專利名稱：抑制靶多核苷酸的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及分子生物學(xué)和基因沉默的方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNAi)是在靶器官中選擇性阻斷基因功能的方法。已經(jīng)很好地建立了 將該方法用于體外細(xì)胞過程的遺傳剖析。RNAi在昆蟲整體生物體中的應(yīng)用已大大限于經(jīng)P 元件介導(dǎo)的種系轉(zhuǎn)化的果蠅黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(以及在其他昆蟲中有 限數(shù)量的基于dsRNA注入昆蟲血腔的RNAi實驗報道)。在本領(lǐng)域中需要在多種生物體中增 強(qiáng)感興趣序列的靶向抑制的方法。在農(nóng)業(yè)上蟲害是嚴(yán)重的問題。它們毀壞了數(shù)百萬英畝的主要作物例如玉米、大豆、 豌豆和棉花。每年，這些害蟲僅在美國就造成了超過千億美元的作物損失。在正進(jìn)行的季 節(jié)性保衛(wèi)戰(zhàn)中，農(nóng)場主必須應(yīng)用億萬加侖的合成殺蟲劑以抗擊這些害蟲。過去采用的其他 方法是通過微生物或衍生自微生物的、于轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因來遞送殺蟲活性。例如， 已知桿菌屬的某些微生物物種具有針對廣范圍蟲害的殺蟲活性，所述害蟲包括鱗翅目、雙 翅目、鞘翅目、半翅目、和其他。事實上，微生物殺蟲劑，特別是從桿菌株獲取的那些在農(nóng)業(yè) 中發(fā)揮重要作用以替代害蟲的化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)科學(xué)家已通過基因工程化作物植株由桿菌產(chǎn) 生殺昆蟲蛋白來發(fā)展具有增強(qiáng)昆蟲抗性的作物植株。例如，經(jīng)基因工程化產(chǎn)生Cry毒素的 玉米和棉花植株(參見例如 Aronson(2002)Cell Mol. Life Sci. 59(3) 417-425 ；Schnepf et al. (1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (3) :775_806)現(xiàn)在被廣泛用在美國農(nóng)業(yè)中并為 農(nóng)民提供了傳統(tǒng)昆蟲防治方法的替代方案。然而，這種Bt殺昆蟲蛋白僅保護(hù)植物免受相對 窄范圍的害蟲。而且，這種模式的殺昆蟲活性會提供可變水平的特異性，并在一些情況下會 造成明顯的環(huán)境后果。因而，迫切需要一種防治害蟲的替代方法。發(fā)明概述提供了增強(qiáng)細(xì)胞中靶序列特異抑制性RNA濃度的方法和組合物。在一種實施方式 中，方法和組合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸含有可操作連接至在 植物細(xì)胞中有活性的啟動子的靶害蟲序列沉默元件；第二多核苷酸含有包含靶害蟲序列或 其活性片段或變體的、可操作連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動子的抑制增強(qiáng)元件。沉默 元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)導(dǎo)致由沉默元件產(chǎn)生的抑制性RNA的擴(kuò)增相對于沉默元 件單獨表達(dá)可實現(xiàn)的擴(kuò)增增加。還提供了防治害蟲的方法。該方法包括飼喂害蟲含有包含害蟲靶序列沉默元件的 第一多核苷酸和包含抑制增強(qiáng)元件的第二多核苷酸的植物細(xì)胞。還提供了含有植物、植物細(xì)胞、植物部分、種子和包含第一多核苷酸和第二多核苷 酸的載體的組合物，所述第一多核苷酸含有可操作連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動子的 靶害蟲序列的沉默元件；所述第二多核苷酸含有可操作連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動 子的抑制增強(qiáng)元件，所述抑制增強(qiáng)元件包含靶害蟲序列或其活性變體或片段。附圖簡述

圖1提供了抑制構(gòu)建體的非限制性圖示。
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發(fā)明詳述下文將參照附圖更充分地描述本發(fā)明，其中僅顯示了部分而非全部的實施方式。 事實上，本發(fā)明可具體化成多種不同形式且不應(yīng)解釋成限于本文所列的實施方式；相反，提 供這些實施方式以便本公開滿足可適用的法律要求。通篇地，同樣的數(shù)字表示的是同樣的 元素。受益于前述說明和相關(guān)附圖中給出的教導(dǎo)的本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員會想到本 文所述的本發(fā)明的多種修改和其他實施方式。因此，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明并不限于所公開 的特定實施方式，修改和其他實施方式也包括在所附權(quán)利要求的范圍中。盡管本文采用了 特定術(shù)語，但是僅以一般性和描述性意義而非限制性目的使用它們。I.概述提供了增強(qiáng)細(xì)胞中靶序列特異抑制性RNA(RNAi)濃度的方法和組合物。在一種實 施方式中，方法和組合物采用了第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸含有可操作 連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動子的靶害蟲序列的沉默元件；第二多核苷酸含有包含靶 害蟲序列或其活性變體或片段的、可操作連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動子的抑制增強(qiáng) 子。沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)導(dǎo)致由沉默元件產(chǎn)生的抑制性RNA的擴(kuò)增相對于 沉默元件單獨表達(dá)可實現(xiàn)的擴(kuò)增增加。除增強(qiáng)擴(kuò)增特定RNAi物質(zhì)本身之外，該方法和組 合物還允許產(chǎn)生不同種群的RNAi物質(zhì)，其可增強(qiáng)阻斷靶基因表達(dá)的效力。因此，當(dāng)在植物 細(xì)胞中聯(lián)合表達(dá)抑制增強(qiáng)元件和沉默元件時，該方法和組合物可允許整個植物系統(tǒng)性產(chǎn)生 RNAi ；比僅由單獨的沉默元件構(gòu)建體觀察到的產(chǎn)生更大量的RNAi ；并且改善RNAi裝載至植 物韌皮部，因而提供通過RNAi方法更好地防治進(jìn)食韌皮部的昆蟲。因而，本發(fā)明的多種方 法和組合物提供了將抑制性RNA遞送至靶生物體的改善方法。如本文所用的，“防治(controlling)害蟲”或“防治(controlls)害蟲”是指會造 成限制害蟲引起的損失的對害蟲的任何影響。防治害蟲包括但不限于殺死害蟲、抑制害蟲 發(fā)展、改變害蟲多產(chǎn)或生長，以致害蟲對植物造成更小的損失，降低所產(chǎn)生的后代數(shù)量，產(chǎn) 生較不健康的害蟲，產(chǎn)生更易受捕食者攻擊的害蟲，或阻止害蟲侵食植物?！凹膊】剐浴笔侵钢参锩馐苡芍参锊≡w相互作用引起的疾病癥狀。即，阻止病原 體引起植物疾病和相關(guān)疾病癥狀，或可選地，最小化或減少病原體引起的疾病癥狀。降低害蟲中靶多核苷酸或由其編碼的多肽的表達(dá)水平會造成抑制、控制、和/或 殺死侵入的病原體生物。降低害蟲靶序列的表達(dá)水平會將由病原體侵襲造成的疾病癥狀降 低至少約2% -至少約6%，至少約5% -至少約50%，至少約10% -至少約60%，至少約 30% -至少約70%，至少約40% -至少約80%，或至少約50% -至少約90%或更多。因 而，可利用本發(fā)明的方法保護(hù)植物免受疾病。測量害蟲防治的測定法是本領(lǐng)域公知的，如感染病原體之后定量植物中疾病抗性 的方法。參見，例如美國專利第5，614，395號，將其通過引用并入本文。這些技術(shù)包括持續(xù) 測量損傷的平均直徑，病原體生物量和腐爛植物組織的整體百分比。參見，例如Thomma et al. (1998)Plant Biology 95 :15107_15111，通過引用將其并入本文。也參見以下實施例。在一種實施方式中，提供了保護(hù)植物免受植物害蟲的組合物和方法。在特定實施 方式中，該方法產(chǎn)生的RNAi不會降低植物序列或來自非靶向動物的其他序列的表達(dá)水平， 所述動物包括但不限于害蟲的捕食者(即瓢蟲幼蟲、花蝽、草蛉、寄生蜂、或食蚜蠅幼蟲)或動物例如人、哺乳動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物等。 本發(fā)明的病原體(害蟲)包括但不限于病毒或類病毒、細(xì)菌、昆蟲、線蟲、真菌 等等。病毒包括任何植物病毒，例如煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒、壞死病毒、玉米矮 花葉病毒等。真菌病原體包括但不限于禾生剌盤孢(Colletotrichum graminocola)、 玉蜀黍殼色單隔孢菌(Diplodia maydis)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)禾口 串珠鐮刀菌(Fusarium verticillioides) 0主要作物的特定病原體包括大豆大豆 疫病菌(Phytophthora megasperma fsp. Glycinea)，大豆碳腐病菌(Macrophomina phaseolina)，立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)，核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)， 尖抱德刀菌(Fusarium oxysporum), Diaporthe phaseolorum var. sojae ( M 點病 (Phomopsis so jae))，大豆北方蓮饋痛病菌(Diaporthe phaseolorum var. caulivora)， 白絹病菌(Sclerotium rolfsii)，大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)，大豆灰斑 病菌(Cercospora sojina)，大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica)，束狀剌盤 包(Colletotrichum dematium(炭痕病菌(Colletotichum truncatum)),多主棒 包 病菌(Corynespora cassiicola)，大豆褐紋病菌(Septoria glycines)，大豆灰星病 M (Phyllosticta sojicola),(Alternaria alternata), T^iU^-MM
大豆致病變種(Pseudomonas syringae p. v. glycinea)，野油菜黃單胞菌菜豆致病型 (Xanthomonas campestris p. v. phaseoli)，大顯白粉病菌(Microsphaera diffusa)，半 裸鐮刀病菌(Fusarium semitectum)，大豆蓮褐腐病菌(Phialophora gregata)，大豆花 葉病毒(Soybean mosaic virus)，大豆小從殼菌(Glomerella glycines)，煙草環(huán)斑病 毒(Tobacco Ring spot virus)，煙草條紋病毒(Tobacco Streak virus)，豆薯層銹菌 (Phakopsora pachyrhizi)，瓜果腐霉菌(Pythium aphani derma turn)，終極腐霉菌(Pythium ultimum)，罾巴禾I」冑 β (Pythium debaryanum)， ^ M M ^ (Tomato spotted wilt virus)，大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)，,廉抱菌(Fusarium solani)；卡 諾拉大豆:白銹菌(Albugo Candida)，白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)，油菜 蓮基饋痛病菌(Leptosphaeria maculans)，立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)，菌核 病(Sclerotinia sclerotiorum),油菜環(huán)斑病菌(Mycosphaerella brassicicola)， 終極腐霉菌(Pythium ultimum),寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)，粉紅鐮刀 菌(Fusarium roseum)，互隔交鏈孢菌(Alternaria alternata)；苜猜密執(zhí)安棒桿 菌詭譎亞禾中(Clavibacter michiganese subsp. Insidiosum)，終極腐霉菌(Pythium ultimum)，畸雌腐霉菌(Pythium irregulare)，華麗腐霉菌(Pythium splendens)，德巴 禾1J腐霉菌(Pythium debaryanum)，瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，大豆疫病菌 (Phytophthora megasperma)，三葉草霜霉菌(Peronospora trifoliorum)，蓮點霉苜猜變 禾中(Phoma medicaginis var. medicaginis)，首猜尾抱(Cercospora medicaginis)，首猜 褐斑病菌(Pseudopeziza medicaginis)，苜猜黃斑病菌(Leptotrochila medicaginis)， 尖抱德刀菌(Fusarium oxysporum),苜猜黃萎病菌(Verticilliam albo-atrum)，古月 蘿卜細(xì)菌性葉斑病菌(Xanthomonas campestris p. v. alfalfae)，豌豆根腐絲囊霉 (Aphanomyces euteiches)，枯葉格孢腔菌匍柄霉(Stemphylium herbarum)，苜猜匍柄 霉(Stemphylium alfalfae)，三葉草剌盤孢菌(Colletotrichum trifolii)，苜蓿小光殼 菌(Leptosphaerulina briosiana)，條紋單胞誘菌(Uromyces striatus)，三葉草核盤菌(Sclerotinia trifoliorum)，草木犀殼多抱菌(Stagonospora meliloti)，葉枯病菌 (Stemphylium botryosum),苜猜纖毛菌(Leptotrichila medicaginis)小麥丁香假單胞 ^fjiHfji^l^ft (Pseudomonas syringae p. v. atrofaciens), /h^ff Hi)·^! ' (Urocystis agropyri),里予油菜黃單胞菌小麥至文病變禾中(Xanthomonas campestris p. v. translucens), 丁香假單胞桿菌桑樹致病變種(Pseudomonas syringae p. v. syringae)，互隔交鏈孢菌 (Alternaria alternate),多主枝抱霉(Cladosporium herbarum),禾谷鍵抱菌(Fusarium graminearum)，燕麥鏈抱菌(Fusarium avenaceum)，黃色鍵抱菌(Fusarium culmorum), 小麥散黑粉病菌(Ustilago tritici)，小麥莖枯病菌(Ascochyta tritici)，麥類條斑 病菌(Cephalosporium gramineum)，禾谷炭 Ι 病菌(Collotetrichum graminicola)， 小麥白粉病菌(Erysiphe graminis f. sp. tritici),小麥稈銹病菌(Puccinia graminis f. sp. tritici), /」、麥卩十銹菌(Puccinia recondita f. sp. tritici), /」、麥 條繡菌(Puccinia striiformis),小麥褐斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis), 小麥穎枯病病菌(S印toria nodorum)，小麥殼針孢(S^toria tritici)，燕麥殼針孢 (Septoria avenae),小麥基腐病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)，立枯 絲核菌(Rhizoctonia solani)，禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)，小麥全蝕病菌 (Gaeumannomyces graminis var. tritici)，瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)， 多雄腐霉菌(Pythium arrhenomanes)，終極腐霉菌(Pythium ultimum)，小麥根腐病菌 (Bipolaris sorokiniana),大麥黃矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus),雀麥花葉病毒 (Brome Mosaic Virus)，±#/j、胃#口十__ (Soil Borne Wheat Mosaic Virus)， 條花葉病毒(Wheat Streak Mosaic Virus)，小麥紡錘線條病毒(Wheat Spindle Streak Virus)，美洲小麥條紋病毒(American Wheat Striate Virus)，黑麥麥角菌(Clavic印s purpurea)，小麥腥黑穗病菌(Tilletia tritici)，Tilletia laevis，小麥散黑粉病菌 (Ustilago tritici)，小麥印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)，立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)， Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola,瓜果腐 β 菌(Pythium aphanidermatum),高平原病毒(High Plains Virus),歐洲小麥條紋病毒(European wheat striate virus)；向日葵霍爾其斤單鈾霉(Plasmopora halstedii),核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum), '^MM'it^lM (Aster Yellows), ( ι] H Μτ Ψ^Μ (Septoria helianthi), 向日葵褐紋病菌(Phomopsis helianthi),向日葵黑斑病菌(Alternaria helianthi), 百日草鏈格孢菌(Alternaria zinniae)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，莖點霉黑 蓮病菌(Phoma macdonaldii)，大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina),白粉病菌 (Erysiphe cichoracearum)，米f艮霄(Rhizopus oryzae),(Rhizopus arrhizus),
