專利名稱：：疫苗載體的制作方法疫苗載體本發(fā)明涉及新型低變應(yīng)原性分子及其用途。I型過敏癥是IgE介導(dǎo)的超敏性疾病，其影響大約25%的人口。它是基于特異性免疫球蛋白E對無害的空中傳播的、昆蟲、毒液、食物變應(yīng)原和接觸變應(yīng)原抗原(源自本身無害的抗原來源，例如花粉、昆蟲、霉菌和動物蛋白)的識別。與效應(yīng)細胞結(jié)合的IgE抗體的交聯(lián)引起炎性調(diào)節(jié)子(例如組胺，白細胞三烯(leucotrienes))的釋放并因此引起過敏癥的即刻癥狀(例如，鼻結(jié)膜炎、哮喘、皮炎、過敏反應(yīng))。通過IgE依賴性和IgE非依賴性機制進行的T細胞激活有助于慢性過敏性炎癥。過敏癥治療的可能的唯一致使形式為變應(yīng)原特異性免疫治療，其基于反復(fù)使用漸增數(shù)量的大多數(shù)來源的變應(yīng)原提取物。很多臨床研究證明了注射免疫治療的臨床功效，并有這種治療下的幾種免疫機理的證據(jù)。由于制備來自某些變應(yīng)原來源的高質(zhì)量變應(yīng)原提取物的困難，以及向病人使用變應(yīng)原會引起嚴重的副作用的事實，只能夠向某些病人組和疾病表現(xiàn)來推薦變應(yīng)原特異性免疫治療。治療對幾種不同變應(yīng)原來源共同敏感的病人以及遭受嚴重疾病表現(xiàn)例如過敏性哮喘的病人是特別困難的。過敏性哮喘是過敏癥最嚴重的表現(xiàn)之一，因為它嚴重影響日常生活質(zhì)量，引起高入院率，其表現(xiàn)為嚴重的、威脅生命的形式，需要對病人的深切關(guān)注。從天然變應(yīng)原來源制備的變應(yīng)原提取物性質(zhì)上是粗糙的，不可能通過技術(shù)手段影響這種制備物中的個別變應(yīng)原的質(zhì)量和數(shù)量。它們也含有各種不明確的非變應(yīng)原性成分，幾項最近的研究表明了這種提取物的劣質(zhì)并證明了它們的高異質(zhì)性。在過去的十年中，使用重組DNA技術(shù)在分子變應(yīng)原鑒定領(lǐng)域取得了巨大進步。很大數(shù)量的引起疾病的最重要的變應(yīng)原已被鑒定至分子水平，已經(jīng)生產(chǎn)出模擬天然變應(yīng)原提取物表位復(fù)雜性的重組變應(yīng)原。而且，幾個研究小組己經(jīng)使用己知的關(guān)于變應(yīng)原結(jié)構(gòu)的知識發(fā)展了確定的新的過敏癥疫苗。已經(jīng)使用遺傳工程、合成肽化學和變應(yīng)原與免疫剌激DNA序列的結(jié)合來減少新疫苗的變應(yīng)原性活性，并因此減少治療誘導(dǎo)的副作用率。以這種變應(yīng)原衍生物進行了第一個有前景的臨床研究。有趣的是，雖然可以強烈減少或甚至消除遺傳工程化重組變應(yīng)原和源自變應(yīng)原的合成的包含T細胞表位的肽的IgE反應(yīng)活性，但是這些衍生物仍然可以誘導(dǎo)全身性副作用(出現(xiàn)于注射幾小時后)。例如，有報道指出，在皮內(nèi)注射幾個小時以后，主要貓變應(yīng)原Feldl的T細胞表位肽誘導(dǎo)了哮喘和支氣管的高反應(yīng)性，且有力證據(jù)表明，這種效應(yīng)是T細胞介導(dǎo)的和MHC限制性的。這些結(jié)果表明，除去IgE反應(yīng)活性可減少IgE介導(dǎo)的副作用，因為在這些免疫治療研究的過程中未記錄到即現(xiàn)反應(yīng)。但是，變應(yīng)原特異性T細胞表位(被保留在重組變應(yīng)原衍生物以及肽混合物中)是造成延遲的副作用(例如非常有問題的或過敏性皮炎，慢性T細胞介導(dǎo)的過敏性皮膚表現(xiàn))的原因。在重組變應(yīng)原衍生物的情況下，所引起的副作用相對輕微，在T細胞肽疫苗的情況下可通過足夠的劑量來克服。因此這兩種新方法似乎對過敏性鼻結(jié)膜炎的免疫治療都是有前景的，但對于治療嚴重形式的過敏性哮喘(其中肺中的延遲副作用的誘導(dǎo)可能是非常有問題的)可能具有局限性。為了使用并因此激發(fā)針對肽、多肽和蛋白的有效免疫反應(yīng)，通常使用佐劑和/或載體。例如，完全氟氏佐劑，是一種可獲得的最有力的佐劑。但是，由于其副作用，不允許用于人類。因此，需要能夠誘導(dǎo)針對肽和多肽(源自變應(yīng)原，當然，和其他抗原)的強烈免疫反應(yīng)的疫苗組合物，以避免使用完全氟氏佐劑。而且，雖然在一個動物模型中已成功使用BSA作為載體，它可能不適宜用于人類疫苗組合物，因為具有有害反應(yīng)的風險，例如傳播朊病毒病(變異型克雅氏病，(variantCreutzfeldt-Jakobdisease))的風險。發(fā)展有效的針對變應(yīng)原疫苗的一個進一歩挑戰(zhàn)是需要能夠迅速降低個體或動物中變應(yīng)原的免疫反應(yīng)。因此，需要血液中高濃度的變應(yīng)原特異性抗體(主要是IgG亞型)。在粘膜表面IgA抗體是主要的亞型?；魜y毒素(一個現(xiàn)有技術(shù)中已知的載體蛋白)，通常也用作佐劑，減少疫苗組合物中完全氟氏佐劑的需要。但是，霍亂毒素增加總的和特異性的IgE抗體水平，并引起IgE相關(guān)的炎性反應(yīng)。由于大多數(shù)用于疫苗的載體蛋白所激發(fā)的副作用，需要能夠刺激針對變應(yīng)原或其他抗原免疫反應(yīng)的載體系統(tǒng)，而不使用毒性佐劑，不使用較差耐受的載體蛋白，并且，在一些情況下，不刺激潛在的致病性免疫反應(yīng)。滿足這些特性的新型載體系統(tǒng)可被用于形成適合于治療或預(yù)防疾病(例如過敏性疾病)的新型佐劑和組合物。BohleB.等人(J.Immunol.172(11)(2004):6642-6648)描述了一種包含S-層蛋白(S-layerprotein)半體和Betv1半體的重組融合蛋白。這個分子包含天然的高變應(yīng)原性Betvl蛋白。WO2004/004761涉及融合至免疫原的病毒樣顆粒，可用于免疫。在WO2004/003143中揭示了一種融合蛋白(包含病毒樣顆粒和高變應(yīng)原性分子)作為免疫原用于接種疫苗的用途。本發(fā)明的目標是提供可以克服前述缺陷并允許具有減少的副作用的變應(yīng)原疫苗的藥物和載體。因此，本發(fā)明涉及低變應(yīng)原性蛋白，其由至少一個源自變應(yīng)原的低變應(yīng)原性分子組成，該低變應(yīng)原性分子與至少一個另一個非變應(yīng)原性蛋白或其片段融合或^口口o為了激發(fā)針對分子，特別是本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子的加強的免疫反應(yīng)，所述分子被融合至(通過遺傳工程)或結(jié)合至(通過化學反應(yīng))載體。常規(guī)和通常使用的載體為例如KLH(鑰孔戚血藍素，keyholelimpethemocyanin)。KLH(分離自巨大海洋軟體動物Megathuracrenulata)是最常見的用于產(chǎn)生用來注射的免疫原的載體蛋白之一。由于具有高質(zhì)量并且為非哺乳動物蛋白，KLH誘導(dǎo)強烈的抗體反應(yīng)。融合至或結(jié)合至本發(fā)明的低變應(yīng)原性分子的另一個蛋白("載體"或"載體蛋白")是非源自變應(yīng)原的("非變應(yīng)原性")。但是，當向動物或人體使用時，本發(fā)明中所用的載體蛋白可表現(xiàn)出T細胞反應(yīng)活性，和Z或激發(fā)針對其自身以及與其融合或結(jié)合的低變應(yīng)原性分子的免疫反應(yīng)。因此，如果載體蛋白源自病原體(例如病毒，細菌等)，則產(chǎn)生針對所述抗體和病原體的(保護性)抗體。如這里所用的"低變應(yīng)原性蛋白"意思是非變應(yīng)原性來源的載體與低變應(yīng)原性分子的融合蛋白/多肽。而且，"低變應(yīng)原性蛋白"也指載體與低變應(yīng)原性分子的結(jié)合產(chǎn)物(例如，化學偶聯(lián)，吸附)。如這里所用的"低變應(yīng)原性"是指具有減少的變應(yīng)原性潛力的分子。這樣的分子與野生型蛋白(即這些分子所源自的蛋白)相比，在個體中具有降低的激發(fā)過敏性反應(yīng)的能力。優(yōu)選地，至少一個源自變應(yīng)原的并與另一個蛋白融合/結(jié)合的低變應(yīng)原性分子為C-和/或N-末端截尾。如這里所用的"C-和域N-末端截尾"意思是來自野生型變應(yīng)原的N-末端或C末端-或N-和C-末端的氨基酸殘基通過刪除至少1、2、3、4、5、7、10、15、20、30個氨基酸殘基被除去。低變應(yīng)原性分子，即肽/多肽，優(yōu)選為包含10至50個氨基酸，更優(yōu)選為15至40個氨基酸，特別地，20-30個氨基酸，并且表現(xiàn)出減少的IgE反應(yīng)活性。將這些分子設(shè)計為不包含T細胞表位(其可能引起T細胞介導(dǎo)的副作用)。T細胞表位和表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)的分子可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定和鑒別(例如，BercoviciN.等人ClinDiagnLabImmunol.(2000)7:859-864)。發(fā)現(xiàn)可能使用表面暴露肽來設(shè)計源自變應(yīng)原(如主要草花粉變應(yīng)原例如PWpl和主要樺樹花粉變應(yīng)原，Betvl)的肽疫苗。獲得的數(shù)據(jù)表明可針對任何變應(yīng)原(根據(jù)IgE表位制圖，三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)或電腦輔助的表面暴露結(jié)構(gòu)域預(yù)測，這些變應(yīng)原的主要結(jié)構(gòu)是己知的)來生產(chǎn)這些肽疫苗。但是，選擇可用于疫苗的合適的肽仍然是關(guān)鍵的，因為不是所有的經(jīng)過這些方法鑒定的肽都可用于疫苗。適合于疫苗目的的肽需要表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力，以及為了減少或避免延遲的副作用而需要表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。如這里所用的術(shù)語"源自變應(yīng)原"意思是根據(jù)本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子通過裂解或截斷從變應(yīng)原直接獲得。優(yōu)選地，本發(fā)明的低變應(yīng)原性分子的氨基酸序列與野生型變應(yīng)原(這些低變應(yīng)原性分子所源自的)的氨基酸序列的一段(stretch)至少80%是同源的，更優(yōu)選為至少90%同源，最優(yōu)選為至少95%同源，特別地為100%同源。但是，不與野生型變應(yīng)原片段100%同源的分子需要能夠以至少60%，優(yōu)選為至少70%，更優(yōu)選為至少80%，最優(yōu)選為至少90%的能力結(jié)合至抗體(antibody)或抗體(antibodies),優(yōu)選為針對所述野生型變應(yīng)原片段的IgG抗體。一個氨基酸序列與另一個氨基酸序列的同源度可通過使用一定的算法直接對比兩個氨基酸序列來確定。這樣的算法為例如，嵌合在各種計算機程序中(例如"BLAST2SEQUENCES(blastp)"(Tatusova等人.(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-25;CorpetF,Nucl.AcidsRes.(1988)16:10881-10890)。根據(jù)本發(fā)明所述的截尾分子可被定義為完全變應(yīng)原的一部分，其比完全野生型變應(yīng)原引起較少的變應(yīng)原特異性T細胞激活(優(yōu)選為至少30%，更優(yōu)選為至少50%，最優(yōu)選至少70%的減少)，表現(xiàn)出減少超過50%的變應(yīng)原性活性(優(yōu)選為超過70%，按照IgE結(jié)合測試所估計)和誘導(dǎo)IgE介導(dǎo)的細胞激活的能力，并且當與所描述的載體偶聯(lián)時，誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體，該IgG抗體抑制來自過敏性病人的多克隆IgE與完全野生型變應(yīng)原的結(jié)合。該肽應(yīng)該含有來自變應(yīng)原的序列以避免與模擬位(mimotope)的重疊。但是，模擬位(抗原碎片的小的肽模擬物，小于15個氨基酸，從隨機肽文庫中獲得)不代表如此處所定義的原始的、源自變應(yīng)原的分子。根據(jù)本發(fā)明不能使用它們，因為它們太小以致于不能誘導(dǎo)強有力的阻斷IgG反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子可通過重組方法或化學合成來獲得?；蛘?，當然也可能通過酶法或化學切割野生型變應(yīng)原或容納(harbour)感興趣分子的多肽/蛋白來獲得。優(yōu)選地，低變應(yīng)原性分子可包含至少兩個截尾的變應(yīng)原分子(源自至少一個變應(yīng)原)，其中，如果該至少兩個分子源自相同變應(yīng)原的話，截尾的變應(yīng)原片段的順序與野生型變應(yīng)原中片段的順序不同。根據(jù)本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子可包含一個或一個以上(優(yōu)選為至少2個，更優(yōu)選為至少3個)如此處所定義的低變應(yīng)原性分子，因此，形成融合蛋白。該融合蛋白中的單個低變應(yīng)原性分子(當然也缺少IgE結(jié)合能力并缺少T細胞表位)，可源自相同和/或不同來源的變應(yīng)原。如果分子源自相同的變應(yīng)原，低變應(yīng)原性融合蛋白中的順序應(yīng)與野生型變應(yīng)原中的順序不同(這防止了IgE結(jié)合位點的還原和形成)(參見例如WO2004/065414,LinhartB和ValentaR(IntArchAllergyImmunol.(2004)134:324-31))。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，至少一個低變應(yīng)原性分子融合至所述至少一個另一個蛋白或其片段的N-末端和/或C-末端。變應(yīng)原或其片段可通過化學或重組方法與彼此結(jié)合。如果變應(yīng)原或其片段與載體以化學方式結(jié)合，應(yīng)該給所述變應(yīng)原或其片段提供一個末端半胱氨酸殘基(形成一個自由巰基基團)。任何馬來酰亞胺激活的載體蛋白可結(jié)合至所述末端(N-或C-末端)半胱氨酸殘基，因此產(chǎn)生一個免疫原/載體復(fù)合物。如果變應(yīng)原或其片段在末端沒有巰基基團，可應(yīng)用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)化學以把胺(賴氨酸)或羧基酸(谷氨酸、天冬氨酸或5'-磷酸鹽)結(jié)合至載體蛋白。如果低變應(yīng)原性分子融合至載體的N-或C-末端，則使用重組方法。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，至少一個另一個蛋白為病毒，特別是RNA或DNA病毒，細菌、真菌或原生動物蛋白。至少一個另一個蛋白("載體")可以是任何以上提及的來源。但是，特別優(yōu)選為使用激發(fā)免疫反應(yīng)的蛋白，所述免疫反應(yīng)為針對該蛋白本身及低變應(yīng)原性分子所融合或結(jié)合的。由于也針對至少一個另一個蛋白的(保護性)抗體形成的誘導(dǎo)，根據(jù)本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性蛋白可也可用作針對所述另一個蛋白和其發(fā)生起源(例如病毒、細菌、真菌)的疫苗。當然，也可能使用本領(lǐng)域熟知的載體蛋白(例如KLH)作為至少一個另一個蛋白。根據(jù)本發(fā)明所述的病毒蛋白優(yōu)選為衣殼蛋白。病毒衣殼蛋白是特別合適的，因為它們誘導(dǎo)抗病毒活性，激發(fā)抗體(阻斷病毒例如鼻病毒吸附至內(nèi)皮細胞)的形成，表現(xiàn)出針對Thl反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)活性，增加肽的免疫原性(例如，較高的抗-肽，由此較高水平的保護性IgG抗體)，是被證實適合于預(yù)防性疫苗(病毒疫苗)，并且是安全的(當衣殼蛋白用于持續(xù)暴露的人(例如鼻病毒)時)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選具體實施方式，至少一個病毒衣殼蛋白源自人類致病性病毒，優(yōu)選為微小核糖核酸病毒科家族的病毒。微小核糖核酸病毒科家族的病毒優(yōu)選為鼻病毒屬，優(yōu)選為人類鼻病毒種，特別是人類鼻病毒89和14。衣殼蛋白可以是VP1、VP2、VP3禾Q/或VP4。融合至病毒衣殼蛋白的變應(yīng)原優(yōu)選為選自主要樺樹花粉變應(yīng)原(特別是Betvl禾口Betv4)、主要牧草花粉變應(yīng)原(特別是Phlpl、Phlp2、Phlp5、Phip6和Phlp7)、主要屋塵螨變應(yīng)原(特別是Derp1和Derp2)、主要貓變應(yīng)原Feldl、主要蜜蜂變應(yīng)原、主要黃蜂變應(yīng)原、前纖維蛋白(特別是Phlp12)或儲藏室塵螨變應(yīng)原(特別是Lepd2)。其他根據(jù)本發(fā)明所用的合適變應(yīng)原可源自下表。種名變應(yīng)原名生化.ID或lll名分了-量cDNA(C)或ig白(p)參考文獻，登錄S-脈^(Ambrosiaartemisiifolia)矮脈#-(shortragweed)Amba1Amba2Amba3Amba5Amba6Amba7三裂葉豚草(Ambrosiatrifida)巨大豚草(giantragweed)Ambt5三裂葉豚草(Artemisiavulgaris)艾iij(mugwort)Artv1Artv2Artv3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白Artv4前纖維蚩EU向E-l葵(Helianthusannuus)太陽花(sunflower)Hela1Hda2前纖維蛋白一年生山靛(Mercurialisannua)Meral前纖維蛋白抗原E抗原KRa3Ra5Ra6Ra7Ra5G83810124.427-293512143415.714-15CCCCCPCPPC8,208,212211,2324,25269,10,272828A532929AY15210YI3271石竹目(Cary叩hyllales)藜(Chenopodiumalbum)lamb's-quarters,藜(pigweed),Chea1白莧菜(whitegoosefoot)Chea2前纖維級白Chea3polcalcin鉀豬毛萊(Salsolakali)Russian-thistleSalkl17141043CCAY049012,29BAY082337AY08233829C13Rosales蓰草(Humulusjaponicus)蓰草(Japanesehop)Humj4w歐蓍草(Parietariajudaica)Parjl脂肪轉(zhuǎn)移蛋白1Parj2脂肪轉(zhuǎn)移3i白2Parj3前纖維蛋E白藥用墻草(Parietariaofficinalis)Parol脂肪轉(zhuǎn)移蛋CJCAY33518715C參見變應(yīng)原異構(gòu)休列表C參見變應(yīng)原異構(gòu)休列表C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表1529DB.草Poales中國狗牙根(Cynodondactylon)狗牙根(bermudagrass)Cynd1Cynd7Cynd12前纖維蛋白Cynd15Cynd22w烯醇酶Cynd23CyncM4Cynd24發(fā)病機理相關(guān)性蛋白鴨茅(Dactylisglomerata)果園草(orchardgrass)Dacg1AgDglDacg2Dacg3Dacg5羊茅屬未草(Festucapratensis)牛尾草(meadowfescue)Fesp4w絨毛草(Holcuslanatus)天鵝絨草(velvetgrass)HoiI1黑麥草(loliumperemie)黑麥草(ryegrass)Lolp1第I組Lolp2第II組Lolp3第III組數(shù)據(jù)未定3214992132113160CCcccppccp30,S8334331,X9125631a，Y08390AF517686AF517685未定3233,S4535433A,U2534334271111CPPZ2708435,3637.37A,X7336338Lolp5LolpIX，LolplbLolp11hom:胰島素抑制劑球基草戸(Phalarisaquatica)金黃草(CanaryGrass)Phaa1貓尾草(Phleumpratense)牧草Phip1Phip2Phlp4Phip5Ag25Phlp6Phip11胰島素抑制劑hom.Phip12前纖維蛋"Phip13多聚半乳糖醛酸酶草地早熟未(Poapratensis)草地早熟未(Kentuckybluegrass)Poapl第I組Poap5假i力i梁(Sorghumhalepense)蔣森草(Johnsongrass)Sorh131/3516C34，3939AC40,S8065427322055-60CCPCCCCCX78813X75925,4141A42Z27082,43AF521563,43AX77583,44AJ2388483331/34PC4634,4748C.樹木Arecales海譽(Phoenixdactylifera)海冬-(datepalm)Phod2前纖維蛋白14.3CAsturiasp.c.普通赤楊(Al腿gluti膨a)榿木Alng117CS50892白樺(Betulaverrucosa)枠樹Betv117C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Betv2前纖維蛋白15CM65179Betv3CX79267Betv48CX87153,S54819Betv6h:異黃酮還原酶33.5C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Betv7親環(huán)素18PP81531歐洲鵝耳櫪(Carpinusbetuhis)鐵樹(Hornbeam)Carb1紐西蘭生鮮栗子(Castaneasativa)栗子17參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Cass;122P52Cass;5幾丁質(zhì)酶Cass;8脂肪轉(zhuǎn)移蛋山9.7P53歐洲榛子(C017lusavellana)檢子Cor￡t117C參見變應(yīng)原異構(gòu)Co"12前纖維蛋白14cCo"iS脂肪轉(zhuǎn)移蛋白9cCo"t9US球蛋白樣蛋tJ40/cBeyerp.c.Corfiio魯米諾結(jié)合蛋G70cAJ295617Co"ni7S豌豆球蛋G樣齒白48cAF441864美洲白橡木(QuercusAlba)白橡木Que:a117p54唇形目(Lamiales)木犀科(Oleaceae)歐洲白蠟樹(FraxinusExcelsior)卑樹Frae20p58A，AF526295普通女貞(Ligustrumvulgare)女貞Lig、'120p58A油橄欖(Oleae!uropea)橄欖樹Ole《16c59,60Ole<:2前纖維蛋白15-18c60AOle(:39.260BOle':432pP80741Ole':5過氧化物歧化酶16pP80740Ole':610c60C,U86342Ole(p60D，P81430Ole(:8012+結(jié)合蛋白21c60E,AF078679Ole';9卩-l,3-葡聚糖酶46cAF249675Olei510糖基水解酶hom.11c60F，AY082335歐洲丁香(Syringavulgaris)丁香Syr，"120p58A車前禾斗(Plantaginaceae)Plall18PP842242Pinales卩]本柳杉(Cryptomeriajaponica)R本雪松Cryj1Cryj2C叩ressusarisonica柏科樹CupaI意大禾U柏(Cupressussempervirens)線杉(CommonCypress)Cups1Cups3w氺h松(Juniperusashei)mounteinccckrJuna1Juna2Juna3杜松木(Juniperusoxycedrus)pricklyjuniperJuno4hom:鈣調(diào)蛋l(fā)j(calmodulin)JuniperussabinoidesmountaincedarJuns1鉛筆柏(Juniperusvirginiana)easternredcedarJunv14M5CC55,5657,D2977243A124357043C34C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表參考文獻未定4330PCPP8129457A,AJ40465357B,P8129529C57C,AF03147150P5843PP81825,58B懸鈴木科(platanaceae)二球懸鈴木法國梧桐(Londonplanetree)Plaal18PP82817Plaa243PP82967Plaa3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白10PIrisp.c.17D.