專利名稱：：重組豬霍亂沙門氏菌及二價基因工程疫苗與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動物細(xì)菌基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白的重組豬霍亂沙門氏菌活疫苗株的構(gòu)建及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)是導(dǎo)致2-4月齡仔豬副傷寒的主要病原，感染豬后會引起急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等典型癥狀，常引起斷奶仔豬大批發(fā)病，如伴發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時，死亡率較高，造成重大損失。動物生前感染沙門氏菌或其產(chǎn)品受到污染，可使人發(fā)生食物中毒，因此該病原在公共衛(wèi)生學(xué)上也具有重要意義。人們最早用滅活的全菌疫苗來預(yù)防沙門氏菌引起的傷寒，由于滅活苗具有容易引起全身及局部反應(yīng)、只能激發(fā)體液免疫、不能提供交叉保護、需多次加強免疫等缺點，此類疫苗的應(yīng)用受到限制。隨后，人們發(fā)現(xiàn)弱毒沙門氏菌在誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)方面比滅活的或亞單位疫苗更為有效。于是，各種沙門氏菌弱毒苗在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，取得了良好的預(yù)防效果。我國在60年代初，房曉文等將抗原性良好的豬霍亂沙門氏菌強毒株接種含有醋酸鉈的培養(yǎng)基中傳數(shù)百代后，選出一株免疫原性好的弱毒株，命名為C500。全國推廣使用C500后，我國仔豬副傷寒得到有效控制(黃昌炳等，仔豬副傷寒弱毒通氣培養(yǎng)凍干苗口服免疫研究.國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1981，6:8994;康凱.仔豬副傷寒活疫苗.中國獸藥雜志，2003，3749)。近30年來，人們開始關(guān)注使用減毒沙門氏菌作為載體表達(dá)各種外源抗原以預(yù)防重大人、畜傳染病研究領(lǐng)域。應(yīng)用各種基因工程方法構(gòu)建沙門氏菌減毒株和利用減毒沙門氏菌作為活載體表達(dá)外源抗原研制多價疫苗等已成為該領(lǐng)域的研究熱點。減毒沙門氏菌作為疫苗載體具有諸多的優(yōu)點(1)產(chǎn)生細(xì)胞毒性τ細(xì)胞的殺傷反應(yīng)(CTL反應(yīng))；(2)減毒沙門氏菌因侵入淋巴系統(tǒng)，能更有效地激發(fā)宿主的體液和細(xì)胞免疫；(3)通過自然感染途徑如口服或鼻內(nèi)接種，可以激發(fā)系統(tǒng)和粘膜免疫反應(yīng)；(4)具有免疫佐劑作用；(5)免疫具有持續(xù)性；(6)具有聯(lián)合免疫作用，可以穩(wěn)定表達(dá)原核和真核基因，本身不致病，且可作為傷寒疫苗；(7)所表達(dá)的靶抗原不需提純，制備簡單，可直接用于免疫保護試驗，顯著降低了疫苗的制作成本；(8)接種簡單方便，易于操作等(Curtiss，R.，III，T.Doggett,A.Nayak,andJ.Srinivasan.1996.Strategiesfortheuseofliverecombinantavirulentbacterialvaccinesformucosalimmunization,p.499-511.InH.KiyonoandM.F.Kagnoff(ed.),Essentialsofmucosalimmunology.AcademicPress,SanDiego，Calif;S·Spreng，G·DietrichandG.Weidinger.2006.RationaldesignofSalmonella-basedvaccinationstrategies.Methods38133-143；Sirard，J.C.，F(xiàn).Niedergang，andJ.P.Kraehenbuhl.1999.LiveattenuatedSalmonella:aparadigmofmucosalvaccines.Immunol.Rev.171:5_26)。重組沙門氏菌疫苗的發(fā)展常需要使用選擇標(biāo)記，由于以前普遍釆用攜帶抗性基因的表達(dá)質(zhì)粒，抗性基因成為體外轉(zhuǎn)化篩選轉(zhuǎn)化子和質(zhì)粒在體外遺傳的的主要標(biāo)記。但是，抗生素是臨床上治療細(xì)菌感染的主要藥物，由此引起的最大恐慌是抗性基因在環(huán)境病原微生物中傳播，從而減弱治療這些病原感染的藥物效果。因此，抗生素抗性質(zhì)粒選擇系統(tǒng)不被人們所接受。如今，人們已經(jīng)研制出多種不含抗生素抗性標(biāo)記的沙門氏菌疫苗系統(tǒng)，如將外源抗原穩(wěn)定整合到沙門氏菌染色體，或用能篩選重組菌但不需要抗生素的質(zhì)粒平衡系統(tǒng)(Balanced-lethalPlasmidStabilisationSystem)。其中，應(yīng)用最多的系統(tǒng)是asd質(zhì)粒載體平衡致死系統(tǒng)。沙門氏菌的asd基因編碼天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶(aspartateL-semialdehydedehydrogenase)，是二氨基庚二酸(diaminopimelicacid,DAP)生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分肽聚糖四肽側(cè)鏈的一個組分，asd缺失株在無外源DAP條件下不能形成完好的細(xì)胞壁，最終溶菌死亡。