專利名稱：：仔豬副傷寒活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種動物活疫苗的制備方法，尤其涉及一種仔豬副傷寒活疫苗的制備方法以及由該方法制備得到的產(chǎn)品，屬于副傷寒活疫苗領域。
背景技術：
：仔豬副傷寒是由豬霍亂沙門氏菌引起的急性、亞急性或慢性傳染病。主要發(fā)生于2-4月齡仔豬，危害性極大，急性病例主要表現(xiàn)為敗血癥，癥狀為體溫突然升高、精神不振、不食，后期間有下痢、呼吸困難、耳根、胸前和腹下皮膚有紫紅色斑點，有時出現(xiàn)癥狀后24h內死亡，病死率很高。亞急性和慢性癥狀表現(xiàn)為消瘦、下痢和腸炎，病情往往拖后2-3周或更長，最后極度消瘦，衰竭而死。1948年蘇聯(lián)人伊瓦諾夫因成功研制出仔豬副傷寒滅活菌苗，獲得了斯大林勛章。國外很早就使用滅活菌苗，我國在五六十年代也開始使用滅活菌苗，但滅活菌苗的使用效果很不理想，I960年我國曾制造了含各種不同佐劑的滅活菌苗共52批對235頭仔豬進行免疫試驗，均免疫兩次，攻毒后保護率僅為29.9%。1961年我國開始弱毒菌株培育及弱毒菌苗的研制，于1964年選出一株毒力弱而又穩(wěn)定、免疫原性良好的菌種，編號為C500。在生產(chǎn)C500弱毒菌苗過程中，因采用大扁瓶瓊脂培養(yǎng)生產(chǎn)菌苗，存在勞動強度大和產(chǎn)量低的缺點，從七十年代初開始各生物制品廠陸續(xù)改用液體通氣培養(yǎng)法生產(chǎn)。但由于通氣培養(yǎng)有部分菌體生命較為脆弱，容易出現(xiàn)菌苗凍干后活菌率較低，而引起仔豬反應較大，并偶爾有出現(xiàn)不安全的情況。后經(jīng)各廠家改善培養(yǎng)和凍干技術以及進行菌苗口服試驗，口服試驗證明口服免疫的效果與注射的效果同樣良好，而且口服活菌率低至37%的菌苗也很安全，據(jù)此結果規(guī)定了凍干活菌率不低于50%的用于注射或口服；凍干活菌率低于50%的菌苗不能注射但可用于口服。此規(guī)定可保證更多的菌苗出廠使用。我國于1976年將液體通氣培養(yǎng)法批準列入《獸用生物制品規(guī)程》，在全國許多生物制品生產(chǎn)廠家投入生產(chǎn)，推廣應用。此方法一直延用至今，此培養(yǎng)方法一直存在著菌數(shù)低、凍干死亡率高的問題，生產(chǎn)難度大，產(chǎn)量低、成本高。因市場需求量大，各生產(chǎn)廠家時常都有出現(xiàn)斷貨的現(xiàn)象發(fā)生，多年來一直困擾著各生產(chǎn)廠家。《獸用生物制品規(guī)程》對仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法進行了具體的規(guī)范，按《規(guī)程》生產(chǎn)方法如下1、一級菌種的制備菌種用普通肉湯稀釋或經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)繁殖后，接種普通瓊脂平板，37t:培養(yǎng)18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種于普通瓊脂斜面若干支，37t:培養(yǎng)24h經(jīng)純粹檢驗，并用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-『C保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養(yǎng)基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的制備3取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養(yǎng)24h(普通瓊脂培養(yǎng)物用普通肉湯洗下制成濃度適宜的菌液)，純粹檢查合格后，即可作為種子。在2-『C保存，應不超過2日。3、菌液培養(yǎng)將二級菌種按培養(yǎng)基總量的1%_2%接種于含1%-1.5%蛋白胨的普通肉湯中，在37t:通氣培養(yǎng)18-2ih，培養(yǎng)過程中根據(jù)需要加入適量的消泡劑，并根據(jù)ra升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制ra。培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37t:的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻后按規(guī)定頭份定量分裝。每頭份活菌不少于30億個。按照上述方法生產(chǎn)，培養(yǎng)菌數(shù)一般在180-260億/ml，按每頭份活菌30億個計算配苗，最大分裝量為3.8ml/瓶，規(guī)程規(guī)定最低為20頭份/瓶，此菌凍干死亡率在40%-60%，按最高培養(yǎng)菌數(shù)260億和60%死亡率計算接近《規(guī)程》規(guī)定的最低頭份標準，此培養(yǎng)方法一直存在著菌數(shù)低、凍干死亡率高的問題，生產(chǎn)難度大，產(chǎn)量低、成本高，有待改進。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有的仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法所存在的菌數(shù)低、凍干死亡率高，生產(chǎn)難度大，產(chǎn)量低，成本高等問題，提供一種新的仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法可使細菌培養(yǎng)時間縮短，培養(yǎng)菌數(shù)明顯提高，凍干死亡率大幅度下降。