葡枝根霉(Rhizopus stolonifer),向日葵柄銹菌(Puccinia helianthi)，大麗輪枝 胃(Verticillium dahliae), 3 卜 @ 冑 古月胃卜禾中(Erwinia carotovorum pv. carotovora),頂頭抱霉菌(Cephalosporium acremonium),隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)，白 f秀菌(Albugo tragopogonis)；玉米禾生炭 Ι 菌(Colletotrichum graminicola),玉米頂腐病菌(Fusarium moniliforme var. subglutinans),斯氏歐文 菌(Erwinia stewartii),輪狀鐮孢(F. verticillioides),玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae(禾谷鍵抱菌(Fusarium graminearum))，玉米穗腐病菌(Stenocarpella maydi (馬 伊德殼色單隔孢(Diplodia maydis))，畸雌腐霉菌(Pythium irregulare)，德巴利腐(Pythium debaryanum)，禾草腐# (Pythium graminicola)，華麗腐(Pythium splendens)，終極腐霉菌(Pythium ultimum)，瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)， 黃曲霉菌(Aspergillus flavus)，玉米小斑病菌 0、T(Bipolaris maydis 0，T(玉米小 斑菌(Cochliobolus heterostrophus),玉米圓斑病菌 I, II 禾口 III (Helminthosporium carbonum I，II & III (玉米圓斑菌(Cochliobolus carbonum))，玉米大斑病菌 I，II 和 III (Exserohilum turcicum 1,11 & II I),螺抱菌(Helminthosporium pedicel latum),玉 米褐斑病(Physoderma maydis)，玉米黃葉枯病菌(Phyllosticta maydis)，玉蜀黍球梗孢 菌(Kabatiella maydis)，高粱紫斑病菌(Cercospora sorghi)，玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)，玉米銹病菌(Puccinia sorghi)，玉米多堆柄銹菌(Puccinia polysora)，枯腐 菌(Macrophomina phaseolina)，草酸青霉(Penicillium oxalicum)，禾S黑抱(Nigrospora oryzae),(Cladosporium herbarum), Sfife lif (Curvularia lunata), ^^
(Curvularia inaequalis), ^ S Sf (Curvularia pallescens)，EEL 氏_ 胃 t生妻 病lif (Clavibacter michiganense subsp. nebraskense)，M^y^M (Trichoderma viride)，玉米矮花葉病毒A&B(Maize Dwarf Mosaic Virus A&B)，小麥線條花葉病毒 (Wheat Streak Mosaic Virus)，玉米黃萎病毒(Maize Chlorotic Dwarf Virus)，高粱 麥角菌(Clavic印s sorghi)，玉米細(xì)菌性葉疫病菌(Pseudonomas avenae)，/K稻基腐病 菌(Erwinia chrysanthemi pv.zea),古月蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora),谷 物矮小螺原體(Cornstunt spiroplasma),大孢殼色單隔孢(Diplodia macrospore), Sclerophthora macrospora，大 包才旨疫霄(Peronosclerospora sorghi)，菲律賓才旨If 霄 (Peronosclerospora philippinensis)，玉蜀泰指霜霄(Peronosclerosporamaydis),甘 蔴指霜霉(Peronosclerospora sacchari)，高梁絲黑穗菌(Sphacelotheca reiliana), 玉米殼銹菌(Physopella zeae),玉蜀黍頭孢霉(C^phalosporium maydis),頂頭孢霉菌 (Cephalosporium acremonium),玉米黃萎斑點病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus), 高平原病毒(High Plains Virus)，玉米花葉病毒(Maize Mosaic Virus)，玉米雷亞多非 納病毒(Maize Rayado Fino Virus)，玉米線條病毒(Maize Streak Virus)，玉米條紋病 毒(Maize Stripe Virus)，玉米粗矮縮病毒(Maize Rough Dwarf Virus)高粱玉米大斑 病菌(Exserohilum turcicum),炭疽刺盤孢(C. sublineolum),高粱紫斑病菌(Cercospora sorghi),高粱銅斑病菌(Gloeocercospora sorghi),高梁粗斑殼二孢(Ascochyta sorghina)，丁香單 1&桿菌丁香至文病$禾中(Pseudomonas syringae p. v. syringae), ^ 菜黃單胞菌絨毛草致病變種(Xanthomonas campestris p. v. holcicola)，高粱假單胞菌 (Pseudomonas andropogonis)，秀胃(Puccinia purpurea)，才古(Macrophomina phaseolina), Perconia circinata,串珠鍵抱霉菌(Fusarium moniliforme),互隔交鏈 MM (Alternaria alternate), i^^^BgE^I^I^ (Bipolaris sorghicola)， ι^Μ Ι 包 (Helminthosporium sorghicola)，新月彎抱菌(Curvularia lunata)，高梁蓮點霉(Phoma insidiosa),玉米細(xì)菌性葉疫病菌(Pseudomonas avenae (玉米疫病菌(Pseudomonas alboprecipitans))，高梁座枝抱(Ramulispora sorghi)，高梁生座枝抱(Ramulispora sorghicola), Phyllachara sacchari, Ε M ^M'M M (Sporisorium reilianum( M 梁絲黑！!菌(Sphacelotheca reiliana))，高梁車由黑粉菌(Sphacelotheca cruenta), 高粱堅黑穗病(Sporisorium sorghi)，甘蔗花葉病毒H(Sugarcane mosaic H)，玉米矮花葉病毒 A&B(Maize Dwarf Mosaic Virus A&B)，高粱麥角菌(Claviceps sorghi)，立 枯絲核菌(Rhizoctonia solani)，枝頂孢霉(Acremonium s trie turn)，黃化萎縮病菌 (Sclerophthona macrospora)，高梁霜霉病菌(Peronosclerospora sorghi)，菲律賓指霜 霉(Peronosclerospora philippinensis)，禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)，禾谷 ,廉抱菌(Fusarium graminearum)，尖抱德刀菌(Fusarium oxysporum)，多雄腐霉(Pythium arrhenomanes)，禾草腐霉(Pythium graminicola)等。線蟲包括寄生線蟲類例如根癌、胞囊和損傷線蟲，包括胞囊線蟲屬(Heterodera spp·)，根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne spp.)和球形胞囊線蟲(Globodera spp.)；特別地， 胞囊線蟲的成員包括但不限于，大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines (soybem cyst nematode))；舌甘菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii (beet cyst nematode))；谷物胞囊線 蟲(Heterodera avenae (cereal cyst nematode))；禾口馬鈴薯球形胞囊線蟲(Globodera rostochiensis)禾口馬鈴薯球形胞囊線蟲(Globodera pallida (potato cyst nematodes))。 損傷線蟲包括根腐線蟲屬(Pratylenchus spp.)。昆蟲蟲害包括選自以下目的昆蟲鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同 翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、鞘翅目和鱗翅目。主 要作物的本發(fā)明蟲害包括玉米歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis, European corn borer)；小地老虎，黑地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；美洲棉鈴蟲，棉鈴 蟲(Helicoverpa zea，corn earworm)；草地貪夜蛾，秋夜娥(Spodoptera frugiperda， fall armyworm)；西南玉米蟲冥(Diatraea grandiosella，southwestern corn borer)；南 美玉米苗斑螟，小型玉米蓮螟(Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)； 小蔴螟，甘蔴螟(Diatraea saccharalis，surgarcane borer)；玉米幼芽根葉甲，西部玉 米豐艮葉甲(Diabrotica virgifera, western corn rootworm)；長角葉甲，！匕部玉米豐艮葉 甲(Diabrotica longicornis barberi，northern corn rootworm)；黃瓜十一星葉甲，南 部玉米根葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi, southern corn rootworm) ；口 頭蟲，金針蟲(Melmotus spp.，wireworms)；北部圓頭獨角仙，北部圓頭犀金龜(蠐螬) (Cyclocephala borealis，northern masked chafer (white grub))；無斑圓頭獨角仙， 南部圓頭犀金龜(擠贈)(Cyclocephala immaculata，southern masked chafer (white grub))；日本金龜子，日本麗金龜(Popillia japonica，Japanese beetle)；玉米跳 ψ (Chaetocnema pulicaria, corn flea beetle)；谷 _ 甲，玉 f 谷 | (Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米蟲牙，玉米葉蟲牙(Rhopalosiphum maidis，corn leaf aphid)；玉蜀黍根蟲牙，玉米根蟲牙(Anuraphis maidiradicis，corn root aphid)；麥長 蟲舂，長蟲舂(Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug)；紅腿蟲皇(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；遷徙蚱蟲孟(Melanoplussanguinipes, migratory grasshopper)；灰禾中蟲黽，禾中蟲黽(Hylemya platura，seedcorn maggot)；美洲黍潛葉蟲黽， 玉米斑點潛葉蟲(Agromyza parvicornis, corn blot leafminer)；玉米薊馬，暗薊馬 (Anaphothrips obscrurus， grass thrips)；火蟲義(Solenopsis milesta， thief ant)； 二 斑葉螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；高梁玉米螟(Chilo partellus, sorghum borer)；草地貪夜娥，秋夜娥(Spodoptera frugiperda, fall armyworm)；棉鈴蟲，玉米夜蛾(Helicoverpa zea, corn earworm)；南美玉米苗斑螟，小型玉米蓮螟(Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)；粗粒夜蛾(reltia subterranea，granulate cutworm)；擠贈(Phyllophaga crinita，white grub)；金針蟲 (Eleodes，Conoderus, and Aeolus spp.，wireworms)；禮足負(fù)泥蟲(OuIema melanopus， cereal leaf beetle)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria，corn flea beetle)；玉米象 蟲(Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米蟲牙(Rhopalosiphum maidis ；corn leaf aphid) ；蟲牙(Sipha flava,yellow sugarcane aphid) ；(Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug) ； M ^ ^ K (Contarinia sorghicola, sorghum midge)；朱 砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus，carmine spider mite) ；二斑葉螨(Tetranychus urticae， twospotted spider mite)小麥粘蟲(Pseudaletia unipunctata， army worm)；草地貪夜蛾，秋夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；南美玉米苗斑 螟，小型玉米蓮螟(Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)；西部夜蛾 (Agrotis orthogonia,western cutworm)；南美玉米苗斑螟，小型玉米蓮螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；禮足負(fù)泥蟲(OuIema melanopus，cereal leaf beetle)；三葉草葉象，車軸草葉象(Hypera punctata，clover leaf weevil)；南部玉 米線蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi, southern corn rootworm)；俄羅斯 麥蟲牙(Russian wheat aphid)；麥二叉蟲牙(Schizaphis graminum，greenbug)；麥長管 蟲牙(Macrosiphum avenae，English grain aphid)；紅腿蟲皇(Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper)；殊禾中蟲皇(Melanopplus differentialis, differential grasshopper)；遷徙炸蟲孟(Melanoplus sanguinipes, migratory grasshopper) ； 岐(Mayetiola destructor, Hessian fly)；麥紅吸楽蟲(Sitodiplosis mosellana, wheat midge)；麥禾干蟲黽(Meromyza americana，wheat stem maggot)；麥禾中蟲黽(Hylemya coarctata, wheat bulb fly)；煙草薊馬(Frankliniella fusca，tobacco thrips)；灰翅麥蓮蜂 (Cephus cinctus,wheat stem sawfly)；小麥卷葉螨(Aceria tulipae，wheat curl mite)； 向日葵向日葵頂芽卷葉蛾(Suleima helianthana，sunflower bud moth)；向日葵斑螟 (Homoeosoma electellum，sunflower moth)；向日奏金龜(zygogramma exclamationis, sunflower beetle)；古月蘿卜金龜(Bothyrus gibbosus，carrot beetle)；向日葵籽搖蚊 (Neolasioptera murtfeldtiana，sunflower seed midge) ；綠棉鈴蟲(Heliothis virescens，cotton budworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea，cotton bo 11 worm)；舌甘菜 夜娥(Spodoptera exigua，beet armyworm)；棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella, pink bo 11 worm)；棉鈴象甲(Anthonomus grandis，boll weevil)；棉蟲牙(Aphis gossypii, cotton aphid)；棉跳盲蟲舂(Pseudatomoscelis seriatus，cotton fleahopper)；溫室粉 風(fēng)(Trialeurodes abutilonea, bandedwinged whitefly)；牧草盲蟲舂(Lygus