專利名稱：檢測水體中綜合毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)保中的檢測水質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體涉及一種利用熒光 素酶反應(yīng)體系檢測水體中綜合毒性的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前國際上檢測飲用水中主要有害化學(xué)污染物的確證性方法為氣相色譜法、 高效液相色譜法、色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法；飲用水中有機(jī)污染物分析的富集方法主要 有頂端空間分配法、疏水吸附法、氣相提取法、溶劑萃取法、固相萃取法、大孔 樹脂吸附法及反滲透法。中國對(duì)飲用水質(zhì)的檢測規(guī)范遵循國家標(biāo)準(zhǔn)GB5750-85中 的"生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢測方法"和建設(shè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)CJ/T206-2005中的"城市供 水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)"，對(duì)飲用水中有害化學(xué)污染物質(zhì)的檢測基本上以儀器分析法為主， 為我國大型水系及主要大城市水源污染狀況提供了非常重要的數(shù)據(jù)。但這些確證 性檢測方法的一次性檢測范圍較窄，且非常耗時(shí)和費(fèi)力。由于飲水中有機(jī)物染物 種類繁多，且大多數(shù)有機(jī)物在水中含量極微，要全部分析監(jiān)測和研究這些污染成 分，工作量非常巨大。這些儀器方法的檢測時(shí)間長、操作復(fù)雜、需要昂貴的儀器， 且不能在短時(shí)間內(nèi)確定水體樣品是否有生物毒性；另外，即使定性或定量檢測出 單種或多種有害物，也無法判定這些有害物質(zhì)的綜合生物毒性作用，因?yàn)椴煌?性物質(zhì)的拮抗作用或協(xié)同作用所產(chǎn)生的生物毒性效果并不能以這些毒物的具體 的量來推算。因此這些確證性的方法在檢測水質(zhì)綜合毒性時(shí)具有很大的缺限性。 近十多年來，歐美一些發(fā)達(dá)國家非常重視水質(zhì)綜合毒性檢測技術(shù)，如德國、美國、 荷蘭、意大利及西班牙等國家將水質(zhì)及環(huán)境樣品綜合毒性測試列入國家標(biāo)準(zhǔn)。該 技術(shù)的核心是一種基于生物傳感技術(shù)的檢測系統(tǒng)，具體為一種利用發(fā)光細(xì)菌的急 性毒性測試技術(shù)，已被很多國家用于檢測大城市飲用供水系統(tǒng)。該傳感器具有攜 帶方便，檢測時(shí)間短、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。中國于1995年制定了水質(zhì)急性毒性的 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GB/T15441-1995，該標(biāo)準(zhǔn)中利用有毒有害物質(zhì)對(duì)海洋發(fā) 光桿菌T3的生物發(fā)光具有抑制作用的原理來判定水質(zhì)的綜合毒性，但該方法為維
4持T3菌的正常生存，需在測試體系中加入較高濃度的NaCl (2 % 3 %)。但大 量氯離子或鈉離子的存在會(huì)在相當(dāng)程度上影響樣品中一些污染物的生物可利用 性和毒性順序，同時(shí)也對(duì)測試淡水體系樣品中污染物毒性存在一定的局限性和矛 盾。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，專利申請(qǐng)?zhí)枮?00610150846.9的中國專利， 名稱為"一種濃縮預(yù)處理用于水體綜合毒性檢測的方法"，該專利方法首先以超 濾膜、反滲透膜對(duì)水樣品進(jìn)行濃縮處理，然后利用有害物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑 制特性來測定水樣品的綜合毒性。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測水樣品的綜合毒性，檢 測時(shí)間短，靈敏度較高；但該方法在應(yīng)用中需要對(duì)發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行凍存復(fù)活處理， 需要特定的培養(yǎng)設(shè)施及冷凍設(shè)備，因而使這種方法在現(xiàn)場水樣綜合毒性的檢測受 到一定的限制；另外，由于在凍存、復(fù)活及培養(yǎng)過程中，不同批次所得到的空白 對(duì)照樣品的發(fā)光強(qiáng)度差異較大，使得這種方法的穩(wěn)定性及重復(fù)性不佳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種檢測水體中綜合毒性的 方法，用熒光素酶反應(yīng)體系代替發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行水體綜合毒性檢測，具有檢測靈敏 度高、操作簡便、檢測時(shí)間短、穩(wěn)定性及重復(fù)性好、不需要貴重儀器的優(yōu)點(diǎn)，可 實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測水樣的綜合毒性，也非常適用于國家舉辦大型社會(huì)活動(dòng)時(shí)應(yīng)急檢測 和防恐需要。