螨蟲粗腳粉螨(Acarussiro)節(jié)肢動物螨蟲Acas13脂肪酸結(jié)合蛋白14*CAJ006774熱帶剝爪螨(Blomiatropicalis)螨蟲Blotl半胱氨酸蛋D酶39CAF277840Blot3胰島素24*CCheongp.c.Blot4cc淀粉酶56CCheongp.c.Blot5cU59102Blot6膚凝乳蛋fl酶25cCheongp.c.Blot10原肌球蛋白33c61BlotII副肌球蛋白110cAF525465,61ABlot2BtllacU27479Blotl3Bt6,脂肪酸結(jié)合蛋白cU58106Blot19抗微生物肽hom.7.2cCheongp.c.粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)美洲l屋塵螨(Americanhousedustmite)Derfl半胱氨酸蛋白酶25c69Derf214c70,70A,參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Derf3胰島素30c63Derf724-31cSW:Q26456，71DerflO原肌球蛋山c72Derfl1副肌球蛋白98c72ADerfl4mag3,家蠶體液低分子近白(apolipophorin)cD17686Derfl598k幾丁質(zhì)酶98cAF178772Derfl6小鼠凝溶膠蛋白(gelsolin)/villin53c71ADerfl7Ca結(jié)合EF蛋白53c71ADerfl8w60k幾丁質(zhì)酶60cWeberp.c.微角塵螨(Dermatophagoidesmicroceras)屋塵螨(housedustmite)Derml半胱氨酸蛋白酶25p68屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)歐洲屋塵螨(Europeanhousedustmite)Derpl抗原PI,半胱氨酸蛋白酶25c62,參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Derp214c62A-C,參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Derp3胰島素28/30c63Derp4淀粉酶60p64Derp514c65Derp6胰凝乳蛋白酶Derp7Derp8谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Derp9溶膠原絲氨酸蛋白Derp10原肌球蛋白DerpU家蠶體液低分子蛋白樣蛋l(fā)j梅氏嗜霉螨(Euroglyphusmaynei)螨蟲Eurm2Eurm14家蠶體液低分子蛋白家食甜螨(Glycyphagusdomesticus)儲藏室塵螨(storagemite)Glyd2害嗜喊螨(Lepidoglyphusdestructor)儲藏室塵螨(storagemite)Lepd2Lepd1Lepd5Lepd7Lepd10原肌球蛋白Lepd13腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)儲藏室塵螨(storagemite)Tyrp2E.動物Bosdomesticus家牛(domesticcattle)Bosd2Ag3,lipocalin2522/28361771520PCcpcccccc666767A67BY14906Eptonp.c.參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表AF14982772B，參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表73,74,74A,參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表75,AJ25027875,AJ27105875A，AJ25009675,AJ25027975B,Y1269076,參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表(同時參見食物)Bosd3Ca-結(jié)合SI00hom.11CL39834Bosd4a-乳白蛋白14.2CMl8780Bosd5P-乳球蛋白18.3cX14712Bosd6血清白蛋白67cM73993Bosd7免疫球蛋白16077Bosd8酪蛋白20-3077家犬(Canisfamiliaris)(Canisdomesticus)Canf125c78，79<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>Alta128CU82633Alta225C83A,U62442Alta3熱擊蛋白.70CU87807,U87808Alta4蛋Q二硫鍵異構(gòu)離57CX84217Alta6酸性核糖體蛋白P211CX78222,U87806Alta7YCP4蛋白22CX78225AltaIO醛脫氫酶53CX78227,P42041Alta1烯醇酶45CU82437Alta2酸性核糖體蛋白PI11CX84216單本枝抱(Ciadosporium'nerbarum)Clah11383B,83CClah22383B,83CClah3醛脫氫酶53CX78228Clah4酸性核糖體蛋白P211CX78223Clah5YCP4蛋tl22CX78224Clah6烯醇,46CX78226Clah2酸性核糖體蛋白PInCX851801.2散囊菌目(Eurotiales)黃曲霉(Aspergillusflavus)Aspfl13堿性絲氨酸蛋白酶3484煙曲霉(Aspergillusfumigatus)Aspfl18CM83781,S39330Aspf237CU56938Aspf3過氧物酶體蛋白19CU20722Aspf430CA腦1732Aspf5金屬邁白40CZ30424Aspf6錳過氧化物歧化酶26.5CU53561Aspf712CAJ223315Aspf8核糖體蛋白P211CAJ224333Aspf934CAJ223327AspflO天冬氨酸蛋白酶34CX85092Aspfll肽基脯氨酰異構(gòu)酶2484AAspfl2熱擊蛋白P9090c85Aspf13堿性絲氨酸蛋白蜜3484BAspfl516cAJ002026Aspf1643cg3643813Aspf17cAJ224865Aspfl8氣泡絲氨酸蛋白酶3484CAspf22w烯醇酶46cAF284645Aspf23L3核糖體蛋白44c85A,AF464911黑曲蔣(Aspergillusniger)Aspn14|3-木糖苷酶Aspn18氣泡絲氨酸蛋白酶Aspn253-肌醉六磷酸酶BAspn米曲霜(Aspergillusoryzae)Aspo13堿性絲氨酸酶Aspo21TAKA-淀粉酶A短密青萄:菌(Penicilliumbrevicompactum)Penbl3堿性絲氨酸離產(chǎn)貞青蔣(Penicilliumchrysogenum)(舊稱點青霉(P.notatum))Pench13堿性絲氨酸l每Pench18氣泡絲氨酸蛋白酶Pench20N-乙酰-e-葡糖胺酶枯青導(dǎo)(Penicilliumcitrinum)Penc3過氧化物酶體膜蛋白Penc13堿性絲氨酸酶Penc19熱擊蛋GP70Penc22w烯醇離Penc24延長因子ip草酸青蹤(Penicilliumoxalicum)Penol8氣泡絲氨酸蛋白酶105C34C66-100C85C3453333432681833704634CCCccAF10894484B85B，P34754Z84377X17561D00434,M3321886A878787A86B86AU64207AF254643AY36391I87B1.3肉座菌目(Hypocreales)黃色鐮孢(Fusariumculmorum)Fusel核糖體蛋白P2Fusc2硫氧還蛋白樣蛋白1"13*CCAY077706AY0777071.4爪甲團囊菌(Onygenales)紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)Trir2Trir4絲氨酸蛋白酶斷發(fā)毛癬菌(Trichophytontonsurans)Trit1Trit4絲氨酸蛋白酶C88C8830P88A83C88說明1.5酉孝母目(Saccharomycetales)tl色念珠菌(Candidaalbicans)Canda1Canda3過氧化物酶體蛋山甲醇酵母(Candidaboidinii)Candb2402920CC89AY136739J04984,J049852.ftl子菌亞.門(Basidiomycotina)2.1層菌綱(Hymenomycetes)古巴裸蓋菇(Psilocybecubensis)PsicIPsic2親環(huán)素毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)shaggycapCopcl亮氨酸拉鏈蛋白Copc2Copc3Copc5Copc7161189AAJ132235A.I242791AJ242792AJ242793AJ2427942.2銹菌綱(Urediniomycetes)粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulanuicilaginosa)Rhoml烯醇酶Rhom2氣泡絲氨酸蛋白酶4731CC89BAY5472852.3黑粉菌綱(Ustilaginomycetes)MalasseziafurfurMalaf2MFl.過爭t化物酶體膜蛋白21ABO11804,90Malaf3MF2，過氧化物酶體膜蛋白20ABO11805,90Malaf4線粒體蘋果酸鹽脫氫酶馬拉色菌(Malasseziasympodialis)Malas1Malas5Malas6Malas73518*17*CCCCAF084828,90AX96486,91AJ011955AJ011956AJ0U957,91A23Malas8Malas9Malas10熱擊蛋白70Malasll錳過氧化物歧化酶.3.半知菌亞門(Deuteromycotina)3.1瘤座菌目(Tuberculariales)紫附諒菌(Epicoccumpurpurascens)(1H私(E.nigrum)Epipl絲氨酸蛋白酶19*37*8623CCccAJ011958，91AAJ011959,91AAJ428052AJ54842130SW:P83340,91BG.昆蟲埃及斑蚊(Aedesaegyptii)蚊子Aeda1三磷酸腺苷雙磷酸酶68CL12389Aeda237CM33157西方蜜蜂(Apismellifera)蜜蜂Apim1磷脂,A216c92Apim2透明質(zhì)酸酶44c93Apim4蜂毒肽c94Apim67-8pKettnerp.cApim7CUB絲氣酸近白R39cAY127579熊蜂(Bombuspennsylvanicus)大黃蜂bumblebeeBomp1磷脂酶16p95Bomp4蛋白酶p95德國小蠊(Blattellagermanica)德國小蠊(Germancockroach)Blag1Bd90kcBlag2天冬蛋白酶36c96Blag4卡里堿(calycin)21c97Blag5谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶22c98Blag6肌鈣蛋白C27c98美洲l大蠊(Periplanetaamericana)美洲l大蠊(Americancockroach)Pera1Cr-PHcPera3Cr-PI72-78c98APera7原肌球蛋白37cY14854花翅搖蚊(Chironomuskiiensis)蚊Chik0原肌球蛋白32.5*CAJ012184擬背搖蚊(Chironomusthummithummi)蚊Chit1-9血色素16C99Chit1.01成分1116cP02229Chit1.02成分IV16cP02230Chit2.0101成分I16cP02221Chit2.0102成分A6cP02221Chit3成分II-beta16cP02222Chi14成分ITIA16cP02231Chit5成分VI16cP02224Chit6.01成分VIIA16cP02226Chit6.02成分IX16cP02223Chit7成分VIIB16cP02225Chit8成分VIII16cP02227Chit9成分X16cP02228貓蚤(Ctenocephalidesfelisfelis)貓蚤Ctef1Qef2Mlb27cAF231352Ctef325c松異帶蛾(Thaumetopoeapityocampa)ftt異^".l我(pineprocessionarymoth)Thap115pPIR:A59396,衣魚(Lepismasaccharina)蠹蟲(silverfish)Lepsl原肌球蛋白36cAJ309202大黃蜂(Dolichovespulamaculata)白面大黃蜂(whitefacehornet)Dolml磷脂酶AI35c100Dolm2透明質(zhì)酸酶44c101Dolm5抗原523c102,103黃蜂(Dolichovespulaarenaria)黃蜂(yellowhornet)Dola5抗原523c104Polistesannularies黃蜂Pola1磷脂酶Al35p105Pola2透明質(zhì)酸酶44p105Pola5抗原523c104胡蜂(Polistesdominulus)地中海紙黃蜂(Mediterraneanpaperwasp)Pold1Pold4絲氨酸蛋白酶Pold5纟氏質(zhì)黃蜂(Polistesexclamans)黃蜂Polel磷脂酶A1Pole5抗原5馬蜂(Polistesfuscatus)與蛑Polf5抗原5柞蠶馬蜂(Polistesgallicus)黃蜂Polg5抗原5黃蜂(Polistesmetricus)黃蜂Polm5抗原5黃邊胡蜂(Vespacrabo)歐洲蜜蜂(Europeanhoney)Vespcl磷脂酶Vespc5抗原5黑胡蜂(Vespamandariria)雀鋒(giantasianhornet)VespmjVespni5Vespulaflavopilosa32-3434233423PC23C24C23CPCHoffmanp.iHoffmanp.iP81656107104106P83377106107106Hoffmanp.iP81657黃蜂Vesf5抗原523C106德國黃胡蜂(Vespulagermanica)黃蜂Vesg5抗原523C106Vespulamaculifrons黃蜂Vesm1ffl旨酶Al33.5c108Vesm2透明質(zhì)酸酶44p109Vesm5抗原523c104Vespulapermsylvanica黃蜂Vesp5抗原523c106Vespulasquamosa黃蜂Vess5抗原523c106Vespulavidua黃蜂Vesvi5抗原523c106黃胡蜂(Vespulavulgaris)黃蜂Vesv1磷脂酶Al35C105AVesv2透明質(zhì)酸酶Vesv5抗原5Myrmeciapilosula澳洲跳蟻(Australianjumperant)Myrp1Myrp2火蟲義(Soknopsisgeminata)熱帶紅火蟻(tropicalfireant)Solg2Solg4紅火蟻(Solenopsisinvicta)火蟲義(Solenopsissaevissima)巴西火蟻(Brazilianfireant)Sols2Triatomaprotracta力口州吸血蟲(Californiakissingbug)Triap1Procalin4423PCCc105A104X70256S81785Hoffm肌p.'Hoffmanp.i火蚊Sol:i213C110,111Solii324C110Soli413C11020CHoffmanp.c.AF179004.111A.H.食物鱈魚Gadc1變應(yīng)原M大西洋鮭亞特蘭大鮭魚(Atlanticsalmon)Salsi小清蛋白BosdomesticusdomesticcattleBosd4a乳白蛋白(牛奶)Bosd5P-乳球蛋白同時參見動物Bosd6血清白蛋白Bosd7免疫球蛋白Bosd8酪蛋白鯉魚(Cyprinuscarpio)(普通鯉魚(Commoncarp))Cypcl小清蛋白家雞(Gallusdomesticus)雞Galdl卵類粘蛋白121214.218.36716020-301228CC112,113X97824Ml8780X147I2M739937777129114,11527Gald2卵清蛋白44C114,115Gald3Ag22.伴淸蛋白78C114,115Gald4溶解酵素14C114,115Gald5血清"蛋白69CX60688刀額新對蟲下(Metapenaeusensis)蝦Metel原肌球蛋白CU08008棕蟲卩(Penaeusaztecus)!t!卜Penal原肌球蛋白36P116印度對臥(Penaeusindicus)蝦Penil原肌球蛋CJ34C116A節(jié)對蟲下(Penaeusmonodon)黑虎蟲下(blacktigershrimp)Penml原肌球蛋白38CPenm2精氨酸激酶40CAF479772-北就((Todarodespacificus)魷魚Todpi原肌球蛋白38P117A散大蝸牛(Helixaspersa)散人蝸牛(browngardensnail)Helasl原肌球蛋白南非鮑螺(Haliotismidae)鮑魚Halm1食用蛙(Ranaesculenta)食用蛙Ranel小清蛋白aRane2小清蛋白卩芥菜(Brassicajuncea)西亞大蒜芥(orientalmustard)Braj12S白蛋白甘藍型油菜(Brassicanapus)油菜籽Branl2S白蛋白白菜型冬油菜(Brassicarapa)蕪箐Brar2hom:prohevein大麥(Hordeumvulgare)大麥Horvl5BMAI-1Horvl6a-淀粉酶Horvl7p-淀粉酶Horv21，3大麥醇溶蛋白364914C15P2515C34CY14855,117B117C11.9*CAJ31595911.7*CAJ414730118118A,P80208P81729119U9A，SW:P80198黑麥(Secalecereale)黑麥Secc20黑麥精小麥(Triticumaestivum)小麥Trial8凝集素Trial9w-5麩朊玉米(Zeamays)玉米(maise),玉米(corn)Zeam14脂肪轉(zhuǎn)移蛋白.水稻(Oryzasativa.)水稻Orys17f菜籽(Aphimgraveolens)片菜Apig1hom:Betv1Apig4前纖維蛋白Apig5胡蘿卜(Daucuscarota)胡蘿卜Dauc1hom:Betv1Dauc4前纖維蛋白歐洲榛子(Corylusavellana)榛實Cora1.04hom:Betv1Cora2前纖維蛋白Cora8脂肪轉(zhuǎn)移蛋白蘋果(Malusdomestica)蘋果Maid1hom:Betv1Mald2hom:植物甜蛋白(thaumatin)Mald3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白Maid4前纖維蛋白梨(Pyruscommunis)梨Pyre1hom:Betv1Pyrc4前纖維蛋白Pyre5hom:異黃酮還原酶油梨(Perseaamericana)鱷梨Persal內(nèi)幾丁質(zhì)酶杏(Prunusarmeniaca)杏Pruar1hom:Betv1Pruar3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白6516*55/581617149914.4*181433.532Cccccccccccp參見變應(yīng)原異構(gòu)休列表PIR:A59156PI9656119B,U3177IZ48967AF29423P819431HD，參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表AF456482參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表AF327622AF329829參見變應(yīng)原異構(gòu)休列表AJ243427Pastorellop.c.參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表AF05730AF129424AF071477Z78202U93165甜櫻桃(Prunusavium)甜櫻桃Pruav1hom:Betv1Pruav2hom:植物甜蛋白Pruav3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白Pruav4前纖維蛋白歐辨l李(Pru簡domestica)歐洲李Prud3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白桃(Prunuspersica)杉fePrup3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白Prup4前纖維蛋白綠戸努(Asparagusofficinalis)蘆筍Aspao1脂肪轉(zhuǎn)移蛋白藏紅花(Crocussativus)藏紅花Cros1離苣(Lactucasativa)萵苣Lacsl脂肪轉(zhuǎn)移蛋白葡萄(Vitisvinifera)葡萄Vitvl脂肪轉(zhuǎn)移蛋白香蕉(Musaxparadisiaca)香蕉Musxpl前纖維蛋fi菠蘿(Ananascomosus)菠蘿Anacl前纖維蛋白Anac2bromelain檸檬(Citruslimon)檸檬Citl3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白甜橙(Citrussinensis)甜橙Cits1germin樣蛋白Cits2前纖維蛋白Cits3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白惹枝(Litchichinensis)荔枝Lite]前纖維蛋白白芥(Sinapisalba)黃芥Sinai2S白蛋白10151522.8*231491514CCCC9P10P14C9P2115CCCU66076U32440AF221501AF129425119CP81402參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表119DVarastehA-Rp.'Viethsp.'P80274AF377948AF377949119E-G,D14059Torrejonp.c.Torrejonp.c.Torrejonp.c.Torrejonp.c.AY049013120大豆(Glycine腿x)大豆Glym1HPS7P120AGlym28PA57106Glym3前纖維蛋白14C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列Glym4(SAM22)PR-1017C細043，120B綠豆(Vignaradiata)綠豆VigrlPR-10蛋白15CAY792956花生(Arachishypogaea)花生Arahl豌豆球蛋白63.5cL34402Arah2conglutin17cL77197Arah3火豆球蛋白60cAF093541Arah4大豆球蛋白37cAF086821Arah5前纖維蛋白15cAF059616Arah6hom:羽扇豆球蛋白(conglutin)15cAF092846Arah7hom:羽扇豆球蛋白15cAF091737Arah8PR-10蛋白J7cAY328088兵豆(Lensculinaris)小扁豆Lenc1豌豆球蛋白47c參見變應(yīng)原異構(gòu)體列:Lenc2種子生物素化蛋白.66p120C豌豆(Pis咖savitum)豌豆Piss1豌豆球蛋白44c參見變應(yīng)原異構(gòu)體列:Piss2convicilin63c未決中華頓;猴桃(Actinidiachinensis)幾維Actcl半胱氨酸蛋白酶30pP00785Actc2植物甜蛋白樣蛋白24pSW:P81370,121菜椒(Capsicumannu隨)甜椒(bellpepper)Capalw逆滲透蛋白(osmotin)樣蛋tl23cAJ297410Capa2前纖維蛋白14cAJ417552番恭(Lycopersiconesculentum)番茄Lycel前纖維蛋白14cAJ417553Lyce2b-呋喃果糖苷酶50c參見變應(yīng)原異構(gòu)體列:Lyce3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白6cU81996馬鈴薯(Solatiumtuberosum)馬鈴薯Solatl馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)43pPI5476Solat2組織蛋白酶D抑制劑21pP16348Solat3半胱氨酸蛋白酶抑制劑21pP20347Sola14天冬蛋白酶抑制劑16+4pP30941巴西堅果(Bertholletiaexcelsa)巴西堅果(Brzailnut)Bere12S白蛋白Bere211S球蛋白種T貯存蛋白東部黑核桃(Juglansnigra)山核桃(blackwalnut)Jugnl2S白蛋白Jugn2豌豆球蛋白樣蛋白核桃(Juglansregia)英國核杉fe(Englishwalnut)Jugrl2S白蛋l(fā)二Jugr2豌豆球蛋白Jugr3脂肪轉(zhuǎn)移蛋白)!