lineolaris， tarnished plant bug)；紅腿蟲皇(Melanoplus femurrubrum, redlegged grasshopper)； 殊禾中蟲皇(Melanoplus differentials，differential grasshopper)；煙薊馬，蔥薊馬 (Thrips tabaci, onion thrips)；煙草薊馬(Franklinkiella fusca, tobacco thrips)； 朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus，carmine spider mite) ；二斑葉螨(Tetranychus urticae, twospotted spider mite)水禾因甘鹿蟲冥(Diatraea saccharalis，sugarcane borer)；草地貪夜蛾，秋夜娥(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；美洲棉鈴蟲 (Helicoverpa zea, corn earworm)；葡萄銷葉甲(Colaspis brunnea，grape colaspis)；禾苗水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus, rice water weevil)；米象(Sitophilus oryzae, rice weevil)；漂尾葉蝶(Nephotettix nigropictus，riceleafhopper)；麥長蟲舂(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；綠色惡臭臭蟲(Acrosternum hilare，green stink bug)大豆豆卷卩十蟲冥(Pseudoplusia includens, soybean looper)；豆青蟲 (Anticarsia gemmatalis, velvetbean caterpillar)；胃(Plathypena scabra, green cloverworm)；歐效、1、|玉米蟲冥(Ostrinia nubilalis, European corn borer) ；Mi也老 虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；舌甘菜夜蛾(Spodoptera exigua, beet armyworm)； 綠棉鈴蟲(Heliothis virescens，cotton budworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea， cotton bo 11 worm)；墨西哥豆票瓜蟲(Epilachna varivestis, Mexican bean beetle)； 煙桃蟲牙(Myzus persicae，green peach aphid)；馬鈴薯小綠葉蝶(Empoasca fabae， potato leafhopper)；綠色惡臭臭蟲(Acrosternum hilare, green stink bug)；紅 腿蟲皇(Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper)；殊禾中蟲皇(Melanoplus differentialis， differential grasshopper)；灰禾中蟲黽(Hylemya platura， seedcorn maggot)；豆 J馬(Sericothrips variabilis, soybean thrips)；煙 J馬，蔥 J馬(Thrips tabaci, onion thrips) ；土耳其斯fiO十蟲葡(Tetranychus turkestani, strawberry spider mite) ；二斑葉螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)大麥歐洲玉米 蟲冥(Ostrinia nubilalis, European corn borer) ； Mi也老虎(Agrotis ipsilon, black cutworm)；麥二叉蟲牙(Schizaphis graminum，greenbug)；麥長蟲舂(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；綠色惡臭臭蟲(Acrosternum hilare, green stink bug)； 揭Μ蟲春(Euschistus servus, brown stink bug)；灰地禾中蟲竜(Delia platura, seedcorn maggot) ； S(Mayetiola destructor, Hessian fly) ；* Hil ■蟲朱(Petrobia
latens, brown wheat mite)油菜甘藍(lán)蟲牙(Brevicoryne brassicae，cabbage aphid)；蔬 菜黃條跳甲(Phyllotreta cruciferae，F(xiàn)lea beetle)；稽帶夜蛾(Mamestra configurata， Bertha armyworm)；小菜蛾(Plutella xylostella, Diamond-back moth)；根蟲且(Delia ssp.，Root maggots) 0在一種實施方式中，害蟲是來自半翅目。半翅目包括四個亞目胸喙亞目(例如 蚜蟲、粉虱)、頭喙亞目(例如蟬、葉蟬)、鞘喙亞目和異翅亞目(例如臭蝽)。因此，組合物 和方法可用于保護(hù)植物免于半翅目的任何成員，包括大葉蟬科、角蟬科、蠟蟬科、介殼蟲、蚜 科、長蝽科、蝽科、和盲蝽科。在其它實施方式中，害蟲來自草盲蝽屬。草盲蝽屬包括盲蝽科的超過40種植食 性昆蟲。如本文所用的，“草盲蝽”或“草盲臭蝽”用于表示草盲蝽屬的任何成員。因此，組 合物和方法也用于保護(hù)植物免于任何草盲蝽，包括例如多疤盲蝽(Lygus adspersus)，賀蘭 山盲蟲春(Lygus alashanensis), ；!匕部盲蟲春(Lygus borealis), Lygus elisus,青參錄草盲蟲春 (Lygus gemellatus)，豆莢盲蟲春(Lygus Hesperus)，牧草盲蟲春(Lygus lineolaris)或Lygus rugulipermis。在特定實施方式中，該方法防治豆莢盲蝽。在其它實施方式中，害蟲來自鱗翅目。鱗翅目昆蟲的毛蟲和相關(guān)形式包括一重要 組的尤其在生長的幼蟲階段期間的植食農(nóng)業(yè)害蟲。鱗翅目幼蟲的飼喂方法通常包括咀嚼植 物或植物部分。如本文所用，術(shù)語“鱗翅目”指鱗翅目的任何成員。在特定實施方式，本發(fā) 明的組合物和方法防治鱗翅目幼蟲(即毛蟲)。因此，該組合物和方法還可以用于保護(hù)植物免于鱗翅目，包括例如菜粉蝶(Pieris rapae)，棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)， ΙΙ^Μ (Synanthedon exitiosa) ,Melittia cucurbitae，(Cydi a pomonella)， 梨小食心蟲(Grapholita molesta)，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，印度谷螟 (Plodia interpunctella)，大錯螟(Galleria mellonella)，煙草天蛾(Manduca sexta)， 煙青蟲(Manduca quinquemaculata)，舞毒蛾(Lymantria dispar)，掠尾毒蛾(Euproctis chrysorrhoea), f^^M (Trichoplusia(Mamestrabrassicae), Mit^ll^
(Agrotis ipsilon)或Spodoptera littoralis。在特定實施方式中，所述害蟲是草地貪夜 娥(Spodoptera frugiperda)0 在其它實施方式中，害蟲來自蚜科。此處所使用的術(shù)語“蚜科(Aphididae)” 或“蚜蟲(Aphid)”用于表示蚜蟲科的任何成員。因此，組合物和方法也用于保護(hù)植 物免于任 可蟲牙蟲，包括例如t兆蟲牙(peach-potato aphid Myzus persicae)，豆蟲牙(the bean aphid Aphis fabae)，豌豆蟲牙(the pea aphid Acyrthosiphum pi sun),甘藍(lán)蟲牙 (the cabbage aphid Brevicoryne brassicae)，蟲牙(the grain aphid Sitobion avenae)，麥無網(wǎng)長管蟲牙(the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum)，俄羅斯麥 蟲牙(麥雙尾蟲牙)(the Russian wheat aphid Diuraphis noxia (Mordvilko)),麥長管 蟲牙(the English grain aphid，Macrosiphum avenae)，麥二叉蟲牙(the greenbug aphid Schizaphisgraminum(Rondani))，古月蘿卜埃二 尾蟲牙(the carrot aphid Cavariella aegopodii)，馬鈴薯蟲牙(the potato aphid Macrosiphum euphorbiae)，豆蟲牙(the groundnut aphid Aphis craccivora)，棉蟲牙(the cotton aphid Aphis gossypii), M 柑橘蟲牙(the black citrus aphid Toxoptera aurantii)，褐柑橘蟲牙(the brown citrus aphid Toxoptera ciidius)，柳蟲牙(the willow aphid Cavariella spp.)，玉米葉蟲牙 (the corn leaf aphid Rhopalosiphum maidis)，禾谷溢管蟲牙(the aphid Rhopalosiphum padi)，柳葉蟲牙(the willow leaf aphids Chaitophorus spp.)，漂松蟲牙(the black pine aphids Cinara spp.)，■蟲牙(the sycamore aphid Drepanosiphum platanoides), 云杉蟲牙(the spruce aphids Elatobium spp.)，繡線菊蟲牙(Aphis citricola)，蕪菁蟲牙 蟲(Lipaphis pserudobrassicae (turnip aphid))，Nippolachnus piri，毛地黃蟲牙(the foxglove aphid Aulacorthum solani)，戸異蟲牙(the asparagus aphid Brachycorynella asparagi)，掠色豚草蟲牙(the brown ambrosia aphid Uroleucon ambrosiae)，鼠李禾斗蟲牙蟲 (the buckthorn aphid Aphis nasturtii)，玉米根部蟲牙蟲(the corn root aphid Aphis maidiradicis)，the cresentmarked lily aphid Neomyzus circumflexes，金色蟲牙蟲(the goldenglow aphid Dactynotus rudbeckiae)，，忍冬蟲牙(the honeysuckle and parsnip aphid Hyadaphis foeniculi)，洋李梅蟲牙(the leafcurl plum aphid Brachycaudus helichrysi)，囊柄; 綿蟲牙(the lettuce root aphid Pemphigus bursarius)，薄荷蟲牙(the mint aphid Ovatus crataegarius),卓月魚羊 J 蟲牙(the artichoke aphid Capitophorus elaeagni)，洋蔥蟲牙(the onion aphid Neotoxoptera formosana)，豌豆蟲牙(the pea aphid Macrosiphum pisi)，生誘梅蟲牙(the rusty plum aphid Hysteroneura setariae)， 蔥蟲牙(the shallot aphid Myzus ascalonicus)，前根蟲牙(the solanum root aphid Smynthurodes betae)，舌甘菜根蟲牙(the sugarbeet root aphid Pemphigus betae)，百合西 圓尾蟲牙(the tulip bulb aphid Dysaphis tulipae)，西方紫苑根蟲牙(the western asterroot aphid Aphis armoraciae),白紫苑根蟲牙(the white aster root aphid Prociphilus erigeronensis)。在特定實施方式中，該方法防治大豆蚜(the soybean aphid Aphis glycines)。在一種實施方式中，害蟲是植物汁液吸食昆蟲。本文所使用的“植物汁液吸食昆 蟲”指的是，使用其可插入到植物中的尖利口部從植物維管系統(tǒng)中獲取流體的植食性昆蟲。 在一種實施方式中，這些是直接以植物維管系統(tǒng)中的流體為食的昆蟲。在插入位點，植物細(xì) 胞還可以遭到破壞，不管其是否可以用作植物汁液吸食昆蟲的食物來源。這些昆蟲是植物 害蟲，因為其取食降低了其取食莊稼的生命力，并且它們能夠傳播病毒疾病。此外，這樣的 植物汁液吸食昆蟲能夠制造稱為蜜露的富含糖的流體，其蓄積在植物的較低部位，這樣的 部位很快變得由被稱為煙霉的特定黑色或褐色的真菌所覆蓋，從而干擾光合作用。包含在這樣的植物汁液吸食昆蟲中的是蚜蟲(aphids)或同翅目蚜(Homopteran insects of the Aphididae)，并且本文所使用的植物汁液吸食昆蟲包含但不限于，桃-馬
(peach-potato aphid Myzus persicae) ,SL^ (the bean aphid Aphis fabae), 豆豆蟲牙(the pea aphid Acyrthosiphumpisun)，甘藍(lán)蟲牙(the cabbage aphid Brevicoryne brassicae)，谷類蟲牙(the grain aphid Sitobion avenae)，舊蔽屬谷類蟲牙(the rose-gram aphid Metopolophium dirhodum)，俄羅斯麥蟲牙(麥雙尾蟲牙)(the Russian wheat aphid Diuraphis noxia(Mordvilko)),麥長管蟲牙(the English grain aphid， Macrosiphum avenae)；麥二叉蟲牙(the greenbug aphid Schizaphis graminum(Rondani))，古月蘿卜蟲牙 (the carrot aphid Cavariella aegopodii)，馬鈴薯蟲牙(the potato aphid Macrosiphum euphorbiae)，落花生蟲牙(the groundnut aphid Aphiscraccivora)，豐帛蟲牙(the cotton aphid Aphis gossypii)，Mffl"IS (the black citrus aphid Toxoptera aurantii)， 褐柑橘蟲牙(the brown citrus apid Toxoptera ciidius)，柳蟲牙(the willow aphid Cavariella spp. )，HP十蟲牙(the corn leaf aphid Rhopalosiphum maidis), 蟲牙(the aphid Rhopalosiphum padi)，柳葉蟲牙(the willow leaf aphids Chaitophorus spp·)，Μ 公蟲牙(the black pine aphids Cinara spp·)，美國梧桐蟲牙(the Sycamore Aphid Drepanosiphum platanoides)，云杉蟲牙(the Spruce aphids Elatobium spp.)，繡線菊 蟲牙(Aphis citricola)，小褐色飛風(fēng)(灰飛風(fēng)(Laodelphax striatellus) Lipaphis (small brown planthopper))，水禾§褐色飛風(fēng)(Nilaparvata lugens (rice brown plant hopper)) 禾口白背水稻飛風(fēng)(Sogatella furcifera (white-backed rice planthopper))禾口 葉蝶 (Deltocephalidae)(或葉蝶(Ieafhoppers))例如 Flexamia DeLong spp.，漂尾葉蝶 (Nephotettix cincticeps)禾口黑尾夜蛾(Nephotettix virescens)，小葉綠蝶(Amrasca bigutulla)，禾口馬鈴暮小綠葉蝶(the potato leafhopper Empoasca filament)。除了網(wǎng)疇 科(Tingidae (或lace bugs))、木虱科(Psyllidae)昆蟲和沫蟬科(spittle)臭蟲之外， 同樣被包括在內(nèi)的是蚧(又名介殼蟲)，例如紅圓蚧(Aonidiella aurantii (California red scale))，梨圓盾階(Comstockaspis perniciosa (San Jose scale))，桔盾階(Unaspis citri (citrus snow scale))，桃介殼蟲(Pseudaulacaspis pentagona (white peach scale))，欖珠臘蚧(棕橄欖介殼蟲)(Saissetia ο Ieae (brown olive scale))，紫牡蠣蚧 (紫介殼蟲)(Lepidosaphes beckii (purple scale))，紅臘階(Ceroplastes rubens (red wax scale))和吹綿介殼蟲(Icerya purchasi (cottonycushion scale))。