由于哺乳動物組織中不含DAP，因此突變菌在不含DAP的培養(yǎng)基中或動物體內(nèi)均被降解。將目的基因插入含asd的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化asd宿主菌后可形成互補，asd質(zhì)粒丟失的asd沙門氏菌在體內(nèi)死亡，只有含有asd質(zhì)粒的沙門氏菌才能存活，并穩(wěn)定的在體內(nèi)體外表達(dá)外源抗原。由于用asd質(zhì)粒載體平衡致死系統(tǒng)代替了抗生素抗性標(biāo)記，因此也更加安全。(Nakayama，K.,S.Μ.Kelly,andR.CurtissIII.1988.CoeNEandRLWood.TheeffectofexposuretoaΔcrpΔcyamutantofSalmonellatyphimuriumonthesubsequentcolonizationofswinebythewild-typeparentstrain.VetMicrobiol,1992,31-.207-220.Hassan,JO,andRCurtissIII.ControlofcolonizationbyvirulentSalmonellatyphimuriumbyoralimmunizationofchickenswithavirulentΔcrpΔcyaS.typhimurium.Res.Microbiol,1990,141:839-850.KellySM,BoseckerBA,CurtissRIII.CharacterizationandprotectivepropertiesofattenuatedmutantsofSalmonellacholeraesuis.InfectImmun,1992,60:4881_4890ConstructionofanAsd+expression-cloningvector:stablemaintenanceandhighlevelexpressionofclonedgenesinaSalmonellavaccinestrain.Bio/Technology6:693_697;Kang,H.Y.,J.Srinivasan,andR.CurtissIII.2002.ImmuneresponsestorecombinantpneumococcalPspAantigendeliveredbyliveattenuatedSalmonellaentericaserovarTyphimuriumvaccine.Infect.Immun.701739-1749.)。豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus,PCV)的發(fā)現(xiàn)是在1974年，Tischer等(1974)在PK-15細(xì)胞系A(chǔ)TCC-CCL31的傳代過程中，發(fā)現(xiàn)了與細(xì)小病毒和乳多空病毒類似的顆粒，這種顆粒狀物質(zhì)不引起細(xì)胞病變，曾在當(dāng)時被認(rèn)為是一種細(xì)胞污染物。Tischer等(1982)用超速離心提取病毒粒子和病毒核酸，通過電鏡觀察核酸狀態(tài)，首次揭示了這種污染ΡΚ-15細(xì)胞系的物質(zhì)實際上是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，并將其命名為PCV。用該病毒感染試驗動物，發(fā)現(xiàn)只有豬產(chǎn)生特異性抗體，但無臨床癥狀和病理變化，而兔、鼠、牛均為血清學(xué)陰性。大量的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，許多國家的豬群中PCV抗體呈陽性，PCV感染十分普遍。尤其1991年在加拿大出現(xiàn)了斷奶豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、黃疸，剖檢有淋巴結(jié)腫大、肝硬變、多灶性粘液性氣管炎、間質(zhì)性肺炎和腎炎等，當(dāng)時認(rèn)為是一種新發(fā)的豬病，將之命名為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaningpigsmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)(Fenauxetal.，2000)。隨后，該病迅速在全世界相繼發(fā)生，我國也于2000年報道了該病的發(fā)生(郎洪武等，2000)。通過臨床和實驗室的研究表明，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原是豬圓環(huán)病毒，但并不是唯一的病原(Allanetal.，1998)。同時還發(fā)現(xiàn)這種病原與傳統(tǒng)的持續(xù)感染PK-15細(xì)胞的PCV，彼此間抗原性相似，但也有很大的區(qū)別，所以根據(jù)PCV在致病性、抗原性及核苷酸序列上的差異性，將從PMWS病豬體內(nèi)分離到的有致病性的PCV稱為PCV2，而將污染PK-15細(xì)胞且無致病性的PCV稱為PCVl(Allanetal.，1998a)。PCV基因組為單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，PCVl基因組全長為1759bp，PCV2基因組全長為1767或1768bp。