專利名稱：一種動(dòng)物干擾素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種制備動(dòng)物干擾素的方法。

背景技術(shù)：
雞病毒性疾病仍是當(dāng)前嚴(yán)重制約養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。而傳統(tǒng)的傳染病治療方案臨床上有時(shí)難以湊效，尤其針對病毒病辦法不多。雞病毒性疾病至今尚無有效的治療藥物和治療方法。近年來曾經(jīng)有人進(jìn)行過用中草藥制劑預(yù)防和治療雞病毒性疾病的試驗(yàn)，但治愈率較低?？股丶盎前奉愃幬锘緹o效。目前，雞干擾素是治療雞病毒性疾病的有效藥物。存在的問題是在雞干擾素的生產(chǎn)中使用常規(guī)用雞新城疫病毒(NDV)誘導(dǎo)雞脾白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素含量較低，但沒有人用仙臺(tái)病毒作為干擾素誘導(dǎo)劑。另外采集無菌雞脾比較困難。黃芪多糖是一種具有新型免疫調(diào)節(jié)作用物質(zhì)，能刺激人體免疫系統(tǒng)的功能，誘生和促生干擾素產(chǎn)生，也是一種的雞脾淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)素。黃芪多糖具有增強(qiáng)免疫力、 抗腫瘤、抗病毒、抗放射、保肝、催眠等廣泛的藥理活性，能誘生與促誘生人血細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-a(IFN-a)，干擾素_r(IFN_r)，雞脾淋巴細(xì)胞介素-2(IL4)，雞脾淋巴細(xì)胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)，與粒一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種細(xì)胞活性因子。黃芪多糖是一種新型的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，具有間接抗病毒、抗腫瘤作用。但有關(guān)利用仙臺(tái)病毒和黃芪多糖作復(fù)合干擾素誘導(dǎo)劑高效制備干擾素的方法目前還未見報(bào)道。因此，提供一種簡單工藝方法生產(chǎn)含量高、制備成本低的高效生產(chǎn)動(dòng)物干擾素的方法，是該技術(shù)領(lǐng)域科研人員急需開發(fā)的新課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)中的不足之處，提供一種動(dòng)物干擾素的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種動(dòng)物干擾素的制備方法，具體實(shí)施步驟如下(1)無菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，加入10μ g/ml卡那霉素，用配置好的培養(yǎng)液稀釋淋巴細(xì)胞懸液，使雞脾淋巴細(xì)胞濃度稀釋為每ml含IXIO5-IXIO7 ；；(2)對淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(3)雞脾淋巴細(xì)胞中加入少量干擾素，使其最終濃度為100-1000IU/ml，于37°C水浴培養(yǎng)0. 5-2小時(shí)；(4)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為25-100μ g/ml，于37°C水浴培養(yǎng)1_2小時(shí)；(5)然后在上述雞脾淋巴細(xì)胞懸液中再加入適量干擾素誘生劑仙臺(tái)病毒，使其最終濃度為128-1280血凝單位/ml，37°C搖床培養(yǎng)18- 小時(shí)；
(6)待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH2. 0,4. 0°C，放置1_4 天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH 7. 0，即得粗制動(dòng)物干擾素。本發(fā)明的有益效果是雞基因工程干擾素具有制備成本高，在臨床推廣中受到很到限制。本發(fā)明利用雞脾制備動(dòng)物干擾素的方法其具有很多優(yōu)點(diǎn)生產(chǎn)工藝簡單、制備成本低，療效好。常規(guī)用NDV-F誘導(dǎo)雞脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素含量低。本發(fā)明在仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)干擾素過程中加入黃芪多糖，顯著提高利用雞脾制備動(dòng)物干擾素的含量，顯著降低了藥物的成本。本產(chǎn)品注入雞機(jī)體后，具有療效好、安全可靠、用量低、無毒副作用和成本低等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
詳述如下實(shí)施例1一種動(dòng)物干擾素的制備方法的具體步驟如下(1)雞脾淋巴細(xì)胞制備無菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，加入10 μ g/ml卡那霉素，用配置好的培養(yǎng)液稀釋淋巴細(xì)胞懸液，使雞脾淋巴細(xì)胞濃度稀釋為每ml含1X106。雞脾淋巴細(xì)胞的分離應(yīng)在采集后48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到90%以上。并對淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；使雞脾淋巴細(xì)胞濃度稀釋為每ml含1X106。雞脾淋巴細(xì)胞的分離應(yīng)在制備后 48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到90%以上。(2)誘生病毒采用仙臺(tái)病毒，血凝效價(jià)達(dá)到適宜滴度方可投產(chǎn)。(3)培養(yǎng)液采用細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640，內(nèi)含5_10%牛血清和10 μ g/ml卡那霉素或慶大霉素，也可用其它適宜培養(yǎng)液。(4)生產(chǎn)用原水應(yīng)符合飲用水標(biāo)準(zhǔn)，直接用于制品的水應(yīng)符合注射用水標(biāo)準(zhǔn)。(5)粗制干擾素的制備工藝(5. 