還包含在植物汁液吸食昆蟲中的是以植物維管系統(tǒng)為食的頭喙部異翅目和半翅 目昆蟲，例如蟬科(例如蟬)、沫蟬科(沫蟬(spittlebugs)或沫蟬(froghoppers))、角蟬 科(Membracoidea)(葉蟬(Ieafhoppers)和角蟬(treehoppers))以及賭蟬科(飛虱科) (Fulgoroidea (planthoppers))，例如吮食棉籽的棉紅蝽(異翅目紅蝽科)，蘋果酒窩盲蜷 (the apple dimpling bug, Campylomma liebknechti)(半翅目盲蝽科)，和吸食棉花的昆 蟲害蟲greenmirid，Creontiades dilutus，以及草盲蝽(半翅目盲蝽科，例如豆莢草盲蝽 (Lygus hesperus))的汁液吸食昆蟲。II.靶序列本文所用的“靶序列”包含害蟲中期待降低表達(dá)水平的任何序列。在特定實施方 式中，靶序列來自害蟲。在進(jìn)一步的實施方式中，降低害蟲中靶序列水平防治害蟲。例如， 靶序列對于生長和發(fā)育可以是必需的。盡管靶序列可以在害蟲中任何組織表達(dá)，在本發(fā)明 的特定實施方式中，害蟲中靶向抑制的序列在害蟲的腸道組織的細(xì)胞、害蟲的中腸的細(xì)胞， 和腸道內(nèi)腔或中腸襯層的細(xì)胞中表達(dá)。這樣的靶序列可以涉及例如腸道細(xì)胞新陳代謝、生 長或分化。本發(fā)明靶序列的非限制性實例包括如在2008年1月17日提交的名稱為“抑制源 自草盲蝽的靶多核苷酸的組合物和方法”的美國臨時專利申請US61/021，685，2008年1月 17日提交的名稱為“抑制源自鱗翅目的靶多核苷酸的組合物和方法”的美國臨時專利申請 US61/021，699，2008年10月28日提交的名稱為“抑制源自蚜科的靶多核苷酸的組合物和 方法”的美國臨時專利申請US61/108，924中公開的多核苷酸。通過引用全文將以上每份申 請并入本文。其他的可使用本發(fā)明的方法和組合物靶向的靶害蟲序列進(jìn)一步公開在例如WO 2005/049841，US 2005/0095199，W001/37654 和 WO 2005/110068 中，均通過引用全文將其 并入本文。其他的靶序列示于SEQ ID N0S:l-58。III.包含抑制增強(qiáng)元件的多核苷酸在本發(fā)明的方法中，沉默元件和包含靶向序列或其活性片段或變體的抑制增強(qiáng)元 件的聯(lián)合表達(dá)導(dǎo)致與單獨使用沉默元件表達(dá)可獲得的相比，由沉默元件所產(chǎn)生的抑制性 RNA的增強(qiáng)的擴(kuò)增。本文所使用的“抑制增強(qiáng)元件”包括多核苷酸，所述多核苷酸包含待 抑制的靶序列或其活性片段或變體。已認(rèn)識的是，抑制增強(qiáng)元件無需和靶序列同一，而是， 抑制增強(qiáng)元件可以包含靶序列的變體，只要抑制增強(qiáng)元件與靶序列具有足夠的序列同一性 (identity)，以致與單獨使用沉默元件表達(dá)可獲得的相比，由沉默元件產(chǎn)生的RNAi的水平 提高。類似地，抑制增強(qiáng)元件可包含靶序列的片段，其中片段具有足夠長度從而允許與單獨 使用沉默元件表達(dá)可獲得的相比，由沉默元件產(chǎn)生的RNAi的水平提高?？梢允褂眠M(jìn)一步的同一靶序列的多抑制增強(qiáng)元件。例如，所使用的抑制增強(qiáng)元件 可以包含源自靶序列的不同區(qū)域的靶序列片段(例如源自3’UTR，編碼序列，內(nèi)含子和/或 5，UTR)。IV.沉默元件“沉默元件”指的是能夠減少或消除靶多核苷酸或其編碼多肽的水平或表達(dá)的多 核苷酸。在特定實施方式中，沉默元件，當(dāng)由昆蟲攝食時特異性地減少或消除靶害蟲序列的 水平。所用沉默元件可以通過影響靶RNA轉(zhuǎn)錄本水平或可選地通過影響翻譯并進(jìn)而影響編 碼的多肽的水平而減少或降低靶序列的表達(dá)水平。本文他處公開了測驗?zāi)軌驕p少或降低感興趣序列的水平的功能性沉默元件的方法。在本發(fā)明的方法中使用的單一多核苷酸可包含 同樣或不同靶多核苷酸的一個或多個沉默元件。本文所使用的“抑制性1 嫩”或“1 嫩1”指的 是，能夠以序列特異方式減少或消除靶多核苷酸或其所編碼多肽的表達(dá)水平的RNA分子。在特定實施方式中，靶序列不是植物內(nèi)源基因。在其它實施方式中，當(dāng)沉默元件防 治害蟲時，優(yōu)選地，沉默元件對于正常的植物或植物部分沒有影響。如下文中進(jìn)一步所述，沉默元件可以包含但不限于，雙鏈RNA，miRNA，或發(fā)卡抑制 元件。可應(yīng)用于本發(fā)明的方法和組合物的沉默元件的非限制性實例包括，如在2008年1 月17日提交的名稱為“抑制源自草盲蝽的靶多核苷酸的組合物和方法”的美國臨時申請 US61/021，685、2008年1月17日提交的名稱為“抑制源自鱗翅目的靶多核苷酸的組合物和 方法”的美國臨時申請US61/021，699、2008年10月28日提交的名稱為“抑制源自蚜科的 靶多核苷酸的組合物和方法”的美國臨時申請US61/108，924中公開的多核苷酸。通過引用 全文將以上每份申請并入本文。其他序列的可使用本發(fā)明的方法和組合物靶向的靶害蟲序 列進(jìn)一步公開在例如 WO 2005/049841, US 2005/0095199，WO 01/37654 和 W02005/110068 中，均通過引用全文將其并入本文?！皽p少(reduces) ”或“減少(reducing) ”多核苷酸或由其編碼多肽的表達(dá)水平的 意思是，靶序列的多核苷酸或多肽水平在統(tǒng)計學(xué)上低于同樣的靶序列在未暴露于沉默元件 和抑制增強(qiáng)元件的適當(dāng)對照中的多核苷酸水平或多肽水平。在本發(fā)明的特定實施方式中， 根據(jù)本發(fā)明減少害蟲中靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導(dǎo)致，適當(dāng)對照害蟲中同樣 的靶序列的多核苷酸水平或由其編碼的多肽水平的少于95%、少于90%、少于80%、少于 70%、少于60%、少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%。本文他 處討論了測驗RNA轉(zhuǎn)錄本水平、所編碼多肽的水平、或多核苷酸或多肽活性的方法。在特定實施方式中，沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)與單獨表達(dá)沉默元件時 獲得的水平相比，提高了植物細(xì)胞、植物、植物部分、植物組織或韌皮部中抑制性RNA的濃 度。本文所述“提高的抑制性RNA水平”包括聯(lián)合表達(dá)的植物中所產(chǎn)生的RNAi水平與適當(dāng)對 照植物相比的任何統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加。例如，在植物、植物部分或植物細(xì)胞中RNAi水平 的增加可以包括，與適當(dāng)對照相比，在植物、植物部分、植物細(xì)胞或韌皮部中RNAi水平的至 少約 1%、約 1-5%、約 5-10%、約 10-20%、約 20-30%、約 30-40%、約 40-50%、約 50-60%、 約60-70 %、約70-80 %、約80-90 %、約90-100 %或更多的增加。在其它實施方式中，在植 物、植物部分、植物細(xì)胞或韌皮部中RNAi水平的增加可以包括，與適宜對照相比，在植物、 植物部分、植物細(xì)胞或韌皮部中RNAi水平的至少約1倍、約1-5倍、約5-10倍、約10-20倍、 約20-30倍、約30-40倍、約40-50倍、約50-60倍、約60-70倍、約70-80倍、約80-90倍、 約90-100倍或更多的增加。本文他處討論了測驗RNAi水平增加的方法?！半p鏈RNA沉默元件”或“dsRNA”包括至少一個能夠形成dsRNA的轉(zhuǎn)錄本。從而， “dsRNA沉默元件”包括dsRNA、轉(zhuǎn)錄本或能夠形成dsRNA的多核苷酸，或多于一個的轉(zhuǎn)錄本 或能夠形成dsRNA的多核苷酸?！半p鏈RNA”或“dsRNA”指由單一自互補(bǔ)RNA分子形成的多 核苷酸結(jié)構(gòu)，或由至少兩個不同RNA鏈的表達(dá)形成的多核苷酸結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法和組合 物中采用的dsRNA)分子介導(dǎo)靶序列表達(dá)的降低，其例如通過以序列特異方式介導(dǎo)RNA干擾 “RNAi”或基因沉默。在特定實施方式中，dsRNA能夠減少或降低害蟲中靶多核苷酸或其編 碼多肽的水平或表達(dá)。
dsRNA能夠通過影響靶RNA轉(zhuǎn)錄本水平、通過影響翻譯從而影響編碼多肽水平、 或通過影響預(yù)轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)(例如通過染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、甲基化模式等的調(diào)節(jié)，從而改變基 因表達(dá))而減少或消除靶序列的表達(dá)水平。參見，例如Verdel等人，(2004) Science 303 672-676 ;Pal-Bhadra 等人，(2004) Science 303 669-672 ；Allshire (2002) Science 297 1818-1819 ；Volpe ^ 人，(2002)Science 297 1833-1837 Jenuwein (2002)Science297 2215-2218 ；以及Hall等人，(2002) Science 297 :2232_2237。本文他處公開了測驗?zāi)軌驕p 少或消除感興趣序列水平的功能性iRNA的方法。相應(yīng)地，本文中所使用的術(shù)語“dsRNA”意 在包括其他用于描述能夠介導(dǎo)RNA干擾或基因沉默的核酸分子的術(shù)語，其包括例如小干擾 RNA(siRNA)、雙鏈 RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、發(fā)卡 RNA、短發(fā)卡 RNA(shRNA)、轉(zhuǎn)錄后基因 沉默RNA (ptgsRNA)以及其它。在特定實施方式中，dsRNA的雙鏈體或雙鏈區(qū)域的至少一條鏈與靶多核苷酸共享 足夠的序列同一性或序列互補(bǔ)性，從而允許dsRNA減少靶序列的表達(dá)水平。如本文所用，與 靶多核苷酸互補(bǔ)的鏈?zhǔn)恰胺戳x鏈”而與靶多核苷酸同源的鏈?zhǔn)恰坝辛x鏈”。在一種實施方式中，dsRNA包括發(fā)卡RNA。發(fā)卡RNA包括能夠折疊回其自身從而形 成雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA分子。可應(yīng)用作為發(fā)卡元件的多重結(jié)構(gòu)。在特定實施方式中，dsRNA抑 制元件包含發(fā)卡元件，所述發(fā)卡元件按如下順序包含第一片段(segment)，第二片段和第 三片段，其中第一和第三片段享有足夠的互補(bǔ)性從而允許所轉(zhuǎn)錄RNA形成雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。發(fā)卡的“第二片段”包含“環(huán)”或“環(huán)狀區(qū)域”。本文使用的這些術(shù)語是同義的，并應(yīng) 當(dāng)被廣義地理解，從而包含任何賦予足夠柔性以允許多核苷酸互補(bǔ)區(qū)域(即形成發(fā)卡的莖 的片段1和片段2)之間發(fā)生自我配對的核苷酸序列。例如，在一些實施方式中，環(huán)狀區(qū)域 可以基本上是單鏈的并作為發(fā)卡莖環(huán)的自互補(bǔ)區(qū)域之間的間隔子起作用。在一些實施方式 中，環(huán)狀區(qū)域可以包含隨機(jī)或無義核苷酸序列，從而和靶多核苷酸沒有序列同一性。在其他 實施方式中，環(huán)狀區(qū)域包含和靶多核苷酸具有同一性的有義或反義RNA序列或其片段。參 見，例如，國際專利申請公開WO 02/00904，將其通過引用并入本文。在特定實施方式中，環(huán) 狀區(qū)域可以被優(yōu)化為盡可能短同時仍然提供足夠的分子內(nèi)柔性從而允許形成堿基對的莖 狀區(qū)域。相應(yīng)地，環(huán)狀序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、 20、15、10個核苷酸或更少。發(fā)卡RNA分子的“第一”和“第三”片段包含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基配對的莖。第一和第 三片段互為反向重復(fù)并擁有足夠的互補(bǔ)性從而允許堿基配對的莖狀區(qū)域形成。在特定實施 方式中，第一和第三片段是彼此充分互補(bǔ)的?？蛇x地，第一和第三片段可以是彼此部分互補(bǔ) 的，只要它們能夠彼此雜交從而形成堿基配對的莖狀區(qū)域?？梢詫⒌谝缓偷谌沃g互 補(bǔ)性的量計算為全片段的百分比。從而，發(fā)卡RNA的第一和第三片段通常擁有至少50%、 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，多至且 包含100%互補(bǔ)性。第一和第三片段長至少約1000、500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、15 或 10
個核苷酸。在特定實施方式中，第一和/或第三片段的長度是約10-100個核苷酸，約10-約 75個核苷酸，約10-約50個核苷酸，約10-約40個核苷酸，約10-約35個核苷酸，約10-約 30個核苷酸，約10-約25個核苷酸，約10-約20個核苷酸。在其它實施方式中，第一和/ 或第三片段的長度包含至少10-20個核苷酸，20-35個核苷酸，30-45個核苷酸，40-50個核苷酸，50-100個核苷酸或100-300個核苷酸。參見例如國際專利申請公開WO 02/00904。在 特定實施方式中，第一和/或第三片段包含與第一片段具有至少約85 %互補(bǔ)性的至少20個 核苷酸。在又一些實施方式中，形成發(fā)卡的莖狀結(jié)構(gòu)的第一和第三片段包含具有未配對核 苷酸殘基的3’或5’突出端。在特定實施方式中，在第一、第二和/或第三片段中所用的序列包含設(shè)計為和感 興趣的靶多核苷酸具有足夠序列同一性從而具有降低靶多核苷酸表達(dá)水平的能力的結(jié)構(gòu) 域。抑制性RNA轉(zhuǎn)錄本的特異性通常由沉默元件的這些結(jié)構(gòu)域所賦予。因此，在本發(fā)明的 一些實施方式中，沉默元件的第一、第二和/或第三片段包含結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有與靶 多核苷酸享有足夠序列同一性從而允許靶多核苷酸在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)時表達(dá)水平降低的 至少10個、至少15個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24 個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少100個、至少200個、至少300個、至 少500個、至少1000個或者多于1000個核苷酸。在其它實施方式中，該結(jié)構(gòu)域是約15-50 個核苷酸、約20-35個核苷酸、約25-50個核苷酸、約20-75個核苷酸、約40-90個核苷酸、 約15-100個核苷酸。在特定實施方式中，第一、第二和/或第三片段的結(jié)構(gòu)域具有和靶多核苷酸100% 的序列同一性。在另外的實施方式中，與靶多肽同源的第一、第二和/或第三片段的結(jié)構(gòu)域 與靶多肽的區(qū)域具有至少 50%,60%,70%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三片段的結(jié)構(gòu)域和靶多 核苷酸的序列同一性僅僅是足夠的以降低感興趣靶多核苷酸的表達(dá)。參見，例如，Chuang 和 Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 :4985_4990 ；Stout jesdi jk 等人，(2002) Plant Physiol. 129 1723-1731 ；Waterhouse R Helliwell(2003)Nat. Rev. Genet. 4 29-38 ；Pandolfini 等人，BMC Biotechnology 3 7 ；以及美國專利公開 US20030175965，其 中每一均通過引用被并入本文。Panstruga等人，(2003)Mol. Biol. R印.30 :135_140 (通過 引用并入本文)已經(jīng)記載了對hpRNA構(gòu)建體體內(nèi)沉默基因表達(dá)的效率的瞬時測定法。第一、第二和/或第三片段和靶多核苷酸之間所具有的互補(bǔ)性的量或第一片段和 第三片段之間所具有的互補(bǔ)性的量(即發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖)可以基于意欲控制基因表達(dá)的生物 體而變化。某些生物體或細(xì)胞類型可能需要確切的配對或100%的同一性，而其他的一些生 物體或細(xì)胞類型可以忍受一些錯配。在某些細(xì)胞中，例如，在靶向序列中的單一核苷酸錯配 導(dǎo)致失去抑制基因表達(dá)的能力。在這些細(xì)胞中，本發(fā)明的抑制盒能夠用于靶向抑制突變基 因，例如轉(zhuǎn)錄本包含點突變的致癌基因，并且因此可以使用本發(fā)明的方法和組合物特異性 靶向它們而不改變余下的野生型等位基因的表達(dá)。靶多核苷酸的任何區(qū)域都可用以設(shè)計具有足夠序列同一性從而允許發(fā)卡轉(zhuǎn)錄本 的表達(dá)以降低靶多核苷酸水平的沉默元件的結(jié)構(gòu)域。例如，可以將結(jié)構(gòu)域設(shè)計成和靶多核 苷酸的5’非翻譯區(qū)、靶多核苷酸的3’非翻譯區(qū)、靶多核苷酸的外顯子區(qū)、靶多核苷酸的內(nèi) 含子區(qū)以及其任意組合具有序列同一性。在特定實施方式中，沉默元件的結(jié)構(gòu)域和來自 靴序列的核苷酸約 1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、 400-450,450-500,550-600,600-650,650-700,750-800,850-900,950-1000,1000-1050, 1050-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、 1700-1800、1800-1900、1900-2000的至少約15個連續(xù)核苷酸具有足夠的同源性。在一些實施方式中，為優(yōu)化發(fā)卡中應(yīng)用的siRNA序列，可以使用合成的寡脫氧核苷酸/RNAse H 方法，以確定靶mRNA上處于對RNA沉默敏感的構(gòu)象中的位點。參見例如，Vickers等人，
(2003)J. Biol. Chem 278 :7108_7118 和 Yang 等人，(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9442-9447，通過引用并入本文。這些研究顯示，在RNase-H-敏感位點和促進(jìn)有效的siRNA 定向mRNA降解的位點之間存在明顯的相關(guān)性。也可以設(shè)計發(fā)卡沉默元件，以致有義序列或反義序列不對應(yīng)靶多核苷酸。在該實 施方式中，有義和反義序列位于包含與靶多核苷酸的全部或部分對應(yīng)的核苷酸序列的環(huán)狀 序列的側(cè)翼。因此，正是環(huán)狀區(qū)域確定RNA干擾的特異性。參見例如W002/00904，通過引用 將其并入本文。此外，可以通過使用發(fā)卡抑制元件來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)，其中發(fā)卡的反向 重復(fù)與待沉默的靶多核苷酸的啟動子區(qū)具有序列同一性。參見例如Aufsatz等人，(2002) PNAS 99 (Supp 1. 4) 16499-16506 和 Mette 等人，(2000) EMBO J 19(19) :5194_5201。在其它實施方式中，dsRNA可以包含小RNA (sRNA)。sRNA可以包括微RNA (miRNA) 和小干擾 RNA (siRNA) (Meister 和 Tuschl (2004) Nature431 :343_349，以及 Bonetta 等人，