兩種基因型病毒的基因組同源性為76%，同基因型的PCV內(nèi)部基因組變異很小，PCVl分離株間基因組的同源性大于99%，PCV2分離株間基因組的同源性大于96%。PCV的基因組共編碼11個開放閱讀框架(Openreadingframes,ORFs)，閱讀框之間相互重疊，使病毒可以充分利用有限的遺傳物質(zhì)傳遞大量的遺傳信息。病毒的0RF1、0RF5、0RF7、0RF10在病毒DNA鏈上，而0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9、ORFll在互補鏈上，在這11個開放閱讀框架中，功能上重要的是ORFl和0RF2。ORFl編碼R印和R印，蛋白，與病毒基因組的復(fù)制有關(guān)。0RF2編碼病毒的核衣殼(Cap)蛋白，是病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，PCVl和PCV2的ORFl間核酸同源性為83%，氨基酸同源性為86%，兩種基因型病毒的ORFl基因間的差異比較小，Rep蛋白間存在交叉反應(yīng)，而0RF2基因變異較大，核酸同源性為67%，氨基酸同源性為65%(Morozovetal.，1998)，Cap蛋白間不存在交叉反應(yīng)，因此0RF2基因可作為鑒別診斷的依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，在PCVl和PCV2的保守區(qū)段都包含有Poly(A)信號，在正鏈上，PCVl的Poly(A)分別位于314nt-319nt、973nt-978nt；PCV2的Poly(A)分別位于327nt-332nt、983nt_998nt；在負(fù)鏈上，PCVl有兩個Poly(A)信號分別位于1015nt-1030nt、1184nt-1189nt；而PCV2只有一個Poly(A)信號位于1022nt-1027nt(Hameletal.，1998)。0RF3基因為近年來新研究的具有重要功能的基因，它不參與病毒的復(fù)制過程，編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，可以引起細(xì)胞凋亡，在PCV2致病機理中具有重要作用(Liuetal.，2005)。0RF2基因編碼病毒的Cap蛋白，含有234個氨基酸，分子量大小為27.8kDa。由基因組的互補鏈合成。Cap蛋白轉(zhuǎn)錄起始位點在1238位核苷酸，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物內(nèi)含有由119個核苷酸(1238nt-1120nt)組成的非編碼前導(dǎo)序列，Cap啟動子精確定位于1353nt-1168nt核苷酸區(qū)域，與R印基因有重疊(Mankertzetal.，1998)。Cap蛋白在圓環(huán)病毒感染細(xì)胞后6_12小時即可表達(dá)，在12-24小時定位于細(xì)胞核中(Meertsetal.,2005)0RF2基因在圓環(huán)病毒中變異比較大，同源性約為70%。Cap蛋白端的41個氨基酸序列高度保守，富含堿性氨基酸(如精氨酸)，編碼病毒的核定位信號，與病毒在細(xì)胞核內(nèi)的定位有關(guān)，其中第12-18位和第34-41位氨基酸殘基對0RF2的定位起著至關(guān)重要的作用(Liuetal.，2001b)。Mahe等(2000)發(fā)現(xiàn)PCV中共存在5個抗原位點，有1個位于ORFl中(185aa-211aa)，其余4個都在0RF2中，有2個是PCV2特異性的(B_121，B_133)，有1個與PCVl和PCV2抗血清都反應(yīng)(B-146)，另有1個與PCVl和PCV2抗血清(B-152)都不反應(yīng)。雖然PCVl和PCV2的Cap蛋白有交叉反應(yīng)的抗原表位存在，但其0RF2之間卻無交叉反應(yīng)存在，可能是在整個蛋白中引起交叉反應(yīng)的抗原表位處于不易被接觸到的位置。Truong等(2001)用免疫相關(guān)線性B-細(xì)胞表位及ELISA方法也驗證了0RF2的69-83位和117-131(B-133位)位氨基酸殘基是特異性抗原決定簇，其中B-133是PCV2血清學(xué)檢測的標(biāo)志性抗原決定簇之一，用于PCV2的血清學(xué)診斷。0RF2基因決定PCV2的毒力，0RF2基因的變異導(dǎo)致各地PCV2分離株在毒力上的不同，0RF2基因可能與病毒增殖滴度有一定關(guān)系。Fenaux等(2003)利用病毒感染性克隆將PCVl的ORF2與PCV2的ORF2基因進行互換，發(fā)現(xiàn)病毒的毒力大大下降。雖然PCVl和PCV2的Cap蛋白有引起交叉反應(yīng)的抗原表位存在，但二者的0RF2之間卻不存在交叉反應(yīng)，所以關(guān)于PCV2診斷和基因工程疫苗的研究，都集中在0RF2基因或Cap蛋白上。Mahe等(2000)提出可以利用PCV2-0RF2多肽或完整蛋白作為診斷抗原建立區(qū)別PCVl和PCV2的鑒別診斷方法。Blanchard等(2003)利用PCV2的Cap蛋白作為抗原建立檢測PCV2特異性抗體間接ELISA，與IFA相比其準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上，并在臨床檢測中取得了良好的效果。Kamstrup等(2004)研究了0RF2基因的DNA疫苗，Blanchard等(2003b)用桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白免疫豬，取得了理想的免疫效果。