1)誘生病毒的制備采用9-10日齡健康雞胚，于每胚的尿囊腔內(nèi)接種適量仙臺(tái)病毒，37°C培養(yǎng)48-72 小時(shí)，雞胚發(fā)育良好，病毒達(dá)到適宜滴度后，收集尿囊液，并做無菌試驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后合并， 抽樣做效價(jià)測定，放-20°C待用；(5. 雞脾淋巴細(xì)胞懸液用離心法分離血漿，吸取雞脾淋巴細(xì)胞層，然后用步驟(3)中配置的培養(yǎng)液稀釋， 以每ml含5X106為宜；(5. 3)起動(dòng)與誘生雞脾淋巴細(xì)胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為600IU/ml，于37°C水浴培養(yǎng)0. 5小時(shí)，再加入黃芪多糖，使其最終濃度為100 μ g/ml，于37°C水浴培養(yǎng)1. 5小時(shí)；(5. 4)再加入IOM血凝單位/ml仙臺(tái)病毒進(jìn)行誘生，待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，收集上清，將上清經(jīng)酸化和中性化后滅活病毒，即為粗制動(dòng)物干擾素；(5. 5)待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH2. 0，4. 0°C，放置2天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH7. 0,即得粗制動(dòng)物干擾素；(5. 6)離心收集上清即得粗制干擾素，放-20°C保存；(5.7)留樣分別作無菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)及安全檢驗(yàn)，并以微量法滴定干擾素效價(jià)。通過此法制備的雞粗制干擾素共1次，2個(gè)批號，獲得了高產(chǎn)量干擾素，平均效價(jià)為 21600IU/ml。不加入黃芪多糖的常規(guī)誘生組干擾素平均效價(jià)低于8450IU/ml。干擾素效價(jià)測定采用CPE (細(xì)胞致病效應(yīng))抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測定法，以每 ml干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞人羊膜細(xì)胞Wish細(xì)胞(50)免受水泡性口腔炎病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)定為干擾素單位。以國際單位(IU)表示，并用國家標(biāo)準(zhǔn)品校正結(jié)果。半成品和成品的檢驗(yàn)半成品檢定半成品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌檢查、PH值等項(xiàng)檢測。成品檢定成品分別作干擾素的鑒別試驗(yàn)、外觀檢測、PH值、特異活性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性等項(xiàng)檢驗(yàn)。實(shí)施例2一種動(dòng)物干擾素的制備方法的具體步驟如下(1)無菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，10 μ g/ml青霉素、鏈霉素， 用配置好的1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞沉淀物，使雞脾淋巴細(xì)胞濃度稀釋為每ml含IX 107。(2)在雞脾淋巴細(xì)胞懸液中加入8%雞血漿，混勻。(3)在上述雞脾淋巴細(xì)胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為200-300IU/ ml，于37°C水浴培養(yǎng)1小時(shí)。(4)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為25 μ g/ml ；于37°C水浴培養(yǎng)2小時(shí)。(5)在啟動(dòng)的雞脾淋巴細(xì)胞懸液中再加入512血凝單位/ml仙臺(tái)病毒進(jìn)行誘生， 37°C搖床培養(yǎng)12- 小時(shí)。(6)待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，以3000rpm離心，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至 PH2. 0，4. 0°C，放置4天，滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH7. 0，即得粗制雞細(xì)胞干擾素。留樣測定干擾素效價(jià)，通過此法制備的雞粗制干擾素共2次，4個(gè)批號，獲得了高產(chǎn)量干擾素，平均效價(jià)為19700IU/ml。不加入黃芪多糖的常規(guī)誘生組干擾素平均效價(jià)為11750IU/ml。半成品和成品的檢驗(yàn)半成品檢定半成品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌檢查、PH值等項(xiàng)檢測。成品檢定成品分別作干擾素的鑒別試驗(yàn)、外觀檢測、PH值、特異活性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性等項(xiàng)檢驗(yàn)。實(shí)施例3一種動(dòng)物干擾素的制備方法，具體步驟如下(1)無菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，加入10 μ g/ml卡那霉素， 4. 0°C冰箱放置。用配置好的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀物，使雞脾淋巴細(xì)胞濃度稀釋為每ml含 IXlO50(2)雞脾淋巴細(xì)胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為800IU/ml，于37°C水浴培養(yǎng)2小時(shí)。(3)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為50 μ g/ml，于37°C水浴培養(yǎng)2小時(shí)。
