專利名稱：一種基于pcr-dgge水體藍藻檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到生物技術、分類學、生態(tài)學及水環(huán)境監(jiān)測領域，特別是涉及一種利用藍藻鑒定標準Marker快速檢測自然水體藍藻種類的PCR-DGGE方法，同時還涉及快速檢測水體藍藻種類的PCR-DGGE試劑盒。
背景技術：
藍藻水華已經成為一個嚴重的環(huán)境問題，了解自然水體存在的藍藻種類有利于開展預防和治理工作。傳統(tǒng)的顯微鏡觀察方法需要豐富的藻類分類學知識，并且對屬內種與種之間的區(qū)分非常困難，而通過分子生物學PCR-DGGE技術能將藻類鑒定到種，目前已有的藍藻分子檢測技術需要借助對PCR產物的測序和數據庫比對分析，檢測周期長且花費大，因此，需要建立一種基于PCR-DGGE技術的快速檢測方法。本發(fā)明通過制備藍藻種類鑒定標準Marker,在不對PCR-DGGE產物測序的情況下，可以直接利用藍藻鑒定標準Marker進行電泳條帶分析，確定水體中的主要藍藻種類和群落結構組成。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供了一種基于PCR-DGGE水體藍藻檢測方法，在使用標準Marker的基礎上，該方法鑒定速度快，不需對DGGE產物測序，藍藻鑒別能力強，結果可靠。
本發(fā)明的另一個的目的是在于提供了一種基于PCR-DGGE水體藍藻檢測試劑盒，該試劑盒成分簡單，成本較低，能同時檢測多個水樣，且易操作。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施
—種基于PCR-DGGE水體藍藻檢測方法其步驟是 A、制備變性梯度膠按照DGGE裝置說明書(如Bio-Red公司)，制備丙稀酰氨濃度為8%、變性梯度范圍為25% _45%的變性梯度膠。 B、采集水體樣品，用浮游生物網濃縮后，反復(2-3次)凍融釋放出藍藻DNA，倒入分液漏斗靜置30sec后，取中間部分的水樣(約lOmL)，進一步離心，將其轉入1. 5mLEP管中，離心后，用去離子水反復洗滌3次后，加入50yL去離子水，反復凍融2次后[-80。C (5min)/80。C (5min)]，再次-80。C冷凍5min后，直接在旋渦儀上vortex lmin后，在8(TC水浴中靜置2min， 5000rpm/min離心lmin，用移液槍取1 y L上清溶液作為模板DNA加入PCR管； C、取1 ii L上清溶液作為模板DNA加入PCR管，進行PCR擴增反應，反應條件為94°C預變性5min， 94°C 40sec， 55_58°C (每個循環(huán)后退火溫度降低1°C ) ， 72°C 30sec，循環(huán)4次，接著94°C 40sec，55。C 30sec，72。C 30sec，循環(huán)27次，接著72。C延伸10min，最后溫度降至12。C恒溫30min ; D、將標準DNA marker和PCR產物分別加入不同泳道，以50V-30min， 120V_7h的條件進行DGGE電泳；E、染色，拍照，并對結果進行分析，鑒定出水體中藍藻的種類。 一種基于PCR-DGGE水體藍藻快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下幾部分 A、PCR相關試劑①藍藻鑒定特異性引物，其序列如下上游引物5' -CGCCCG CCGCGC CCC GCG CCC GGCCCG CCG CCC CCG CCC C-GTC ACGCCC GAAGTC GTTAC-3';下游引物5' -CTAACCACC TGAGCTAAT-3'。②熱聚合酶(Taq酶)；③dNTPs包括ATP、 GTP、 CTP、 TTP)。
B、自行制備的藍藻鑒定標準marker。其制備方法包括兩種途徑
(1)利用PCR-DGGE反應制備①選定已知的藍藻種類，利用本發(fā)明所述的方法，首先進行一次PCR反應。在紫外燈下，利用一次性20iiL白色小槍頭，從變性梯度膠上的目的條帶的中間位置取少許含有DNA片斷的膠，將粘有膠末的槍頭小心放入1. 5mL的EP管中，加入50ii L去離子水，在8000rpm/min的條件下離心lmin，確保膠末浸入水中，置于4t:中過夜。②取上述的浸泡液IP L，稀釋IOO倍后，再取稀釋液liiL作為模板DNA加入50iiLPCR反應體系中進行二次PCR擴增(每個循環(huán)的Ta = 58t:，其余條件同第一次PCR)，將PCR產物測序，接著把測序結果登陸網站NCBI，利用Blast進行搜尋，從而確定序列所對應的物種。③將多個(1-50)測序后的目的條帶的二次PCR產物混合，進一步純化濃縮得到含有多個(1-50)已知物種特異條帶的標準Marker混合溶液，通過PCR-DGGE電泳，將含有多個(1-50)條帶的標準Marker溶液與混合前的各種單一條帶的PCR產物進行比較，從而確定標準Marker泳道從上至下各個條帶(即對應的物種)的排列順序。 (2)利用人工合成的方法制備根據上述已知藍藻物種PCR-DGGE產物測序結果，通過人工合成藍藻種類鑒定標準Marker，將含有多個(1_50)物種標準Marker混合，并與制備的單一物種條帶特異性Marker進行DGGE比較分析，從而確定標準Marker泳道從上至下各個條帶(即對應的物種)的排列順序。C、 DGGE電泳相關試劑7L 1XTAE緩沖液，16mL25X和45%的變性梯度膠配置液
