①上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-tcgcaatgccaatttcccgagg-ggagctatgggcgactct-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-gaccaccagaacctgggtcc-gcatcttgagaggttccgc-3，；上游夕卜弓丨物 F3 :5，-aatggcagagggaggagg-3，；下游外引物 B3 5，-cccagggggtactgtatcc-3，；②上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-ggccaaatcctccgagattcgg-cagggacctattggggca-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-caatccaccaccgcaggtgt-ccacttctggtgcacgtatt-3，；上游外弓丨物 F3 :5，-ggtttggcagaacagggata-3，；下游外引物B3 5，-gcccgtagagtactgggtta-3，；③上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-ggccaaatcctccgagattcgg-tggggcaaaaataccgaaga-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-caatccaccaccgcaggtgt-ccacttctggtgcacgtatt-3，；上游外弓丨物 F3 5，-ggtttggcagaacagggata-3，；
下游外引物 B3 :5，-gcccgtagagtactgggtta-3，；④上游內(nèi)弓I物 FIP :5，-cttgatgaacacctgcggtggt-ccatccttctccgaatctcg-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_aatacaccagtgcctgcagacc_gcccgtagagtactgggtta_3，；上游夕卜弓丨物 F3 :5，-tggggcaaaaataccgaaga-3，；下游夕卜弓丨物 B3 5，-tcccacaccatctctactgt-3，。進(jìn)一步，還含有以下試劑中的一種或多種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bst)DNA聚合酶、 IOX熱聚合反應(yīng)緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物(dNTPs)、硫酸鎂、甜菜堿和熒光染 料賽博綠I (SYBR Green I)；所述IOX熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8. 8 的三羥基甲基氨基甲烷_鹽酸(Tris-HCl)、濃度為lOOmmol/L的氯化鉀、濃度為IOOmmol/ L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的曲拉通(Triton) X-100組成；所 述dNTPs由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸胞 嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)組成。上述試劑均為常規(guī)試 劑，可直接從商業(yè)渠道購得，通常在相關(guān)實(shí)驗(yàn)室中為常備試劑，故本發(fā)明試劑盒中可以不放 入上述試劑，或僅放入上述試劑中的一種或幾種，當(dāng)然也可全部放入，提供多種選擇以方便 使用者購買。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝細(xì)小病毒 的方法，包括以下步驟a、提取待檢樣品的病毒DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的0D26(1/0D28(1值為 1. 6 2. 0,濃度為 10 IOOng/ μ 1 ；b、鵝細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在反應(yīng)管中配制總體積為25 μ 1的環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增反應(yīng)體系，由以下組分組成濃度各為0. 2 μ mol/L的上游內(nèi)引物FIP和下游內(nèi)引物 BIP,濃度各為0. 8 μ mol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8U嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA 聚合酶，IX熱聚合反應(yīng)緩沖液，濃度各為lmmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥 嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為3mmol/L 的硫酸鎂，濃度為lmol/L的甜菜堿，待檢模板DNA水溶液1 μ 1，余量為水；將反應(yīng)管于60 65°C水浴中保溫反應(yīng)45 90分鐘，再于80 95°C水浴中保溫3 5分鐘終止反應(yīng)；C、顯色檢測(cè)在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料賽博綠I水溶液1 μ 1， 用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有鵝細(xì)小病毒；如果顏色變?yōu)?綠色，說明待檢樣品中含有鵝細(xì)小病毒。