(2004)Nature Methods 1:79-86)。miRNAs是包含約19個核糖核苷酸的調(diào)節(jié)劑，其在抑制 靶多核苷酸表達(dá)方面有很高的效率。參見例如Javier等人，(2003)Nature 425:257-263， 通過引用并入本文。對于miRNA干擾，可以將沉默元件設(shè)計為表達(dá)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的dsRNA 分子，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)包含和感興趣的靶多核苷酸互補(bǔ)的19-核苷酸序列?？梢院铣芍苽?miRNA,或?qū)⑵滢D(zhuǎn)錄為隨后切割產(chǎn)生活性miRNA的更長的RNA。特定地，miRNA可以在有義方 向包含和靶多核苷酸具有同源性的19個核苷酸的序列，以及與有義序列互補(bǔ)的19個核苷 酸的相應(yīng)反義序列。當(dāng)表達(dá)miRNA時，認(rèn)為可轉(zhuǎn)錄多種形式的miRNA，包括例如初級轉(zhuǎn)錄本(稱為 “pri-miRNA”)，其通過多個解核(nucleolytic)步驟被加工成更短的前體miRNA(稱為 "pre-miRNA") ；pre-miRNA ；或終(成熟)miRNA呈雙鏈體，兩條鏈?zhǔn)侵竚iRNA (最終與靶堿基 配對的鏈)和miRNA*。Pre-miRNA是從前體中去除miRNA/miRNA*雙鏈體的dicer形式的 底物，在所述的去除后，與siRNAs相似，雙鏈體可以被帶進(jìn)RISC復(fù)合物。已經(jīng)證實，miRNA 可轉(zhuǎn)基因表達(dá)并通過表達(dá)前體形式而非完整初級形式而有效(Parizotto et al. (2004) Genes & Development 18 :2237_2242 禾口 Guo etal. (2005)Plant Cell 17:1376—1386)。本發(fā)明的方法和組合物采用沉默元件，其轉(zhuǎn)錄時“形成”dsRNA分子。因此，正表達(dá) 的異源多核苷酸本身不需要形成dsRNA，但可與細(xì)胞或者(在特定實施方式中)取食后的害 蟲腸中的其他序列相互作用以允許形成dsRNA。例如，通過將含有miRNA或siRNA靶序列的 嵌合構(gòu)建體表達(dá)成與待沉默的一個或多個基因的所有或部分相對應(yīng)的序列，可生成可選擇 性沉默靶多核苷酸的嵌合多核苷酸。在這個實施方式中，當(dāng)miRNA或siRNA的靶與細(xì)胞中 存在的miRNA相互作用時“形成” dsRNA。然后所得的dsRNA可降低待沉默的一個或多個基 因的表達(dá)水平。參見，例如2005年6月17日提交的美國臨時申請第60/691，613號，名稱 為“基因沉默的方法和組合物”，通過引用將其并入本文。構(gòu)建體可設(shè)計成具有內(nèi)源miRNA 的靶或可選地在構(gòu)建體中可采用異源和/或合成miRNA的靶。如果采用異源和/或合成 miRNA，它可在與嵌合多核苷酸相同的核苷酸構(gòu)建體上或單獨的構(gòu)建體上被導(dǎo)入細(xì)胞。如本 文別處所討論的，可使用任何方法導(dǎo)入含有異源miRNA的構(gòu)建體。
V.變體和片段“片段”是指部分多核苷酸或部分的由此編碼的氨基酸序列和因此的蛋白。多核苷 酸片段可編碼保留天然蛋白生物活性的蛋白片段?？蛇x地，用作沉默元件或抑制增強(qiáng)元件 的多核苷酸片段不需要編碼保留生物活性的蛋白。因而，核苷酸序列片段的范圍可以是至 少約10、約15、約20個核苷酸、約50個核苷酸、約75個核苷酸、約100個核苷酸、約200個 核苷酸、約300個核苷酸、約400個核苷酸、約500個核苷酸、約600個核苷酸、約700個核 苷酸和多達(dá)本發(fā)明所采用的全長多核苷酸。本文在別處描述了測驗所需沉默元件或抑制增 強(qiáng)元件活性的方法?！白凅w”表示基本相似的序列。對于多核苷酸，變體包括在天然多核苷酸內(nèi)的一個 或多個內(nèi)部位點刪除和/或增加一個或多個核苷酸和/或在天然多核苷酸的一個或多個 位點取代一個或多個核苷酸。如本文所用的，“天然”多核苷酸或多肽分別包括天然存在 的核苷酸序列或氨基酸序列。對于多核苷酸，保守變體包括因為遺傳密碼簡并性編碼本發(fā) 明所采用多肽之一的氨基酸序列的那些序列。變體多核苷酸也包括合成源的多核苷酸，例 如通過使用定點突變生成的但仍保留所需活性的那些。通常地，如通過本文別處所述的序 列比對程序和參數(shù)所測定的，本發(fā)明特定多核苷酸(即沉默元件)的變體與該特定多核苷 酸具有至少約 40%,45%, 50%, 55%,60%,65%, 70%, 75%,80%,85%,90%,91%,92%, 93%，94%，95%，96%，97%，98%，99% 或更高的序列同一性。也可通過比較變體多核苷酸編碼的多肽和參照多核苷酸編碼的多肽之間的序列 同一性百分比，來估算本發(fā)明特定多核苷酸(即參照多核苷酸)的變體?？墒褂帽疚膭e處 所述的序列比對程序和參數(shù)來計算任兩個多肽之間的序列同一性百分比。通過比較它們 編碼的兩個多肽共享的序列同一性百分比來估算本發(fā)明所采用的任意給定多核苷酸對時， 兩個編碼多肽之間的序列同一性百分比為至少約40 %，45 %，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列同 一性。“變體”蛋白表示通過在天然蛋白的一個或多個內(nèi)部位點上刪除或增加一個或多 個氨基酸和/或在天然蛋白的一個或多個位點上取代一個或多個氨基酸而由天然蛋白衍 生的蛋白。本發(fā)明包括的變體蛋白是有生物活性的，即它們?nèi)該碛刑烊坏鞍姿璧纳锘?性，如本文別處所討論的。這種變體可由例如基因多態(tài)性或人為操作所產(chǎn)生。如通過本文 別處所述序列比對程序和參數(shù)所測定的，天然蛋白的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序 列具有至少約 40%,45%, 50%, 55%,60%,65%, 70%, 75%,80%,85%,90%,91%,92%, 93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高序列同一性。本發(fā)明蛋白的生物活性變體與 該蛋白可以只有1-15個氨基酸殘基，只有1-10，例如6-10，只有5，只有4，3，2或甚至1個 氨基酸殘基的區(qū)別。以下術(shù)語用于描述兩個或多個多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a) “參照序列”， (b) “比較窗口”，(c) “序列同一性”，和(d) “序列同一性百分比”。(a)如本文所用的，“參照序列”是用作序列比較基礎(chǔ)的確定序列。參照序列可以 是完整的特定序列或子集；例如，作為全長cDNA或基因序列的片段，或完整cDNA或基因序 列。(b)如本文所用的，“比較窗口 ”表示多核苷酸序列的鄰近和特定片段，其中在比較窗口中的多核苷酸序列與用于兩個多核苷酸最佳比對的參照序列(其不含有添加或刪除) 相比可含有添加或刪除(即空位)。通常地，比較窗口在長度上是至少20個鄰近核苷酸，和 任選地可以是30，40，50，100或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，為避免由于在多核苷酸 序列中包含空位而造成的與參照序列的高相似性，通常引入空位罰分，并將其從配對數(shù)中 減去。除非另有規(guī)定，本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP第10版采用以 下參數(shù)獲得的值使用GAP權(quán)重50和長度權(quán)重3的核苷酸序列％同一性和％相似性，和 nwsgapdna. cmp評分陣列；使用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2的氨基酸序列％同一性和％相似 性，和BL0SUM62評分陣列；或任何等效程序?！暗刃С绦颉笔侵溉魏涡蛄斜容^程序，其可為討 論的任何兩個序列生成與GAP第10版生成的相應(yīng)比對相比，具有相同核苷酸或氨基酸殘基 配對和相同的序列同一性百分比的比對。(c)如本文所用的，兩個多核苷酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”是指， 當(dāng)在特定比較窗口內(nèi)為最大對應(yīng)而比對時，兩個序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比 用于指示蛋白時，認(rèn)為不同一的殘基位置的區(qū)別通常是保守氨基酸取代，其中氨基酸殘基 被具有相似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基取代因此不改變分子的功能 特性。當(dāng)序列在保守取代上有區(qū)別時，序列同一性百分比可向上調(diào)整以校正取代的保守特 性。通過這種保守取代區(qū)別的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行這種調(diào)整 的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常這涉及將保守取代作為部分而非全部錯配評分，由 此增加序列同一性百分比。因而，例如在相同氨基酸被評為1分，非保守取代被評為0分時， 保守取代被評為ο到1之間。計算保守取代的評分，例如應(yīng)用PC/GENEdntelligenetics， Mountain View, California)禾呈序。(d)如本文所用的，“序列同一性百分比，，表示通過比較在比較窗口內(nèi)兩個最佳比 對序列所測定的值，其中與用于兩個序列最佳比對的參照序列(不含有添加或刪除)相比， 在比較窗口中的部分多核苷酸序列可含有添加或刪除(即空位)。百分比的計算可通過測 定兩個序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)量而產(chǎn)生配對位置數(shù)量，將配對位 置數(shù)量除以比較窗口中位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。VI. DNA 構(gòu)建體使用術(shù)語“多核苷酸”并非意在將本發(fā)明限制為含DNA的多核苷酸。本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員會認(rèn)為，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。這 種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。本發(fā)明的多核苷酸也 包括所有形式的序列，其包括但不限于單鏈形式，雙鏈形式，卡發(fā)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。本發(fā)明方法和組合物中采用的編碼沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件的多核苷酸可 提供在用于在感興趣植物或生物體中表達(dá)的表達(dá)盒中。認(rèn)為可使用多沉默元件和/或抑制 增強(qiáng)元件。例如，可使用多相同沉默元件和/或多相同抑制增強(qiáng)元件；靶向靶序列不同區(qū)域 的多沉默元件和/或靶向靶序列不同區(qū)域的多抑制增強(qiáng)元件；來自不同靶序列的多沉默元 件和/或來自不同靶序列的多抑制增強(qiáng)元件。認(rèn)為每個沉默元件可包含在單個或單獨的盒、DNA構(gòu)建體或載體中。相似地，含有 抑制增強(qiáng)元件的一個或多個多核苷酸可在單個或多構(gòu)建體或載體中。同樣地，發(fā)現(xiàn)兩個元 件(即沉默元件和抑制增強(qiáng)元件)可在單獨的DNA構(gòu)建體和/或載體中或可選地包含在相同構(gòu)建體和/或載體中。如上所述，涉及提供沉默元件和/或抑制增強(qiáng)序列的任何手段?？?用含有編碼一個或多個沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件的DNA的單個盒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、例如 植物或植物細(xì)胞，或含有每一沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件的單獨的盒可用于轉(zhuǎn)化植物或 植物細(xì)胞或宿主細(xì)胞。同樣地，用一種組分轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或植物隨后可用另一組分進(jìn)行 轉(zhuǎn)化。也可通過有性雜交集合一個或多個沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件。即，含有一種組 分的第一植物與含有另一組分的第二植物雜交。雜交而來的后代植物會含有這兩種組分。表達(dá)盒可包括可操作連接至本發(fā)明多核苷酸的5’和3’調(diào)控序列?！翱刹僮鬟B接” 表示兩個或更多個元件之間的功能性連接。例如，本發(fā)明多核苷酸和調(diào)控序列(即啟動子) 之間的可操作連接是允許表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的功能性連接?？刹僮鬟B接元件可以是鄰近 的或不相鄰的。當(dāng)用于表示連接兩個蛋白編碼區(qū)時，可操作連接是指編碼區(qū)在相同閱讀框 中。盒可以還含有至少一個待共轉(zhuǎn)化至生物體的另外的多核苷酸。可選地，該另外的多核 苷酸可提供在多表達(dá)盒中。表達(dá)盒可與用于插入多核苷酸使其處于調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的 多個限制性位點和/或重組位點一起提供。表達(dá)盒可另外地含有選擇性標(biāo)記基因。表達(dá)盒在5’ -3’轉(zhuǎn)錄方向上可包括在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟 動子)，含有沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件的多核苷酸，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。 本發(fā)明采用的調(diào)控區(qū)(即啟動子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，和翻譯終止區(qū))和/或多核苷酸對于宿主細(xì) 胞或?qū)Ρ舜丝梢允翘烊坏?類似物的?？蛇x地，本發(fā)明采用的調(diào)控區(qū)和/或多核苷酸可以 是與宿主細(xì)胞異源的或彼此異源的。如本文所用的，“異源的”是指源自外來物種、或雖然來 自相同物種但通過有意的人為干預(yù)在組成和/或基因組位點上自其天然形式實質(zhì)修飾的 序列。例如，可操作連接至異源多核苷酸的啟動子是來自不同于多核苷酸源自物種的物種， 或雖然來自相同/類似物種，之一或兩者自它們的原始形式和/或基因組位點實質(zhì)修飾，或 啟動子不是用于可操作連接的多核苷酸的天然啟動子。如本文所用的，嵌合基因含有可操 作連接至與編碼序列異源的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上的編碼序列。終止區(qū)與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以是天然的，與編碼沉默元件的可操作連接的多核苷酸 可以是天然的，與植物宿主可以是天然的，或可衍生自對該啟動子、含有沉默元件的多核 苷酸、植物宿主、或其任意組合而言的另一來源(即外來或異源)。便利的終止區(qū)可從根 瘤農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)的Ti-質(zhì)粒獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。也 參見 Guerineau etal. (1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674 ；Sanfacon et al. (1991)Genes Dev. 5141-149 ；Mogen et al. (1990)Plant Cell2 1261-1272 ；Munroe et al. (1990)Gene 91:151_158 ；Ballas et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891_7903 ；和 Joshi et al. (1987)Nucleic Acids Res. 15 :9627_9639。已知附加序列修飾增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包含消除編碼假多聚腺苷酸 化信號、外顯子_內(nèi)含子剪接位點信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)的序列，和可能對基因表達(dá)不利的其 他如此良好表征的序列。序列的G-C含量可調(diào)整至給定細(xì)胞宿主的平均水平，其計算參照 宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因。如果可能，修飾序列以避免預(yù)知的發(fā)卡二級mRNA結(jié)構(gòu)。在表達(dá)盒的制備中，可操作多種DNA片段，以便提供處于正確方向和適當(dāng)時正確 閱讀框的DNA序列。為此，可采用適配子(adapter)或連接子來連接DNA片段，或包括其他 操作以提供方便的限制性位點，去除多余的DNA，去除限制性位點等。為此，可包括體外誘 變，引物修復(fù)，限制，退火，再取代，例如轉(zhuǎn)換和顛換。