重組沙門氏菌活疫苗自然感染或試驗感染誘導(dǎo)抗任何異源血清型沙門氏菌保護的同時，沙門氏菌因侵入淋巴系統(tǒng)，能更有效地激發(fā)宿主產(chǎn)生針對異源抗原的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點。這樣，重組弱毒活疫苗也許是解決當(dāng)前豬傳染性胃腸炎病毒商品化疫苗不足的一種可行方法。構(gòu)建沙門氏菌重組菌株的傳統(tǒng)方法存在很多缺陷。如以前普遍采用攜帶抗性基因的表達(dá)質(zhì)粒，因存在生物安全問題而不被人們所接受。asd質(zhì)粒載體平衡致死系統(tǒng)具有表達(dá)量高、外源基因表達(dá)穩(wěn)定、不需純化無抗生素抗性標(biāo)記等優(yōu)點，同時鑒于豬霍亂沙門氏菌C500的良好免疫原性，將其開發(fā)為表達(dá)豬圓環(huán)病毒主要抗原位點基因的重組活疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，其第一個目的是獲得表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒主要抗原位點的重組豬霍亂沙門氏菌株，該重組菌含有豬II型圓環(huán)病毒主要免疫性抗原Cap蛋白。本發(fā)明的第二個目的是利用上述的重組菌獲得一種豬霍亂沙門氏菌株制備豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒二價基因工程疫苗；本發(fā)明的第三個目的是上述重組菌在制備豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒二價基因工程疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)申請人:通過基因工程的方法，獲得一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒主要抗原位點的重組的豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)C501/pYA_Δ410RF2,該菌株于2009年12月24日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCCNO:Μ209314。一種重組豬霍亂沙門氏菌C501/pYA_Δ410RF2的制備方法，它包括下列步驟1)PCV2去核定位信號0RF2的克隆以申請人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室制備的重組質(zhì)粒pMD-PCV2(李文潔，何啟蓋，等.中國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的基因型分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40(9):1358-1362)為模版擴增A410RF2片段，片段大小為582bp，連接pMD-18T，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆經(jīng)PCR和酶切鑒定表明構(gòu)建正確。經(jīng)測序A410RF2序列與GeneBank上發(fā)布的序列同源性在98%以上，確實無堿基錯配；2)重組質(zhì)粒pYA_A410RF2的構(gòu)建回收Δ410RF2基因的PCR產(chǎn)物，并用限制性內(nèi)切酶SaulI和HindIII雙酶切，純化回收后，連接用同樣方法處理過的ρΥΑ3493載體，轉(zhuǎn)化Ε.coli乂6097感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒？￥々-八4101^2。PCR和酶切結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2構(gòu)建。序列測定結(jié)果表明構(gòu)建的ρΥΑ-Δ410RF2重組質(zhì)粒中插入的Δ410RF2片段與GeneBank上發(fā)布的序列同源性在98%以上，未發(fā)生任何堿基突變。3)構(gòu)建重組菌株C501(ρYA-Δ410RF2)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2,電轉(zhuǎn)化至豬霍亂沙門氏菌ΔasdC500缺失株感受態(tài)細(xì)胞，得到保藏編號為CCTCCNO:M209314的重組豬霍亂沙門氏菌C501/pYA-Δ410RF2。申請人:獲得一種合成的豬II型圓環(huán)病毒主要免疫性抗原Cap蛋白主要抗原位點的基因片段0RF2(核苷酸序列)，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表所示(其制備方法見實施例所示)。申請人:利用所述的重組豬霍亂沙門氏菌C501/pYA_A410RF2菌液制備成功一種防治豬霍亂沙門氏菌病和豬圓環(huán)病毒病的二價基因工程疫苗。上述的不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白主要抗原位點的重組豬霍亂沙門氏菌株缺失了沙門氏菌基因組中必需的細(xì)胞壁形成相關(guān)基因asd基因(需要含asd基因的質(zhì)粒存在于菌體內(nèi)或外源添加DAP的培養(yǎng)基上才能正常生長、繁殖)，同時該重組菌株含有外源質(zhì)粒PYA-Δ410RF2(含有asd基因)，保留了親本菌株C500作為豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。