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明利用熒光素酶代替發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行 水體綜合毒性檢測，熒光素酶是一種從熒火蟲體內(nèi)提取出來的或利用基因工程技
術(shù)得到的商品化的酶制劑，該酶對(duì)環(huán)境中或水體中存在的痕微量有毒有害物質(zhì)非 常敏感。當(dāng)水體中存在有害物質(zhì)，包括重金屬、無機(jī)化工污染物、有機(jī)污染物等， 會(huì)改變熒光素酶的活性，從而使該熒光素酶在三磷酸腺苷存在的條件下催化D-熒光素的反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致該反應(yīng)所產(chǎn)生的光強(qiáng)度隨著水樣中毒物量的含量而 改變，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低程度來判定水樣的綜合毒性。
本發(fā)明采用的熒光素酶為由熒火蟲中提取的酶制劑；熒光素為由熒火蟲中提 取的D-熒光素，通過市售，如可以直接從美國Sigma公司購買。通過檢測與水樣 中有毒有害物質(zhì)作用后的熒光索酶所催化的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來判定水樣是否受到 污染或確定飲用水是否安全可飲用。
本發(fā)明包括如下步驟第l步反應(yīng)體系緩沖液的制備所述的反應(yīng)體系緩沖液，包括A液一酶促 反應(yīng)緩沖液、B液一底物稀釋液、C液一熒光素酶貯存液及D液一底物應(yīng)用液。
其中A液的配制方法如下0. 025mol/L的N-三羥甲基甘氨酸20ml 100ml， pH7.5的0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液5ml 20ml，將這兩種緩沖 液混合，將混合液的pH用0. lmol/L的HC1或0. lmol/L Na0H調(diào)為6. 0 8. 5。
其中B液的配制方法如下稱取牛血清白蛋白5mg 20mg， MgCl2. 6H20 30mg 60mg, 二硫蘇糖醇2呢 10mg，最后用A液定容至10毫升。
其中C液的配制方法如下將購得的熒光素酶凍干粉用0.01 mol/L 0.05 mol/L pH 7.4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為0. 15mg/ml 0. 55mg/ml的酶貯存液，按100微升每管，分裝凍存于-80°C -20'C冰箱中。
其中D液的配制方法如下先將D-熒光素用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基 氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為0.2mg/ml 1.0mg/ml溶液，然后取該溶液 5uL 15yL， B液500iiL 1500iiL， C液50 w L 150 w L，最后將這三種溶液 混合即成為底物應(yīng)用液D。
第2步三磷酸腺苷二鈉貯存液及應(yīng)用液的配制用pH7. 5的0. 01mol/L三 羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液配制成濃度為2. 0mg/ml 10.0mg/ml的三磷酸腺苷 二鈉貯存液；配制應(yīng)用液時(shí)，用pH7.5的0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩 沖液稀釋5 50倍即可。
第3步水體綜合毒性的檢測取6個(gè)聚四氟乙烯材料制成的透光性良好的 反應(yīng)杯，或可應(yīng)用普通的48塑料孔養(yǎng)板。進(jìn)行空白測試時(shí)，每次做三個(gè)平行樣， 先向每杯或每孔中分別加入A液250yL， D液50ixL， 二次蒸餾水100yL，室溫 孵育15分鐘 25分鐘；然后將上述各反應(yīng)杯或培養(yǎng)板放入發(fā)光檢測儀中，向反 應(yīng)杯或反應(yīng)孔中加入三磷酸腺苷二鈉應(yīng)用液100u L，用移液槍吹打混勻；15秒 30秒后記錄發(fā)光強(qiáng)度。在測試每個(gè)水樣時(shí)，也做三個(gè)平行樣，測試方法基本同 空白樣測試，不同之處時(shí)用待測水樣替代二次蒸餾水。按照下面的公式計(jì)算待測 水樣的發(fā)光強(qiáng)度