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的—種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法，包括(l)一級菌種的制備豬霍亂沙門氏菌菌種用普通肉湯稀釋或經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)繁殖后，接種普通瓊脂平板，37t:培養(yǎng)18-20h，選取中等大小菌落5-10個，混合接種于普通瓊脂斜面，37t:培養(yǎng)24h，檢驗合格后作為一級菌種；(2)二級菌種的制備取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養(yǎng)24h，檢查合格后，作為二級種子；(3)菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37°C的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻；其中，步驟(3)中所述的培養(yǎng)基由普通肉湯培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基按照2:1的體積比例所組成；所述的普通肉湯培養(yǎng)基組成為牛肉500g，蛋白胨10-15g，氯化鈉5g，蒸餾水或去離子水1000ml;所述的合成培養(yǎng)基的組成為牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化鈉5g;加水至1000ml。本發(fā)明還通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，在上述生產(chǎn)方法中采用以下手段，對于縮短細菌培養(yǎng)時間，提高培養(yǎng)菌數(shù)以及降低凍干死亡率等方法均有明顯的效果步驟(2)中取一級菌種接種普通瓊脂或普通肉湯，37t:培養(yǎng)24h后用40%滅菌葡萄糖溶液沖洗菌苔后接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養(yǎng)20-22h;檢查合格后，再作為二級種子；步驟(3)中所述的接種量優(yōu)選為按培養(yǎng)基總重量的3%接種量將二級種子接種到培養(yǎng)基中；所述的培養(yǎng)優(yōu)選為在37t:條件下通氣培養(yǎng)15h，其中，更優(yōu)選的，在37t:溫度下逐漸加大通氣培養(yǎng)15h;本發(fā)明針對仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)方法所存在的菌數(shù)低、凍干死亡率高，生產(chǎn)難度大，產(chǎn)量低，成本高等問題，有針對性的開展了改進仔豬副傷寒活疫苗制備方法的研究，從生產(chǎn)工藝和培養(yǎng)基配方方面做了大量的探索、研究試驗。本發(fā)明方法所生產(chǎn)的仔豬副傷寒活疫苗，培養(yǎng)菌數(shù)突破500億/ml，最高達到580億/ml，凍干死亡率降至20-40%?！东F用生物制品規(guī)程》中對仔豬副傷寒活疫苗規(guī)格為20頭份/瓶、30頭份/瓶、40頭份/瓶；按照本發(fā)明方法所生產(chǎn)的15個批次的活疫苗，其中11個批次達到30頭份/瓶，4個批次達到40頭份/瓶。本發(fā)明方法具有所生產(chǎn)的活疫苗菌數(shù)高、凍干死亡率低，容易生產(chǎn)，產(chǎn)量高，成本低等優(yōu)點。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。—、普通肉湯的配制牛肉500g蒸餾水或去離子水1000ml蛋白胨10-15g氯化鈉5g;將上述各組分溶于蒸餾水或去離子水中，高溫高壓滅菌，即得。二、合成培養(yǎng)基的配制牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化鈉5g;加水至1000ml，高溫高壓滅菌，即得。實施例11、一級菌種的制備將豬霍亂沙門氏菌菌種(購買于中國獸藥監(jiān)察所)用普通肉湯稀釋或經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)繁殖后，接種普通瓊脂平板，37t:培養(yǎng)18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種于普通瓊脂斜面若干支，37t:培養(yǎng)24h經(jīng)純粹檢驗，并用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-8t:保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養(yǎng)基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的制備鉤取一級菌種劃線接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養(yǎng)24后，用40%滅菌葡萄糖溶液沖洗菌苔后接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養(yǎng)20_22h，純粹檢查合格后，即可作為二級種子。