要果(Anacardi腦occidentale)腰果Anao1豌豆球蛋白樣蛋白Anao2豆球蛋G樣蛋白Anao32S白蛋白—度麻(Ricinuscommunis)齒麻子92919*56*449505514CC.CCCCPCCcP04403,M17146AY22I641AY102930AY102931U66866AF066055Pastorello參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表AF453947AY081853Rice12S白蛋白CPO畫芝麻(Sesamuraindic鵬)芝麻Sesi12S白蛋白9C121A,AF240005Sesi22S白蛋白CAF091841Sesi37S豌豆球蛋白樣蛋白45CAF240006Sesi4油質(zhì)蛋白(Oleosin)17CAAG23840Sesi5油質(zhì)蛋白15CAAD42942厚皮甜瓜(Cucumismelo)香瓜Cueml絲氨酸蛋白酶66CD32206Cucm2前纖維蛋白14CAY271295Cucm3發(fā)病機理相關(guān)性蛋白PR-l16*PP83834I.其他的海獸胃線蟲(Anisakissimplex)線蟲Anis124P12IB,A59069Anis2副肌球蛋白97CAF173004Anis3原肌球蛋白41C121C,Y19221Anis49PP83885翹緣銳緣蟀(Argasreflexus)壁虱(pigeontick)Argr117CAJ697694豬蛔蟲(Ascarissuum)蠕蟲Ascs110P122番木瓜(Caricapapaya)木瓜Carp3w木瓜蛋白酶23.4*C122A,Ml5203軟珊瑚(Dendronephthyanipponica)軟珊瑚Denn153P122B巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)橡膠(橡膠)Hevbl延仲因子58P123,124Hevb21，3-葡聚糖酶34/36C125Hevb324P126,127Hevb4microhelix復(fù)合物成分跳P128115Hevb516CU42640Hevb6.01橡膠蛋白前體20CM36986,p02877Hevb6.02橡膠蛋白CM36986,p02877Hevb6.03C-末端片段14CM36986,p02877Hevb7.01hom:來自B血清的馬鈴薯塊莖特異蛋白42C畫598Hevb7.02hom:來自C血清的馬鈴薯塊莖特異蛋白44CAJ223038Hevb8前纖維蛋白14C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Hevb9烯醇酶51CAJ132580Hevb10錳過氧化物歧化酶26C參見變應(yīng)原異構(gòu)體列表Hevb111類幾丁質(zhì)酶C參見變應(yīng)原異構(gòu)休列表Hevb12脂肪轉(zhuǎn)移蛋白9.3CAY057860Hevb13酯酶42PP83269智人(Homosapiens)人自身變應(yīng)原(humanautoallergens)Horns173*CY14314Homs210.3*CX80909Horns320.1*CX89985Homs436*cY177UHoms542.6*cP02538硬白梧桐(Triplochitonscleroxylon)非洲輕木(obeche)Trips11類幾丁質(zhì)酶38.5pKespohlp.c.參考文獻IMarsh,D.G.,禾卩L.R.Freidhoff.1992.ALBE,anallergendatabase.IUIS,Baltimore,MD,Edition1.0.2Marsh,D.G.等人1986.Allergennomenclature.BullWHO64:767-770.3King,T.P.等人1964.Biochemistry3:458-468.4Lowenstein,H.1980.Allergy35:188-191.5Aukrust,L.1980.Allergy35:206-207.6Demerec,M.等人1966.Genetics54:61-75.7Bodmer,J.G.等人1991.Immunogenetics33:301-309.8Griffith,I丄等人1991.Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.96:296-304.9Roebber,M.等人1985.J.Immunol.134:3062-3069.10Metzler,W.J.等人1992.Biochemistry31:5117-5127.IIMetzler，W.J.等人1992.Biochemistry31:8697-8705.12Goodfriend,L.等人1979.Fed.Proc.38:1415.13Ekxamoddoullah,A.K.M.等人1982.Mol.Immunol.19:1527-1534.14Ansari，A.A.等人1987.J.AllergyClin.Immunol.80:229-235.15Morgenstern，J.P.等人1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9690-9694.16Griffith,U.等人1992.Gene113:263-268.17Weber,A.等人1986.Biochem.Physiol.83B:321-324.18Weber,A.等人1987.Allergy42:464-470.19Sta畫rth,D.R.等人1990.BulletinWHO68:109-111.20Rafnar,T.等人1991.J.Biol.Chem.266:1229-1236.21Rogers,B丄.等人1991.J.Immunol.147:2547-2552.22Klapper,D.G.等人1980.Biochemistry19:5729-5734.23Ghosh,B.等人1993.J.Immunol.150:5391-5399.24Roebber,M.等人1983.J.Immunol.131:706-711.25Lubahn,B.,和D.G.Klapper.1993.J.AllergyClin.Immunol.91:338.26Roebber,M.,和D.G.Marsh.1991.J.AllergyClin.Immunol.87:324.27GoodfriendL.等人MolImmunol22:899-906,1985.28HimlyM.等人FASEBJ17:106-108,2003.28ANilsen,B.M.等人1991.J.Biol.Chem.266:2660-2668.29WopfnerN.等人BiolChem383:1779-1789,2002.29AJimenezA.等人1994.IntArchAllergyImmunol105:297-307.29BBarderasR.等人IntArchAllergyImmunol127:47-54,2002.29CCarn6sJ.等人Allergy56,Supplement68:274,2001.29DGiulianiA.等人Allergy42:434-440,1987.30Smith,P.M.等人1996.J.AllergyClin.Immunol.98:331-343.31Suphioglu,C.等人1997.FEBSLett.402:167-172.31aAsturiasJ,A.等人1997.ClinExpAllergy27:1307-1313.32Mecheri,S.等人1985.AllergyAppl.Immunol.78:283-289.33Roberts,A.M.等人1993.Allergy48:615-623.33aGuerin-Marchand,C.等人1996.Mol.Immunol.33:797-806.34Klysner，S.等人1992.Clin.Exp.Allergy22:491-497.35Perez,M.等人1990.J.Biol.Chem.265:16210-16215.36Griffith,I.J.等人1991.FEBSLetters279:210-215.37Ansari,A.A.等人1989.J.Biol.Chem.264:11181-11185.37aSidoli,A.等人1993.J.Biol.Chem.268:21819-21825.38Ansari,A.A.等人1989.Biochemistry28:8665-8670.39Singh,M.B.等人1991.Proc.Natl.Acad.Sci.88:1384-1388.39avanReeR.等人1995.JAllergyClinImmunol95:970-97840Suphioglu,C.和Singh，M.B.1995.Clin.Exp.Allergy25:853-865.41Dolecek,C.等人1993.FEBSLett.335:299-304.41AFischerS,等人1996.JAllergyClinImmunol98:189-198.42Matthiesen,F.和H.Lowenstein.1991.Clin.Exp.Allergy21:297-307.43Petersen,A.等人1995.Int.Arch.AllergyImmunol.108:55-59.43AMarknellDeWittA.等人ClinExpAllergy32:1329-1340,2002.44Valenta,R.等人1994.Biochem.Biophys.Res.Commun.199:106-118.46Esch,R.E.,禾GD.G.Klapper.1989.Mol.Immunol.26:557-561.4701sen,E.等人1991.J,Immunol.147:205-211.48Avjioglu,A.等人1993.J.AllergyClin.Immunol.91:340.52KosT.等人1993.BiochemBiophysResCommun196:1086-92.53Diaz-PeralesA.等人2000.ClinExpAllergy30:1403-1410.54Ipsen,H.,和O.C.Hansen.1991.Mol.Immunol.28:1279-1288.55Taniai,M.等人1988.FEBSLett.239:329-332.56Griffith,I丄等人1993.J.AllergyClin.Immunol.91:339.57Sakaguchi,M.等人Allergy45:309-312,1990.57AYokoyamaM.等人BiochemBiophysResCommun275:195-202，2000.57BMidoro-HoriutiT.等人Jlmmunol164:2188-2192,2000.57CTinghinoR.等人J,AllergyClin.Immunol.101:772-777,1998.58GrossGN等人ScandJImmunol8:437-441,1978.58AObispoTM等人ClinExpAllergy23:311-316,1993.58BMidoro-HoriutiT.等人ClinExpAllergy31:771-778,2001.59LombarderoM.等人Clin.Exp.Allergy24:765-770,1994.60Villalba,M,等人Eur.J.Biochem.216:863-869,1993.60AAsturiasJA等人JAllergyClinImmunol100:365-372,1997.60BBataneroE.等人EurJBiochem241:772-778,1996.60CBataneroE.等人FEBSLett.410:293-296,1997.60DTejeraML等人JAllergyClinImmunol104:797-802,1999.60ELedesmaA.等人FEBSLett466:192-196,2000.60FBarralP.等人JImmunol172:3644-3651,2004.61YiFC等人ClinExpAllergy32:1203-1210,2002,61ARamosJD等人IntArchAllergyImmunol126:286-293,2001.62Chua,K.Y.等人J.Exp.Med.167:175-182,1988.62AChua,K.Y.等人Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.91:118-123,1990.62BSmithAM等人IntArchAllergyImmunol124:61-63,2001.62CSmithAM等人JAllergyClinImmunol107:977-984,2001.63SmithWA,ThomasWR.IntArchAllergyImmunol109:133-140,1996.64Lake,F.R.等人J.AllergyClin.Immunol.87:1035-1042,1991.65Tovey,E.R.等人J.Exp.Med.170:1457-1462,1989.66Yasueda,H.,T.Shida，T.Ando,S.Sugiyama禾卩H.Yamakawa.1991.AllergenicandproteolyticpropertiesoffourthallergensfromDermatophagoidesmites.In:"DustMiteAllergensandAsthma.Reportofthe2ndinternationalworkshop"A.Todt,Ed.,UCBInstituteofAllergy,Brussels,Belgium,pp,63-64.67Shen,H,D.等人Clin.Exp.Allergy23:934-940,1993.67AO'NeilGM等人BiochimBiophysActa,1219:521-528,1994.67BKingC.等人JAllergyClinImmunol98:739-747,1996.68LindP.等人J.Immunol.140:4256-4262,1988.69Dilworth,R.J.等人Clin.Exp.Allergy21:25-32,1991.70Nishiyama,C.等人Int.Arch.AllergyImmunol.101:159-166,1993.70ATrudinger,M.等人Clin.Exp.Allergy21:33-38,199171ShenHD等人ClinExpAllergy25:1000-1006,1995.71ATategakiA.等人ACIInternationalsuppl.1:74-76,2000.72AkiT.等人JAllergyClinImmunol96:74-83,1995.72ATsaiL等人ClinExpAllergy29:1606-1613,1999.72BGafvelinG.等人JAllergyClinImmunol107:511-518,2001.73vanHage墨Hamsten.等人J.AllergyClin.Immunol.91:353,1993.74VarelaJ.等人EurJBiochem225:93-98,1994.74ASchmidtM.等人FEBSLett370:11-14,1995.75ErikssonTLJ等人Eur.J.Biochem.268:287-294，2001.75ASaarneT.等人IntArchAllergyImmunol130:258-265,2003.75BErikssonTL等人Eur.J.Biochem.251(1-2),443-447，1998.76RautiainenJ,RytkonenM,PelkonenJ,PentikainenJ,PerolaO，VirtanenT,ZeilerT,MantyjarviR.BDA20,amajorbovinedanderallergencharacterisedatthesequencelevelisBosd2.Submitted.77GjesingB,LowensteinH.AnnAllergy53:602,1984.78deGroot,H.等人J.AllergyClin.Immunol.87:1056-1065,1991.79Konieczny,A.Personalcommunication;ImmunologicPharmaceuticalCorp.79ABulone,V.EurJBiochem253:202-211,1998.79BSwiss誦Protacc.P81216,P81217.79CDandeuJ.P.等人(1993)J.Chromatogr.621:23-31.79DGoubranBotrosH.等人1998.J.Chromatogr.B710:57-65.79EHilgerC.等人Allergy52:179-187;禾BHilgerC.等人Gene169:295-296,]996.79FIchikawaK.等人ClinExpAllergy,InPress2001.80FahlbuschB.等人Allergy57:417-422,2002,81McDonald,B.等人1988.J.AllergyClin.Immunol.83:251.81AClarke,A.J.等人1984.EMBOJ3:1045-1052.82Longbottom,J.L.1983.Characterisationofallergensfromtheurinesofexperimentalanimals.McMillanPress,London,pp.525-529.83Laperche,Y.等人1983.Cell32:453-460.83ABushRK等人1999.JAllergyClinImmunol104:665-671.83BAukrustL,BorchSM.1979.IntArchAllergyApplImmunol60:68-79.83CSward-NordmoM.等人1988.IntArchAllergyApplImmunol85:288-294.84Shen,等人J.AllergyClin.Immunol.103:S157,1999.84ACrameriR.EpidemiologyandmolecularbasisoftheinvolvementofAspergillusfumigatusinallergicdiseases.Contrib.Microbiol.Vol.2,Karger，Basel(付梓).84BShen,等人(已投稿),199984CShenHD等人Vacuolarserineproteinase:AmajorallergenofAspergillusfumigatus.10thInternationalCongressofImmunology,Abstract,1998.85KumarA.等人1993.J.AllergyClin.Immunol.91:1024-1030.85ASaxenaS.等人2003.ClinExpImmunol134:86-91.85BBaurX.等人Allergy57:943-945,2002.86AShenHD等人1996.ClinExpAllergy26:444-451.86BShen,等人Abstract;TheXVIIICongressoftheEuropeanAcademyofAllergologyandClinicalImmunology,Brussels,Belgium,3-7My1999.87ShenHD等人ClinExpAllergy29:642-651,1999.87AShenHD等人ClinExpAllergy25:350-356，1995.87BShenHD等人JLabClinMed137:115-124,2001.88WoodfolkJA等人1998.JBiolChem273:29489-96.88ADeudl,B.等人1991.J.Immunol.147:96-101.89Shen,H.D.等人1991.Clin.Exp.Allergy21:675-681.89AHornerWE等人1995.IntArchAllergyImmunol107:298-300.89BChangCY等人JBiomedSci9:645-655,2002.90YasuedaH.等人BiochemBiophysResCommun248:240-244,1998.NB:strainTIMM2782(TeikyoUniversityInstituteforMedicalMycology)equaltostrainCBS1878(CentralBureauvonSchimmelkulturen).90AOnishiY.等人EurJBiochem261:148-154,1999.NB:strainTIMM2782(TeikyoUniversityInstituteforMedicalMycology)equaltostrainCBS1878(CentralBureauvonSchimmelkulturen).91SchmidtM.等人EurJBiochem246:181-185，1997.NB:strainATCCno.42132(AmericanTypeCultureCollection).91ARasoolO.等人EurJBiochem267:4355-4361,2000.NB:strainATCCno.42132(AmericanTypeCultureCollection).91BNB:;strain4625(IndianAgriculturalResearchInstitute,PUSA;NewDelhi,India).92Kuchler,K.等人1989.Eur.J.Biochem.184:249-254.93Gmachl,M.,禾卩G.Kreil.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3569-3573.93AHoffmanDR.1977.JAllergyClin.Immunol.59:364-366.94Habermann,E.1972.Science177:314-322.95HoffmanDR,JacobsonRS.1996.J.AllergyClin.Immunol.97:812-821.95AHoffmanDR,El-ChoufaniAE,SmithMM,deGrootH.2001.Occupationalallergytobumblebeevenom:AllergensofBombusterrestris.JAllergyClinImmunolInpress.95BHelmR.等人1996.JAllergClinImmunol98:172-180.95CPomesA.等人1998.JBiolChem273:30801-30807.96ArrudaLK等人JBiolChem270:19563-19568,1995.97ArrudaLK等人JBiolChem270:31196-31201,1995.98ArrudaLK等人IntArchAllergyImmunol107:295-297,1995.98AWuCH等人1998.JAllergyClinImmunol101:832-840.98BMelenE.等人1999.JAllergyClinImmunol103:859-64.98CWuCH等人JBiolChem271:17937-17943,1996.98DWuCH等人MolecularImmunol34:1-8,1997.98ESantosABR等人1999.JAllergyClinImmunol104:329-337.98FAsturiasJA等人1999.JImmunol162:4342-4348.99Mazur，G.等人1990.Monog.Allergy28:121-137.99AMoneoI.等人Allergy58:34-37,2003.100Soldatova,L.等人1993.FEBSLetters320:145-149.IOILu,G.等人1994.J.AllergyClin.Immunol.93:224.102Fang,K.S.F.等人1988.Proc.Natl.Acad.Sci"USA85:895-899.103King,T.P.等人1990.Prot.Seq.DataAnal.3:263-266.104Lu,G.等人1993.J.Immunol.150:2823-2830.105King,T.P.和Lu,G.1997.數(shù)據(jù)未發(fā)表105AKingTP等人1996.J.AllergyClin.Immunol.98:588-600.106Hoffman,D.R.1993.J.AllergyClin.Immunol.92:707-716.107HoffmanDR.1992.