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=樣品三個(gè)平行樣的平均發(fā)光值+空白三個(gè)平行樣的平均發(fā)光 值X 1000/0
根據(jù)計(jì)算出的發(fā)光強(qiáng)度，參照中國1995年制定的水質(zhì)急性毒性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 方法——GB/T15441-1995中的結(jié)果判定方法，査對(duì)表1。表l
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度
安全90% 120%
可疑大于120% 80% 90%
不安全小于80%
根據(jù)査表結(jié)果得出待測水樣的綜合毒性安全、可疑或不安全。本發(fā)明利用熒光素酶對(duì)毒物反應(yīng)非常靈敏的特點(diǎn)，建立了檢測水體中綜合毒性的新方法，與現(xiàn)有檢測方法相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)及優(yōu)勢
1、 快速。在30分鐘之內(nèi)可得出檢測結(jié)果。在實(shí)際檢測時(shí)，只需要將己配制并貯存的反應(yīng)體系緩沖液、三磷酸腺苷二鈉液現(xiàn)場稀釋，再加入待檢水樣孵育十幾分鐘后即可進(jìn)行測試。不需要像背景技術(shù)那樣，要對(duì)毒物敏感發(fā)光菌進(jìn)行復(fù)蘇與重培養(yǎng)，從發(fā)光細(xì)菌處理至一個(gè)樣品測試完成，實(shí)際需要2小時(shí)以上。而本發(fā)
明從配制試劑到獲得檢測結(jié)果，只需20至30分鐘，從而大大節(jié)省時(shí)間。如果應(yīng)
用目前的國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測法檢測水體受有毒有害物質(zhì)污染情況，則需要幾天才有結(jié)果，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速預(yù)警河流水質(zhì)、城市供水系統(tǒng)及市售飲用水的安全情況。
2、 檢測靈敏度高。本發(fā)明采用的熒火蟲源性熒光素酶對(duì)不同毒物的反應(yīng)非常靈敏，即痕微量的毒性物質(zhì)即可顯著抑制熒光素酶的活性。另外，本發(fā)明所用的發(fā)光儀是利用現(xiàn)代光子技術(shù)來檢測發(fā)光信號(hào)，該技術(shù)能檢測到微弱的化學(xué)或生物發(fā)光，并能區(qū)分微小的光強(qiáng)變化。因而本發(fā)明所建立的發(fā)光體系檢測水體綜合毒性的靈敏度要比利用其它酶類的檢測方法高數(shù)千倍，比一般生物或生物細(xì)胞的檢測方法高出數(shù)十倍至數(shù)百倍。
3、 能檢測待檢水樣中所有毒物的綜合毒性。采用國標(biāo)的某一種方法只能檢針對(duì)性地檢測某種物質(zhì)，無法判定規(guī)定檢測項(xiàng)目之外的有毒有害物質(zhì)，因而很容易導(dǎo)致漏檢。而本發(fā)明方法是利用熒光素酶檢測結(jié)果來判定待檢樣品中所有毒有害物質(zhì)的綜合毒性，因此，即使人類還未發(fā)現(xiàn)的毒物或從未出現(xiàn)過的新化學(xué)合成毒物，也會(huì)顯著影響熒光素酶的活性，通過本發(fā)明所述的方法可檢測其毒性的強(qiáng)弱。
4、 可檢測的物質(zhì)的范圍寬廣，可達(dá)數(shù)百種有毒有害物質(zhì)綜合毒性的檢測
① 重金屬類離子及其化合物，如無機(jī)汞、甲基汞、硫柳汞、鎘、鉛、銅、銀等;
② 無機(jī)化合物，如氰化物、砷化合物、硒化合物、氨水等；③有機(jī)化合物及農(nóng)藥，如苯酚、對(duì)氨基苯酚、苯胺、聯(lián)苯胺、甲醛、五氯苯酚、苯、二惡英、四苯基甲苯、氰化苯酰、四苯基甲苯、三硝基甲苯、百草枯、二嗪農(nóng)、馬拉硫磷、其它有機(jī)磷類農(nóng)藥及有機(jī)氯類農(nóng)藥等； 生物毒素類，如番木鱉堿、赭曲霉素、肉毒毒素、黃曲霉毒素等。
5、 應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明可應(yīng)用到①地表水毒性的檢測；②由于泄露事故、環(huán)境污染、自然災(zāi)害，以及人為破壞而造成的飲用水污染情況的檢測；◎食品加工用水毒性的檢測； 江、河、湖泊及水產(chǎn)養(yǎng)殖用水中綜合毒性的檢測；⑤重大社會(huì)性活性中飲用水質(zhì)安全監(jiān)測；◎城市供水系統(tǒng)安全性檢測。
6、 實(shí)用型強(qiáng)。本發(fā)明所建立的檢測水體綜合毒性的方法簡單，只需將配制好的測試緩沖液及底物混合進(jìn)行反應(yīng)，然后將其放置在化學(xué)發(fā)光儀上檢測即可得到結(jié)果。在現(xiàn)場檢測時(shí)，除利用便攜式發(fā)學(xué)發(fā)光儀外，不需要其它特殊的儀器及裝置，檢測時(shí)間短、操作方便，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場水樣綜合毒性的檢測。