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢 測(cè)試劑盒及方法，該試劑盒根據(jù)鵝細(xì)小病毒VP3基因(Genbank AccessionNo. U25749)保 守區(qū)的六個(gè)特異區(qū)域設(shè)計(jì)了兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物，從而保證了環(huán)介導(dǎo)等 溫?cái)U(kuò)增的高度特異性和檢測(cè)結(jié)果的可靠性；本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)鵝細(xì)小病 毒，由四條引物對(duì)靶序列的六個(gè)特異區(qū)域進(jìn)行識(shí)別，特異性強(qiáng)；在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì)因 溫度改變而造成時(shí)間損失，耗時(shí)短，在1小時(shí)內(nèi)即可將靶序列擴(kuò)增至IO9倍，而且受非靶序 列的影響小，與PCR法相比靈敏度更高，檢測(cè)限僅為幾個(gè)拷貝；此外，該技術(shù)不需要特殊、昂 貴的儀器和試劑，擴(kuò)增產(chǎn)物不需要進(jìn)行凝膠電泳，直接用熒光染料顯色即可憑肉眼判斷結(jié) 果，操作簡便快速，檢測(cè)成本低。本發(fā)明的試劑盒及方法特別適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng) 用。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn) 行詳細(xì)的描述。實(shí)施例11、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，由以下試劑組成a、濃度各為5ymol/L的上游內(nèi)引物FIP水溶液和下游內(nèi)引物BIP水溶液，濃度各 為20 μ mol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-tcgcaatgccaatttcccgagg-ggagctatgggcgactct-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-gaccaccagaacctgggtcc-gcatcttgagaggttccgc-3，；上游夕卜弓丨物 F3 :5，-aatggcagagggaggagg-3，；下游外弓I物 B3 :5，-cccagggggtactgtatcc-3，；b、濃度為8U/ μ 1的Bst DNA聚合酶水溶液；cUOX熱聚合反應(yīng)緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8. 8的Tris-HCl、濃度為 100mmol/L的氯化鉀、濃度為lOOmmol/L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
的 Triton X-100 組成；d、濃度為 10mmol/L 的 dNTPs 水溶液由濃度各為 10mmol/L 的 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP組成；e、濃度為lOOmmol/L的硫酸鎂水溶液；f、濃度為2mol/L的甜菜堿水溶液；g、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料SYBR Green I水溶液。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝細(xì)小病毒 的方法，包括以下步驟a、提取待檢樣品的病毒DNA作為模板DNA 本實(shí)施例同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照 組，其中實(shí)驗(yàn)組為鵝細(xì)小病毒，來源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心；采用DNA提取試劑盒 (天根生化科技有限公司)提取各組病毒DNA，按照試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)組所得病毒DNA 水溶液的0D26Q/0D28Q值為1. 8，濃度為20ng/l·! 1。b、鵝細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在反應(yīng)管中配制總體積為25 μ 1的環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增反應(yīng)體系加入濃度均為5 μ mol/L的上游內(nèi)引物FIP水溶液和下游內(nèi)引物BIP水溶液 各1 μ 1，濃度均為20 μ mol/L的上游外引物F3水溶液和下游外引物B3水溶液各1 μ 1，濃度 為8U/y 1的Bst DNA聚合酶水溶液1 μ 1，10Χ熱聚合反應(yīng)緩沖液2. 5 μ 1，濃度為IOmmol/ L的dNTPs水溶液2. 5 μ 1，濃度為lOOmmol/L的硫酸鎂水溶液0. 75 μ 1，濃度為2mol/L的甜 菜堿水溶液12. 5 μ 1，用無DNA酶的水稀釋至24 μ 1，再加入模板DNA水溶液1 μ 1，混合均 勻，即得；將反應(yīng)管于60 65°C水浴中保溫反應(yīng)60分鐘，再于80°C水浴中保溫5分鐘終止 反應(yīng)；C、顯色檢測(cè)在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料賽博綠I水溶液1 μ 1， 振搖均勻，用肉眼觀察顏色變化。結(jié)果空白對(duì)照組的顏色為黃色，說明不含有鵝細(xì)小病毒；實(shí)驗(yàn)組的顏色變?yōu)榫G 色，說明含有鵝細(xì)小病毒，與預(yù)期結(jié)果一致。
實(shí)施例21、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，與實(shí)施例1所述試劑盒的 不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-ggccaaatcctccgagattcgg-cagggacctattggggca-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-caatccaccaccgcaggtgt-ccacttctggtgcacgtatt-3，；上游外弓丨物 F3 :5，-ggtttggcagaacagggata-3，；下游外弓丨物 B3 5，-gcccgtagagtactgggtta-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝細(xì)小病毒 的方法，與實(shí)施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組的顏色為黃色，說明不含有鵝細(xì) 