數(shù)據(jù)未發(fā)表108HoffmanDR.J.AllergyClin.Immunol.91:187,1993.109JacobsonRS等人J.AllergyClin.Immunol.89:292,1992.110HoffmanDR.J.AllergyClin.Immunol91:71-78,1993.111SchmidtM.等人FEBSLetters319:138-140，1993.111APaddockCD等人JImmunol167:2694-2699,2001.112ElsayedS,BennichH.ScandJImmunol3:683-686,1974.113ElsayedS.等人Immunochemistry9:647-661,1972.114Hoffman,D.R.1983.J.AllergyClin.Immunol.71:481-486.115Langdand,T.19".Allergy38:4S3-500.116DaulCB,SlatteryM,MorganJE,LehrerSB.1993.Commoncmstaceaallergens:identificationofBcellepitopeswiththeshrimpspecificmonoclonalantibodies.In:"MolecularBiologyandImmunologyofAllergens"(D.KraftandA.Sehon,eds.).CRCPress,BocaRaton,pp.291-293.116AShantiKN等人J,Immunol.151:5354-5363,1993.ii/iuu守乂vJ丄iiuiiuiKU丄/u:4^-3-4:):),zuuj.117AMiyazawaM等人J,AllergyClin.Immunol.98:948-953,1996.117BAsturiasJA等人IntArchAllergyImmunol128:90-96,2002.117CL叩ataAL等人J.AllergyClin.Immunol.100:642-648,1997.117DHoffmann-SommergruberK.等人Clin.Exp.Allergy29:840-847,1999.118MonsalveRI等人Biochem.J.293:625-6321993.118A.MonsalveRI等人1997.ClinExpAllergy27:833-841.119Mena,M.等人PlantMolec.Biol.20:451-458,1992.119APalosuoK.等人J.AllergyClin.Immunol.108:634-638,2001.119BXuH.等人Gene164:255-259,1995.119CPastorelloEA等人J.AllergyClin.Immunol.94:699-707，1994.119DDiaz-PeralesA.等人JAllergyClinImmunol110:790-796,2002.119EGalleguillosF,RodriguezJC.ClinAllergy8:21-24，1978.119FBaurX.ClinAllergy9:451-457,1979.119GGailhoferG.等人ClinAllergy18:445-450,1988.120Menendez-Arias,L.等人1988.Eur.J.Biochem.177:159-166.120AGonzalezR.等人Lancet346:48-49,1995.120BKleine-TebbeJ.等人JAllergyClinImmunol110:797-804,2002.120CSanchez-MongeR.等人J.AllergyClin.Immunol.106:955-961,2000.121Gavrovic-JankulovicM.等人JAllergyClinImmunol110:805-810，2002.121APastorelloEA等人J.Chromatogr.BBiomed.Sci.Appl.756:85-93,2001.121BMoneoL等人J.AllergyClin.Immunol.106:177-182,2000.121CAsturiasJA等人2000.Allergy55:898-890.122Christie,J.F.等人1990.Immunology69:596-602.122ABaurX.等人ClinAllergy12:9-17,1982.122BOnisukaR.等人IntArchAllergyImmunol125:135-143,2001.123CzupponAB等人JAllergyClinImmunol92:690-697,1993.124AttanayakaDPSTG等人1991.PlantMolBiol16:1079-1081.125ChyeML,CheungKY.1995.PlantMolBiol26:397-402.126AleniusH.等人1993.IntArchAllergyImmunol102:61-66.127YeangHY,CheongKF,SunderasanE,HamzahS，ChewNP,HamidS,HamiltonRG,CardosaMJ.1996.The14.6kD(REF,Hevb1)and24kD(Hevb3)rubberparticleproteinsarerecognisedbyIgEfromSpinaBifidapatientswithLatexallergy.JAllergClinImmunolinpress.128SunderasanE.等人1995.JnatRubbRes10:82-99.129SwobodaI.等人2002.JImmunol.168:4576-84.根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，低變應(yīng)原性分子表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選具體實施方式，低變應(yīng)原性分子表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。但是，在根據(jù)本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子中也可使用包含至少一個T細胞表位的變應(yīng)原片段。如這里所用的"表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力"意思是，根據(jù)本發(fā)明所述的分子顯示出顯著減少的IgE結(jié)合能力或活性(與野生型變應(yīng)原相比，結(jié)合能力至少減少50%，優(yōu)選為至少減少70%，更優(yōu)選為至少減少80%，再更優(yōu)選為至少減少90%，最優(yōu)選為至少減少95%)或甚至完全缺失。分子(像肽和蛋白)的IgE結(jié)合活性/能力可通過例如酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)使用例如從曾經(jīng)暴露于野生型變應(yīng)原的個體(例如過敏性個體)獲得的血清來確定。簡單來說，將待測肽包被至微量滴定板的孔中。洗滌并封閉孔后，以抗體溶液(由過敏性個體的血漿組成，該個體曾暴露于所測肽或由其制備的蛋白)在孔中溫育。向孔中加入標記的二抗并溫育。然后IgE結(jié)合的數(shù)量被定量并與純化的野生型變應(yīng)原的IgE結(jié)合相比較?；蛘?，肽的結(jié)合能力可通過Western雜交分析確定。例如，使用SDS-PAGE將所測肽在聚丙烯酰胺凝膠中分析。然后將該肽轉(zhuǎn)移至硝化纖維，接下來以來自過敏性個體的血清溫育。經(jīng)標記的二抗溫育后，所結(jié)合的IgE數(shù)量被確定和定量。另外一個可用于確定肽的IgE結(jié)合活性的測試為ELISA競爭測試。簡單來說，通過混合來自過敏性個體(通過直接ELISA表明其與野生型變應(yīng)原有IgE反應(yīng)活性)的血漿產(chǎn)生一個IgE抗體庫。在ELISA競爭測試中使用這個庫將野生型變應(yīng)原的IgE結(jié)合與所測肽相比較。野生型變應(yīng)原和所測肽的IgE結(jié)合被確定并定量。"T細胞表位"意思是蛋白(例如變應(yīng)原)或其片段，對于它T細胞具有抗原特異性結(jié)合位點，結(jié)合至所述結(jié)合位點的結(jié)果為激活該T細胞。如這里所用的術(shù)語"表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性"是指分子表現(xiàn)出T細胞反應(yīng)活性，使用本領(lǐng)域已知的標準測試中的等摩爾量，與野生型變應(yīng)原(低變應(yīng)原性分子源自該野生型變應(yīng)原)所誘導(dǎo)的刺激相比，所述反應(yīng)活性顯著性減少(減少的T細胞反應(yīng)活性意味著，在等摩爾數(shù)量下，與野生型變應(yīng)原相比，低變應(yīng)原性分子的剌激減少至少30%，優(yōu)選為至少50%，更優(yōu)選為至少70%，最優(yōu)選為至少90%)。在本發(fā)明的一個特別具體實施方式中，該分子可"缺少"T細胞表位，因此在待處理的個體(即，將接受表位呈遞價態(tài)分子)中分子顯示出減少的T細胞反應(yīng)活性。例如可能是，源于變應(yīng)原的分子相對于一個個體或一組個體為缺少T細胞表位，但相對于其他個體則具有T細胞表位。檢測T細胞表位存在的方法在本領(lǐng)域是己知的，包括檢測T細胞增殖的測試(例如胸苷攝入)。不能誘導(dǎo)統(tǒng)計學上顯著高于背景(即，使用標準的統(tǒng)計學方法，通常p小于0.05)的胸苷攝入的免疫原通常被認為是缺少T細胞表位，雖然將意識到，胸苷攝入的定量數(shù)量可依賴于所測的免疫原而變化(參見例如，ZhenL.等人(InfectImmun.(2003)71:3920-3926))。通常，低于大約2-3的刺激指數(shù)(更優(yōu)選為低于大約l)表明缺少T細胞反應(yīng)活性和表位。也可根據(jù)標準方法通過測定源自T細胞的淋巴因子的分泌來確定T細胞表位的存在。可通過將受刺激細胞的增殖率(胸苷攝入)除以只在培養(yǎng)液中的未刺激細胞的增值率來計算刺激系數(shù)(SI)。SI=1意味著無刺激，SK1意味著毒性效應(yīng)，SI>1意味著對細胞的刺激。可通過經(jīng)驗確定T細胞表位的位置和內(nèi)容(如果存在的話)。除了T細胞的刺激，還可確定細胞因子的分泌。例如，IFN-Y已被識別為有害細胞因子。其他的例子可以是TNF-a、IL-5、IL-4、IL-8等。優(yōu)選地，變應(yīng)原片段由下列組成Phlp1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，PWp5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，F(xiàn)eld1的鏈1的1至34或35至70位氨基酸，F(xiàn)eld1的鏈2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Betvl的30至59、50至79或75至104位氨基酸，Derp2的l至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Derp7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp10的1-35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Derp21的l至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，F(xiàn)eld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canf1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Ambal的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alta6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列變體。以上所列源自變應(yīng)原的分子的具體氨基酸序列為-<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>術(shù)語"其片段"和"其序列變體"是指從此處披露的源自變應(yīng)原分子所導(dǎo)出的肽，其表現(xiàn)出與所述源自變應(yīng)原分子相當?shù)幕蛳嗤纳锘瘜W特性(例如，防止IgE與變應(yīng)原(那些分子所源自的變應(yīng)原)結(jié)合的能力)。本發(fā)明所述的片段包含至少5個，優(yōu)選為至少7個，更優(yōu)選為至少10個連續(xù)的，和/或最大為95%，優(yōu)選的最大為90%，更優(yōu)選的最大為80%的源自變應(yīng)原的分子的氨基酸殘基。術(shù)語"序列變體"包括對肽進行的修飾例如片段化(參上)、氨基酸取代(例如以其他天然或非天然的氨基酸或氨基酸衍生物)、去除或加入。"序列變體"也指上表中的所述源自變應(yīng)原的分子，其中至少1個，優(yōu)選為至少2個，更優(yōu)選為至少3個，再更優(yōu)選為至少4個(5、6、7、8、9、10、15、20)個氨基酸殘基被加入到C-和/或N-末端。注意到克隆30變應(yīng)原是源自屋塵螨Dermatophagoidespteronyssinus的變應(yīng)原，由以下序列組成KDCPGNTRWNEDEETCT(SEQIDNo.140;也參見ATA733/2006)。根據(jù)本發(fā)明，肽也是環(huán)繞的(encompassed),其與以上所披露的氨基酸序列為至少80%，優(yōu)選為90%同源。本發(fā)明的另一個方面涉及編碼根據(jù)本發(fā)明所述的融合的低變應(yīng)原性蛋白的核酸分子。本發(fā)明的另一個方面涉及包含本發(fā)明所述的核酸分子的載體。所述載體優(yōu)選為表達載體。容納本發(fā)明所述核酸分子的載體可用于克隆目的或用于生產(chǎn)表達載體。所述載體可以是質(zhì)粒、粘粒(cosmid)、病毒、噬菌體或任何其他遺傳工程中通常使用的載體，并且，除了本發(fā)明所述的核酸分子外，還可包括控制表達的真核或原核元件，例如用于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯啟動和終止的調(diào)節(jié)序列、增強子、啟動子、信號序列等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，該載體是細菌、真菌、昆蟲、病毒或哺乳動物載體。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的載體可用于在各種宿主中克隆和表達的目的。因此，所述載體除了編碼本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子或融合蛋白之外，還包含宿主特異性調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的另一個方面涉及包含本發(fā)明所述核酸分子或載體的宿主。根據(jù)本發(fā)明所述的核酸分子和載體可被引入合適的宿主。所述分子可被引入該宿主的基因組。該載體可在胞質(zhì)中以染色體外的形式存在或被引入宿主的染色體。本發(fā)明的另一個方面涉及針對本發(fā)明所述低變應(yīng)原性分子、低變應(yīng)原性融合蛋白或融合蛋白的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，抗體是單克隆或多克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體包括，但不限于，多克隆、單克隆、多特異性、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段和任何以上的表位結(jié)合片段。而且，抗體被認為是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結(jié)合位點(與抗原免疫特異性地結(jié)合)的分子。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的免疫球蛋白分子為IgG、IgM、IgD、IgA和IgY型，免疫球蛋白分子的類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。多克隆抗體可通過向非人類的哺乳動物使用本發(fā)明所述多肽(優(yōu)選為使用佐劑)并收集所產(chǎn)生的抗血清來制備。可通過一段時間的重復(fù)注射來獲得改善的效價。對于引起抗體的哺乳動物種沒有特別限制；通常優(yōu)選使用兔子或天竺鼠，但是也可使用馬、貓、狗、山羊、豬、大鼠、母牛、綿羊、駱駝等。在制備抗體時，將確定數(shù)量的本發(fā)明所述免疫原用例如生理鹽水溶液稀釋至合適的濃度，將得到的稀釋溶液與例如完全弗氏佐劑混合以制備懸浮液，或與礦物膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇類(pluronicpolyols)、聚陰離子、肽、油乳狀液、鑰孔戚血藍素、二硝基酚和潛在有用的人類佐劑例如BCG(卡介苗，bacilleCalmette-Guerin)禾口短小棒狀，下菌(corynebacteriumparvum)、混合。每次使用大約50嗎至大約2500嗎的本發(fā)明所述多肽通過例如腹膜內(nèi)方式向哺乳動物例如兔子使用懸浮液和混合物。優(yōu)選地，在大約2-3個月的時間內(nèi)，優(yōu)選大約l個月每2周使用一次懸浮液以引起免疫。在最后一次施藥1至2周后，通過從免疫的動物中收集血液，離心血液并從血液中分離血清來重新獲得抗體。單克隆抗體可以是例如人源或鼠源的。鼠單克隆抗體可由K6hler和Milstein的方法(K6hler,G,和Milstein,C.,Nature256(1975)495)來制備，例如通過將超免疫小鼠的脾細胞與合適的鼠骨髓瘤細胞系融合。嵌合抗體是抗體的不同部分源自不同動物種的分子，這樣的抗體具有源自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)。產(chǎn)生嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見例如Morrison,Science229:1202(1985);Oi等人，BioTechniques4:214(1986);Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods125:191-202;US5,807,715;US4,816,567禾口US4,816,397。人源化抗體是與所需的抗原結(jié)合的來自非人物種抗體的抗體分子，其具有來自該非人物種的一個或一個以上補體決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)。通常，人框架區(qū)的框架殘基被來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基替代，以改變(優(yōu)選為改善)抗原的結(jié)合。這些框架取代物通過本領(lǐng)域熟知的方法鑒定，例如通過模擬CDR和框架殘基之間的相互作用來鑒定對抗原結(jié)合重要的框架殘基，通過序列比對來鑒定特定位置不正常的框架殘基(參見例如，Queen等人，US5,585,089;Riechmann等人,Nature332:323(1988))?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的眾多方法將抗體人源化，例如，CDR-移植(CDR-grafting)(EP239,400;WO91/09967;US5,225,539;US5,530,101;禾nUS5,585,089),鑲飾(veneering)或重塑(resurfacing),(EP592,106;EP519,596;Padlan,MolecularImmunology28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人，ProteinEngineering7(6):805-814(1994);Roguska.等人，PNAS91:969-913(1994)),和鏈穿梭(chainshuffling)(US5,565,332)。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可有利地用于遭受過敏癥(特別是遭受屋塵螨過敏癥)個體的脫敏(desensitization)。對于被動免疫，抗體優(yōu)選為IgG或其衍生物(例如嵌合或人源化抗體)。而且，抗體也可被用于個體的脫敏(desensibilisation)。本發(fā)明的另一個方面涉及包含本發(fā)明所述低變應(yīng)原性蛋白或抗體的疫苗制劑。根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗制劑可以本領(lǐng)域己知的方式制成，并必要地適應(yīng)于所述疫苗制劑的使用方式。(本發(fā)明的)疫苗制劑的優(yōu)選使用方式包括通常的為疫苗接種所描述和建議的所有標準使用制度以及特異的過敏癥免疫治療(口服、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、直腸等)。但是，特別優(yōu)選為經(jīng)皮下或肌內(nèi)使用本發(fā)明所述的分子和蛋白。本發(fā)明所述的疫苗制劑可只包含鼻病毒屬成員的病毒衣殼蛋白或其片段。優(yōu)選地所述制劑進一步包含至少一個佐劑，藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。為了增加本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子的免疫原性，可在本發(fā)明所述的藥物中使用例如佐劑。根據(jù)本發(fā)明所述的佐劑為輔助性試劑，當與抗原一起或平行使用時，增加其免疫原性和/或影響免疫反應(yīng)的質(zhì)量。因此，佐劑可例如相當?shù)赜绊戵w液或細胞免疫反應(yīng)的程度。通常的佐劑為例如鋁化合物、含脂化合物或滅活的分支桿菌。47通常，佐劑可以是不同的形式，只要它們適合于向人類使用。這些佐劑的其他例子為礦物或植物來源的油乳狀液、礦物化合物例如磷酸鋁或氫氧化鋁，或磷酸鈣、細菌產(chǎn)物和衍生物，例如P40(源自肉芽腫棒狀桿菌(Corynebacteriumgranulosum)的細胞壁)、單磷酰脂質(zhì)A(monophosphoryllipidA,MPL,LPS的衍生物)和胞壁酰肽(muramylpeptide)衍生物及其結(jié)合物(衍生自分支桿菌成分)、明礬、不完全氟氏佐劑、靜脈脂肪乳劑(liposyn)、皂角苷、鯊烯等(參見例如GuptaR.K.等人(Vaccine11:293-306(1993))禾QJohnsonA.G.(Clin.Microbiol.Rev.7:277-289)。根據(jù)本發(fā)明的另外一個優(yōu)選具體實施方式，所述疫苗制劑包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別地，0.5昭至200昭的所述低變應(yīng)原性分子或抗體。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明所述低變應(yīng)原性蛋白或抗體在制備用于治療或預(yù)防人類或動物中病毒感染和/或過敏癥的藥物的用途。所述藥物優(yōu)選為進一歩包含至少一個佐劑，藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。根據(jù)本發(fā)明所述的藥物可用于主動(使用本發(fā)明的低變應(yīng)原性蛋白和/或分子)以及被動(針對本發(fā)明所述低變應(yīng)原性蛋白和/或分子的抗體)免疫。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，所述藥物包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別地，0.5叱至200嗎的所述低變應(yīng)原性分子、核酸分子、載體、宿主或抗體。優(yōu)選地，該藥物以0.01mg/kg體重至5mg/kg體重，優(yōu)選為0.1mg/kg體重至2mg/kg體重的數(shù)量向個體使用。特別的劑量制度，即劑量、時間和重復(fù)，取決于特別的個體和該個體的醫(yī)療史。經(jīng)驗考慮，例如半衰期，通常有助于確定劑量?？