圖1為不同濃度的汞對(duì)熒光素酶的抑制作用示意圖；圖2為不同濃度的鎘對(duì)熒光素酶的抑制作用示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1檢測重金屬污染水樣的綜合毒性
1、重金屬污染水樣的獲得
在本實(shí)施例中，首先人工制備重金屬汞、鉛、鎘、銅污染水樣。在人工配制汞污染水樣時(shí)，于雙蒸水中分別加入氯化汞標(biāo)準(zhǔn)液，使水樣中的汞含量分別為0. 006 mg/L、0. 03 mg/L、0. 15 mg/L、0. 75 mg/L、3. 75 mg/L、 18. 75 mg/L、93. 75mg/L。按上述方法分別利用硝酸鉛、氯化鎘、硫酸銅配制重金屬鉛、鎘、銅的人工污染水樣。單獨(dú)或混合重金屬污染水樣的配制如下①濃度0. 03 mg/L的汞污染水樣；②濃度為0.03mg/L的鉛污染水樣；③濃度為0.75mg/L的鎘污染水樣； 濃度為0. 75 mg/L的銅污染水樣；◎濃度為0. 03 mg/L的汞污染水樣+0. 15 mg/L的鉛污染水樣；(D濃度為0. 03 mg/L的汞污染水樣+0. 15 mg/L的鉛污染水樣+0. 75mg/L銅污染水樣；⑦0. 006 mg/L汞污染水樣+O. 03 mg/L鉛污染水樣+O. 15 mg/L鎘污染水樣；⑧濃度為0. 15 mg/L的鉛污染水樣+O. 75 mg/L的鎘污染水樣+3. 75mg/L的銅污染水樣；⑨自來水樣。2、反應(yīng)體系緩沖液的制備反應(yīng)體系緩沖液的制備同前述的技術(shù)方案中步驟1:
在配制A液時(shí)，用0. 025mol/L的N-三羥甲基甘氨酸40ml ， pH7. 5的0. Olmol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液10 ml,其它步聚同前所述；
在配制B液時(shí)，稱取牛血清白蛋白10mg， MgCl2.6H2O40nig， 二硫蘇糖醇5mg，其它步聚同前所述；
在配制C液時(shí)，將購得的熒光素酶凍干粉用0. 03 mol/L pH 7. 4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為0. 35mg/ml的酶貯存液，其它步聚同前所述；
在配制D液時(shí)，將D-熒光素用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為0. 5mg/ml溶液，然后取該溶液10uL， B液1000nL, C液100 li L混合成底物應(yīng)用液D。
三磷酸腺苷二鈉貯存液及應(yīng)用液的配制同前述的技術(shù)方案中步驟2，具體配制時(shí)，用PH7.5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為5. 0mg/ml的三磷酸腺苷二鈉貯存液；配制應(yīng)用液時(shí)，用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液稀釋20倍即可。
3、重金屬污染水樣綜合毒性的檢測
重金屬污染水樣綜合毒性的檢測同前述的技術(shù)方案中步驟3，空白對(duì)照樣及每個(gè)檢測樣做三個(gè)平行，反應(yīng)過程中室溫孵育的時(shí)間為20分鐘，記錄發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間為20秒。
按上述方法分別測試上述8種人工重金屬污染水樣及自來水樣，所對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，查對(duì)表l，判定結(jié)果如下①不安全；②可疑；③不安全； 可疑;⑤不安全；⑥不安全；⑦可疑；⑧不安全；◎安全。同時(shí)該方法也能靈敏地反映出不同汞濃度及不同鎘濃度對(duì)熒光素酶的抑制作用，分別見圖1及圖2，圖1中的阿位伯?dāng)?shù)字1、 2、 3、 4、 5、 6、 7分別表示汞的濃度為0. 00 mg/L 、 0. 03 mg/L、0. 15 mg/L、 0. 75 mg/L、 3. 75 mg/L、 18. 75 mg/L、 93. 75mg/L。圖2中的阿位伯?dāng)?shù)字l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9分別表示鎘的濃度為0. 00 mg/L 、 0. 03 mg/L、