在2-8t:保存，應不超過3日。3、菌液培養(yǎng)將二級菌種按培養(yǎng)基總量的3%接種于兩份含1%-1.5%蛋白胨的普通肉湯和一份合成培養(yǎng)基中(2:1)，用智能微生物發(fā)酵罐37t:通氣培養(yǎng)15h，培養(yǎng)過程中要采用逐漸加大通氣量進行培養(yǎng)，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制pH值為7.4-7.6。培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37°C的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻后按規(guī)定頭份定量分裝。每頭份活菌達到40億個。實施例21、一級菌種的制備將豬霍亂沙門氏菌菌種(請給出豬霍亂沙門氏菌菌種的商業(yè)購買途徑)用普通肉5湯稀釋或經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)繁殖后，接種普通瓊脂平板，37t:培養(yǎng)18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種于普通瓊脂斜面若干支，37t:培養(yǎng)24h經(jīng)純粹檢驗，并用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-『C保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養(yǎng)基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的制備鉤取一級菌種劃線接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養(yǎng)24后，純粹檢查合格后，即可作為二級種子。在2-『C保存，應不超過3日。3、菌液培養(yǎng)將二級菌種按培養(yǎng)基總量的3%接種于兩份含1%-1.5%蛋白胨的普通肉湯和一份合成培養(yǎng)基中(2:1)，用智能微生物發(fā)酵罐37t:通氣培養(yǎng)15h，培養(yǎng)過程中采用逐漸加大通氣量進行培養(yǎng)，并根據(jù)PH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制pH值為7.4-7.6;培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37°C的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻后按規(guī)定頭份定量分裝。每頭份活菌不少于30億個。實施例31、一級菌種的制備將豬霍亂沙門氏菌菌種(請給出豬霍亂沙門氏菌菌種的商業(yè)購買途徑)用普通肉湯稀釋或經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)繁殖后，接種普通瓊脂平板，37t:培養(yǎng)18-20h，選取菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤的光滑型中等大小菌落5-10個，混合接種于普通瓊脂斜面若干支，37t:培養(yǎng)24h經(jīng)純粹檢驗，并用1/500吖啶黃溶液做玻片凝集試驗檢查合格，作為一級菌種，在2-『C保存，應不超過2個月此間可移植1-2次，在培養(yǎng)基上繼代，不超過5代。2、二級菌種的制備鉤取一級菌種劃線接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養(yǎng)24后，用40%滅菌葡萄糖溶液沖洗菌苔后接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養(yǎng)20_22h，純粹檢查合格后，即可作為二級種子。在2-8t:保存，應不超過3日。3、菌液培養(yǎng)將二級菌種按培養(yǎng)基總量的3%接種于兩份含1%-1.5%蛋白胨的普通肉湯和一份合成培養(yǎng)基中(2:1)，用智能微生物發(fā)酵罐37t:通氣培養(yǎng)20h，并根據(jù)pH升高情況加入適量滅菌40%葡萄糖液以控制pH值為7.4-7.6。培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37t:的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5%明膠及5%蔗糖，充分混勻后按規(guī)定頭份定量分裝。每頭份活菌不少于30億個。試驗例1—、試驗材料供試疫苗實施例1-3所制備的活疫苗；共分為15個批次；對照疫苗按照《獸用生物制品規(guī)程》所生產(chǎn)的仔豬副傷寒活疫苗；分為9個批次；二、試驗方法及結果供試疫苗和對照疫苗采用相同凍干曲線，凍干曲線為-15°〇入箱，預凍-40°C4h，升華干燥-2t:25h，解吸干燥32t:7h。細菌計數(shù)用培養(yǎng)基為普通肉湯瓊脂(普通肉湯加1.5%瓊脂)，采用《獸用生物制品規(guī)程》活菌計數(shù)法，供試疫苗和對照疫苗的培養(yǎng)菌數(shù)和凍6干死亡率對比見表1。