稍谥委熯^程中確定并調(diào)節(jié)使用頻率。優(yōu)選地，向其使用本發(fā)明所述藥物的個體為具有成為過敏癥風險的個體或動物?；加谢蚓哂谢歼^敏性病狀、紊亂或疾病風險的個體包括己存在過敏性病狀或者已知的或懷疑趨勢(朝著與過敏性病狀相連或由過敏性病狀引起的征狀發(fā)展的趨勢)的個體。因此，該個體可具有主動的慢性過敏性病狀、紊亂或疾病，急性過敏性發(fā)作，或潛伏的過敏性病狀、紊亂或疾病。某些過敏性病狀與季節(jié)性或地理性環(huán)境因素相關(guān)。因此，有風險的個體包括那些具有遭受病狀風險的(該病狀基于既往個人或家庭史，以及季節(jié)或物理位置)的個體，但該病狀或與該病狀相關(guān)的癥狀可能不在個體中表現(xiàn)其自身。根據(jù)本發(fā)明所述的向個體使用的藥物(其包括至少一個如此處描述的低變應(yīng)原性分子)可預(yù)防所述個體的致敏或誘導(dǎo)針對變應(yīng)原的合適的免疫反應(yīng)。如果本發(fā)明的藥物用于預(yù)防致敏，則它應(yīng)該在個體與所述變應(yīng)原首次接觸前使用。因此，優(yōu)選為向嬰兒和兒童使用本發(fā)明所述的藥物。向懷孕個體使用本發(fā)明所述的藥物將在未出生子女中誘導(dǎo)針對變應(yīng)原的抗體的形成。對這種治療使用本發(fā)明所述低變應(yīng)原性分子是特別有益的，這是因為，由于缺少T細胞表位，在變應(yīng)原免疫治療過程中發(fā)生的副作用可被顯著減少甚至完全避免。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明所述低變應(yīng)原性蛋白或抗體在診斷個體中過敏癥和/或病毒感染中的用途。本發(fā)明的另一個方面涉及來自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣殼蛋白作為載體在藥物或疫苗中的用途或用于診斷病毒感染，特別是普通感冒的用途。作為廣泛傳播的KLH載體蛋白的有價值的替代物，可使用微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣殼蛋白。載體可通過化學方式結(jié)合至或通過重組技術(shù)融合至肽、蛋白和多肽或其他抗原。而且，病毒衣殼蛋白可用于檢測例如針對個體血清中所述衣殼蛋白的抗體。這樣的載體的一個優(yōu)點為，不僅所融合或結(jié)合的抗原可暴露于免疫系統(tǒng)，而且誘導(dǎo)了針對鼻病毒的衣殼蛋白的免疫反應(yīng)。因此，這樣的疫苗引起對鼻病毒引起的疾病的預(yù)防和/或治療。該病毒優(yōu)選為人類鼻病毒種，特別是人類鼻病毒89和14。本發(fā)明的另一個方面涉及源自Phip5(GenbankNr.X7435)的低變應(yīng)原性分子，具有C-和/或N-末端截尾并實質(zhì)上缺乏IgE結(jié)合能力。草花粉是空氣傳播過敏原(對干草熱和過敏性哮喘負責)的最有力的室外季節(jié)性來源之一。超過40%的過敏性個體表現(xiàn)出對草花粉變應(yīng)原的IgE反應(yīng)活性，其被分成超過11個組。超過80%的草花粉過敏性病人與第5組變應(yīng)原反應(yīng)。第5組變應(yīng)原為非糖基化的，高度同源蛋白，具有介于25-33kD的分子量。幾個第5組變應(yīng)原已被克隆和/或免疫鑒定。通過引入點突變、行中幾個氨基酸的突變或缺失來降低變應(yīng)原性活性的試驗表明沒有效果(SchrammQ等人JImmunol1999;162:2406-1435)。已經(jīng)描述了Phlp5的IgE結(jié)合區(qū)域(FlickerS,等人JImmunol2000;165:3849-3859)，已經(jīng)解決了其三維結(jié)構(gòu)(MaglioO,等人2002.ProteinEng.15:635-642)。特別地，根據(jù)本發(fā)明所述的Phip5肽(其為C-和/或N-末端截尾的并缺少IgE結(jié)合能力)，可用于個體的主動疫苗接種。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，經(jīng)截尾的分子缺少T細胞表位。如上所述，如果低變應(yīng)原性分子實質(zhì)上缺少T細胞表位，變應(yīng)原免疫治療的延遲副作用可被顯著降低甚至是避免。缺少T細胞表位的經(jīng)截尾的Phip5分子由Phip5的93至128、98至128、26至53、26至58或252至283位氨基酸或其片段或其序列變體組成。特別地，這些經(jīng)截尾的分子實質(zhì)上表現(xiàn)出無T細胞表位，但是，能夠激發(fā)針對野生型變應(yīng)原的合適的免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的具體實施方式，低變應(yīng)原性經(jīng)截尾的Phip5由Phip5的132至162、217至246或176至212位氨基酸或其序列變體組成。這些低變應(yīng)原性分子包含一個或一個以上T細胞表位但缺少IgE結(jié)合能力。本發(fā)明的另一個方面涉及源自Feldl的低變應(yīng)原性分子(GenbankNr.X62477和X62478),其具有C-和/或N-末端截尾并缺少IgE結(jié)合能力。對動物的過敏癥影響多達40%的過敏性病人。在國內(nèi)環(huán)境中，對主要流行寵物，貓和狗的過敏癥占特別主導(dǎo)并與長年的癥狀相連。動物變應(yīng)原存在于皮屑、上皮細胞、唾液、血清或尿液中。既可通過直接的皮膚接觸也可通過吸入攜帶變應(yīng)原的顆粒而暴露于變應(yīng)原。已表明主要貓和狗變應(yīng)原普遍存在，甚至可在不擁有寵物的家庭和公共地方例如學校被檢測到。這是由于工業(yè)化國家養(yǎng)寵物的家庭數(shù)目較高并在增長(大約50%)以及變應(yīng)原(其被得到并分散)的高度穩(wěn)定性。Fdd1被鑒定為主要貓變應(yīng)原，其被超過90%的貓過敏性病人所識別。Feld1代表生物功能未知的38kDa的酸性糖蛋白。它由兩個相同的非共價連接的異二聚物組成，所述異二聚物又由兩個反平行的由3個二硫鍵連接的多肽鏈組成。鏈1和鏈2在不同的基因上編碼，每個由3個外顯子組成。已經(jīng)在大腸桿菌(五.co//)中作為鏈2-鏈1融合蛋白而表達了重組Feld1(rFeld1)。這個重組Feld1能夠完全模擬野生型變應(yīng)原的免疫特性。源自主要貓變應(yīng)原Feld1并缺少IgE結(jié)合能力的肽適合于例如免疫治療和預(yù)防性的過敏癥疫苗接種。這些肽可包含在一個較大的多肽中或與合適的載體蛋白(例如鑰孔戚血藍素，KLH)偶聯(lián)。源自Feldl的合成肽(像Phlp5和這里所揭露的源自變應(yīng)原的肽)能夠誘導(dǎo)IgG反應(yīng)，即產(chǎn)生所謂的"阻斷抗體"或"保護性抗體"。這些抗體防止IgE與變應(yīng)原Feld1的結(jié)合。因此可達到過敏性癥狀的顯著性降低。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，經(jīng)截尾的分子表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。為了避免或顯著降低延遲的副作用，源自Feld1的低變應(yīng)原性分子表現(xiàn)出如本發(fā)明所定義的減少的T細胞反應(yīng)活性。優(yōu)選地，經(jīng)截尾的Feld1由Feld1的鏈1的1至34或35至70位氨基酸，F(xiàn)eld1的鏈2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列變體組成。本發(fā)明的另一個方面涉及低變應(yīng)原性分子，其由下列氨基酸組成或包含下列氨基酸Derp2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Derp7的1至30、20至50、50至80、卯至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，F(xiàn)eld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canf1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Ambal的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alta6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列變體。本發(fā)明的另一個方面涉及低變應(yīng)原性融合蛋白，其包含至少兩個本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子，所述低變應(yīng)原性分子表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力并表現(xiàn)出任選減少的T細胞反應(yīng)活性。本發(fā)明所述的源自變應(yīng)原并缺少IgE結(jié)合能力的低變應(yīng)原性分子可重組地與彼此融合或化學地與彼此結(jié)合。作為融合蛋白/多肽的單一成分(變應(yīng)原片段)，所述融合蛋白/多肽也缺少IgE結(jié)合能力。根據(jù)本發(fā)明所述的融合蛋白可包含至少兩個，優(yōu)選為至少3個，更優(yōu)選為至少4個，再更優(yōu)選為至少5個本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子。當然，也可能將低變應(yīng)原性分子與其他非源自變應(yīng)原的肽、多肽和蛋白融合。當向個體使用時，這些肽、多肽和蛋白也可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或者作為載體或表現(xiàn)出酶學活性。根據(jù)本發(fā)明所述的融合蛋白中的低變應(yīng)原性分子可直接或通過一個連接子(優(yōu)選為由氨基酸殘基組成)與彼此相連。制備融合蛋白的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，可在標準的分子生物學參考書例如Sambrook等人(MolecularCloning,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)禾卩Ausubel等人(ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded;WileyandSons,1995)中找到。通常，通過首先構(gòu)建融合基因(被插入到合適的表達載體中)，然后，用于轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞來產(chǎn)生融合蛋白。通常，通過一系列限制性酶消化和連接反應(yīng)(這導(dǎo)致產(chǎn)生所需要的插入到質(zhì)粒中的序列)來產(chǎn)生重組融合構(gòu)建體。如果不能得到合適的限制性位點，則可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和以上所列參考書中的合成低聚核苷酸接頭或連接子。編碼變應(yīng)原和天然蛋白的多聚核苷酸序列可在被插入到合適的載體之前被組裝，或者編碼變應(yīng)原的序列可被插入到編碼載體中已經(jīng)存在的天然序列的序列附近。將序列插入到載體中應(yīng)該符合讀碼框(inframe)以使該序列能被轉(zhuǎn)錄成蛋白。所需要的精確的限制性酶、連接子和/或接頭以及精確的反應(yīng)條件將根據(jù)所用的序列和克隆載體而變化，這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是明顯的。但是DNA構(gòu)建體的組裝在本領(lǐng)域是常規(guī)的，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地完成。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，如果至少兩個分子源自相同的變應(yīng)原，則這些分子以不同于野生型變應(yīng)原中片段順序的順序與彼此相融合。根據(jù)本發(fā)明所述的融合蛋白可包含至少兩個源自相同野生型變應(yīng)原的低變應(yīng)原性分子。在這樣的情況下，單一的分子(變應(yīng)原片段)以不同于野生型變應(yīng)原中順序的順序與彼此相融合。這樣的方法防止了低變應(yīng)原性融合蛋白中潛在的IgE結(jié)合位點/表位的重新形成。本發(fā)明的另一個方面涉及編碼本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子和融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可用于例如重組地生產(chǎn)所述分子。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述核酸分子可包含在載體中。該載體優(yōu)選為表達載體。本發(fā)明的另一個方面涉及疫苗制劑，其包含本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子、融合蛋白或抗體。優(yōu)選地，該制劑進一歩包含至少一個佐劑、藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。現(xiàn)今最新的增加免疫反應(yīng)的方法中也有使用特別的載體物質(zhì)例如KLH(鑰孔戚血藍素)。本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子也可融合或結(jié)合至病毒衣殼蛋白，該病毒衣殼蛋白也可用作載體(參見以上)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，所述制劑包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別為0.5嗎至200(ig的所述低變應(yīng)原性分子或抗體。疫苗制劑實質(zhì)上可由本發(fā)明所述的藥物組成(參見以上)。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明所述低變應(yīng)原性分子、融合蛋白或抗體在制備用于治療或預(yù)防個體中過敏癥的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明所述的低變應(yīng)原性分子、融合蛋白和抗體可用于個體的疫苗接種。此疫苗接種可降低或防止由野生型變應(yīng)原所引起的過敏性反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，所述藥物進一步包含至少一個佐劑、藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的藥物包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別為0.5嗎至200嗎的所述免疫原性分子、核酸分子、載體、宿主或抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選具體實施方式，該藥物以0.01mg/kg體重至5mg/kg體重，優(yōu)選為0.1mg/kg體重至2mg/kg體重的量向個體使用。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方式，所述個體具有獲得過敏癥的風險。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明所述低變應(yīng)原性分子、融合蛋白或抗體在診斷個體中的過敏癥或監(jiān)視過敏癥治療過程中的用途。根據(jù)本發(fā)明所述低變應(yīng)原性分子、融合蛋白或抗體不僅可用于藥物也可合適地用于各種診斷目的。例如，這些分子和融合蛋白可通過例如將個體的樣品(包含組胺釋放細胞)暴露于所述多肽而用于診斷過敏癥(參見例如，Purohit等人,Clin.Exp.Allergy35(2005):186-192)。而且，這些分子、融合蛋白和抗體可被固定于表面以形成多肽陣列/芯片。這樣的陣列可用于例如高通量篩選以診斷取自許多個體的許多樣品中的過敏癥。本發(fā)明通過以下圖示和實施例進一步解釋，但是，并不限制于此。圖1A顯示了載體p89VPl的示意性綜述。圖1B顯示了pET-17b載體的多克隆位點和89VP1編碼基因的DNA序列。圖1C顯示了產(chǎn)生核酸融合體三種可能性的示意性代表。圖2顯示了含有經(jīng)純化的89VP1his-標簽化蛋白的經(jīng)考馬斯藍染色的12%的SDS-PAGE凝膠(第1道5叱分子標記；第2-5道1089VP1洗脫樣品)。圖3顯示了對14VP1的IgG識別14VP1和對照的免疫雜交。點通過放射自顯影來顯示(第1-6道以1:500-1:16000稀釋的兔子抗-14VPl抗血清溫育；第7-12道以1:500-1:16000稀釋的免疫前血清溫育)。圖4顯示了小鼠中89VP1特異性IgGl反應(yīng)。以不同的抗原來免疫各組小鼠，如每個箱頂部所示。89VP1特異性IgGl的效價通過ELISA測定，以y-軸上的OD值來表達。結(jié)果顯示為箱線圖(boxplot)，其中50%的值在箱和柱之間的非異常值之內(nèi)。箱內(nèi)的線表明了中位數(shù)。圖5顯示了小鼠中Phlp1特異性IgG反應(yīng)。以不同的抗原來免疫各組小鼠，如每個箱頂部所示。rPhlp1特異性IgGl的效價通過ELISA測定，以y-軸上的光學值(OD405nm)來表達。光學值對應(yīng)于小鼠血清中的IgGl抗體水平。結(jié)果顯示為箱線圖，其中50%的值在箱和柱之間的非異常值之內(nèi)。箱內(nèi)的線表明了中位數(shù)。圖6顯示了經(jīng)免疫小鼠中牧草花粉提取物特異性IgGl反應(yīng)。以不同的抗原來免疫各組小鼠，如每個箱頂部所示。牧草花粉提取物特異性IgGl的效價通過ELISA測定，以y-軸上的光學值(OD405nm)來表達。光學值對應(yīng)于小鼠血清中的IgGl抗體水平。結(jié)果顯示為箱線圖，其中50%的值在箱和柱之間的非異常值之內(nèi)。箱內(nèi)的線表明了中位數(shù)。圖7顯示了通過以所有19個病人的針對rPhlp1、r89P5和KLHP5的抗血清預(yù)溫育而對病人的IgE與rPhlp1結(jié)合的％抑制的平均值。％抑制顯示于y-軸。結(jié)果以柱形圖顯示。圖8顯示了經(jīng)免疫小鼠的脾細胞的增殖。用肽5、89VP1(89)和KLH來刺激經(jīng)不同抗原(如每個箱頂部所示)免疫的小鼠的T細胞。培養(yǎng)液用作參考。在y-軸顯示了刺激指數(shù)。結(jié)果以柱形圖顯示。圖9顯示了在人血清中通過ELISA測定而檢測的IgGl、IgG2、IgG4和IgA對14VP1、89VP1和rPhlp1的反應(yīng)。對于4個89VP1、14VP1及rPWp1特異性抗體測試了IO個病人的血清(如每個箱頂部所示)。在左手邊和右手邊的每個"柱形圖配對"分別顯示了秋季和冬季所取的血清。效價通過ELISA測定，以y-軸上的光學值(OD405nm)來表達。光學值對應(yīng)于人血清中的抗體水平。結(jié)果顯示為箱線圖，其中50%的值在箱和柱之間的非異常值之內(nèi)。箱內(nèi)的線表明了中位數(shù)。圖10顯示了過敏性病人的血清中抗-89VPl和抗-rPhlp1抗體的檢測。對于7個89VP1特異性抗體(每對的左側(cè)柱形圖)和rPhlpl特異性抗體(每對的右側(cè)柱形圖)測試了5個Phlp1過敏性病人的血清。效價通過ELISA測定，以y-軸上的光學值(OD405nm)來表達。光學值對應(yīng)于人血清中的抗體水平。結(jié)果顯示為箱線圖，其中50%的值在箱和柱之間的非異常值之內(nèi)。箱內(nèi)的線表明了中位數(shù)。圖11顯示了抗-14VPlIgG與HRV14蛋白提取物和純化的14VP1的結(jié)合(第1禾口4道5嗎的標記；第2禾n4道病毒提取物；第2禾n5道5嗎的14VP1)。用抗-14VP1免疫血清和免疫前血清分別溫育A雜交和B雜交。通過Western雜交來檢測所結(jié)合的IgG，通過放射自顯影來顯示。圖12顯示了HRV14的中和(第A道(細胞對照)以1:10、1:1()S稀釋的抗-14VP1免疫血清預(yù)溫育HRV14之后的細胞(Al-A6行)；第B道以1:102-1:108稀釋的免疫前血清預(yù)溫育HRV14之后的細胞(B1-B6行)；第C道以HRV1410TCD50-106TCD50溫育之后的細胞(Cl-C6行)；D5:以免疫前血清溫育之后的細胞；D6:以免疫血清溫育之后的細胞)。細胞植板于所有的孔，在三天后以結(jié)晶紫染色。圖13顯示了抗-肽抗血清與完全Phip5變應(yīng)原的IgG反應(yīng)活性。顯示了從6只兔子(每個均以一種KLH偶聯(lián)的肽來免疫)獲得的3個血清樣品(取血l:免疫前血清；取血2-3:月間隔收集的血清樣品)對Phip5的IgG反應(yīng)活性(OD值)。圖14顯示了rPhlp5的變應(yīng)原性活性，以及由CD203c表達所檢測的肽混合物。來自三個Phlp5過敏性病人的肝素化血液樣品以10—4至10pg/mL系列稀釋的重組變應(yīng)原、源自Phlp5的肽的等摩爾混合物、抗-IgE或?qū)φ站彌_液(co，x-軸)進行溫育。然后以CD203cmAb將細胞染色，并在FACScan上分析CD203c的表達。在y-軸上顯示了刺激指數(shù)(SI)。圖15顯示了對源自Phlp5的肽的鑒定，該肽誘導(dǎo)低淋巴增殖反應(yīng)。以不同濃度的肽和用于對照目的的白細胞介素-2(x-軸)刺激來自牧草花粉過敏性病人的PBMC。在y-軸上顯示了刺激指數(shù)(SI)。圖16顯示了源自Feld1的合成肽(其在兔子中誘導(dǎo)Feld1特異性IgG免疫反應(yīng))。以KLH偶聯(lián)的源自Feld1的合成肽或未偶聯(lián)的rFeld1來免疫6只兔子，在月間隔進行取血3-4次。免疫前血清和抗血清針對ELISA板上所結(jié)合的rFeld1的IgG反應(yīng)活性表示為光學密度(O.D.值，y-軸)。圖17顯示了通過敏性病人嗜堿細胞上CD63和CD203c的表達而確定的源自Feld1的合成肽的低變應(yīng)原性活性。以系列稀釋的Fdd1(實心框)或源自Fdd1的合成肽的混合物(空心框)(x-軸)溫育來自5個貓過敏性病人的PBMC。對于病人RR，也用系列稀釋的源自Feld1的合成肽作為單一成分對PBMC進行探測。表面標記CD203c和CD63表達的誘導(dǎo)以平均熒光強度測定，經(jīng)計算的刺激指數(shù)顯示于y-軸。圖18顯示了以KLH偶聯(lián)的源自Betv1的肽處理在致敏小鼠中減少了針對rBetv1的淋巴增殖反應(yīng)。在體外以重組樺樹花粉變應(yīng)原Betv1(白色條形柱)、KLH(黑色條形柱)或肽混合物(灰色條形柱)刺激后培養(yǎng)的脾細胞中測定了T細胞增殖。條形柱代表不同小鼠組別的平均刺激指數(shù)(SI士SD)。圖19顯示了以KLH偶聯(lián)的源自Betv1的肽對初次接受試驗小鼠進行預(yù)防性疫苗接種，在致敏后該肽減少針對rBetv1的淋巴增殖反應(yīng)。圖20顯示了以KLH偶聯(lián)的源自Betv1的肽對初次接受試驗小鼠進行預(yù)防性疫苗接種誘導(dǎo)了Betv1特異性IgG反應(yīng)并為由完全變應(yīng)原誘導(dǎo)的變應(yīng)原特異性IgG反應(yīng)作好了準備。在不同的時間點(x-軸)測定了4個處理組中的針對Betvl的IgG反應(yīng)(OD值:y-軸)。圖21顯示了源自Phlp5的肽(1，2)和變體(la，2b)的IgE反應(yīng)活性IgE結(jié)合能力的對比，使用來自7個草花粉過敏性病人(pl-p7)和來自一個非過敏性個體(NHS)的血清通過使用0.20g/點的點雜交測驗來確定。rPhlp5用作陽性對照，HSA用作陰性對照。以1251標記的抗-人IgE來檢測所結(jié)合的IgE。圖22顯示了源自PWp5的肽(1，2)和變體(la，2b)的淋巴增殖反應(yīng)。以不同濃度的肽和用于對照目的的等摩爾濃度的rPhlp5刺激來自草花粉過敏性病人的PBMC。在y-軸顯示了刺激指數(shù)(SI)。圖23顯示了抗VP1抗體的交叉保護。實施例泰沐p卵KP7游裕遂使用QIAamp病毒RNA試劑盒(Qiagen,Germany)從細胞培養(yǎng)物上清液中提取RNA，然后加入1pi的RNase抑制劑(BoehringerGmbH,Germany)至最終濃度0.01U/pl，這樣來制備用于RT-PCR的病毒貯存樣品。.通過用編碼人類鼻病毒株89(89VP1)的VP1蛋白的cDNA序列替代pET-17b的多克隆位點的Ndel/EcoRI片段來構(gòu)建質(zhì)粒p89VPl(圖1A)。