在本發(fā)明實踐中可使用多個啟動子。編碼沉默元件的多核苷酸可與組成型、組織 優(yōu)選或用于植物表達(dá)的其他啟動子聯(lián)合。這類組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子和W099/43838和美 國專利第6，072，050號中公開的其他組成型啟動子；核心CaMV 35S啟動子(Odell et al. (1985)Nature 313:810-812)；水稻肌動蛋白(McElroy et al. (1990)Plant Cell 2 163-171)；泛素(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12 :619_632 和 Christensen et al. (1992)Plant Mol. Biol. 18 675-689) ；pEMU(Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81 :581-588) ；MAS (Velten et al. (1984)EMBO J. 3 2723-2730) ；ALS 啟動子(美 國專利第5，659，026號)等等。其他組成型啟動子包括例如美國專利號5，608，149 ； 5，608，144 ；5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ；5，268，463 ；5，608，142 ；和 6，177，611。也可采用可誘導(dǎo)啟動子例如病原體誘導(dǎo)啟動子。這種啟動子包括來自致病相關(guān)蛋 白(I3R蛋白)的那些，其在感染病原體之后被誘導(dǎo)；例如ra蛋白，SAR蛋白，β-1，3-葡聚 糖酶，殼多糖酶等。參見例如 Redolfi et al. (1983)Neth. J. Plant Pathol. 89 245-254 ； Uknes et al. (1992)Plant Cell4 :645_656 ；和 Van Loon(1985)Plant Mol. Virol. 4 111-116。也參見W099/43819，通過引用將其并入本文。感興趣的是在位于或鄰近病原體感染部位局部表達(dá)的啟動子。參見例如 Marineau et al. (1987)Plant Mol. Biol. 9 335-342 ；Matton et al. (1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-331 ；Somsisch et al. (1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 2427-2430 ；Somsisch et al. (1988)Mol. Gen. Genet. 2:93_98 ；和 Yang(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977。也參見 Chen et al. (1996) Plant J. 10 955-966 ；Zhang et al. (1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91 2507-2511 ；Warner et al. (1993)Plant J. 3 :191_201 ；Siebertz et al. (1989)Plant Cell 1 :961_968 ；美國專利 號5，750，386(線蟲可誘導(dǎo)的)和本文引用的參考文獻(xiàn)。特別感興趣的是玉米PRms基因的 可誘導(dǎo)啟動子，可通過病原體串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)誘導(dǎo)其表達(dá)(參見例如 Cordero et al. (1992)Physiol. Mol. Plant Path. 41 189—200)。此外，病原體通過創(chuàng)傷或昆蟲損傷進(jìn)入植物，因而創(chuàng)傷可誘導(dǎo)啟動子可用于本發(fā) 明的構(gòu)建。這種創(chuàng)傷可誘導(dǎo)啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(Pin II)基因(Ryan(1990) Ann. Rev.Phytopath. 28 425-449 ；Duan et al. (1996)Nature Biotechnology 14: 494-498) ；wunl 和 wun2,美國專利號 5，428，148 ；winl 和 win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215 :200_208)；系統(tǒng)素(systemin) (McGurl et al. (1992) Science225 1570-1573) ；WIPl (Rohmeier et al. (1993)Plant Mol.Biol. 22 783-792 ；Eckelkamp et al. (1993)FEBS Letters 323:73-76) ；MPI 基因(Corderok et al. (1994)Plant J. 6(2) 141-150)；等等，通過引用將其并入本文?；瘜W(xué)調(diào)控啟動子通過應(yīng)用外源的化學(xué)調(diào)控劑可用于調(diào)節(jié)植物中的基因表達(dá)。根 據(jù)目的，啟動子可以是化學(xué)可誘導(dǎo)啟動子，其中應(yīng)用化學(xué)品誘導(dǎo)基因表達(dá)，或化學(xué)可抑制 啟動子，其中應(yīng)用化學(xué)品抑制基因表達(dá)?；瘜W(xué)可誘導(dǎo)啟動子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限 于玉米In2-2啟動子，其是通過苯磺酰胺除草安全劑激活的，玉米GST啟動子，其是通過 用作萌發(fā)前除草劑的疏水性親電子化合物激活的，和煙草PR-Ia啟動子，其是通過水楊酸
23激活的。感興趣的其他化學(xué)調(diào)控啟動子包括類固醇應(yīng)答啟動子(參見例如在Schena et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10421-10425 和 McNellis et al. (1998)Plant J. 14(2) 247-257中的糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)啟動子)和四環(huán)素可誘導(dǎo)和四環(huán)素可抑制啟動子 (參見例如 Gatz et al. (1991)Mol. Gen. Genet. 227 :229_237 和美國專利號 5，814，618 和 5，789，156)，通過引用將其并入本文。組織優(yōu)選啟動子可用于在特定植物組織內(nèi)靶向增強(qiáng)表達(dá)。組織優(yōu)選啟動子包 括 Yamamoto et al. (1997)Plant J. 12(2) 255-265 ；Kawamata et al. (1997)Plant Cell Physiol.38(7) 792-803 ；Hansen et al. (1997)Mol. GenGenet. 254(3) :337_343 ； Russell et al. (1997)Transgenic Res. 6(2) 157-168 ；Rinehart et al. (1996)Plant Physiol.112(3) 1331-1341 ；Van Camp et al. (1996)Plant Physiol.112(2) :525_535 ; Canevascini et al. (1996)Plant Physiol. 112(2) 513-524 ；Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol.35(5) 773-778 ；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20 181-196 ；Orozco et al. (1993)PlantMol Biol. 23(6) 1129-1138 ；Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA90 (20) :9586_9590 和 Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3) :495_505。如果需要，這種啟動子可被修飾用于弱表達(dá)。葉片優(yōu)選啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto et al. (1997)Plant J. 12(2) 255-265 ；Kwon et al. (1994)Plant Physiol. 105 357-67 ；Yamamoto et al. (1994)Plant Cell Physiol.35(5) :773_778 ；Gotor et al. (1993)Plant J. 3 509-18 ； Orozco et al. (1993)Plant Mol. Biol. 23(6) 1129-1138 ；禾口 Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586_9590。根部優(yōu)選啟動子是已知的，并且可從許多可用文獻(xiàn)中選擇或從多種兼容物種中從 頭分離。參見例如 Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2) :207_218 (大豆根部特異性 谷氨酰胺合成酶基因)；Keller 和 Baumgartner (1991)Plant Cell 3(10) 1051-1061 (在 法國菜豆的61^1.8基因中的根部特異性控制元件)；5￡1叫吐et al. (1990)Plant Mol. Biol. 14(3) :433-443(根瘤農(nóng)桿菌甘露堿(mannopine)合酶(MAS)基因的根部特異性啟 動子)；和Miao et al. (1991)Plant Cell 3(1) :11-22 (編碼細(xì)胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS) 的全長cDNA克隆，其在大豆的根部和根瘤中表達(dá))。也參見Bogusz et al. (1990)Plant Cell 2(7) :633-641，其中描述從固氮非豆類Parasponia andersonii和相關(guān)的非固氮非 豆類Trema tomentosa的血紅蛋白基因中分離的兩個根部特異性啟動子。這些基因的啟 動子與β-葡糖苷酸酶報告基因連接，并將其導(dǎo)入非豆類煙草(Nicotiana tabacum)和豆 類百脈根(Lotus corniculatus)，在兩種情況中都保留了根部特異性啟動子活性。Leach 和Aoyagi (1991)描述對生根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)中高度表達(dá)的rolC和 rolD根部誘導(dǎo)基因的啟動子的分析(參見Plant Science (Limerick) 79 (1) :69_76)。他 們總結(jié)了在這些啟動子中增強(qiáng)子和組織優(yōu)選DNA決定簇是解離的。Teeri et al. (1989) 使用與IacZ融合的基因，以顯示編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖的表皮中特 別有活性，而TR’ 2基因在完整植物中是根部特異性的，并受葉片組織創(chuàng)傷刺激，是特別期 望的可與殺昆蟲或殺幼蟲基因一起使用的特征的組合(參見EMBO J.8(2) :343-350)。與 nptll (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1’基因顯示出相似特征。其他根部優(yōu)選啟動子包 括 VfEN0D-GRP3 基因啟動子(Kuster et al. (1995)Plant Mol. Biol. 29(4) :759_772)；和rolB 啟動子(Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4) :681_691)。也參見美國專利號 5，837，876 ；5，750，386 ；5，633，363 ；5，459，252 ；5，401，836 ；5，110，732 ；和 5，023，179。在本發(fā)明的一種實施方式中，植物表達(dá)啟動子是維管特異性啟動子例如韌皮部特 異性啟動子。如本文所用的，“維管特異性”啟動子是至少在維管細(xì)胞中表達(dá)的啟動子，或優(yōu) 選在維管細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。維管特異性啟動子的表達(dá)無需局限在維管細(xì)胞中，也可以 在其他細(xì)胞類型或組織中表達(dá)。如本文所用，“韌皮部特異性啟動子”是至少在韌皮部細(xì)胞 中表達(dá)的植物可表達(dá)啟動子，或優(yōu)選在韌皮部細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。韌皮部特異性啟動子的表達(dá)無需局限在韌皮部細(xì)胞中，也可以在其他細(xì)胞類型或 組織例如木質(zhì)部組織中表達(dá)。在本發(fā)明的一種實施方式中，韌皮部特異性啟動子是至少在 韌皮部細(xì)胞中表達(dá)的植物可表達(dá)啟動子，其中與在韌皮部細(xì)胞中的表達(dá)相比，在非韌皮部 細(xì)胞中的表達(dá)更受限(或不表達(dá))。根據(jù)本發(fā)明的適當(dāng)維管特異性或韌皮部特異性啟動子 的實例包括但不限于選自以下的啟動子SCSV3，SCSV4，SCSV5和SCSV7啟動子(Schunmann et al. (2003)Plant Functional Biology 30 453-60 ；生根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的 rolC 基因啟動子(Kiyokawa et al. (1994) Plant Physiology 104 801-02 ；Pandolfini et al. (2003) BioMedCentral (BMC)Biotechnology 3 -J, (www. biomedcentral. com/1472-6750/3/7) ；Graham et al. (1997)Plant Mol. Biol. 33 729-35 ； Guivarc' h et al. (1996) ；Almon et al. (1997) Plant Physiol. 115 :1599_607 ；生根農(nóng) ff (Agrobacterium rhizogenes)白勺 rolA云力〒(Dehio et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 1199-210)；根瘤農(nóng)桿菌T-DNA基因 5 的啟動子(Korber et al. (1991)EMBO J. 10: 3983-91)；水稻蔗糖合酶 RSsl 基因啟動子(Shi et al. (1994) J. Exp. Bot. 45 623-31)； CoYMV (Commelina yellow mottle badnavirus) 云力〒(Medberry et al. (1992)Plant Cell4 185-92 ；Zhou et al. (1998)Chin. J. Biotechnol. 14 :9_16); CFDV 或椰子葉腐病毒啟動子(Rohde et al. (1994)Plant Mol. Biol. 27 623-28 ；Hehn 和Rhode (1998) J. Gen. Virol. 79 1495-99) ；RTBV或水稻東格魯桿狀病毒啟動子(Yin禾口 Beachy (1995) Plant J. 7 969-80 ；Yin et al. (1997) Plant J. 12 1179-80)；豌豆谷氨酰 胺合酶 GS3A 基因(Edwards et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 3459-63 ；Brears et al. (1991)Plant J. 1 :235_44)；馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶基因的 inv CDlll 和 inv CD141 啟動 子(Hedley et al. (2000)J. Exp. Botany 51:817-21) ；Kertbundit et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :5212_16)顯示了從擬南芥分離的啟動子在煙草中具有韌皮部特 異性表達(dá)；VAH0X1 啟動子區(qū)(Tornero et al. (1996)Plant J. 9 :639_48)；豌豆細(xì)胞壁轉(zhuǎn) 化酶啟動子(Zhang et al. (1996)Plant Physiol. 112 :1111_17)；與美國公開專利申請 20030106097殼多糖酶相關(guān)的內(nèi)源棉花蛋白的啟動子，來自胡蘿卜的酸轉(zhuǎn)化酶基因啟動子 (Ramloch-Lorenz et al. (1993) The Plant J. 4 :545_54)；硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 Sultrl 的啟動子；3 (Yoshimoto et al. (2003) Plant Physiol. 131 :1511_17)；蔗糖合酶基因啟動 子(Nolte和Koch(1993)Plant Physiol. 101 899-905)；和煙草蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動子 (Kuhn et al. (1997)Science 275-1298-1300)?？赡艿膯幼舆€包括野櫻苷水解酶的黑櫻桃啟動子(PH DLl. 4PR0)(美國專利 第6, 797,859號)，來自黃瓜和水稻的硫氧還蛋白H啟動子(Fukuda A et al. (2005). Plant Cell Physiol. 46(11) 1779~86),水稻(RSsl) (Shi, Τ. Wang et al. (1994).J. Exp. Bot. 45 (274) :623_631)和玉米蔗糖合酶 _1 啟動子(Yang.，N-S. et al. (1990) PNAS 87 4144-4148),來自南瓜的 PP2 啟動子(Guo，H. et al. (2004) Transgenic Research 13:559—566)，At SUC2 啟動子(Truernit，Ε. et al. (1995)Planta 196(3) 564-70.，At SAM-I (S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV. et al. (1996) Planr. Cell. Physiol. 37(8) 1108-1115)，和水稻東格魯桿狀病毒(RTBV)啟動子 (Bhattacharyya-Pakrasiet al. (1993)Plant J. 4(1) :71_79)。表達(dá)盒也可含有選擇性標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。可利用選擇性標(biāo)記基因 選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移 酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些，以及賦予對除草劑化合物抗性的基因， 所述除草劑化合物例如草胺磷，溴苯腈，咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸鹽(2，4-D)。