(含8X聚丙稀酰氨膠濃度)，30iiL 10% APS，15iiLTEMED。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果 1.能快速鑒定水樣的藍藻種類及群落結構； 2.能同時對多個不同時空的樣品進行直觀的比較分析； 3.靈敏度高； 4.成本低，檢測速度快，容易操作。


圖1為一種水體藍藻快速檢測試劑盒的應用示意圖。 利用本發(fā)明方法及快速檢測試劑盒檢測兩個自然水體藍藻群落的結果。從圖中可以看出，可以看出水體l含有Phormidium autumale ArthrospiraplatensisSynechocystis sp Synechocystis sp等藻類，水體2含有Anabaena spPhormidiumautumale Synechocystis sp Synechocystis sp等藻類。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明做進一步說明
實施例1 : —種基于PCR-DGGE水體藍藻檢測方法，其步驟是
A、變性梯度膠制備在DGGE電泳槽中加入約7L 1 XTAE緩沖液，并開啟預熱裝置，將緩沖液預熱至6(TC。分別取16mL 25%和45%的聚丙烯酰胺變性梯度膠配置液，加入30iiL 10XAPS和15iiL TEMED后，迅速灌膠，制得丙稀酰氨膠濃度為8% 、變性梯度膠范圍為25% _45%的變性梯度膠。 B、從深圳石巖水庫采集的樣品1和從深圳鐵崗水庫采集的樣品2(均取1000mL水樣)，用浮游生物網濃縮，倒入分液漏斗靜置30sec后，取中間部分的水樣(約10mL)，進一步離心，將其轉入1. 5mL EP管中，用去離子水反復洗滌3次后，加入50 ii L去離子水，反復凍融2次后[-8(TC (5min)/8(TC (5min)]，再次-8(TC冷凍5min后，直接在旋渦儀上vortexlmin后，在8(TC水浴中靜置2min， 5000rpm/min離心lmin，用移液槍取1 y L上清溶液作為模板DNA，以備進行PCR-DGGE分析。 C、以50iiL的反應體系進行PCR反應。反應條件為94"C預變性5min， 94°C 40sec，58 °C -55 °C (每個循環(huán)后退火溫度降低1°C )，72°C 30sec，循環(huán)4次，接著94°C 40sec，55°C 30sec，72。C 30sec，循環(huán)27次，接著72。C延伸10min，最后溫度降至12。C恒溫30min得到PCR產物。 D、DGGE電泳①取標準Marker樣品20 ii L，在膠的最中間泳道上樣，待檢測樣品上樣量為20-50 ii L。②設置電泳條件50V-30min， 120V-7h。 E、染色及拍照將變性梯度膠小心置于裝有100mL的染色液玻璃器皿，在慢速搖床上放置lh后，凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。 F、結果鑒定分析見圖1 ，對照制備藍藻鑒定標準Marker (包含15條具有代表性的特異性條帶)，可以看出樣品l(石巖水庫水樣)含有Phormidiumaut咖ale Arthrospiraplatensis Synechocystis sp Synechocystis sp等藻類，樣品2 (深圳鐵崗水庫水樣)含有Anabaena sp Phormidium autumale Synechocystis spSynechocystis sp等藻類。
實施例2 : —種基于PCR-DGGE水體藍藻快速檢測試劑盒，該試劑盒包括 A、 PCR反應試劑PCR 10Xbuffer (含MgCl2)，正向引物和反向引物，dNTPs， Taq
DNA聚合酶，無菌雙蒸水； B、自行制備的標準marker,從上至下的DGGE電泳條帶依次為1 :Anabaenasp， 2 :Phormidium autumale， 3-Microcystis sp， 4 :Phormidium sp， 5 :Arthrospir即latensis，6 -Microcystis sp，7 :Cylindrospermopsis raciborskii，8 :Raphidiopsis sp，9:L印tolyngbya badia，10 :Cylindrospermopsis raciborskii，11 -Synechocystis sp，12 :Phormidium sp，13 :Synechocystis sp，14 :Synechocystis sp，15 :Synechocystis sp