Ndel和EcoRI限制性位點(在pET-17b中)用于插入Asel/EcoRI連接的89VP1，該89VP1在5'末端帶有ATG，在3'末端帶有6個組氨酸，接著是終止密碼子TGA(圖1B)。通過核苷酸測序來確定在pET-17b中插入了89VP1。在Ndel/Asel融合代替Ndel位點后產(chǎn)生了CATAAT，其不能被任何已有酶切割。因此，該位點突變?yōu)镃TTAAG，即AflII的限制性位點。為了再插入一個變應(yīng)原片段，ACCGTT序列在3'末端被突變?yōu)锳CCGGT，即Agel的限制性位點。89VP1的核苷酸序列下面顯示了氨基酸序列。在圖1B中以下劃線顯示了限制性位點。所述AflII和Agel限制性位點以快速改變位點形成突變試劑盒(QuickchangesitemutagenesisKit(Stratagene))產(chǎn)生。因此，如圖1C所示，可在89VP1的5'末端(使用AflII)或3'末端(使用Agel)的剩余限制性位點或同時兩個位點插入基因片段的cDNA，以便于容易純化。因此重組變應(yīng)原片段將在89VP1的N-末端和/或C-末端表達。表l:克隆和突變形成的引物(5'至3')卵m克澄89VP1正向CGGAATTCATTAATATGAACCCAGTTGAAAATTATATAGATAGTGTATTA189VP1反向CGATTAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACGTTTGTAACGGTAA2克蘑效廁AflII正向CTTTAAGAAGGAGATATACTTAAGATGAACCCAGTTG3AflII反向CAACTGGGTTCATCTTAAGTATATCTCCTTCTTAAAG4Agel正向CCTGATGTTTTTACCGGTACAAACGTCCACCAC5Agel反向GTGGTGGACGTTTGTACCGGTAAAAACATCAGG6宴蕭2,殺膨m應(yīng)M凝合節(jié)游/鍵歸雄將以上所描述的方法示例于C-末端Phip1變應(yīng)原片段，即肽5(CVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTAYESK;M.Focke等人FASEBJ(2001)15:2042-4)。用Phip1cDNA(GenBank:X78813)作為模板通過PCR擴增肽5的DNA序歹U(弓l物Phip1正向5'-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3，(SEQIDNo.7);Phip1反向5，陽CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAGGCGGTGTCGGC-3，(SEQIDNo.8))。將PCR產(chǎn)物插入p89VPl載體的AflII限制性位點，得到的構(gòu)建體被稱為載體p89P5和基因產(chǎn)物r89P5。婆'嚴激j,卵PT7嚴5嚴會歪/^,卵PT7游表這,錄眾為了達到89VP1或r89P5(重組89VPl-肽5融合蛋白)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的E.coli在37。C下生長于250ml含有100mg/1氨比西林的LB培養(yǎng)基，生長至0.4的光密度(600nm)，通過加入異丙基-卩-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的最終濃度來誘導(dǎo)蛋白表達。4小時后，通過在4'C和3500rpm56下離心10分鐘來收集E.coli細胞。使用QiagenNi-NTA和柱以Qiagen程序來進行純化。將細胞沉淀在變性條件下重懸于5ml的6M鹽酸胍1個小時。離心(20分鐘，10000xg)后，以1ml的Ni-NTA再溫育上清液1個小時。然后將懸浮液裝柱，以5ml的洗滌緩沖液(8M的尿素，pH6.3)洗滌兩次，然后以4ml的洗脫緩沖液(8M的尿素，pH3.5)洗脫。通過降低尿素的摩爾濃度透析后達到復(fù)原。如圖2所示以SDS-PAGE分析純化蛋白的純度和大小。蛋白帶對應(yīng)于經(jīng)計算的33.6kD的蛋白大小。也通過Western雜交分析(使用抗-組氨酸標簽抗體)確定了蛋白的完整性。劣蕭(-淑免泉被澄彥KP7錄辦好i沐將5叱的14VP1(人類鼻病毒株14的VP1蛋白)和對照(Betv1、Phlp5、BSA)點膜至硝化纖維膜帶。將這些帶暴露于兔子抗-14VPl抗血清(第1-6道)和免疫前血清(第8-12道)的稀釋液。以1:1000稀釋的1251標記的驢抗-兔子IgG檢測所結(jié)合的兔子IgG抗體，并以放射自顯影顯示(圖3)。兔子抗-14VPl血清的點雜交分析表明14VP1有強烈的免疫原性。與免疫前血清和Betv1、Phip5和BSA對照相反，以1:16000稀釋的抗血清仍能檢測到IgG抗體。實嚴翔5,if過虹/M緣定，瘦V、,f^卵py7錄，絲i沐及應(yīng)為了確定89VP1的免疫原性及其作為肽5的載體的能力，以下列抗原免疫六周齡的雌性balb/c小鼠組(CharlesRiver):KLH、KLH馬來酰亞胺偶聯(lián)的肽5(KLHP5)和KLHEDC偶聯(lián)的肽5(KLHP5edc)。通過Imject馬來酰亞胺激活的mcKLH禾口ImjectImmunogenEDCKit(Pierce)進行化學偶聯(lián)。馬來酰亞胺基團與SH基團反應(yīng)，EDC與羧基和氨基基團反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵。每組4只的小鼠以89VP1、r89P5和89P5edc進行免疫，2只以單獨的肽5進行免疫(每只5嗎，與氫氧化鋁1:2混合)。在大約三周間隔內(nèi)通過皮下來免疫小鼠，在尾靜脈取血。通過ELISA確定89VP1特異性IgGl抗體的水平。以5嗎/ml的89VP1包被ELISA板(Nunc)。以1:500稀釋小鼠抗-89VPl、抗-r89P5和肽5血清。以1:1000的大鼠抗-小鼠IgGl(BDPharmingen)，然后以1:2000的POX偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG(AmershamBioscience)檢測所結(jié)合的IgGl。在y-軸顯示了光學值(OD405nm)，對應(yīng)于小鼠血清的IgGl抗體水平(圖4)。KLHP5、KLHP5edc、KLH和肽5用作對照。以89VP1(89VP1、89P5edc和r89P5)注射的小鼠的免疫過程中以增加的效價檢測到了IgGl抗體。以89VP1、r89P5和KLHP5免疫的兔子顯示了相同的結(jié)果。實:MW6.'遞i^虹7&4磁定免度V、嵐^^PWp7錄岸絲拔銀^應(yīng)為了評估以r89P5免疫是否誘導(dǎo)與完全Phlp1反應(yīng)的IgG抗體，使用了如實施例5中描述的同樣的方法和同樣的小鼠血清。以5pg/ml的rPhlp1包被ELISA板并測定了IgGl抗體的效價(圖5)。所有的與KLH或89VP1偶聯(lián)的源自Phip1的肽都在免疫過程中以漸增的反應(yīng)來誘導(dǎo)rPhlp1特異性IgGl抗體。以r89P5和KLHP5免疫的兔子顯示了相同的結(jié)果。婆i激7,/W定發(fā)享花教碧欲激錄弄絲/gG/拔沐如第5部分所述進行了小鼠免疫和ELISA分析。將全牧草花粉提取物包被于ELISA板(100嗎/ml)，并確定了IgGl抗體的效價(圖6)。三次免疫后可在以肽5免疫的小鼠中檢測到提取物特異性IgGl抗體。類'/f,/g,^子i-r卵戶5叛謬淑欽諒乂游/g五與r/Wp7游禁合為了確定肽誘導(dǎo)的兔子Ig的抑制過敏性病人的IgE抗體與rPhlp1結(jié)合的能力，以1pg/ml的rPhlp1包被ELISA板，洗滌并封閉。板以I:IOO稀釋的兔子抗-肽(89P5,KLHP5)、兔子抗rPhlp1以及用于對照目的的相應(yīng)的免疫前血清進行預(yù)溫育。洗滌以后，板以來自Phlpl過敏性病人的(l:3稀釋的)人血清進行溫育，以小鼠抗-人IgE(Pharmingen1:1000)，然后以1:2000的POX偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠IgG(AmershamBioscience)來檢測所結(jié)合的IgE。按照如下計算經(jīng)抗-肽抗血清預(yù)溫育而達到的對IgE結(jié)合的抑制百分率100-ODi/ODpx100。OD,和ODp分別代表以兔子免疫血清和免疫前血清預(yù)溫育后的消光度。表2顯示了抗-Phlp1肽抗體抑制19個過敏性病人的IgE與完全rPhlp1結(jié)合的能力。圖7顯示了所有的抗-rPhlp1、抗-r89P5和抗-KLHP5免疫血清的平均抑制(以％表示)。抗-肽血清比rPhlp1更好的阻斷了IgE的結(jié)合。抑制能力與89P5和KLHP5幾乎一樣。表2顯示了所有19個病人的抑制(以％表示)。表2:以兔子抗-rPhlp1、r89P5和抗-KLHP5抗血清溫育后19個病人的IgE與rPhlpl結(jié)合的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實細p.-叛腳激V、嵐,細后游r潘淑激以KLH、KLHP5和KLHP5edc免疫每組三只小鼠。以89VP1、r89P5和89P5edc免疫每組4只小鼠四次，以單獨的肽5免疫2只小鼠(每只5嗎)。最后一次免疫IO天后取出脾細胞，在96孔板中以三次重復(fù)用肽5(P5)、89VP1、KLH和分別作為陽性對照和陰性對照的ConA和培養(yǎng)液來刺激單獨的細胞培養(yǎng)物。四天后向每個孔中加入放射性[3司胸苷0.5^Ci。然后在15小時后用Packard細胞收集器收集細胞至imifilter板。用(3計數(shù)器測定細胞相連的放射活性。計算了刺激指數(shù)并顯示于y-軸。在x-軸上顯示了用于剌激的抗原。每個框代表用于免疫小鼠的抗原的數(shù)據(jù)(圖8)。所有超過2的值作為陽性。經(jīng)KLH和KLHP5免疫的小鼠只有當以KLH刺激時是陽性的，肽5小鼠是完全陰性的。對應(yīng)于ELISA結(jié)果，KLHP5edc組也是陰性的。來自經(jīng)r89P5、89P5edc和89VP1免疫小鼠的細胞只有當以89VP1刺激后增殖。初次接受試驗的對照小鼠在所有的情況下沒有表現(xiàn)出增殖。這些結(jié)果表明T細胞表位是由載體89VP1而不是由肽5提供的。婆:MW70.'檢##季浙冬季獲淳游乂虛/,^游"P7V-、/〃riWPJ錄微拔沐在秋季從五個隨機選取的個體中取血清，冬季五個。通過ELISA確定了針對14VP1、89VP1和rPhlp1的IgGl、IgG2、IgG4和IgA抗體水平，如實施例5中所述。以1:1000用1:2000POX偶聯(lián)的綿羊抗小鼠IgG(AmershamBioscience)來檢測人IgGl、IgG2、IgG4和IgA(BDPharmingen)。在取自秋季和冬季的血清中可檢測到抗-14VPl和89VP1IgGl高效價(圖9)?？?rPhlp1IgGl抗體效價相比較很低。IgG2、IgG4和IgA抗體可在所有的情況下檢測到，水平非常低。不同HRV株的VP1蛋白緊密相關(guān)，在其他的研究中已表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性。實'嚴翔〃，/i^敏絲瘋乂游宛-砂FiV/〃i層riWp7貧沐獲取了五個Phlp1過敏性病人的血清，如實施例5所述進行了ELISA實驗。以rPhlp1和89VP1包被ELISA板，確定了特異性IgM、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgE抗體效價(圖10)?？蓹z測到比抗-rPhlp1IgGl抗體更多的抗-89VPlIgGl抗體。實嚴夠J2:遞過腸加r",雜交分,澄^/貧-"FW^沐與全裙毒游茲合通過使用全HRV14病毒(第2禾口5道)和作為對照的5pg的純化的14VP1(第3禾B6道)來確定經(jīng)14VPl注射兔子血清中的IgG抗體與全病毒的結(jié)合。以12%的SDS-Page分離病毒提取物并點膜至硝化纖維膜。測試了1:500的兔子抗-14VP1抗血清(第1-3道)和1:500的免疫前血清(第4-6道)與HRV14和14VP1的結(jié)合。以125I標記的驢抗-兔子抗體檢測了所結(jié)合的IgG，通過放射自顯影顯示(圖ll)?？稍谂c14VP1相同的大小處(33.6kD)檢測到14VPl-抗血清的結(jié)合。實應(yīng)-萍"，拔-"^7V拔沐#完',游乂類#諒毒〃游吵/〃確定了HRV14的組織培養(yǎng)半劑量50(TCD50)。因此，在MEM-Eagle，1%FCS和40mMMgCl2中進行了1:102至1:108的病毒稀釋，在24孔板于34。C下5%C02加濕的空氣屮和HeLaOhio細胞一起溫育三天。也展丌了無病毒的對照。三天后通過結(jié)晶紫顯示病毒的毒性效應(yīng)，計算了TCD50(引起50%細胞死亡的稀釋)。在34t:下溫育行A和B中的血清稀釋液和病毒U00TCD50)。兩小時后在所有的孔中展開細胞。D5和D6是血清對照。在圖12中顯示了實驗計劃。三天后以結(jié)晶紫檢測了抗體的中和效應(yīng)(圖12)。婆:#辨"，源—^尸W。5游會成就游特絲使用IIBTU-激活(0.1mmol小級別循環(huán))以Fmoc策略在AppliedBiosystems肽合成器Model433A上合成了肽，如Focke等人FasebJ(2001)15:2042所述。在對Phip5變應(yīng)原進行了深度分析后，制備了六個源自Phip5的肽，這些肽在長度上介丁-31(Pl:3026道爾頓)至38(P6:3853道爾頓)個氨基酸，富含暴露于溶劑的氨基酸(表3)。這些肽具有介于4.32至8.98的等電點，其中三個(肽3、4和6)可含有人T細胞表位。表3.非變應(yīng)原性的源自Phip5的合成肽的特性。顯示了位置(相對于Phip5分子)、序列、長度、分子量(MW)，等電點(pl)和源自Phip5肽的T細胞表位的存在性。以黑體和下劃線標示了所加入的半胱氨酸殘基(為了促進偶聯(lián))。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>/5..i&iW/75游嚴疑少/gEf應(yīng)舒絲^^嚴絲^/#15.1缺少IgE反應(yīng)活性為了分析六個源自Phip5的肽的IgE反應(yīng)活性，使用來自29個草花粉過敏性病人的血清通過ELISA對分離的和KLH偶聯(lián)的源自Phip5的肽的IgE結(jié)合能力與完全rPhlp5的IgE結(jié)合能力進行了比較(表4)。表4:29個草花粉過敏性病人和1個非變應(yīng)原性對照的血清學特性。性別、年齡、總血清IgE水平(kU/L)、牧草提取物特異性IgE(kUA/L)、對rPhlp5特異性的IgE抗體和6個分離的(Pl至P6)禾nKLH偶聯(lián)的(KLH-P1至KLh-P6)肽(通過ELISA測定)，顯示了OD(光密度)。破折號表示對分離的和KLH偶聯(lián)的肽缺少IgE反應(yīng)活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>CA)來檢測所結(jié)合的IgE抗體?？侷gE水平和草花粉提取物特異性IgE分別介于24.9至2000kU/L(平均262.7)和2.2至100kUA/L(平均41.5)。所有的病人都含有rPhlp5特異性IgE抗體，介于0.157至2.530OD單位(平均1.082OD單位)，但是29個病人中沒有一個顯示出對任何肽(P1-P6)或肽的等摩爾混合物的IgE反應(yīng)活性(OD《0.08)。這個結(jié)果證明沒有血清是含有可檢測的對六個源自PWp5肽中任一個有特異性的IgE抗體。15.2.由嗜堿細胞上CD203c表達所檢測的減少的變應(yīng)原性活性嗜堿細胞的激活和流式細胞術(shù)CD203c的上調(diào)已被描述為變應(yīng)原誘導(dǎo)的嗜堿細胞激活和脫粒的代理標志(Hauswirth等人，JAllergyClinImmunol2002;110:102)。因此，通過測定草花粉過敏性病人的嗜堿細胞上CD203c的上調(diào)比較了完全rPhlp5變應(yīng)原和肽的等摩爾混合物的變應(yīng)原性活性。在獲得知會同意之后，從三個過敏性捐贈人取得了外周血細胞。以系列稀釋的重組變應(yīng)原(10—4至10ng/ml)、抗-IgE抗體(1pg/ml)或?qū)φ站彌_液(磷酸鹽緩沖鹽水-PBS)在37"下溫育肝素化血液等分試樣(100pi)15分鐘。溫育后，以含有20mMEDTA的PBS洗滌細胞。然后以10piPE偶聯(lián)的CD203cmAb97A6在室溫(RT)下溫育細胞15分鐘。然后，以2mL的FACSTM裂解溶液將紅血球裂解。然后洗滌細胞，重懸于PBS，并在FACScan(BectonDickinson)上用二色流式細胞術(shù)使用Paint-a-Gate軟件分析。變應(yīng)原誘導(dǎo)的CD203c的上調(diào)通過平均熒光強度(MFI)(由經(jīng)刺激的(MFIstim)和未刺激的(MFIcontrol)細胞獲得)來計算，并表達為刺激指數(shù)(MFIstim:MFIcontrol)。SI》2.0(》2倍上調(diào))被認為是特異性反應(yīng)的指征。如圖14中所示，發(fā)現(xiàn)在致敏個體中完全rPhlp5表現(xiàn)出外周血嗜堿細胞上CD203c的表達的劑量依賴性(10—4至10ng/ml)增長，而肽的等摩爾混合物沒有表現(xiàn)出效應(yīng)。對來自草花粉過敏性病人的嗜堿細胞上CD203c表達的確定表明以源自Phlp5的肽觀察不到變應(yīng)原性活性。婆:MW".-以i^戶/z/p5游l兗疫遂導(dǎo)7與riWp5浙來^石/^草#游天然變應(yīng)凝應(yīng)游/gG拔沐16.1.重組變應(yīng)原和變應(yīng)原提取物在E.Coli中表達了純化的重組Phlp5，如Vrtala等人(JofImmunol(1993)151:4773-4781)所描述。從AllergonPharmacia(Sweden)獲得了來自梯牧草(Phleumpmtense)、多年生黑麥草(Loliumperenne)、草地早熟未(Poapratensis)、鴨茅(Dactylisglomerata)、黑麥(Secalecereale)、小麥(Triticumaestivum)、燕麥(Avenasativa)、大麥(Hordeumvulgare)、黃花茅(Anthoxanthumodoratum)的草花粉，制備了水性花粉提取物，如Vrtala等人(IntArchAllergyImmunol(1993)102:160-9.)所描述o16.2.兔子的免疫根據(jù)生產(chǎn)商的建議，將HPLC純化的肽偶聯(lián)至KLH(鑰孔戚血藍素，MW4,5xl03-1.3xl07，Pierce,USA)，使用ConjugationKit(Sigma,USA)進行純化。以每個KLH偶聯(lián)的肽(200嗎/注射)和用于對照目的的完全rPhlp5使用弗氏完全佐劑和不完全佐劑(CharlesRiver)將兔子免疫。在四周間隔內(nèi)取得血清樣n叩016.3.兔子抗體與完全rPhlp5和來自不同草種的天然變應(yīng)原的反應(yīng)活性為了研究以KLH偶聯(lián)的肽免疫之后所誘導(dǎo)的抗體是否能夠識別rPhlp5、天然Phip5和來自其他草花粉種的Phip5相關(guān)草花粉變應(yīng)原，進行了ELISA實驗。為了進行ELISA檢測，板(NuncMaxisorp,Denmark)以花粉變應(yīng)原提取物(100pg/ml:梯牧草、多年生黑麥草、草地早熟禾、鴨茅、黑麥、小麥、燕麥、大麥、黃花茅)或純化的重組變應(yīng)原(5(ag/ml:rPhlp5)進行包被。洗滌ELISA板并封閉，接下來以兔子抗-肽抗血清和1:2500稀釋的相應(yīng)的免疫前血清進行溫育。以HRP偶聯(lián)的山羊抗-兔子Ig抗血清(JacksonImmunresearch,Pennsylvania)檢測所結(jié)合的兔子IgG。結(jié)果代表兩次重復(fù)測定的平均，其誤差<5%(圖13，表5)。表5:抗-Phlp5肽抗血清與rPhlp5和來自梯牧草、多年生黑麥草、草地早熟禾、鴨茅、黑麥、小麥、燕麥、大麥、黃花茅的天然第5組變應(yīng)原的交叉反應(yīng)活性。顯示了經(jīng)過KLH偶聯(lián)的源自Phlp5的肽(P1至P6)免疫的六只兔子中肽抗血清(抗-Pl至抗-P6)與Phlp5和來自草花粉的花粉提取物的IgG反應(yīng)活性(OD值)。抗-肽抗血清與rPhlp5和草花粉提取物的交叉反應(yīng)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>16.4.以源自Phip5的肽免疫誘導(dǎo)了交叉反應(yīng)性IgG抗體以每個肽免疫誘導(dǎo)了有力的Phip5特異性IgG反應(yīng)，其在第一次免疫四周后可檢測到，在第二次免疫后增加(圖13)。以肽2免疫誘導(dǎo)了最高的PWp5特異性IgG反應(yīng)，接下來是肽6、4、5禾tU，肽l誘導(dǎo)了最低的反應(yīng)。除了抗-肽l抗體(其缺少與第5組變應(yīng)原中多年生黑麥草、草地早熟禾、鴨茅、黑麥和大麥的反應(yīng)活性)之外，其他的肽抗血清均與每個所測的草花粉提取物有交叉反應(yīng)(表5)。實i,/77,以蕭^P/z/p5游,免資誘導(dǎo)7^",劍享論教謹敏絲MX游/g五與JWp5茲合游/gG貧沐17.1.肽特異性IgG對過敏性病人的IgE與rPhlp5a結(jié)合的抑制關(guān)于肽誘導(dǎo)阻斷抗體的能力的信息是重要的，因為已表朋阻斷抗體在免疫治療中扮演重要角色。為了檢測肽誘導(dǎo)的兔子Ig的抑制過敏性病人的IgE與完全rPhlp5結(jié)合的能力，使用來自29個草過敏性病人的血清進行了競爭性ELISA實驗。以rPhlp5(1嗎/ml)包被ELISA板，并以1:250稀釋的每個抗-肽抗血清(抗-P1至抗-P6)、抗-肽抗血清混合物、抗-rPhlp5抗血清或者用于對照目的的相應(yīng)的免疫前血清或免疫前血清混合物進行預(yù)溫育。洗滌后，板以l:3稀釋的來自29個草花粉過敏性病人的血清溫育，以堿性磷酸酶偶聯(lián)的小鼠單克隆抗-人IgE抗體(Pharmingen)來檢測所結(jié)合的IgE抗體。按照如下計算經(jīng)抗-肽抗血清預(yù)溫育而達到的對IgE結(jié)合的抑制百分率IgE結(jié)合的。/。抑制400-ODi/ODpx100。OD,和ODp分別代表以兔子免疫血清和免疫前血清預(yù)溫育后的消光度。以肽誘導(dǎo)的兔子IgG預(yù)溫育Phip5在不同程度上抑制了過敏性病人IgE反應(yīng)活性。對IgE結(jié)合的平均抑制程度介于19.3%(抗-肽6IgG)至28.5%(抗-肽1IgG)。針對完全Phip5獲得的兔子抗體誘導(dǎo)了對IgE結(jié)合平均43.6%的抑制。表6:兔子抗-Phlp5抗血清抑制牧草花粉過敏性病人的血清IgE與Phip5的結(jié)合。顯示了對Phlp5用抗-肽抗血清(抗-Pl至抗-P6)、六個抗-肽抗血清(抗-Pl-P6)的混合物或抗-rPhlp5抗血清進行預(yù)溫育之后，每個病人的IgE與Phip5結(jié)合的抑制百分率。在最底行顯示了平均抑制百分率。N.d.:未做。特異性抗血清對lgE與Ph1p5結(jié)合的。/。抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>實:MW7^p5游嚴誘導(dǎo)瓶待^絲游沐g譜遭^應(yīng)18.1.淋巴增殖測試為了鑒定具有最低可能的T細胞反應(yīng)活性的肽(為了使治療相關(guān)的副作用最小化)，通過淋巴增殖測試檢測了T細胞反應(yīng)活性。從兩個草花粉過敏性病人中通過Ficoll(AmershamPharmaciaBiotech,UK)密度梯度離心分離了外周血單核細胞(PBMC)。以三次重復(fù)方式在96孔板(Nunclone;NalgeNuncInternational,Denmark)中在37。C下5%C02加濕的空氣中以200pi的無血清UltraCulture培養(yǎng)液(BioWhittaker,Rockland,ME，培養(yǎng)液以2mML-谷氨酸(SIGMA,USA),50卩-巰基乙醇(SIGMA)和每毫升0.1mg的慶大霉素(Sigma)補充)來培養(yǎng)PBMC(2xl05)。用不同濃度的合成肽(每孔1.25、0.6和0.3pg)和用于對比的每孔4U白細胞介素-2(BoehringerMannheim,Germany)以及單獨的培養(yǎng)液來刺激細胞。培養(yǎng)6天后每孔加入0.5nCi的[3印胸苷(AmershamPharmaciaBiotech),16小時后使用微貝塔閃爍計數(shù)器(WallacADL,Germany)通過液體閃爍計數(shù)來測定所引入的放射活性。從三次重復(fù)計算出平均cpm，從抗原或白細胞介素-2刺激與未刺激的對照所獲得的cpm的商作為刺激指數(shù)(SI)。