90. 15mg/L、 0. 75mg/L、 3. 75 mg/L、 18. 75 mg/L、 93. 75mg/L、 200. 0 mg/L、 400.0mg/L。采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15441-1995所采用的水質(zhì)急性毒性的檢驗(yàn)方法對(duì)上述水樣進(jìn)行測試，結(jié)果如下①不安全；②安全；③不安全；④可疑；⑤不安全；⑥不安全；⑦安全；⑧可疑；◎安全。說明該方法基本與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果吻合，但同時(shí)表明該方法對(duì)檢測微量毒性方面要比現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法靈敏。
實(shí)施例2檢測江河水、地表水及工業(yè)廢水的綜合毒性
1、 水樣品的獲得江河水樣3個(gè)采自黃浦江下游上海市閔行區(qū)段的水樣；地表水樣3個(gè)分別采自上海市閔行區(qū)、徐匯區(qū)及普陀區(qū)公園的地表水樣；工業(yè)廢水樣3個(gè)分別采自上海三個(gè)食品加工廠的己處理過的廢水。
2、 反應(yīng)體系緩沖液的制備
反應(yīng)體系緩沖液的制備同前述的技術(shù)方案中步驟1:
在配制A液時(shí)，用0. 025mol/L的N-三羥甲基甘氨酸20ral ， PH7. 5的0. Olmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液5 tnl，其它步聚同前所述；
在配制B液時(shí)，稱取牛血清白蛋白5mg， MgCl2. 6H20 30mg， 二硫蘇糖醇2mg，其它步聚同前所述；
在配制C液時(shí)，將購得的熒光素酶凍干粉用0. 01 mol/L pH 7. 4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為0. 15mg/ml的酶貯存液，其它步聚同前所述；
在配制D液時(shí)，將D-熒光素用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液配制成濃度為0. 2mg/ml溶液，然后取該溶液5 u L， B液500 u L，C液50 u L混合成底物應(yīng)用液D。
三磷酸腺苷二鈉貯存液及應(yīng)用液的配制同前述的技術(shù)方案中步驟2，具體配制時(shí)，用pH7.5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為2. 0mg/ml的三磷酸腺苷二鈉貯存液；配制應(yīng)用液時(shí)，用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液稀釋5倍即可。
3、 待測水樣綜合毒性的檢測
待測水樣綜合毒性的檢測同前述的技術(shù)方案中步驟3，空白對(duì)照樣及每個(gè)檢測樣做三個(gè)平行，反應(yīng)過程中室溫孵育的時(shí)間為15分鐘，記錄發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間為15秒。
10按上述方法分別測試上述水樣，根據(jù)它們所對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，查對(duì)表1，判定結(jié)果如下①3個(gè)采自黃浦江下游上海市閔行區(qū)段的水樣中，2個(gè)不安全，1個(gè)可疑；②3個(gè)上海市公園地表水樣中，2個(gè)水樣安全，l個(gè)可疑；③3個(gè)上海三
個(gè)食品加工廠的廢水樣品均不安全。采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15441-1995所采用的水質(zhì)急性毒性的檢驗(yàn)方法對(duì)上述水樣進(jìn)行測試，結(jié)果如下①3個(gè)采自黃浦江下游上海市閔行區(qū)段的水樣中，1個(gè)不安全，2個(gè)可疑；②3個(gè)上海市公園地表水樣中，2個(gè)水樣安全，l個(gè)可疑；③3個(gè)上海三個(gè)食品加工廠的廢水樣品中，2個(gè)可疑，l個(gè)不安全。
實(shí)施例3檢測市售桶裝水及自來水綜合毒性
1、 水樣品的獲得從上海市6個(gè)超市采集6個(gè)市售桶裝水樣品，從上海市郊區(qū)農(nóng)貿(mào)市場采集6個(gè)桶裝水樣；3個(gè)自來水樣采自上海市不同三個(gè)區(qū)的自來水樣。
2、 反應(yīng)體系緩沖液的制備
反應(yīng)體系緩沖液的制備同前述的技術(shù)方案中步驟1:
在配制A液時(shí)，用0.025mol/L的N-三羥甲基甘氨酸100ml， pH7. 5的0.01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液20 ml，其它步聚同前所述；
在配制B液時(shí)，稱取牛血清白蛋白20mg， MgCl2. 6H20 60mg， 二硫蘇糖醇10mg，其它步聚同前所述；
在配制C液時(shí)，將購得的熒光素酶凍干粉用0. 01 mol/L pH 7. 4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為0. 55mg/ml的酶貯存液，其它步聚同前所述；