C、 DGGE電泳相關試劑7L IXTAE緩沖液，25%和45%的丙稀酰氨變性梯度膠配置液(含8%丙稀酰氨膠濃度)，10% APS和TEMED。
權利要求
一種基于PCR-DGGE水體藍藻檢測方法其步驟是A、水樣采集與處理從自然水體采集含藍藻的水樣，通過浮游生物網濃縮，倒入分液漏斗靜置30sec后，取中間部分的水樣進一步離心，將其轉入1.5mLEP管中，用去離子水反復洗滌3次后，加入50μL去離子水，反復凍融2次后，再次在-80℃冷凍5min，直接在旋渦儀上Vortex 1min后，在80℃水浴中靜置2min，5000rpm/min離心1min，用移液槍取1μL上清溶液作為模板DNA加入PCR反應管；B、變性梯度膠制備按照DGGE裝置說明書，制備丙稀酰氨濃度為8％、變性梯度范圍為25％-45％的變性梯度膠；C、PCR反應取1μL上清溶液作為模板DNA加入PCR管，進行PCR擴增反應，反應條件為94℃預變性5min，94℃40sec，55-58℃、72℃各30sec，循環(huán)4次，接著94℃40sec，55℃30sec，72℃30sec，循環(huán)27次，接著72℃延伸10min，最后溫度降至12℃恒溫30min；D、DGGE電泳將標準藍藻鑒定DNA marker和PCR產物分別加入不同泳道，以50V-30min，120V-7h的條件進行DGGE電泳；E、分析鑒定對電泳緯果進行染色、掃描分析，鑒定出水體中藍藻種類。
2. —種適用權利要求1所述的基于PCR-DGGE水體藍藻快速檢測試劑盒，該試劑盒包括A、 PCR相關試劑①藍藻鑒定特異性引物，其序列如下上游引物5'-CGCCCG CCG CGCCCC GCG CCC GGCCCG CCG CCC CCG CCC C-GTC ACGCCC GAA GTC GTT AC-3';下游引物5' -CTAACC ACC TGA GCT AAT-3';②熱聚合酶；③dNTPs包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP ;B、 自行制備的藍藻鑒定標準marker,其制備方法包括兩種途徑(1) 利用PCR-DGGE反應制備①選定已知的藍藻種類，利用本發(fā)明所述的方法，首先進行一次PCR反應，在紫外燈下，利用一次性20 L白色小槍頭，從變性梯度膠上的目的條帶的中間位置取少許含有DNA片斷的膠，將粘有膠末的槍頭小心放入1. 5mL的EP管中，加入50 ii L去離子水，在8000rpm/min的條件下離心lmin，膠末浸入水中，置于4°C中過夜；②取上述的浸泡液1 y L，稀釋100倍后，再取稀釋液1 y L作為模板DNA加入50 ii L PCR反應體系中進行二次PCR擴增，每個循環(huán)的Ta二58t:，其余條件同第一次PCR，將PCR產物測序，接著把測序結果登陸網站NCBI，利用Blast進行搜尋，確定序列所對應的物種；③將測序后的目的條帶的二次PCR產物混合，進一步純化濃縮得到含有已知物種特異條帶的標準Marker混合溶液，通過PCR-DGGE電泳，將含有條帶的標準Marker溶液與混合前的各種單一條帶的PCR產物進行比較，確定標準Marker泳道從上至下各個條帶的排列順序；(2) 利用人工合成的方法制備根據上述已知藍藻物種PCR-DGGE產物測序結果，通過人工合成藍藻種類鑒定標準Marker,將含有物種標準Marker混合，并與制備的單一物種條帶特異性Marker進行DGGE比較分析，確定標準Marker泳道從上至下各個條帶的排列順序；C、 DGGE電泳相關試劑7L 1XTAE緩沖液，16mL 25%和45%的變性梯度膠配置液，含8%丙稀酰氨膠濃度，3011 L腦APS，15iiL TEMED。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于PCR-DGGE水體藍藻檢測方法及其快速檢測試劑盒。檢測步驟是A、水樣采集濃縮后，通過反復凍融釋放出藍藻DNA，在水浴中靜置2min，離心后取1μL上清溶液作為模板DNA加入PCR管；B、按照DGGE裝置說明書，制備丙稀酰氨變性梯度膠；C、將模板DNA加入PCR管進行PCR擴增反應；D、將標準DNA marker和PCR產物分別加入不同泳道進行DGGE電泳；E、對電泳結果進行分析鑒定。該方法鑒定速度快，不需對DGGE產物測序，藍藻鑒別結果準確可靠。水體藍藻檢測試劑盒包括a、PCR相關試劑藍藻特異性引物和Taq酶；b、自行制備的藍藻鑒定標準marker。c、DGGE電泳相關試劑。該試劑盒成分簡單，檢測成本低，能同時檢測多個水樣。
文檔編號C12Q1/68GK101701264SQ20091027287
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權日2009年11月20日
發(fā)明者羅文懷, 胡章立 申請人:深圳大學