以不同濃度的合成肽刺激來自牧草花粉過敏性病人的PBMC。以肽刺激的刺激指數(shù)顯著性低于以IL2刺激的。源自Phlp5的肽誘導(dǎo)了低特異性淋巴增殖反應(yīng)。最低的反應(yīng)出現(xiàn)于肽5，然后是肽4。総"7游會成扁錄絲為了獲得適合于貓過敏癥疫苗接種的肽，根據(jù)Feld1的已知氨基酸序列設(shè)計了五個肽，這五個肽長度為30至36個氨基酸，并且覆蓋了全分子。使用HBTU[2-(lH-苯并三唑-l-基)1，1,3,3四甲基脲六氟磷酸]-激活(0.1mmol小級別循環(huán))以Fmoc(9-芴甲氧羰基)策略在AppliedBiosystems肽合成器Model433A(USA)上合成了肽。預(yù)裝的PEG-PS(聚乙烯乙二醇聚苯乙烯)樹脂(0.15-0.2mmol/g裝載)(PerSeptiveBiosystems,UK)用作固相以建立起肽?；瘜W物質(zhì)從AppliedBiosystems購買。通過在反饋控制系統(tǒng)中監(jiān)視傳導(dǎo)性來確定氨基酸的結(jié)合。向肽1、3、4和5加入一個半胱氨酸殘基以促進其與載體的偶聯(lián)(表7)。用250pi蒸餾水、250(Jtriisopropylsilan(Fluka,Switzerland)、9.5mlTFA的混合物從樹脂中切割肽2小時，在叔丁基甲基醚(Fluka,Switzerland)中進行沉淀(Focke2001)。通過質(zhì)譜檢測肽的特性，通過制備性HPLC(PiChem,Austria)將肽純化至>90%的純度。表7:源自Feld1的合成肽的分子特性。顯示了源自Feld1的合成肽在天然Feldl分子內(nèi)的位置、氨基酸序列、氨基酸數(shù)目、經(jīng)計算的分子量(MW)和理論等電點(pl)。所有的肽在水中可溶。廠位置氨基酸序列aa長度MWPi肽1SEQIDNo.15鏈l,aal-34telCPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPWC3539114.30肽2SEQIDNo.16鏈l,aa35-70LENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLC3640834.72肽3SEQIDNo.17鏈2,aal-34VKMAITCPIFYDVFFAVANGNEIXLDLSLTKVNAC3538354.56肽4SEQIDNo.18鏈2，aa35-63TEPERTAMKKIQDCYVENGL[SRVLDGLVC3033824.93肽5SEQIDNo.19鏈2,aa64-92CMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR3032464.78五個源自Feld1的合成肽具有介于3246至4083道爾頓的分子量，具有4.30至4.93的經(jīng)計算的等電點。所有的五個肽均為水溶性的，肽l、2和3可能含有人T細胞表位(表7)。表8.與rFeld1相比源自Feld1的合成肽具有減少的IgE反應(yīng)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>與wg/J7淑M象^d/游會y^it^夯凝'少游/g五《應(yīng)活絲#^嚴^Fe"7游^成嚴欽,變應(yīng)嚴絲活絲為了鑒定適合于疫苗接種的低變應(yīng)原性肽，研究了血清IgE對源自Feld1的合成肽的反應(yīng)活性。對IgE介導(dǎo)的貓過敏癥的診斷是基于既往病歷、刺皮測試(Allergopharma,Reinbek,Germany)和對血清總IgE以及貓皮屑特異性血清IgE的測定(CAP-FEIA,PharmaciaDiagnostics,Sweden)。包括了用于對照目的的非過敏性人員。20.1.在ELISA測試中檢測的IgE結(jié)合能力使用來自14個貓過敏性病人的血清對五個源自Feld1的合成肽的IgE結(jié)合能力與完全rFeld1變應(yīng)原進行了比較。ELISA板(NuncMaxisorb,Denmark)以源自Feld1的合成肽或作為對照的rFeld1(0.5^g/孔)進行包被，洗滌然后封閉。然后以1:5稀釋的來自貓過敏性病人和非過敏性個體的血清在4'C下進行溫育過夜。所結(jié)合的IgE抗體用1:2500稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗-人IgE抗體(KPL,USA)進行檢測。對來自7個女性和7個男性貓過敏性病人(年齡為22至75歲)的血清進行CAP-FEIA確定。所測的總IgE水平介于122至>4000kU/1，貓皮屑特異性IgE水平介于1.99至>100kUA/1(表7)。在ELISA測試中，確定了所測的所有14個血清對主要貓變應(yīng)原Feld1的IgE反應(yīng)活性。以光密度(OD)獲得結(jié)果，其介于0.178至2.838OD單位。在相同的ELISA測試中測定了14個血清對源自Feld1的合成肽的IgE反應(yīng)活性。發(fā)現(xiàn)肽1、2、3和5保留了IgE結(jié)合。對于肽1來說觀察到的IgE結(jié)合為6/14血清，對于肽2為3/14血清，對于肽3為1/14血清，對于肽5為10/14血清。所測的OD單位對于肽1來說介于0.051至1.998之間，對于肽2來說介于0.060至0.123，對于肽3為0.186，對于肽5來說介于0.056至0.677。總之，所測的所有OD單位均顯著性低于各自的相對于完全Feld1變應(yīng)原所測的值。這證明了與完全Feld1變應(yīng)原相比，源自Fdd1的合成肽具有減少的IgE反應(yīng)活性。因此，源自Fddl的合成肽可認為是低變應(yīng)原性的，當在SIT中使用時，其提供了減少的IgE介導(dǎo)的副作用的優(yōu)點。20.1.對人嗜堿細胞上的表面標記CD203c和CD63表達的特異性誘導(dǎo)(圖17)由于IgE結(jié)合是誘導(dǎo)1型過敏性反應(yīng)的先決條件，但不足以誘導(dǎo)1型過敏性反應(yīng)，1型過敏性反應(yīng)還需要與效應(yīng)細胞結(jié)合的特異性IgE的交聯(lián)，所以在嗜堿細胞激活測試中研究了源自Feld1的合成肽的實際變應(yīng)原性活性。這些測試檢測到表面標記CD203c和CD63的變應(yīng)原特異性上調(diào)，CD203c和CD63二者均被識別為嗜堿細胞激活的標記(Hauswirth等人JAllergyClinImmunol.(2002)110:102-109)。在獲得知會同意之后，從5個貓過敏性病人取得了肝素化血液樣品。以系列稀釋的rFeld1、源自Feld1的合成肽作為單獨成分或作為等摩爾混合物、抗-IgE抗體或緩沖液(PBS)在37'C下對血液等分試樣(100|al)進行溫育15分鐘。溫育之后，在含有20mMEDTA的PBS中洗滌細胞。然后以10piPE偶聯(lián)的CD203cmAb97A6和20pl的FITC偶聯(lián)的CD63mAbCLB-gran12在室溫下對細胞進行溫育15分鐘。然后，將樣品以2mlFACSTM裂解溶液進行紅血球裂解。然后洗滌細胞，重懸于PBS，并在FACScan(BectonDickinson)上用二色流式細胞術(shù)使用Paint-a-Gate軟件分析。變應(yīng)原誘導(dǎo)的CD203c和CD63的上調(diào)通過平均熒光強度(MFI)(由經(jīng)刺激的(MFIstim)和未刺激的(MFIcontrol)細胞獲得)來計算，并表達為刺激指數(shù)(MFIstim:MFIcontrol)。SI大于2.0(即大于2倍上調(diào))被認為是特異性(診斷性)反應(yīng)的指征。在所研究的所有五個貓過敏性病人(RR、EB、KC、MG和SM)的嗜堿細胞上，以rFdd1刺激均誘導(dǎo)了表面標記CD203c和CD63的變應(yīng)原特異性上調(diào)。在5個病人中的4個(RR、KC、MG和SM)中觀察到CD203c和CD63的上調(diào)為劑量依賴性的。對于這些病人來說對于所測的最低濃度(0.001ngrFeldl/ml),CD203c刺激指數(shù)為1.1(SM)至3.2(RR);對于所測的最高濃度(10嗎的rFeldl/ml)，CD203c刺激指數(shù)為3.6(KC)至6.2(RR)。在同樣的測試中所確定的CD63的刺激指數(shù)對于所測的rFeld1的最低濃度(0.001昭rFeld1/ml)為介于1.1(RR)至2.0(MG);對于所測的rFeld1的最高濃度(10昭的rFeld1/ml)為介于3.9(RR)至7.3(MG)。對于病人EB來說，0.001嗎/ml的Feld1已經(jīng)足以誘導(dǎo)表面標記CD203c和CD63的高水平的上調(diào)，從而防止觀察到表面標記上調(diào)的劑量依賴性。以五個漸增的濃度(0.005、0.05、0.5、5和50嗎/ml)的五個源自Feldl的合成肽的等摩爾混合物對來自所有的五個貓過敏性病人的嗜堿細胞進行探測。另外以五個漸增濃度(0.001、0.01、0.1、l和10嗎/ml)的五個單獨的源自Feld1的合成肽對病人RR的嗜堿細胞進行探測。發(fā)現(xiàn)肽在上調(diào)表面標記CD203c和CD63上是缺陷的。肽不能夠誘導(dǎo)病人RR、KC和SM的CD203c和CD63表達的任何增加。對于病人MG可檢測到CD203c(SI=2.3)和CD63(SI=2.5)輕微的上調(diào)，但是僅限于所測的最高濃度(50pg肽混合物/ml)，而所用的最低濃度也沒有刺激效應(yīng)。對于病人EB觀察到更為有力的CD203c(SI=4.2)和CD63(SI=4.3)的上調(diào)，但是，仍然是只對所測肽混合物的最高濃度。在這兩種情況下(病人MG和EB)，以肽刺激后的上調(diào)率均比相應(yīng)的以完全Fdd1變應(yīng)原刺激后的顯著性降低。這證明了源自Fdd1的合成肽提供了比完全Feld1變應(yīng)原具有較低的變應(yīng)原性活性的優(yōu)點。當在SIT中使用源自Feld1的合成肽時，這與減少IgE介導(dǎo)的副作用風險相關(guān)。寞'嚴激"，議i^Fg/J/游會成嚴應(yīng)處誘導(dǎo)7與完全rFe/d7f應(yīng)游/gGi#源自Fdd1的合成肽在IgE結(jié)合方面表現(xiàn)為缺陷的。作為疫苗接種(目的是誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性IgG抗體)的候選分子，肽必須保持特異性的變應(yīng)原結(jié)構(gòu)并且必須仍然能夠誘導(dǎo)對完全變應(yīng)原特異性的IgG免疫反應(yīng)。為了找出源自Feld1的合成肽是否滿足這些要求，在兔子中進行了免疫實驗。以未經(jīng)偶聯(lián)的rFdd1和KLH偶聯(lián)的源自Feld1的合成肽對兔子進行免疫。使用Imject馬來酰亞胺激活免疫原偶聯(lián)試劑盒(ImjectMaleimideActivatedImmunogenConjugationKit)(Pierce,USA)，通過它們的半胱氨酸殘基將經(jīng)HPLC純化的肽偶聯(lián)至KLH。使用CFA(第一次免疫)和IFA(4周后第一次推進性注射；7周后進行帶有不完全佐劑的第二次推進性注射)(CharlesRiverBreedingLaboratories,Germany)以免疫原(200嗎/注射)對兔子(NewZealandWhiterabbits)進行免疫。在第一次免疫8周后然后在4周間隔內(nèi)對兔子進行取血。在ELISA測試中監(jiān)視肽特異性和rFeld1特異性抗體的誘導(dǎo)。ELISA板(NuncMaxisorb,Denmark)以rFeld1(0.5嗎/孔)進行包被，洗滌并封閉。然后用1:1000稀釋的兔子抗血清和相應(yīng)的兔子免疫前血清以兩次重復(fù)的方式對板上所結(jié)合的rFdd1進行探測，以1:2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗-兔子抗血清(JacksonImmunoResearchInc.,USA)對所結(jié)合的IgG進行探測。計算兩次重復(fù)的平均值，顯示出小于5%的誤差。以源自Feld1的合成肽進行的免疫誘導(dǎo)了與Feld1反應(yīng)的IgG抗體。以五個源自Fdd1的合成肽中的每個進行第一次免疫八周之后，可在五個兔子抗血清中的每個里面檢測到與完全Feld1變應(yīng)原反應(yīng)的IgG抗體。在接下來的取血中IgG抗體水平保持了相當?shù)乃?圖16)?？?肽1、抗-肽2、抗-肽4和抗-肽5兔子抗血清在與抗-Feld1兔子抗血清大約相同的程度上表現(xiàn)出對Feld1的IgG反應(yīng)活性?？?肽3兔子抗血清也表現(xiàn)出明顯的但有些低的對Feld1的IgG反應(yīng)活性。這表明所有的5個源自Feld1的合成肽均為誘導(dǎo)Feld1特異性IgG抗體反應(yīng)的候選分子。,嚴^fe/游^^g,誘導(dǎo)MFe/d/麥諒游沐^潛jn應(yīng)所需要的用于改善的SIT的候選分子不僅提供減少的IgE介導(dǎo)的副作用的優(yōu)點，而且有減少的T細胞介導(dǎo)的副作用的優(yōu)點。為了研究源自Fddl的合成肽的T細胞激活特性，進行了淋巴增殖測試。通過Ficoll(AmershamPharmaciaBiotech,UK)密度梯度離心從7個貓過敏性病人中分離了PBMC。以三次重復(fù)方式在96孔板(Nimclone,NalgeneNuncInternational,Denmark)中在37。C下5%C02加濕的空氣中以200pi的無血清UltraCulture培養(yǎng)液(Cambrex,Belgium,培養(yǎng)液以2mML-谷氨酸(Sigma,USA),50(iM卩-巰基乙醇(Sigma)和每毫升0.1mg的慶大霉素(SIGMA)補充)來培養(yǎng)PBMC(2xl05)。以不同濃度(5、2.5、1.25和0.6昭/孔)的rFeld1和源自Feld1的合成肽作為單獨成分或作為等摩爾混合物以及用作對照目的的4U白細胞介素-2或單獨的培養(yǎng)液來刺激細胞。培養(yǎng)6天后每孔加入0.5|iCi的31€-胸苷(AmershamPharmaciaBiotech)，16小時后使用微貝塔閃爍計數(shù)器(WallacADL,Germany)通過液體閃爍計數(shù)來測定所引入的放射活性，從三次重復(fù)計算出平均cpm。從抗原或白細胞介素-2刺激與未刺激的對照所獲得的cpm的商作為刺激指數(shù)(SI)。IL-2刺激了來自所測的所有7個貓過敏性病人的PBMC的增殖，產(chǎn)生的刺激指數(shù)對RR為9.8，對EB為5.2，對KC為3.2，對MG為6.7，對SM為6.3，對RA為15.7以及對AR為13.9。源自Fddl的合成肽誘導(dǎo)了較低的刺激指數(shù)(表9)。表9:可鑒定源自Feld1的合成肽(基于等摩爾)誘導(dǎo)了比Feld1較弱的淋巴增殖反應(yīng)。以系列稀釋的rFdd1或源自Feld1的合成肽作為單獨成分對來自771個貓過敏性病人的PBMC進行刺激。以刺激指數(shù)顯示特異性淋巴增殖反應(yīng)。5fig/w2.5ng/w1.25pg/w0.6fig/w病人RRrFeld12.61.81.51.9肽l1.90.61.31.5肽22.11.32.01.6肽33.52.82.03.0肽42.52.41.50.8肽51.70.92.30.7病人EBrFeld18.22.91.61.5肽l1.30.91.01.2肽22.41.71.81.6肽31.11.21.41.7肽43.63.63.22.3肽52.22.11.42.1病人KCrFeld10.81.21.35.2肽l0.71.01.11.1肽21.21.51.01.1肽30.60.50.50.6肽41.61.41.31.1肽51.3L40.91.4病人MGrFeld12.92.32.32.2肽l1.81.41.41.1肽21.21.31.40.9肽31.10.50.60.7肽4U1.51.81.0肽51.51.21.60.8病人SMrFeld12.31.61.81.1肽l1.11.00.81.0肽21.81.11,31.2肽32.62.12.11.5肽41.91.61.71.1肽52.31.31.41.0病人RArFeld13.21.22.41.2肽l0.80.71.31.1肽21.20,51.71.6肽32.02.31.60.9肽43.01.3Ll0.6肽50.40.60.90.9病人ARrFeld11.40.60.91,0肽l1.00.51.70.7肽20.70.60.90.6肽31.61.62.11.0肽41.00.70.70,6肽50.80.50.30.5實窗翔"，"jr^^/w游^成嚴兗疫,遂導(dǎo)游/gG^沐漸敘漱過敏絲嫁乂游誠與趙i^/w變應(yīng)廁茲合在ELISA競爭測試中檢測了肽誘導(dǎo)的兔子Ig抑制過敏性病人的IgE抗體與完全rFeld1結(jié)合的能力。ELISA板(NuncMaxisorb，Denmark)以rFeld1(0.05昭/孔)進行包被，洗滌并封閉。然后以1:100稀釋的兔子抗-肽抗血清(使用了單獨的抗-肽抗血清以及抗-肽抗血清的混合物)、兔子抗-rFeld1抗血清和用于對照目的的相應(yīng)的兔子免疫前血清對板上所結(jié)合的rFdd1進行預(yù)溫育。在對板進行洗漆后，以1:5稀釋的來自貓過敏性病人的人血清對它們進行溫育。以1:2500稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗-人IgE抗體(KPL,USA)來檢測所結(jié)合的IgE。按照如下計算經(jīng)抗-肽抗血清預(yù)溫育而達到的對IgE結(jié)合的抑制百分率IgE結(jié)合的％抑制=100-O.DVO.D.px100，其中O.D.!為以兔子免疫血清預(yù)溫育后所測的光密度，O.D.p為兔子免疫前血清預(yù)溫育后所測的光密度。以5個抗-肽兔子抗血清預(yù)溫育ELISA板上所結(jié)合的Feld1產(chǎn)生的抑制圖譜在所測的來自貓過敏性病人的14個不同血清中有差別?？?肽1兔子抗血清阻斷了所測的13/14個病人的血清IgE與Feld1的結(jié)合，抗-肽2兔子抗血清阻斷了8/14個，抗-肽3兔子抗血清阻斷了13/14個，抗-肽4兔子抗血清阻斷了9A4個，抗-肽5兔子抗血清阻斷了5/14個。在不同的抗血清中也顯示出抑制程度的差異。在所測的單一的抗-肽兔子抗血清中，抗-肽l兔子抗血清表現(xiàn)出最好的抑制率(從0-55%，平均為29%)?？?肽2兔子抗血清抑制率可達到0-18%(平均為5%)，抗-肽3兔子抗血清為0-29%(平均為11%)，抗-肽4兔子抗血清為0-24%(平均為8%)，抗-肽5兔子抗血清為0-18%(平均為5%)。所有5個抗-肽兔子抗血清的混合物對所有病人的血清最有效地達到了對病人的IgE與Feld1的結(jié)合的抑制，其抑制率為25-84%(平均為59%)。這些抑制甚至比通過用抗-Feld1兔子抗血清預(yù)溫育而達到的抑制還要顯著(表10)。表10:針對源自Feld1的合成肽產(chǎn)生的兔子抗血清抑制人IgE與Feld1的結(jié)合。顯示了14個病人中通過用兔子抗血清預(yù)溫育Feld1而達到的對IgE與Feld1結(jié)合的抑制百分率(作為平均值)。預(yù)溫育以5個針對源自五個Feldl的合成肽產(chǎn)生的兔子抗血清(抗-肽1至5)、5個抗-肽抗血清的混合物(Mix)和一個針對Feld1產(chǎn)生的抗血清(抗-rFeld1)進行。5個抗-肽病人抗-肽l抗-肽2抗-肽3抗-肽4抗-肽5抗血清的抗rFeldl混合物1481829201878642240800674335511517884744387112486649510551205448633012506846761105058458443171006053926171215165343100010003126113800005256124702207755]132728005641141606502525平均29511845947當把抗-肽1兔子抗血清與每個其他的抗-肽抗血清組合起來時，對過敏性病人的IgE結(jié)合的抑制顯著性增高，幾乎達到(例如，抗-肽1+4:41%，抗-肽1+5:42%)用抗-rFeldl抗體所得到的值(67%)(表ll)。表11:病人抗-肽l+抗-肽2抗-肽1+抗-肽3抗-肽1—卜抗-肽4抗-肽l+抗-肽5抗-rFeld11614961637522417282874360526257864433343406851792730676372442467372621363474851465355729402846436110161130344011453547457812524056597613291729326214710141628平均3628414267禁,^a^房,應(yīng)載沐游r潘應(yīng)表泣游r潘蘑麥勵游,^v7游,誘導(dǎo)vi錄^絲/gGf應(yīng)#磁》、S"vJ^#絲7潘應(yīng)潛裙已經(jīng)表明源自Betvl的、表面暴露的B細胞肽在小鼠治療和預(yù)防性疫苗接種模型中誘導(dǎo)保護性的Betv1特異性IgG反應(yīng)(FockeM等人ClinExpAllergy(2004)34:1525-1533)。在FockeM等人(2004)中，在免疫小鼠前將6個源自Betv1的肽偶聯(lián)至載體分子KLH。在本實施例中表明這些肽所誘導(dǎo)的Betv1特異性IgG反應(yīng)(表l)是由源自載體的而不是源自Betvl變應(yīng)原的T細胞表位的幫助所驅(qū)動。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)任何一個具有以下序列的源自Betvl的肽均未誘導(dǎo)相關(guān)的T細胞反應(yīng)LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF(SEQIDNo.20),GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN(SEQIDNo.21)和VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK(SEQIDNo.22)。這可以證明大多數(shù)T細胞反應(yīng)為針對載體分子KLH(圖18和19)。這個發(fā)現(xiàn)對于減少治療性疫苗接種中的副作用和減少預(yù)防性疫苗接種中潛在的致敏風險具有重要意義。過去已經(jīng)證明源自變應(yīng)原的肽缺少任何IgE反應(yīng)活性，但是由于T細胞激活而含有源自變應(yīng)原的T細胞表位誘導(dǎo)的副作用。源自變應(yīng)原的肽缺少IgE和T細胞反應(yīng)活性，如Betv1肽所例示，在治療性疫苗接種中既沒有誘導(dǎo)IgE介導(dǎo)的也沒有誘導(dǎo)T細胞介導(dǎo)的副作用。當用于預(yù)防性疫苗接種時，該肽將誘導(dǎo)Betvl特異性的保護性IgG反應(yīng)而不預(yù)先準備好Betv1特異性T細胞。這將最小化通過疫苗接種而預(yù)先準備好免疫反應(yīng)(其可為接下來的過敏性致敏鋪好道路)的風險。在本實施例中，在治療性和預(yù)防性變應(yīng)原疫苗接種小鼠模型中變應(yīng)原性和載體特異性T細胞反應(yīng)是分開的。選取了源自Betv1的肽2、3和6(FockeM等人(2004))并且在BALB/c小鼠中測試了它們是否含有任何已知的Betv1特異性T細胞表位。按照如下對小鼠進行免疫(表10顯示了致敏和處理程序)以10嗎重組Betv1(Biomay,Austria)和/或合成的源自Betv1的肽2、3禾B6的混合物(每個10pg)來免疫BALB/c小鼠組(n=5)。如前所述將肽偶聯(lián)至KLH(FockeM等人(2004))。為了進行免疫，把Betv1和肽混合物吸附至氫氧化鋁(Alu-Gd-S,Serva,Germany)，總體積為150(il/小鼠。表12:致敏和處理程序致敏治療組(n=5)(rBetv1)(肽KLH)無致敏/無治療(S-/T-)致敏/無治療(S+/T-)無致敏/治療(S-/T+)致敏/治療(S+/T+)無預(yù)防/致敏(P-/S+)預(yù)防/無致敏(P+/S-)預(yù)防/致敏(P+/S+)第0、20、40天--第60、80、100天第0、20、40天第60、80、100天致敏(rBetv1)第60、80、100天第0、20、40天--第0、20、40天第60、80、100天預(yù)防(肽KLH)在T細胞增殖測試中分析了變應(yīng)原特異性、肽特異性和載體特異性淋巴增殖。在無菌條件下取出脾臟并勻漿。對紅血球進行裂解后，洗滌細胞并重懸于完全培養(yǎng)液(RPMI,10%胎牛血清，O.lmg/ml慶大霉素，2mM谷氨酸)。將單細胞懸浮液以2x105細胞/孔植板于96孔圓底板并以作為陽性對照的concavalinA(0.5ng/孔)、rBetvl(2嗎/孔)、KLH(2pg/孔)、肽混合物(0.34嗎每種肽/孔)或單獨的培養(yǎng)液刺激4天。