小病毒；實(shí)驗(yàn)組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鵝細(xì)小病毒，與預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)施例31、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，與實(shí)施例1所述試劑盒的 不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-ggccaaatcctccgagattcgg-tggggcaaaaataccgaaga-3，；下游內(nèi)弓丨物 BIP :5，-caatccaccaccgcaggtgt-ccacttctggtgcacgtatt-3，；上游外弓丨物 F3 :5，-ggtttggcagaacagggata-3，；下游外引物 B3 :5，-gcccgtagagtactgggtta-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝細(xì)小病毒 的方法，與實(shí)施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組的顏色為黃色，說明不含有鵝細(xì) 小病毒；實(shí)驗(yàn)組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鵝細(xì)小病毒，與預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)施例41、基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，與實(shí)施例1所述試劑盒的 不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游內(nèi)弓丨物 FIP :5，-cttgatgaacacctgcggtggt-ccatccttctccgaatctcg-3，；內(nèi)弓L BIP :5，_aatacaccagtgcctgcagacc_gcccgtagagtactgggtta_3，；上游夕卜弓丨物 F3 :5，-tggggcaaaaataccgaaga-3，；下游夕卜弓丨物 B3 5，-tcccacaccatctctactgt-3，。2、使用所述基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝細(xì)小病毒 的方法，與實(shí)施例1所述方法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組的顏色為黃色，說明不含有鵝細(xì) 小病毒；實(shí)驗(yàn)組的顏色變?yōu)榫G色，說明含有鵝細(xì)小病毒，與預(yù)期結(jié)果一致。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。序列表< 110>重慶市畜牧科學(xué)院、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及方法<160>16<210>1
<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組下游內(nèi)引物BIP<400>6caatccacca ccgcaggtgt ccacttctgg tgcacgtatt40<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組上游外引物F3<400>7ggtttggcag aacagggata20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>第②組下游外引物B3<400>8gcccgtagag tactgggtta20<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>第③組上游內(nèi)引物FIP<400>9ggccaaatcc tccgagattc ggtggggcaa aaataccgaa ga42<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>第③組下游內(nèi)引物BIP<400>100154]caatccacca ccgcaggtgt ccacttctgg tgcacgtatt40
0155]<210>11
0156]<211>20
0157]<212>DNA
0158]<213>人工序列
0159]<220>
0160]<223>第③組上游外引物F3
0161]<400>11
0162]ggtttggcag aacagggata20
0163]<210>12
0164]<211>20
0165]<212>DNA
0166]<213>人工序列
0167]<220>
0168]<223>第③組下游外引物B3
0169]<400>12
0170]gcccgtagag tactgggtta20
0171]<210>13
0172]<211>42
0173]<212>DNA
0174]<213>人工序列
0175]<220>
0176]<223>第④組上游內(nèi)引物FIP
0177]<400>13
0178]cttgatgaac acctgcggtg gtccatcctt ctccgaatct eg42
0179]<210>14
0180]<211>42
0181]<212>DNA
0182]<213>人工序列
0183]<220>
0184]<223>第④組下游內(nèi)引物BIP
0185]<400>14
0186]aatacaccag tgcctgcaga ccgcccgtag agtactgggt ta42
0187]<210>15
0188]<211>20
0189]<212>DNA
0190]<213>人工序列
0191]<220>
0192]<223>第④組上游外引物F3
<400>15
tggggcaaaa ataccgaaga
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第④組下游外引物B3
<400>16
tcccacacca tctctactgt
20
20
10
權(quán)利要求