質(zhì)粒pYA-A410RF2能在該菌株中表達(dá)asd基因與豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白的抗原位點基因。其中，asd基因表達(dá)產(chǎn)物提供沙門氏菌株必需的細(xì)胞壁形成相關(guān)成份。Cap蛋白的抗原位點基因表達(dá)產(chǎn)物提供良好的針對豬II型圓環(huán)病毒的免疫原性。本發(fā)明的不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒主要抗原位點的重組豬霍亂沙門氏菌株C501/pYA-Δ410RF2,該基因工程菌株C501/pYA_Δ410RF2衍生于在中國已經(jīng)使用了50年以上的商品化豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C500。本發(fā)明所述的重組豬霍亂沙門氏菌株C501/pYA-Δ410RF2，缺失了C500菌株基因組中的asd基因，同時添加了含有豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白的抗原位點基因的質(zhì)粒pYA-A410RF2。由于需要ρΥΑ-Δ410RF2的存在重組菌株才能存活，因此大大提高了質(zhì)粒pYA-A410RF2(也就是Cap蛋白抗原位點基因)在重組菌株中的穩(wěn)定性。Cap蛋白抗原位點基因在重組菌株中的穩(wěn)定表達(dá)，使之具有針對豬II型圓環(huán)病毒很好的免疫保護力。本發(fā)明的基本構(gòu)建方法是利用本申請人所在的農(nóng)業(yè)部微生物國家重點實驗室構(gòu)建好的asd基因缺失的豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C500ΔasdAcrp缺失株(參見文獻徐引弟等，豬霍亂沙門氏菌C500株AcrpAasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定.生物工程學(xué)報，2006，5(3):366-371)，同時回收含有豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白抗原位點的質(zhì)粒pYA-A410RF2。將質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2轉(zhuǎn)入C500asd基因缺失株中，由于生長的需要質(zhì)粒pYA-A410RF2與C500asd基因缺失株互補而穩(wěn)定共存，形成我們發(fā)明的不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白主要抗原位點的重組C501(pYA-A410RF2)菌株。通過大量的生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)證明本發(fā)明制備的重組菌株可用于制備針對豬霍亂沙門氏菌病和豬圓環(huán)病毒病的二價基因工程疫苗。本發(fā)明的主要優(yōu)點是1、本發(fā)明的重組菌株表達(dá)的豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白中主要抗原位點是豬II型圓環(huán)病毒主要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保護性。由于豬II型圓環(huán)病毒危害日益嚴(yán)重，而目前市場上還沒有各種商品化豬II型圓環(huán)病毒疫苗。因此，用該基因工程菌株制成的疫苗具有廣闊的市場應(yīng)用前景。2、本發(fā)明的重組菌株衍生于在中國已經(jīng)使用了50年以上的商品化豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500針對豬霍亂沙門氏菌的免疫效力。而且，該重組菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物安全性。3、本發(fā)明的重組菌株可以同時提供針對豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒兩種病原的保護力。4、本發(fā)明的重組菌株不含抗性標(biāo)記，完全符合疫苗生物安全性要求。更詳細(xì)的技術(shù)方案見實施例所述。序列表SEQIDNO1是本發(fā)明克隆的(插入的)豬II型圓環(huán)病毒去核定位信號的Cap蛋白的核苷酸序列。圖1是本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒pYA_A410RF2的物理圖譜。圖2是本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒pYA_A410RF2的PCR鑒定電泳圖譜。圖中M:DNAMarker(DL2000)1:ddH20；2:pYA-A410RF2；3:pYA-A410RF2圖3是本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒pYA_A410RF2的酶切鑒定結(jié)果。