以0.5)iCi/孔含氚胸苷進行脈沖16小時并收集。由閃爍計數(shù)來測定增殖反應(yīng)。計算了抗原和培養(yǎng)液對照剌激后的平均增殖比率值，即刺激指數(shù)(SI)。有趣的是，可以顯示出與致敏但未治療的組8+/丁-相比，Betv1致敏小鼠(S+ZT+組)中以源自Betv1的肽進行的治療性疫苗接種能夠減少Betv1特異性增殖。在致敏和處理組中，未檢測到肽特異性增殖，但是根據(jù)載體效應(yīng)，觀察到了KLH特異性增殖。單獨的肽疫苗(SVT+組)主要誘導(dǎo)了KLH特異性T細胞，但幾乎沒有Betvl特異性T細胞反應(yīng)(圖18)。與Betv1致敏組PVS+相比，以肽進行的預(yù)防性疫苗接種幾乎沒有誘導(dǎo)Betv1特異性增殖(P+ZS-組)，但是有KLH特異性增殖。在進行預(yù)防性疫苗接種然后致敏的小鼠(P+ZS+組)中，Betv1特異性增殖顯著地減少，而且，沒有在任何小鼠組中觀察到肽特異性反應(yīng)(圖19)。因此，可以顯示在過敏癥小鼠模型中，以結(jié)合至載體的源自變應(yīng)原的B細胞肽進行的預(yù)防性疫苗接種沒有預(yù)先預(yù)備肽特異性T細胞，幾乎沒有變應(yīng)原特異性而只有載體特異性T細胞。在過敏性致敏以及治療性疫苗接種之前對小鼠進行的預(yù)防性疫苗接種減少了變應(yīng)原特異性T細胞增殖。以源自Betv1的肽進行的預(yù)防性處理(而無Betv1特異性T細胞的幫助)誘導(dǎo)了Betv1特異性IgG反應(yīng)。而且，預(yù)防性處理增加了Betv1特異性IgG反應(yīng)(已經(jīng)由Betv1變應(yīng)原在第一次致敏20和40天誘導(dǎo))(圖20)。這些結(jié)果證明肽疫苗誘導(dǎo)了可被變應(yīng)原暴露所推進的Betv1特異性IgG反應(yīng)。寞遞W";表觀忠減少游/g五茲合潔力游Jf^DgrP2游嚴使用根據(jù)表13所述的肽和遭受屋塵螨過敏癥個體的血清按照實施例15.1和20.1對源自Derp2的肽的IgE結(jié)合能力進行了確定。表13:源自Derp2的肽肽位置序列SE(JIDNo.Derp2肽11-33DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK%Derp2肽221-51CHGSEPCIIHRGKPFGLEAVFEANGNSKTAK97Derp2肽342-73EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNAC98Derp2肽462-103EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN99Derp2肽598-129APKSENVVVTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD100結(jié)果清晰地顯示本發(fā)明的源自Derp2的肽表現(xiàn)出顯著性減少IgE結(jié)合的能力。表14:結(jié)果rDerp2肽l肽2肽3肽4肽5平均(n=50)1,0800,0100,0150,0040,0310,006—實'嚴樹26:嚴長度殷變存成厥游/w祭會虔力、r鄰應(yīng)i座舒絲教免,嚴絲賄做26.1.肽的設(shè)計為了研究肽長度變異對IgE結(jié)合能力、T細胞反應(yīng)活性和免疫原性的效應(yīng)，通過幾個氨基酸來增加肽l(Pl)的長度和減少肽2(P2)的長度而設(shè)計了源自Phlp5的肽的變體(表15)。表15:合成的源自Phlp5的肽(1，2)及其變體(la，2b)的位置、序列、氨基酸數(shù)目的長度和分子量表15:源自PHLp5的合成肽的變體aa位置序列aa數(shù)目分子量(MW)肽198-128CGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK3230261393-128CFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK373592肽226-58ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKC3430682b26-53ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAC2926447726.2.缺少IgE反應(yīng)活性為了分析源自Phip5的肽1、2及其變體la、2b的IgE反應(yīng)活性，使用0.2嗎的肽/點和來自7個草花粉過敏性病人(pl-p7)和1個來自非過敏性個體(NHS)的血清進行了點雜交測試。所結(jié)合的IgE以125I標記的抗-人IgE(Phadia,Uppsala,Sweden)進行檢測。rPhlp5用作陽性對照，HSA用作陰性對照。病人與rPhlp5但不與肽和肽變體(圖21)反應(yīng)。26.3.淋巴增殖反應(yīng)以不同濃度的源自Phip5的肽1、2及其變體la、2b和用于對照的rPhlp5刺激來自2個草花粉過敏性病人的PBMC。由肽所獲得的刺激指數(shù)顯著性較低于由rPhlp5所獲得的(圖22)。26.4.肽變體的免疫原性以KLH偶聯(lián)的源自Phip5的肽及其變體對兔子進行免疫。使用ELISA實驗來測定所獲得的兔子抗血清對肽及其變體的IgG反應(yīng)活性(表16)。以肽及其變體進行免疫誘導(dǎo)了交叉反應(yīng)性的能識別肽及其相應(yīng)變體的IgG抗體。表16:在兔子中經(jīng)以KLH偶聯(lián)的肽免疫而產(chǎn)生的抗-Phlp5肽抗血清的交叉反應(yīng)活性。顯示了肽抗血清對肽(1，2)和變體(la,2b)的IgG反應(yīng)活性。用免疫前血清未觀察到反應(yīng)活性(prePI,prePla,preP2,preP2b)。a.抗肽1抗血清(抗P1)與肽1變體(la)交叉反應(yīng)，抗肽la抗血清(抗Pla)與肽1交叉反應(yīng)。b.抗肽2抗血清(抗P2)與肽2變體(2b)交叉反應(yīng)，抗肽2b抗血清(抗P2b)與肽2交叉反應(yīng)。表16:兔子抗血清的交叉反應(yīng)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>26.5.肽誘導(dǎo)的兔子抗血清抑制草花粉過敏性病人的IgE與rPhlp5的結(jié)合在競爭性ELISA中研究了兔子抗-肽2和2bIgG的抑制人IgE與rPhlp5結(jié)合的能力。ELISA板以抗P2、抗P2b和用于對照目的的抗Phip5抗血清進行預(yù)溫育。然后將板暴露于來自12個草花粉過敏性病人的血清。在表17中顯示了對IgE與rPhlp5結(jié)合的抑制百分率。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE與rPhlp5的結(jié)合。也以兔子抗肽1和la抗血清進行了競爭性ELISA。在實施例17中(以源自Phlp5的肽進行免疫誘導(dǎo)了IgG抗體，其抑制了草花粉過敏性病人的IgE與Phlp5的結(jié)合)抗肽l(PO抗體抑制了病人的IgE與Phlp5的結(jié)合(其平均抑制率為28.5%)。使用抗肽la抗血清獲得了相似的結(jié)果(其抑制百分率為23.7%)。表17:抗肽抗血清對病人的IgE與rPhlp5結(jié)合的抑制。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE與rPhlp5的結(jié)合。ELISA板上所結(jié)合的rPhlp5以抗P2、抗P2b和用于對照目的的抗Phip5抗血清進行預(yù)溫育。然后將板暴露于來自12個草花粉過敏性病人的血清。顯示了對IgE與rPhlp5結(jié)合的抑制百分率。表17:對lgE結(jié)合的。/。抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實蕭27;恭m雄艦！靜人類鼻病毒包含超過一百種不同的株。在這個中和測試中顯示一種株的鼻病毒感染也可被另一種株的VP1特異性抗體所抑制。以等密度將HeLa細胞鋪種于孔中。100TCD50HRV14以抗-14VPl和抗-89VPl抗體(未稀釋的；1:2-1:32孑L1-6)進行預(yù)溫育并分別加入到行A和D的孔中。把用抗-14VPl和抗-89VPl分別預(yù)溫育的100TCD5oHRV89加入到行B和C的孔中。3天后活細胞染成紫色?？?89VP1抗體和抗-14VPl抗體以相互可比較的方式阻斷了HRV14的感染。針對14VP1和89VP1產(chǎn)生的抗體也在相同濃度上抑制了HRV89的感染。權(quán)利要求1、一種低變應(yīng)原性蛋白，其由至少一個源自變應(yīng)原的低變應(yīng)原性分子組成，該低變應(yīng)原性分子與至少一個另一個非變應(yīng)原性蛋白或其片段融合或結(jié)合。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該至少一個低變應(yīng)原性分子與所述至少一個另一個蛋白或其片段的N-末端和/或-C末端融合。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該至少一個另一個蛋白是病毒，特別是RNA或DNA病毒、細菌、真菌或原生動物蛋白。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該病毒蛋白是衣殼蛋白。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該至少一個病毒蛋白源自人類致病性病毒，優(yōu)選為微小核糖核酸病毒科家族的病毒。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該微小核糖核酸病毒科家族的病毒為鼻病毒種，優(yōu)選為人類鼻病毒種，特別是人類鼻病毒89和14。7、根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為變應(yīng)原選自主要樺樹花粉變應(yīng)原特別是Betv1和Betv4、主要牧草花粉變應(yīng)原特別是Phip1、Phip2、Phlp5、Phlp6和Phlp7、主要屋塵螨變應(yīng)原特別是Derp1和Derp2、主要貓變應(yīng)原Feldl和Feld2、主要蜜蜂變應(yīng)原、主要黃蜂變應(yīng)原、前纖維蛋白特別是Phlpl2、橄欖樹變應(yīng)原特別是01eel、墻草變應(yīng)原特別是Parj2、豚草變應(yīng)原特別是Amba1、艾蒿花粉變應(yīng)原特別是Artv1或儲藏室塵螨變應(yīng)原特別是Lepd2。8、根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該低變應(yīng)原性分子表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力。9、根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該低變應(yīng)原性分子表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。10、根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的低變應(yīng)原性蛋白，其特征為該變應(yīng)原片段由下列氨基酸組成Phlp1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，Phip5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，F(xiàn)eld1的鏈1的1至34或35至70位氨基酸，F(xiàn)eld1的鏈2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Betv1的30至59、50至79或75至104位氨基酸，Derp2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Derp7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp21的1至35、35至72、70至100或卯至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，F(xiàn)eld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canf1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amba1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300、305至350或356至396位氨基酸，Alta6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列變體。11、編碼如權(quán)利要求1至IO任一項所述融合的低變應(yīng)原性蛋白的核酸分子。12、包含如權(quán)利要求ll所述核酸分子的載體。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的載體，其特征為所述載體為表達載體。14、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的載體，其特征為所述載體為細菌、真菌、昆蟲、病毒或哺乳動物載體。15、一種包含如權(quán)利要求11所述核酸分子或如權(quán)利要求12至14任一項所述載體的宿主。16、一種針對如權(quán)利要求1至IO任一項所述低變應(yīng)原性蛋白的抗體。17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，其特征為所述抗體是單克隆或多克隆抗體。18、一種包含如權(quán)利要求1至10任一項所述低變應(yīng)原性復(fù)合物或如權(quán)利要求16或17所述抗體的疫苗制劑。19、根據(jù)權(quán)利要求18所述的制劑，其特征為所述制劑還包含至少一個佐劑，藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。20、根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的制劑，其特征為所述制劑包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別地，0.5嗎至200嗎的所述低變應(yīng)原性蛋白或抗體。21、根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所述的低變應(yīng)原性蛋白或根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的抗體在制備用于治療或預(yù)防人類或動物中病毒感染和/或過敏癥的藥物的用途。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其特征為所述藥物還包含至少一個佐劑，藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。23、根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的用途，其特征為所述藥物用于主動或被動免疫。24、根據(jù)權(quán)利要求21至23所述的用途，其特征為所述藥物包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別地，0.5嗎至200嗎的所述低變應(yīng)原性蛋白或抗體。25、根據(jù)權(quán)利要求21至24任一項所述的用途，其特征為該藥物以0.01mg/kg體重至5mg/kg體重，優(yōu)選為0.1mg/kg體重至2mg/kg體重的數(shù)量向個體使用。26、根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所述的低變應(yīng)原性復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的抗體在診斷個體中的過敏癥和/或病毒感染中的用途。27、來自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣殼蛋白作為載體在藥物或疫苗中的用途或用于診斷病毒感染，特別是普通感冒的用途。28、根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其特征為該病毒是人類鼻病毒種，特別是人類鼻病毒89或14。29、一種源自Phip5的低變應(yīng)原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾，與野生型Phlp5相比表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力。30、根據(jù)權(quán)利要求29所述的分子，其特征為該截尾分子表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的分子，其特征為所述截尾的Phip5由Phip5的93至(128，98至128、26至53、26至58、252至283位氨基酸或其序列變體組成。32、根據(jù)權(quán)利要求29所述的分子，其特征為所述截尾的Phip5由Phip5的132至162，217至246、176至212位氨基酸或其序列變體組成。33、一種源自Feld1的低變應(yīng)原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力。34、根據(jù)權(quán)利要求33所述的分子，其特征為該截尾分子表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。35、根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的分子，其特征為所述截尾的Feld1由Feld1的鏈1的1至34或35至70位氨基酸，F(xiàn)dd1的鏈2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列變體組成。36、一種源自Derp2的低變應(yīng)原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力。37、根據(jù)權(quán)利要求36所述的分子，其特征為該截尾分子表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性。38、根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的分子，其特征為所述截尾的Derp2由Derp2的1至33、21至51、42至73、62至103、98至129位氨基酸或其序列變體組成。39、一種源自Derp7、Derp21、克隆30、Altal、Parjl、Oleel、Feld2、Canfl、Canfl、Artvl、Ambal、Alta2或Alta6的低變應(yīng)原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力及任選地表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性，優(yōu)選地由Derp7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp10的卜35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Derp21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，F(xiàn)eld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canfl的19至56、51至卯、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amba1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alta6的l至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列變體。40、一種包含至少兩個根據(jù)權(quán)利要求29至39任一項所述的表現(xiàn)出減少的IgE結(jié)合能力及任選地表現(xiàn)出減少的T細胞反應(yīng)活性的低變應(yīng)原性融合蛋白。41、根據(jù)權(quán)利要求40所述的融合蛋白，其特征為如果至少兩個分子源自相同的變應(yīng)原，則這些分子以不同于野生型變應(yīng)原中片段順序的順序與彼此相融合。42、一種編碼如權(quán)利要求29至39任一項所述的低變應(yīng)原性分子或如權(quán)利要求40或41所述的融合蛋白的核酸分子。43、一種包含如權(quán)利要求42所述核酸分子的載體。44、根據(jù)權(quán)利要求43所述的載體，其特征為所述載體是表達載體。45、根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的載體，其特征為所述載體為細菌、真菌、昆蟲、病毒或哺乳動物載體。46、一種包含如權(quán)利要求18所述核酸分子或如權(quán)利要求43至45任一項所述載體的宿主。47、一種針對如權(quán)利要求29至39任一項所述低變應(yīng)原性分子或如權(quán)利要求40或41所述融合蛋白的抗體。48、根據(jù)權(quán)利要求47所述的抗體，其特征為所述抗體是單克隆或多克隆抗體。49、一種包含如權(quán)利要求29至39任一項所述低變應(yīng)原性分子、如權(quán)利要求40或41所述融合蛋白或如權(quán)利要求46或47所述抗體的疫苗制劑。50、根據(jù)權(quán)利要求49所述的制劑，其特征為所述制劑還包含至少一個佐劑，藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。51、根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的制劑，其特征為所述制劑包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別地，0.5嗎至200嗎的所述低變應(yīng)原性分子或抗體。52、根據(jù)權(quán)利要求29至39任一項所述低變應(yīng)原性分子、根據(jù)權(quán)利要求40或41所述融合蛋白、根據(jù)權(quán)利要求42所述核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項所述載體或根據(jù)權(quán)利要求47或48所述抗體在制備用于治療或預(yù)防個體中過敏癥的藥物的用途。53、根據(jù)權(quán)利要求52所述的用途，其特征為所述藥物還包含至少一個佐劑，藥學上可接受的賦形劑和/或防腐劑。54、根據(jù)權(quán)利要求52或53所述的用途，其特征為所述藥物包含10ng至1g，優(yōu)選為100ng至10mg，特別地，0.5嗎至200叫的所述免疫原性分子、核酸分子、載體、宿主或抗體。55、根據(jù)權(quán)利要求52至54任一項所述的用途，其特征為該藥物以O(shè).Olmg/kg體重至5mg/kg體重，優(yōu)選為0.1mg/kg體重至2mg/kg體重的數(shù)量向個體使用。56、根據(jù)權(quán)利要求52至55任一項所述的用途，其特征為所述個體具有患過敏癥的風險。57、根據(jù)權(quán)利要求29至39任一項所述低變應(yīng)原性分子、如權(quán)利要求40所述融合蛋白、或如權(quán)利要求47或48所述抗體在診斷個體中的過敏癥或監(jiān)視過敏癥治療過程中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及低變應(yīng)原性蛋白，其由至少一個源自變應(yīng)原的低變應(yīng)原性分子組成，該低變應(yīng)原性分子與至少一個另一個非變應(yīng)原性蛋白或其片段融合或結(jié)合。文檔編號C07K19/00GK101466738SQ200780021374公開日2009年6月24日申請日期2007年6月11日優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日發(fā)明者B·林哈特,H·格倫隆德,I·斯達博達,J·廷霍費爾,K·韋斯特尼,M·?？?泰克爾,M·范哈格,P·瓦倫特,R·瓦倫塔,R·賴寧格,S·弗塔拉,S·斯皮茨約,T·波波夫-克勞普申請人:碧歐美公司