基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于含有以下4組特異性引物中的任意1組①上游內(nèi)引物FIP5’-tcgcaatgccaatttcccgagg-ggagctatgggcgactct-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-gaccaccagaacctgggtcc-gcatcttgagaggttccgc-3’； 上游外引物F35’-aatggcagagggaggagg-3’； 下游外引物B35’-cccagggggtactgtatcc-3’；②上游內(nèi)引物FIP5’-ggccaaatcctccgagattcgg-cagggacctattggggca-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-caatccaccaccgcaggtgt-ccacttctggtgcacgtatt-3’； 上游外引物F35’-ggtttggcagaacagggata-3’； 下游外引物B35’-gcccgtagagtactgggtta-3’；③上游內(nèi)引物FIP5’-ggccaaatcctccgagattcgg-tggggcaaaaataccgaaga-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-caatccaccaccgcaggtgt-ccacttctggtgcacgtatt-3’； 上游外引物F35’-ggtttggcagaacagggata-3’； 下游外引物B35’-gcccgtagagtactgggtta-3’；④上游內(nèi)引物FIP5’-cttgatgaacacctgcggtggt-ccatccttctccgaatctcg-3’； 下游內(nèi)引物BIP5’-aatacaccagtgcctgcagacc-gcccgtagagtactgggtta-3’； 上游外引物F35’-tggggcaaaaataccgaaga-3’； 下游外引物B35’-tcccacaccatctctactgt-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，其特征 在于還含有以下試劑中的一種或多種嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶、10X熱聚合反應(yīng)緩 沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿和熒光染料賽博綠I ；所述10X熱聚 合反應(yīng)緩沖液由濃度為250 mmol/L、pH為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為100 mmol/L的氯化鉀、濃度為100 mmol/L的硫酸銨、濃度為20 mmol/L的硫酸鎂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 %的曲拉通X-100組成；所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、 三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。
3.使用權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鵝 細(xì)小病毒的方法，其特征在于包括以下步驟a、提取待檢樣品的病毒DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的0D26(1/0D28(1值為 1. 6 2. 0，濃度為 10 100 ng/ u 1 ；b、鵝細(xì)小病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在反應(yīng)管中配制總體積為25yl的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 反應(yīng)體系，由以下組分組成濃度各為0. 2 u mol/L的上游內(nèi)引物FIP和下游內(nèi)引物BIP， 濃度各為0.8 P mol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8 U嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合 酶，IX熱聚合反應(yīng)緩沖液，濃度各為1 mmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤 脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為3 mmol/L的 硫酸鎂，濃度為1 mol/L的甜菜堿，待檢模板DNA水溶液1 y 1，余量為水；將反應(yīng)管于60 65°C水浴中保溫反應(yīng)20 60分鐘，再于80 95°C水浴中保溫3 5分鐘終止反應(yīng)；c、顯色檢測(cè)在反應(yīng)管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的熒光染料賽博綠I水溶液1yl，用 肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有鵝細(xì)小病毒；如果顏色變?yōu)榫G 色，說明待檢樣品中含有鵝細(xì)小病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的鵝細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及方法，該試劑盒根據(jù)鵝細(xì)小病毒VP3基因保守區(qū)的六個(gè)特異區(qū)域設(shè)計(jì)了兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物，從而保證了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的高度特異性和檢測(cè)結(jié)果的可靠性；本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)鵝細(xì)小病毒，可以在等溫條件下快速、高效、特異地?cái)U(kuò)增靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，擴(kuò)增產(chǎn)物直接用熒光染料顯色即可憑肉眼判斷結(jié)果，檢測(cè)成本低，特別適合中小型單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101871015SQ20091025105
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者付利芝, 楊松全, 楊柳, 楊睿, 楊金龍, 沈克飛, 程安春 申請(qǐng)人:重慶市畜牧科學(xué)院;四川農(nóng)業(yè)大學(xué)