表1供試疫苗和對照疫苗的培養(yǎng)菌數(shù)及凍干死亡率對比表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從試驗結果可見，采用本發(fā)明生產(chǎn)方法所制備的活疫苗的培養(yǎng)菌數(shù)突破500億/ml，最高達到580億/ml，凍干死亡率降至20-40%;《獸用生物制品規(guī)程》規(guī)格為20頭份/瓶、30頭份/瓶、40頭份/瓶；采用本發(fā)明方法共計生產(chǎn)仔豬副傷寒活疫苗15個批次，其中11個批次達到30頭份/瓶，4個批次達到40頭份/瓶。權利要求一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法，包括(1)一級菌種的制備將豬霍亂沙門氏菌菌種用普通肉湯稀釋或經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)繁殖后，接種普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18-20h，選取菌落5-10個，混合接種于普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h，檢驗合格后作為一級菌種；(2)二級菌種的制備取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37℃培養(yǎng)24h后用40％滅菌葡萄糖溶液沖洗菌苔后接入裝量為3000ml一萬瓶中，37℃培養(yǎng)，檢查合格后，作為二級種子；(3)菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37℃的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5wt％明膠及5wt％蔗糖，充分混勻；其特征在于步驟(3)中所述的培養(yǎng)基由普通肉湯培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基按照2∶1的體積比例所組成。2.按照權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述普通肉湯培養(yǎng)基組成為牛肉500g，蛋白胨10-15g，氯化鈉5g，蒸餾水或去離子水1000ml;所述的合成培養(yǎng)基的組成為牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖2g，氯化鈉5g;加水至1000ml。3.按照權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)中取一級菌種接種普通肉湯瓊脂扁瓶，37t:培養(yǎng)24h后用40X滅菌葡萄糖溶液沖洗菌苔后接入裝量為3000ml—萬瓶中，37t:培養(yǎng)20-22h;檢查合格后，再作為二級種子。4.按照權利要求l所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(3)中按培養(yǎng)基總重量的3%接種量將二級種子接種到培養(yǎng)基中。5.按照權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)為在37t:條件下通氣培養(yǎng)15h。6.按照權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)是在37t:溫度下逐漸加大通氣培養(yǎng)15h。7.權利要求1-6任何一項生產(chǎn)方法所生產(chǎn)得到的活疫苗。8.權利要求7所述的活疫苗在制備預防或治療仔豬副傷寒藥物中的用途。9.一種預防或治療仔豬副傷寒的藥物組合物，其特征在于由權利要求7所述的活疫苗和藥學上可接受的載體或賦型劑組成。全文摘要本發(fā)明公開了一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法及其產(chǎn)品，包括(1)一級菌種的制備；(2)二級菌種的制備；(3)菌液培養(yǎng)將二級菌種接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)結束后立即加入經(jīng)過滅菌及預熱至37℃的穩(wěn)定劑，使疫苗含1.5％明膠及5％蔗糖，充分混勻，即得；其中步驟(3)中所述的培養(yǎng)基由普通肉湯培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基按照2∶1的體積比例所組成。本發(fā)明方法所生產(chǎn)的仔豬副傷寒活疫苗，培養(yǎng)菌數(shù)突破500億/ml，最高達到580億/ml，凍干死亡率降至20-40％。本發(fā)明生產(chǎn)方法具有活疫苗菌數(shù)高，凍干死亡率低，容易生產(chǎn)，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。文檔編號A61P31/00GK101732706SQ20091026170公開日2010年6月16日申請日期2009年12月28日優(yōu)先權日2009年12月28日發(fā)明者付麗杰,劉洪斌,左穎,張繼東,李尊江,楊萬秋,王靜,鄔立權申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司