圖中Ml=DNAMarker(DL2000,DL15,000)1:pYA3493/SaulI+HindIII2And3pYA-A410RF2/SaulI+HindIII圖4是本發(fā)明中一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白主要抗原位點的重組豬霍亂沙門氏菌活疫苗菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果。圖中M:DNAmarker(DL2，000)；1:ddH20陰性對照；2重組質(zhì)粒陽性對照；3-81-50代重組菌株。圖5重組菌株C501(pYA-A410RF2)、空質(zhì)粒對照菌株C500(pYA3493)與親本菌株C500的生長曲線。圖6是本發(fā)明制備的重組菌株C501(pYA-A410RF2)構(gòu)建的流程圖。圖7是本發(fā)明中一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白主要抗原位點的重組豬霍亂沙門氏菌活疫苗菌株C501(pYA-A410RF2)的SDS-PAGE和Western-blot分析結(jié)果。圖7A是用SDS-PAGE方法檢測融合蛋白Cpro-Δ410RF2,圖中1為C501(ρΥΑ3493)；2-7為重組菌株C501(pYA-A410RF2)；箭頭所示為融合表達(dá)蛋白Cpro-Δ410RF2。圖7Β是用Western-blot方法檢測融合蛋白Cpro-Δ410RF2，圖中1-2為C501(pYA-A410RF2)；圖中3為C501(pYA3493)圖8是本發(fā)明中重組沙門氏菌所用載體的圖譜。圖9是沙門氏菌血清抗體水平。圖10是重組豬霍亂沙門氏菌中豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白IgG抗體水平。具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1豬II型圓環(huán)病毒去核定位信號0RF2蛋白基因片段的擴增引物設(shè)計(用于基因克隆和分子檢測)根據(jù)GeneBank發(fā)布的豬2型圓環(huán)病毒序列(登錄號AY035820)，設(shè)計1對可擴增去核定位信號0RF2基因的引物(見表1)，從本實驗室公布的PMD-PCV2質(zhì)粒(李文潔，何啟蓋，等.中國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的基因型分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40(9)1358-1362)中擴增去核定位信號0RF2基因，擴增后的片段大小為582bp，引物上下游分別引入SaulI和HindIII酶切位點。該引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。表1本發(fā)明所用的引物實施例2重組質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2的構(gòu)建與鑒定回收Δ410RF2基因的PCR產(chǎn)物，并用限制性內(nèi)切酶SaulI和HindIII雙酶切，純化回收后，連接用限制性內(nèi)切酶SaulI和HindIII雙酶切處理過的ρΥΑ3493載體(美國華盛頓大學(xué)Dr.RoyCurtissIII教授惠贈)，轉(zhuǎn)化E.colix6097感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2。PCR和酶切結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2構(gòu)建成功。序列測定結(jié)果表明構(gòu)建的ρΥΑ-Δ410RF2重組質(zhì)粒中插入的Δ410RF2片段與GenBank上發(fā)布的序列同源性均在98%以上，未發(fā)生任何堿基突變。重組表達(dá)質(zhì)粒pYA-A410RF2的物理圖譜和酶切鑒定結(jié)果(見圖1、圖3)。實施例3表達(dá)Cap蛋白基因片段的豬霍亂沙門氏菌重組菌株C501(pYA-Δ410RF2)的構(gòu)建與鑒定用BioRadGenePμIserII電轉(zhuǎn)儀按電壓2.ΟΚν，時間4ms,電容25F和脈沖電阻200Ω的參數(shù)將重組質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2電轉(zhuǎn)化ΔasdC500缺失株感受態(tài)細(xì)胞，在DAP陰性平板上篩選陽性重組子。陽性克隆因為含有與asd基因互補的平衡表達(dá)質(zhì)粒而具有表達(dá)DAP的能力，所以培養(yǎng)基中不需再添加DAP。對重組菌株進行PCR鑒定，可以擴增出A410RF2基因581bp(圖2)，結(jié)果表明重組菌構(gòu)建正確，申請人將其命名為C501(pYA-A410RF2)。實施例4表達(dá)Cap蛋白基因片段的豬霍亂沙門氏菌重組菌株C501(ρΥΑ-Δ410RF2)的生物學(xué)特性l、C501(pYA-A410RF2)重組菌株的表達(dá)特性分析SDS-PAGE結(jié)果顯示，本發(fā)明的重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA-Δ410RF2)在約26kDa處有明顯的表達(dá)帶，Western-blot分析表明，重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA-A410RF2)所表達(dá)的蛋白能夠與豬2型圓環(huán)病毒單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，而空質(zhì)粒對照菌株C501(pYA3493)則不能發(fā)生反應(yīng)(圖7B)。