其 他選擇性標(biāo)記包括表型標(biāo)記例如β-半乳糖苷酶和熒光蛋白例如綠色熒光蛋白(GFP) (Su et al. (2004)Biotechnol Bioeng 85 :610_9 禾口 Fetter et al. (2004)Plant Celll6 215-28)，青色熒光蛋白(CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Sciencell7 :943_54 和 Kato et al. (2002)Plant Physiol 129 :913_42)和黃色熒光蛋白(來自 Evrogen 的 PhiYFP ， 參見Bolte et al. (2004) J. Cell Sciencell7 :943_54)。對于其他選擇性標(biāo)記，通常參見 Yarranton(1992)Curr. Opin. Biotech. 3 506-511 ；Christopherson et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 6314-6318 ；Yao et al. (1992)Cell 71 63-72 ；Reznikoff(1992) Mol.Microbiol. 6 :2419_2422 ；Barkley et al. (1980)in The Operon, pp. 177—220 ；Hu et al. (1987)Cell 48 555~566 ；Brown et al. (1987)Cell 49 :603_612 ；Figge et al. (1988) Cell 52 713-722 ；Deuschle et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. 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(1988) Nature334 721-7240通過引用將這些公開文獻(xiàn)并入本文。以上選擇性標(biāo)記基因的列表并 非意在限制。本發(fā)明可使用任何選擇性標(biāo)記基因。VII.多種含有沉默元件的組合物在一實施例中，用DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物或宿主細(xì)胞，以表達(dá)至少一個沉 默元件和/或表達(dá)抑制增強(qiáng)元件。認(rèn)為組合物可含有細(xì)胞(例如植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞)，其 中編碼沉默元件的多核苷酸和含有抑制增強(qiáng)元件的多核苷酸可穩(wěn)定并入基因組并可操作 連接至在細(xì)胞中有活性的啟動子。認(rèn)為含有編碼沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的序列的多核苷酸可用于轉(zhuǎn)化生物體，從而為宿主生物體提供產(chǎn)生這些組分，和隨后將宿主生物體應(yīng)用于靶害蟲環(huán)境。這種宿主生 物體包括桿狀病毒，細(xì)菌等。用這種方式，經(jīng)適宜載體將編碼沉默元件的多核苷酸的組合導(dǎo) 入微生物宿主，和將所述宿主應(yīng)用于環(huán)境、或植物或動物。將核酸插入細(xì)胞的術(shù)語“導(dǎo)入”表示“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”并包括將核酸并 入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，其中核酸可穩(wěn)定并入細(xì)胞基因組(例如染色體，質(zhì)粒，質(zhì)體，或線 粒體DNA)，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子，或瞬時表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。可以選擇已知占據(jù)一種或多種感興趣作物的“植物圈”(葉面，葉圈，根圍和/或根 面)的微生物宿主。選擇這些微生物以便能夠在特定環(huán)境中成功地與野生型微生物競爭， 提供編碼沉默元件的序列和靶序列的穩(wěn)定維持和表達(dá)，和期望地在保護(hù)該組分免受環(huán)境降 解和滅活上的改良。這些微生物包括細(xì)菌、藻類和真菌。特別感興趣是微生物例如細(xì)菌，例如假單胞 菌(Pseudomonas)，歐文氏菌(Erwinia)，沙雷氏菌(Serratia)，克雷伯菌(Klebsiella)， 黃單胞菌(Xanthomonas)，鏈霉素菌(Str印tomyces)，根瘤菌(Rhizobium)，紅色假單胞 菌(Rhodopseudomonas)，Methylius,農(nóng)桿菌(Agrobacterium)，醋桿菌(Acetobacter)， 乳桿菌(Lactobacillus),節(jié)桿菌(Arthrobacter),固氮菌(Azotobacter)，明串珠菌 (Leuconostoc)和產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)，真菌特別是酵母例如酵母菌(Saccharomyces)， 隱球菌(Cryptococcus)，克魯維酵母菌(Kluyveromyces)，擲孢酵母菌(Sporobolomyces)， 紅酵母(Rhodotorula)，和短梗霉菌(Aureobasidium)。特別感興趣的是這種植物圈 細(xì)菌物種，例如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，木醋桿菌(Acetobacter xylinum)， 農(nóng)桿菌(Agrobacteria),球形紅色假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides),平原 黃單胞菌(Xanthomonas campestris),苜猜根瘤菌(Rhizobium melioti),真養(yǎng)產(chǎn)堿 菌(Alealigenes entrophus)，木質(zhì)棍狀桿菌(Clavibacter xyli)和維涅蘭德固氮菌 (Azotobacter yinlandir)，和植物圈酵母物種例如深紅酵母(Rhodotorula rubra)，粘紅 酵母(R. glutinis)，海濱紅酵母(R. marina)，橙黃紅酵母(R. aurantiaca)，白色隱球菌 (Cryptococcus albidus)，流散隱球菌(C. diffluens)，羅倫隱球菌(C. Iaurentii)，玫瑰 酵母菌(Saccharomyces rosei),圓酵母(S. pretoriensis),酉良酒酵母(S. cerevisiae), 玫瑰擲孢酵母(Sporobolomyces rosues)，芳香擲孢酵母(S. odorus)，克魯維酵母 (Kluyveromyces veronae)，和茁芽短梗霉菌(Aureobasidium pollulans)。特別感興趣的 是著色微生物。多種方式可用于在允許穩(wěn)定維持和表達(dá)如下核苷酸序列的條件下，將含有沉默元 件和/或抑制增強(qiáng)元件的多核苷酸導(dǎo)入微生物宿主中。例如，可構(gòu)建表達(dá)盒，其包含與用于 表達(dá)核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號可操作連接的感興趣的核苷酸構(gòu)建體，和與宿主 生物體序列同源的核苷酸序列，由此會發(fā)生整合，和/或在宿主中有功能的復(fù)制體系，由此 會發(fā)生整合或穩(wěn)定維持。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號包括但不限于啟動子，轉(zhuǎn)錄起始啟動位點，操作子 (operator)，激動子(activator)，增強(qiáng)子，其他調(diào)控元件，核糖體結(jié)合位點，起始密碼子，終 止信號等。參見例如美國專利號 5，039，523 和 4，853，331 ；EPO 0480762A2 ；Sambrook et al. (2000) ；Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)(第 3 版；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) ；Davis et al. (1980)Advanced Bacterial Genetics (高級細(xì)菌遺傳學(xué))(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；和本文引用的參考文獻(xiàn)。適宜的宿主細(xì)胞包括原核生物和低等真核生物，例如真菌。示例性原核生物， 包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性，包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌 (Escherichia)，歐文氏菌(Erwinia)，志賀氏菌(Shigella)，沙門氏菌(Salmonella)，和 變性桿菌(Proteus)；芽孢桿菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)，例如根瘤 菌(Rhizobium)；螺旋菌科(Spirillaceae)，例如發(fā)光細(xì)菌(photobacterium)，發(fā)酵單胞 菌(Zymomonas)，沙雷氏菌(Serratia)，氣單胞菌(Aeromonas)，弧菌(Vibrio)，脫硫弧 菌(Desulfovibrio)，螺旋菌(Spirillum)；乳桿菌科(Lactobacillaceae)；假單胞菌科 (Pseudomonadaceae)，例如假單胞菌(Pseudomonas)禾口醋桿菌(Acetobacter)；固氮菌科 (Azotobacteraceae)和硝化桿菌科(Nitrobacteraceae)。在真核生物之中是真菌,例如藻 菌(Phycomycetes)禾口子囊菌(Ascomycetes)，其包括酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)禾口 裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)；禾口擔(dān)子酵母(Basidiomycetes yeast),例如紅酵母 (Rhodotorula)，失豆(Aureobasidium)，i|5i包—胃(Sporobolomyces)等。為本發(fā)明目的，在選擇宿主細(xì)胞中特別感興趣的特征包括將編碼序列輕松導(dǎo)入宿 主，表達(dá)體系的可用性，表達(dá)效率，宿主穩(wěn)定性和輔助遺傳能力的存在。用作殺蟲劑微膠囊 的感興趣特征包括保護(hù)性性質(zhì)，例如厚細(xì)胞壁，染色和細(xì)胞內(nèi)包裝或包涵體的形成；葉片親 和力；缺乏哺乳動物毒性；吸引害蟲攝取等等。其他考慮點包括容易形成和處理，經(jīng)濟(jì)，儲 存穩(wěn)定性等等。特別感興趣的宿主生物體包括酵母，例如紅色酵母菌屬(Rhodotorulaspp.)， 短梗霉菌屬(Aureobasidium spp·)，酵母菌屬(Saccharomyces spp.)，和擲孢酵母菌屬 (Sporobolomyces spp.)，葉面生物體例如假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)，歐文氏菌屬 (Erwinia spp.)和黃桿菌屬(Flavobacterium spp.)，和其他這種生物體，包括銅綠假單 Ifelii (Pseudomonas aeruginosa)，(Pseudomonas fluorescens)，酉良酒_母 (Saccharomyces cerevisiae)，蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)，埃希氏大腸桿菌 (Escherichia coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等等。本發(fā)明包括的編碼沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件的序列可以被導(dǎo)入可在植物(附 生菌)中繁殖的微生物中，以將這些組分遞送至潛在的靶害蟲。附生菌例如可以是革蘭氏 陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件可在細(xì)菌宿主中發(fā)酵，并加工所得細(xì)菌，將其用 作微生物噴霧，其按照與蘇云金桿菌菌株被用作殺昆蟲噴霧的相同的方法。任何適宜微 生物可用于該目的。假單胞菌已被用來將蘇云金桿菌內(nèi)毒素表達(dá)為包囊蛋白，并加工 所得的細(xì)胞，將其作為殺昆蟲劑噴霧，Gaertner et al. (1993)，Advanced Engineered Pesticides (高級工程化殺蟲劑)，ed. L. Kim (Marcel Decker, Inc.)?？蛇x地，通過將異源基因?qū)爰?xì)胞宿主可產(chǎn)生本發(fā)明的組分。異源序列的表達(dá)直 接或間接導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生沉默元件和靶序列。然后可以將這些組合物按照常規(guī)技術(shù)制 劑，應(yīng)用在宿有靶害蟲的環(huán)境中，例如土壤，水和植物葉片。參見例如EPA0192319和本文引 用的參考文獻(xiàn)。
在本發(fā)明中，可將轉(zhuǎn)化的微生物與可接受載體制劑成單獨或組合的組合物，其可 以是例如懸浮液，溶液，乳液，散粉，可分散顆粒，可潤濕粉末和可乳化濃縮液，氣溶膠，浸透 顆粒，佐劑，可涂覆糊劑，也可包囊在例如聚合物物質(zhì)中。以上公開的這種組合物可通過添加表面活性劑，惰性載體，防腐劑，潤濕劑，飼喂 刺激物，吸引劑，包囊劑，粘合劑，乳化劑，染料，UV保護(hù)劑，緩沖劑，流動劑或肥料，微量營養(yǎng) 素供體，或影響植物生長的其他制劑而獲得。一種或多種農(nóng)業(yè)化學(xué)品包括但不限于除草劑， 殺昆蟲劑，殺真菌劑，殺細(xì)菌劑，殺線蟲劑，殺軟體動物劑，殺螨劑，植物生長調(diào)控劑，落葉劑 和肥料可與載體，表面活性劑或制劑領(lǐng)域常規(guī)采用的佐劑或其他組分分組合，以促進(jìn)產(chǎn)品 處理和應(yīng)用于特定靶害蟲。適宜的載體和佐劑可以是固體或液體，并對應(yīng)在制劑技術(shù)中常 規(guī)采用的物質(zhì)，例如天然或再生礦物質(zhì)，溶劑，分散劑，潤濕劑，增稠劑，粘合劑或肥料。本發(fā) 明的活性成分(即至少一種沉默元件)通常以組合物形式應(yīng)用，并可應(yīng)用于待處理的作物 區(qū)域，植物或種子。例如，組合物可在準(zhǔn)備在糧倉或地窖等儲存時或儲存期間應(yīng)用于谷物。 組合物可與其它化合物同時應(yīng)用或與其他化合物依次應(yīng)用。應(yīng)用活性成分或包含至少一種 沉默元件的組合物的方法包括但不限于，葉敷、種子涂覆和土壤應(yīng)用。應(yīng)用的數(shù)量和應(yīng)用速 率取決于相應(yīng)害蟲的侵?jǐn)_強(qiáng)度。適宜表面活性劑包括但不限于，陰離子化合物例如金屬羧酸鹽；長鏈脂肪酸羧酸 鹽；N-酰基肌氨酸酯；脂肪醇乙氧基化物的磷酸單或雙酯或這種酯的鹽；脂肪醇硫酸鹽例 如十二烷基硫酸鈉，十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基化脂肪醇硫酸鹽；乙氧基 化烷基苯酚硫酸鹽；木質(zhì)素硫酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽例如烷基苯磺酸鹽或低 級烷基萘磺酸鹽，例如丁基萘磺酸鹽；磺酸鹽萘甲醛縮合物的鹽；磺酸鹽苯酚甲醛縮合物 的鹽；更復(fù)雜的磺酸鹽例如酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺酸縮合產(chǎn)物；或二 烷基磺基琥珀酸鹽，例如磺酸鈉或琥珀酸二辛酯。非離子劑包括脂肪酸酯，脂肪醇，脂肪酰 胺或脂肪烷基或烯基取代苯酚與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物，多元醇的脂肪酸酯，例如山梨糖醇 脂肪酸酯，這種酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，氧化乙烯和氧 化丙烯的嵌段共聚物，炔乙二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7- 二醇，或乙氧基化炔 乙二醇。陽離子表面活性劑的實例包括例如脂肪族單、雙或聚胺例如乙酸鹽，環(huán)烷酸鹽或油 酸鹽；或含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通過羧酸與雙或聚胺縮合制備的酰胺連 接胺；或季銨鹽。惰性材料的實例包括但不限于，無機(jī)礦物質(zhì)例如高嶺土，硅酸鹽，碳酸鹽，硫酸鹽， 磷酸鹽或植物材料例如軟木，粉狀玉米芯，花生殼，稻殼和胡桃殼。含有沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的組合物可以以適宜形式直接應(yīng)用或作為原始組 合物的濃縮物，其在應(yīng)用前需要用適量水或其他稀釋劑稀釋。組合物(包括轉(zhuǎn)化的微生物)可在害蟲開始出現(xiàn)時或在害蟲出現(xiàn)之前作為保護(hù)措 施，通過例如噴霧，霧化，撒粉，散播，涂覆或傾注，導(dǎo)入土壤里或土壤上，導(dǎo)入灌溉水中，通 過種子處理或一般應(yīng)用或撒粉應(yīng)用于昆蟲害蟲的環(huán)境。例如，組合物和/或轉(zhuǎn)化的微生物 可與谷物混合，以在儲存期間保護(hù)谷物。在植物生長早期良好防治害蟲通常是很重要的，因 為這個時間植物可以被最嚴(yán)重地?fù)p害。組合物可方便地包含另一殺昆蟲劑，如果必要的話。 在本發(fā)明的一種實施方式中，組合物可在種植的時候，以載體和桿狀菌菌株或本發(fā)明轉(zhuǎn)化 微生物的死細(xì)胞的組合物的顆粒形式，直接應(yīng)用于土壤。另一實施方式是含有農(nóng)業(yè)化學(xué)品例如除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體和桿狀菌菌株或本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組 合物的顆粒形式。XII.植物，植物部分，和導(dǎo)入序列至植物的方法在一種實施方式中，本發(fā)明的方法包括將多肽或多核苷酸導(dǎo)入植物?！皩?dǎo)入”表示 以序列能夠進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部的方式，向植物呈遞多核苷酸或多肽。本發(fā)明的方法不依靠 將序列導(dǎo)入植物的特定方法，只要多核苷酸或多肽能夠進(jìn)入植物的至少一個細(xì)胞的內(nèi)部。 將多核苷酸或多肽導(dǎo)入植物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法，瞬時轉(zhuǎn) 化方法，和病毒介導(dǎo)方法?