在配制D液時(shí)，將D-熒光素用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液配制成濃度為1. Omg/ml溶液，然后取該溶液15 u L， B液1500 " L， C液150 U L混合成底物應(yīng)用液D。
三磷酸腺苷二鈉貯存液及應(yīng)用液的配制同前述的技術(shù)方案中步驟2，具體配制時(shí)，用pH7.5的0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液配制成濃度為10. Omg/ml的三磷酸腺苷二鈉貯存液；配制應(yīng)用液時(shí)，用pH7. 5的0. 01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液稀釋50倍即可。
3、 待測水樣綜合毒性的檢測待測水樣綜合毒性的檢測同前述的技術(shù)方案中步驟3，空白對(duì)照樣及每個(gè)待檢樣做三個(gè)平行，反應(yīng)過程中室溫孵育的時(shí)間為20分鐘，記錄發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間為30秒。
按上述方法分別測試上述水樣，根據(jù)它們所對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，查對(duì)表1，判定結(jié)果如下①6個(gè)超市中的市售桶裝水樣品全部為安全；農(nóng)貿(mào)市場上的2個(gè)桶裝水不安全，l個(gè)可疑，3個(gè)安全。②所抽査的3個(gè)上海市三個(gè)區(qū)的自來水樣
均為安全。采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15441-1995所采用的水質(zhì)急性毒性的檢驗(yàn)方法對(duì)
上述水樣進(jìn)行測試，結(jié)果如下①6個(gè)超市中的市售桶裝水樣品全部為安全；
農(nóng)貿(mào)市場上的3個(gè)桶裝水不安全，2個(gè)可疑，l個(gè)安全。②所抽查的3個(gè)上海市三個(gè)區(qū)的自來水樣均為安全。
以上實(shí)施例中，檢測中采用的熒光素酶及D-熒光素酶凍干粉來自美國Sigma公司。從以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明具有檢測靈敏度高、操作簡便、檢測時(shí)間短、穩(wěn)定性及重復(fù)性好、不需要貴重儀器的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測水樣的綜合毒性。
權(quán)利要求
1、一種檢測水體中綜合毒性的方法，其特征在于利用熒光素酶代替發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行水體綜合毒性檢測，熒光素酶是一種從熒火蟲體內(nèi)提取出來的或利用基因工程技術(shù)得到的商品化的酶制劑，該酶對(duì)環(huán)境中或水體中存在的痕微量有毒有害物質(zhì)非常敏感，當(dāng)水體中存在有害物質(zhì)時(shí)會(huì)改變熒光素酶的活性，從而使該熒光素酶在三磷酸腺苷存在的條件下催化D-熒光素的反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致該反應(yīng)所產(chǎn)生的光強(qiáng)度隨著水樣中毒物量的含量而改變，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低程度來判定水樣的綜合毒性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，包括如 下步驟第l步反應(yīng)體系緩沖液的制備，反應(yīng)體系緩沖液包括A液一酶促反應(yīng)緩沖 液、B液一底物稀釋液、C液一熒光素酶貯存液及D液一底物應(yīng)用液，其中A液的配制方法N-三羥甲基甘氨酸20ral 100ml，三羥甲基氨基甲烷-鹽 酸緩沖液5ml 20ml，將這兩種緩沖液混合，將混合液的pH調(diào)為6. 0 8. 5;B液的配制方法稱取牛血清白蛋白5mg 20mg， MgCl2. 6H20 30mg 60mg， 二硫蘇糖醇2mg 10mg，最后用A液定容至10毫升；C液的配制方法將熒光素酶凍干粉用三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液配制 成濃度為0. 15mg/ml 0. 