2、重組菌株C501(pYA_A410RF2)的表型鑒定與親本株C500相同，本發(fā)明的重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA_A410RF2)能夠利用麥芽糖，在加麥芽糖的麥康凱瓊脂平板上呈紅色菌落，在LB平板上長成無色、光滑、濕潤的乳白色菌落。生化鑒定結(jié)果表明，C501(pYA3493)和C501(ρΥΑ-Δ410RF2)與親本菌C500均不產(chǎn)H2S，不能利用乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖醇和尿素，但是能利用麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖作為唯一碳源。這些結(jié)果表明本發(fā)明的重組菌株C501(pYA-A410RF2)的生化特性與親本菌株C500—致，符合豬霍亂沙門氏菌的典型表型特征。3、重組菌株C501(pYA-Δ410RF2)的生長特性研究從重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA-A410RF2)、空質(zhì)粒對照菌株C500(pYA3493)與親本菌株C500的生長曲線(圖5)可以看出，重組菌株C501(pYA-A410RF2)生長速度與親本菌株C500相似，而空質(zhì)粒對照菌株C500(pYA3493)的生長速度比親本菌株C500相對較慢。4、重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(ρΥΑ-Δ410RF2)的遺傳穩(wěn)定性將重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA_A410RF2)在LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳50代，分別取含有相同的CFU第1、10、20、30、40和50代的培養(yǎng)物為模板，進行PCR檢測A410RF2基因在C501中的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，第1、10、20、30、40和50代均能擴增出581bp的條帶，其亮度沒有差別(圖4)。分別取以上代次的含有相同CFU的培養(yǎng)物進行Western-blot，均能與抗PCV2-0RF2得單克隆抗體反應(yīng)，結(jié)果表明重組菌C501(pYA-A410RF2)能穩(wěn)定性的分泌表達(dá)(圖6A)。上述結(jié)果表明重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA-Δ410RF2)能夠穩(wěn)定遺傳。實施例5重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA-A410RF2)在小鼠體內(nèi)的免疫效力檢測1、小鼠的免疫程序使用6-7周齡的BALB/c小鼠作為免疫效力評價，根據(jù)試驗要求分為3組，分別為本發(fā)明制備的重組豬霍亂沙門氏菌菌株C501(pYA-A410RF2)疫苗組、豬霍亂沙門氏菌C500親本菌株疫苗組和非免疫空白對照組。免疫途徑為口服0.2mL(含5.IXIO9CFU活菌量)細(xì)菌液或LB培養(yǎng)基，14天后加強免疫1次。分別于免疫前0天、首免后1、2、3、4周每只小鼠尾靜脈負(fù)壓采血，收集血清，采用間接ELISA法檢測沙門氏菌血清抗體水平(見圖9)(ELISA，操作方法參照徐引弟.豬霍亂沙門氏菌C500株crp-、asd-缺失株平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用.[博士學(xué)位論文].武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，2006.)。同時使用武漢科前生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)的商品0RF2蛋白包被ELISA板(生產(chǎn)批號091005，生產(chǎn)日期091015)，按間接ELISA方法(方法參照柳忠輝等，免疫學(xué)常用實驗技術(shù)，北京科學(xué)出版社，2002)檢測重組Cap蛋白IgG抗體水平(見圖10)。實施例7重組豬霍亂沙門氏菌菌C501(ρΥΑ-Δ410RF2)二價基因工程疫苗在豬體內(nèi)的免疫效力自2009年7月份以來，先后在A、B、C和D豬場口服免疫四批的本發(fā)明制備的重組豬霍亂沙門氏菌菌疫苗。A豬場未使用本發(fā)明制備的重組豬霍亂沙門氏菌菌疫苗(簡稱二價基因工程疫苗)前，仔豬病死率約為50%，口服本發(fā)明的二價基因工程疫苗后，存活率為90%。其他各場口服本發(fā)明的二價基因工程疫苗后，也收到與A場相似的效果。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>重組豬霍亂沙門氏菌及二價基因工程疫苗與制備方法<130><141>2009-12-20<160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>582<212>DNA<213>豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus)<220><221>gene<222>(1)..