(4)在啟動(dòng)的雞脾淋巴細(xì)胞懸液中再加入256-1280血凝單位/ml仙臺(tái)病毒進(jìn)行誘生，同時(shí)在雞脾淋巴細(xì)胞懸液中加入含5%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)12-24小時(shí)。(5)待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，以3000rpm離心，收集上清即得粗制動(dòng)物干擾素。留樣測定干擾素效加，通過此法制備的雞粗制干擾素共2次，3個(gè)批號，平均效價(jià)為18900IU/ ml。不加入黃芪多糖的常規(guī)誘生組干擾素平均效價(jià)為13400IU/ml。半成品和成品的檢驗(yàn)半成品檢定半成品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌檢查、PH值等項(xiàng)檢測。成品檢定成品分別作干擾素的鑒別試驗(yàn)、外觀檢測、PH值、特異活性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性等項(xiàng)檢驗(yàn)。使用該制備方法生產(chǎn)的干擾素含量高，顯著降低了生產(chǎn)成本。具體方法如下首先取雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，使用仙臺(tái)病毒和黃芪多糖作為復(fù)合干擾素誘生劑誘導(dǎo)健康動(dòng)物干擾素，其包括有雞脾淋巴細(xì)胞懸液、啟動(dòng)干擾素、病毒液和培養(yǎng)液，經(jīng)原料制備一混和一水浴攪拌、誘導(dǎo)培養(yǎng)一離心收獲一滅活病毒一解凍除菌一分裝一成品包裝工序制成，制成的動(dòng)物干擾素。留樣分別作無菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)及安全檢驗(yàn)。通過此法制備的雞粗制干擾素共3次，4個(gè)批號，獲得了高產(chǎn)量干擾素，平均效價(jià)大于30720IU/ml，無菌試驗(yàn)、 余毒試驗(yàn)均陰性，動(dòng)物體內(nèi)注射后均健康存活，無不良反應(yīng)。本發(fā)明制備的動(dòng)物干擾素具有治療雞病毒性疾病等病毒病作用，同時(shí)對細(xì)菌性疾病也有治療作用。用于防治雞疾病。如雞法氏囊病、雞新城疫病、雞傳染性支氣管炎等疾病。注射用法與用量小雞0. 002萬-0. 02萬IU/只/天，育成雞0. 004萬-0. 04萬IU/頭 /天。每日注射1次，一個(gè)療程3次，病重用量略加。通過本發(fā)明獲得了高產(chǎn)量干擾素，通過此法制備的雞粗制干擾素共7次，6個(gè)批號，其中4個(gè)批號效價(jià)在31200IU/ml以上(最高達(dá)40960IU/ml)；其余效價(jià)在10120IU/ml 以上。平均效價(jià)約*M230IU/ml，使用該制備方法生產(chǎn)的干擾素含量高，顯著降低了生產(chǎn)成本。留樣干擾素?zé)o菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)均陰性，動(dòng)物體內(nèi)注射后均健康存活，無不良反應(yīng)。副作用，對雞病毒性傳染性疾病有良好治療效果。本發(fā)明是一種廣譜抗病毒制劑，主要治療雞病毒性疾病，例如雞法氏囊病、雞瘟、雞傳染性支氣管炎和雞新城疫病等。通過注射或口服該制劑，使其與機(jī)體細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的繁殖，起到抗病毒作用。臨床實(shí)驗(yàn)證明利用本發(fā)明研制的動(dòng)物干擾素治療雞法氏囊病、雞傳染性支氣管炎和雞新城疫病等雞疾病共觀19頭，治愈2545頭，治愈率達(dá)90. 1 % ；其中特別是治療雞法氏囊病有效率達(dá) 96.2%,治愈率高達(dá)91.6%，效果非常顯著。上述參照實(shí)施例對該高效生產(chǎn)動(dòng)物干擾素的方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物干擾素的制備方法，其特征在于具體實(shí)施步驟如下(1)無菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培養(yǎng)液稀釋淋巴細(xì)胞懸液，使雞脾淋巴細(xì)胞濃度稀釋為每ml含105-1X107 ；(2)對淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(3)雞脾淋巴細(xì)胞中加入少量干擾素，使其最終濃度為100-1000IU/ml，于37°C水浴培養(yǎng)0. 5-2小時(shí)；(4)再加入黃芪多糖，于37°C水浴培養(yǎng)1-2小時(shí)；(5)然后在上述雞脾淋巴細(xì)胞懸液中再加入適量干擾素誘生劑仙臺(tái)病毒，使其最終濃度為128-1280血凝單位/ml，37°C條件下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18-24小時(shí)；(6)待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，離心收集上清，加入鹽酸調(diào)至pH2.0，40°C，放置1-4天， 滅活病毒，再加NaOH調(diào)至pH 7. 0，即得粗制動(dòng)物干擾素；
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種動(dòng)物干擾素的制備方法，其特征是誘導(dǎo)雞脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的黃芪多糖質(zhì)量濃度為25-100 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備動(dòng)物干擾素的方法。本發(fā)明方法的實(shí)施步驟如下(1)無菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培養(yǎng)液稀釋淋巴細(xì)胞懸液；(2)雞脾淋巴細(xì)胞中加入為每ml含105少量干擾素，于37℃水浴培養(yǎng)0.5-2小時(shí)；(3)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為25-100μg/ml，于37℃水浴培養(yǎng)1-2小時(shí)；(4)然后在上述雞脾淋巴細(xì)胞懸液中再加入適量干擾素誘生劑仙臺(tái)病毒；(5)待干擾素達(dá)到高峰值時(shí)，離心收集上清，即得粗制動(dòng)物干擾素。該方法生產(chǎn)的干擾素含量高，生產(chǎn)成本明顯降低。
文檔編號C12P21/02GK102154418SQ200910303630
公開日2011年8月17日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者王麗莉, 王文彪 申請人:天津艾森生物工程有限公司