55mg/ml的熒光素酶貯存液；D液的配制方法先將D-熒光素用pH7.5的0.01mol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液配制成濃度為0.2mg/ml 1.0mg/ml溶液，然后取該溶液5"L 15uL， B液500 uL 1500 uL, C液50 y L 150 y L,最后將這三種溶液混合即 成為底物應(yīng)用液D;第2步用三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液配制成濃度為2.0mg/ml lO.Omg/ml的三磷酸腺苷二鈉貯存液，配制應(yīng)用液時(shí)，用三羥甲基氨基甲垸-鹽 酸緩沖液稀釋5 50倍；第3步取聚四氟乙烯材料制成的反應(yīng)杯或48塑料孔養(yǎng)板，進(jìn)行空白測試 時(shí)，每次做三個(gè)平行樣，先向每杯或每孔中分別加入A液250uL， D液50uL， 二次蒸餾水100y L,室溫孵育15分鐘 25分鐘，然后將上述各反應(yīng)杯或培養(yǎng)板放入發(fā)光檢測儀中，向反應(yīng)杯或反應(yīng)孔中加入三磷酸腺苷二鈉應(yīng)用液IOO"L， 用移液槍吹打混勻，15秒 30秒后記錄發(fā)光強(qiáng)度，在測試每個(gè)水樣時(shí)，也做三 個(gè)平行樣，測試方法基本同空白樣測試，不同之處時(shí)用待測水樣替代二次蒸餾水， 按照下面的公式計(jì)算待測水樣的發(fā)光強(qiáng)度-相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=樣品三個(gè)平行樣的平均發(fā)光值+空白三個(gè)平行樣的平均發(fā)光 值X，/o;根據(jù)計(jì)算出的發(fā)光強(qiáng)度，參照中國1995年制定的水質(zhì)急性毒性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 方法——GB/T15441-1995中的結(jié)果判定方法，確定檢測水體中綜合毒性。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，所述A 液的配制方法中，N-三羥甲基甘氨酸濃度為0.025mol/Ll，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液濃度為0. 01mol/L， pH7. 5。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，所述A 液的配制方法中，混合液的pH用0. lmol/L的HC1或0. lmol/L NaOH調(diào)為6. 0 8. 5。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，所述C 液的配制方法中，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的濃度為0.01 mol/L 0.05 tnol/L, pH 7.4。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，所述C 液的配制方法中，熒光素酶貯存液按100微升每管，分裝凍存于-8(TC -2(TC冰 箱中。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，所述D 液的配制方法中，三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液濃度為0.01mol/L ， pH7.5。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測水體中綜合毒性的方法，其特征是，所述第 2步中，三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液濃度為0.01mol/L， pH7.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的檢測水體中綜合毒性的方法。本發(fā)明利用熒光素酶代替發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行水體綜合毒性檢測，熒光素酶對(duì)環(huán)境中或水體中存在的痕微量有毒有害物質(zhì)非常敏感。當(dāng)水體中存在有害物質(zhì)，會(huì)改變熒光素酶的活性，從而使該熒光素酶在三磷酸腺苷存在的條件下催化D-熒光素的反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致該反應(yīng)所產(chǎn)生的光強(qiáng)度隨著水樣中毒物量的含量而改變，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低程度來判定水樣的綜合毒性。本發(fā)明具有檢測靈敏度高、操作簡便、檢測時(shí)間短、穩(wěn)定性及重復(fù)性好、不需要貴重儀器的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測水樣的綜合毒性，也非常適用于國家舉辦大型社會(huì)活動(dòng)時(shí)應(yīng)急檢測和防恐需要。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101477055SQ200910045400
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者劉國艷, 劉海峰, 鋒 李, 柴春彥, 莉 王 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)