(582)<223><400>1aatggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccttcggatatactatcaagcgaaccaca60gtcaaaacgccctcctgggcggtggacatgatgagattcaatattaatgactttcttccc120ccaggagggggctcaaacccccgctctgtgccctttgaatactacagaataagaaaggtt180aaggttgaattctggccctgctccccgatcacccagggtgacaggggagtgggctccagt240gctgttattctagatgataactttgtaacaaaggccacagccctcacctatgacccctat300gtaaactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccgctacttt360acccccaaacctgtcctagattccactattgattacttccaatcaaacaacaaaagaaat420cagctggggctgagactacaaactgctggaaatgtagaccacgtaggcctcggaactgcg480ttcgaaaacagtatatacgaccaggaatacaatatccgtgtaaccatgtatgtacaattc540cgggaatttaatcttaaagaccccccacttaaccctaagtga58權(quán)利要求一株表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒主要抗原Cap蛋白的重組豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)C501(pYA-Δ41ORF2)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM209314。2.一種重組豬霍亂沙門氏菌C501(ρΥΑ-Δ410RF2)的制備方法，它包括下列步驟1)擴增豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白去核定位信號基因以重組質(zhì)粒PMD-PCV2為模版擴增A410RF2片段，連接pMD-18T，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pYA-A410RF2將回收的A410RF2基因的PCR產(chǎn)物用SalI和HindIII雙酶切，純化回收后，連接用SalI和HindIII雙酶切的pYA3493載體，轉(zhuǎn)化E.coliχ6097感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2；3)構(gòu)建重組菌株C501(ρYA-Δ410RF2)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒ρΥΑ-Δ410RF2,電轉(zhuǎn)化至豬霍亂沙門氏菌AasdC500缺失株感受態(tài)細(xì)胞，得到保藏編號為CCTCCΜ209314的重組豬霍亂沙門氏菌C501/pYA-Δ410RF2。3.一種二價基因工程疫苗，其特征是，將保藏編號為CCTCCΝ0:Μ209314的重組豬霍亂沙門氏菌C501/pYA-A410RF2菌液制備成豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒的二價基因工程疫苗。4.權(quán)利要求1所述的重組豬霍亂沙門氏菌在制備豬霍亂沙門氏菌與豬II型圓環(huán)病毒二價基因工程疫苗中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于動物細(xì)菌基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒主要抗原Cap蛋白的重組豬霍亂沙門氏菌株的構(gòu)建、二價基因工程疫苗及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明得到一株不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬II型圓環(huán)病毒主要抗原位點的重組豬霍亂沙門氏菌C501(pYA-Δ41ORF2)，其保藏號為CCTCCM209314。該株缺失了豬霍亂沙門氏菌生長必需的asd基因，并含有能在該株中表達(dá)asd基因和豬II型圓環(huán)病毒Cap蛋白抗原位點基因的質(zhì)粒。公開了利用該重組株制備豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒二價基因工程疫苗的方法及應(yīng)用。本發(fā)明的二價基因工程疫苗可以刺激豬產(chǎn)生抵抗豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒的保護性免疫反應(yīng)，有效防止豬霍亂沙門氏菌和豬II型圓環(huán)病毒的感染。文檔編號C12R1/42GK101838627SQ20091027337公開日2010年9月22日申請日期2009年12月25日優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日發(fā)明者何啟蓋,庫旭鋼,徐高原,金梅林,陳冬煥,陳煥春申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué);武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司