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”表示被導(dǎo)入植物的核苷酸構(gòu)建體整合到植物基因組并能夠通過其后 代遺傳?！八矔r轉(zhuǎn)化”表示多核苷酸被導(dǎo)入植物且不整合到植物基因組中或多肽被導(dǎo)入植物 中。轉(zhuǎn)化方案以及將多肽或多核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案可依據(jù)轉(zhuǎn)化的靶植物或 植物細(xì)胞的類型即單子葉或雙子葉而變化。將多肽和多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞的適宜方 法包括顯微注射(Crossway et al. (1986)Biotechniques 4:320-334)，電穿孔(Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5602_5606，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(美國專利 號 5，563，055 和美國專利號 5，981，840)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3 2717-2722)和彈道顆粒加速度(參見例如美國專利號4，945，050 ；美國 專利號 5，879，918 ；美國專利號 5，886，244 ；和 5，932，782 ；Tomes et al. (1995)于 Plant Cell, Tissue, and Organ Culture fundamental Methods (植物細(xì)胞、組織 禾口器官培養(yǎng)基石出方法)，ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin)； McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926)；和 Lecl 轉(zhuǎn)化(W000/28058)。也 參 B Weissinger et al. (1988)Ann. Rev. Genet. 22421-477 ；Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27_37(洋蔥)；Christou et al. (1988)Plant Physiol. 87 :671-674(大豆)；McCabe et al. (1988)Bio/Technology 6 923-926(大 豆)；Finer 和 McMullen (1991) In Vitro CellDev. Biol. 27P :175_182 (大豆)；Singh et al. (1998)Theor. Appl. Genet. 96 :319_324(大豆)；Datta et al. (1990)Biotechnology 8 736-740 ( 7jC M ) ；Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :4305_4309 (玉 米)；Klein etal. (1988) Biotechnology 6 559-563 (玉米)；美國專利號 5，240, 855 ； 5,322,783 和 5，324，646 ;Klein et al. (1988)Plant Physiol. 91 440-444(玉米)； Fromm etal. (1990)Biotechnology 8:833_839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984)Nature(倫敦)311 :763-764 ；美國專利號 5，736，369(谷類)；Bytebier etal. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345_5349 (百合)；De Wet et al. (1985)在 The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York)，pp. 197-209 (花粉)；Ka印pier et al. (1990)Plant CellReports 9 :415_418 和 Kaeppler et al. (1992) Theor . Appl. Genet. 84 560-566 (噬菌體頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)； D ‘ Halluin et al. (1992)Plant Cell4 :1495_1505 (電穿孔)；Li et al. (1993)Plant Cell Reports 12 :250_255 和 Christou 和 Ford (1995) Annals of Botany 75:407_413(水 稻)；Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnologyl4 :745_750 (經(jīng)根瘤農(nóng)桿菌的玉米)；通 過引用將其全部并入本文。
在特定實施方式中，可以使用多種瞬時轉(zhuǎn)化方法將沉默元件序列和/或抑制增強(qiáng) 元件提供給植物。這種瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，將蛋白或其變體和片段直接導(dǎo)入植 物或?qū)⑥D(zhuǎn)錄本導(dǎo)入植物。這種方法包括例如顯微注射或顆粒轟擊。參見例如Crosswayet al. (1986)Mol Gen. Genet. 202 179-185 ；Nomura et al. (1986)Plant Sci. 44 53-58 ； Hepler et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci.91 2176-2180 禾口 Hush et al. (1994)The Journal of Cell Science 107 :775_784，通過引用將其全部并入本文。可選地，使用本 領(lǐng)域已知技術(shù)可將多核苷酸瞬時導(dǎo)入植物。這種技術(shù)包括病毒載體體系和以防止隨后 的DNA釋放的方式沉淀多核苷酸。因而，可以出現(xiàn)來自顆粒結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄，但大幅降低 了其釋放并整合到基因組中的頻率。這種方法包括使用包被聚乙二胺亞胺的顆粒(PEI ； Sigma#P3143)。在其他實施方式中，可通過植物與病毒或病毒核酸的接觸，將沉默元件和/或抑 制增強(qiáng)元件導(dǎo)入植物。通常地，這種方法包括將本發(fā)明核苷酸構(gòu)建體并入病毒DNA或RNA分 子內(nèi)。此外，認(rèn)為本發(fā)明的啟動子也包括通過病毒RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄所使用的啟動子。將多 核苷酸導(dǎo)入植物并在其中表達(dá)編碼蛋白、包括病毒DNA或RNA分子的方法是本領(lǐng)域已知的。 參見例如美國專利號 5，889，191,5, 889，190,5, 866，785,5, 589，367,5, 316，931，和 Porta et al. (1996)Molecular Biotechnology 5:209-221 ；通過引用將它們并入本文。在植物基因組的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一種 實施方式中，通過位點特異性重組體系實現(xiàn)在所需基因組位置插入多核苷酸。參見例如 W099/25821，W099/25854，W099/25840, W099/25855 和 W099/25853，通過引用將它們?nèi)坎?入本文。簡而言之，本發(fā)明的多核苷酸可包含在側(cè)翼連接兩個非重組發(fā)生重組位點的轉(zhuǎn)移 盒中。將轉(zhuǎn)移盒導(dǎo)入植物，所述植物使側(cè)翼連接與轉(zhuǎn)移盒位點對應(yīng)的兩個非重組發(fā)生重組 位點的靶位點穩(wěn)定地并入其基因組。提供適當(dāng)重組酶，而轉(zhuǎn)移盒整合至靶位點。感興趣的 多核苷酸由此整合至植物基因組的特定染色體位置中。被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照常規(guī)方式可生長成植物。參見，例如McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5 :81_84。然后這些植物生長，用相同轉(zhuǎn)化株或不同株授粉，并鑒別具 有組成型表達(dá)所需表型特征的所得后代?？缮L兩代或更多世代以確保所需表型特征的表 達(dá)穩(wěn)定保持并遺傳，然后收集種子以確保實現(xiàn)表達(dá)所需表型特征。在這種方式中，本發(fā)明提 供了具有穩(wěn)定并入其基因組的本發(fā)明多核苷酸、例如本發(fā)明的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化種子(也稱為 “轉(zhuǎn)基因種子”)。如本文所用的，術(shù)語植物包括植物細(xì)胞，植物原生質(zhì)體，可再生成植物的植物細(xì)胞 組織培養(yǎng)物，植物愈傷組織，植物團(tuán)塊和植物或植物部分例如胚，花粉，胚珠，種子，葉，花， 枝，果實，果核，穗，穗軸，殼，莖，根，根尖，花藥等等中完整的植物細(xì)胞。谷粒表示由商業(yè)生 長者為非生長或再生物種目的而生產(chǎn)的成熟種子。再生植物的后代，變體和突變體也包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些部分含有被導(dǎo)入的多核苷酸。本發(fā)明可用于任何植物物種的轉(zhuǎn)化，包括但不限于單子葉和雙子葉。感興趣的植 物物種實例包括但不限于，玉米(Zea mays)，蕓薹屬(例如B. napus，B. rapa，B. juncea)，特 別是用作種子油來源的那些蕓薹屬物種，苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa), 黑麥(Secale cereale)，高梁(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)，粟(例如黑粟 (Pennisetum glaucum)，黃米(Panicum miliaceum),小米(Setaria italica),指粟(Eleusine coracana)), (π] H ^ (Helianthus annuus), ^L^c (Carthamus tinctorius), 小麥(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，煙草(Nicotiana tabacum)，馬鈴 暮(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum)，番薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡 (Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠蘿(Ananas comosus)，柑橘樹(Citrus spp.),可可(Theobroma cacao),茶(Camellia sinensis),香蕉(Musa spp·),魚萼 梨(Persea americana)，無花果(Ficus casica)，番石槽(Psidium guajava)，芒果 (Mangifera indica), (Olea europaea),(Carica papaya), (Anacardium
occidentale), ^yjfl(Macadamia integrifolia), (Prunus amygdalus), ^ (Beta vulgaris)，甘蔗(Saccharum spp.)，燕麥，大麥，蔬菜，觀賞植物，和針葉樹類。蔬菜包括番爺(Lycopersicon esculentum),萵苣(例如 Lactuca sativa),青 豆(Phaseolus vulgaris),禾1J 馬豆(Phaseolus limensis)，碗豆(Lathyrus spp.),禾口 甜瓜屬成員例如黃瓜(C. sativus)，香瓜(C. cantalupensis)，和甜瓜(C. melo)。觀賞植 物包括才土胃$^￡ (Rhododendron spp. ), AyIlljiE (Macrophyllahydrangea), 7KH (Hibiscus rosasanensis)，攻瑰(Rosa spp.)，郁金香(Tulipaspp. )，/K 仙花(Narcissus spp.)， ^ 41 ^ (Petunia hybrida)，i 乃 (Dianthus caryophyllus), MM (Euphorbia pulcherrima)禾口菊花。本發(fā)明實踐可采用的針葉樹類包括例如松樹例如火炬松(Pinus taeda)，沼澤 松(Pinus elliotii)，美洲黃松(Pinus ponderosa)，黑松(Pinus contorta)，和輻射松 (Pinus radiata) ；Jft^ (Pseudotsuga menziesii) ；MrP^^ (Tsuga canadensis) ；z 杉(Picea glauca)；紅杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉例如銀揪(Abies amabilis)禾口 香脂冷杉(Abies balsamea)；和雪松例如西部紅雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黃雪松 (Chamaecyparis nootkatensis)。在特定實施方式，本發(fā)明的植物是作物植物(例如玉米， 苜蓿，向日葵，蕓薹屬，大豆，棉花，紅花，花生，高粱，小麥，粟，煙草等)。在其他實施方式中， 玉米和大豆植物是最佳的，在其他實施方式中玉米植物是最佳的。感興趣的其他植物包括提供感興趣種子的谷物植物，油料種子植物，和豆科植物。 感興趣種子包括谷物種子，例如玉米，小麥，大麥，水稻，高粱，黑麥等。油料種子植物包括棉 花，大豆，紅花，向日葵，蕓薹屬，玉米，苜蓿，棕櫚，椰子等。豆科植物包括豆類和豌豆。豆類 包括谷柯，槐豆，胡蘆巴，大豆，青刀豆，豇豆，綠豆，利馬豆，蠶豆，扁豆，鷹嘴豆等。在一種實施方式中，具有聯(lián)合表達(dá)沉默元件和抑制增強(qiáng)元件或其片段的植物、植 物細(xì)胞和植物部分具有相對于沉默元件單獨表達(dá)可實現(xiàn)的，由沉默元件產(chǎn)生的增強(qiáng)水平的 抑制性RNA。在特定實施方式中，系統(tǒng)性產(chǎn)生RNAi發(fā)生在整個植物中。在其它實施方式中，當(dāng) 與僅表達(dá)沉默元件構(gòu)建體的對照相比時，本發(fā)明的植物或植物部分具有改善的RNAi至韌 皮部的裝載，從而通過RNAi途徑提供更好的對韌皮部飼喂昆蟲的防治。在特定實施方式， 本發(fā)明的植物、植物部分和植物細(xì)胞還可以具有特征，如允許產(chǎn)生多樣性RNAi物種種群， 其可增強(qiáng)阻斷靶基因表達(dá)的效率。XI.使用方法提供了增加靶序列特異抑制性RNA濃度的方法。方法包括沉默元件和抑制增強(qiáng)元件在細(xì)胞中的聯(lián)合表達(dá)。在特定實施方式中，方法包括將第一多核苷酸和第二多核苷酸導(dǎo) 入植物細(xì)胞，第一多核苷酸含有害蟲靶序列的抑制性RNA前體和第二多核苷酸含有抑制增 強(qiáng)元件，其中沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)增加了害蟲靶序列特異抑制性RNA在植 物細(xì)胞中的濃度。在其它實施方式中，沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)增加了害蟲靶 序列特異抑制性RNA在含有植物細(xì)胞的植物韌皮部中的濃度。還提供了防治害蟲的方法，包括用植物細(xì)胞飼喂害蟲，該植物細(xì)胞含有包含害蟲 靶序列的沉默元件的第一多核苷酸和包含抑制增強(qiáng)元件的第二多核苷酸。在特定實施方式 中，沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)增加了害蟲靶序列特異抑制性RNA在植物細(xì)胞中 的濃度。通過多種方式用沉默元件飼喂害蟲。例如，在一種實施方式中，將含有沉默元件和 抑制增強(qiáng)元件的多核苷酸導(dǎo)入植物中。隨著植物或其表達(dá)這些序列的部分飼喂害蟲，RNAi 被遞送至害蟲。當(dāng)沉默元件和/或抑制增強(qiáng)元件通過這種方式被遞送至植物時，認(rèn)為兩種 多核苷酸或其一可組成型表達(dá)，或可選擇地，通過采用本文別處討論的多種可誘導(dǎo)或組織 優(yōu)選或發(fā)育調(diào)控啟動子，以階段特異性方式產(chǎn)生兩者或其一。例如，沉默元件和抑制增強(qiáng)元 件可在氣生植物組織、例如葉、莖、花等中表達(dá)。在其他實施方式中，沉默元件和抑制增強(qiáng)元 件是在根部表達(dá)。在這些實施方式中，半翅目例如葡萄木虱可以是靶向的。在某些實施方式中，本發(fā)明的構(gòu)建體可以疊加任何組合的感興趣多核苷酸序列， 以獲得具有所需性狀的植物。如本文所用的，性狀是指源自特定序列或序列組的表型。 例如，本發(fā)明多核苷酸可疊加編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲活性的多肽的任何其他多核苷 酸，例如其他蘇云金桿菌毒性蛋白(在美國專利號5，366，892 ；5, 747，450 ；5, 737，514 ； 5，723，756 ;5，593，881 ；和 Geiser et al. (1986)Gene 48 :109 中描述的)、外源凝集素 (VanDamme et al. (1994)Plant Mol. Biol. 24 :825)，pentin (美國專利號 5，981，722 中描述 的)等。生成的組合也可包括任一感興趣多核苷酸的多個拷貝。本發(fā)明多核苷酸也可疊加 任何其他基因或基因組合，以產(chǎn)生具有多種所需性狀組合的植物，所述性狀包括但不限于， 動物飼喂所需的性狀例如高油基因(例如美國專利號6，232，529)；平衡氨基酸(例如硫素 (hordothionins)(美國專利號 5，990，389 ；5，885，801 ；5，885，802 和 5，703，409)；大麥高 賴氨酸(Williamson et al. (1987)Eur. J. Biochem. 165 :99_106和 WO 98/20122)和高甲硫 氨酸蛋白(Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 6279 ；Kirihara et al. (1988)Gene 71 359 ；和 Musumura et al. (1989)Plant Mol. Biol. 12 123))；增加的消化性(例如修飾 的儲存蛋白(2001年11月7日提交的美國申請流水號10/053,410)；和硫氧還蛋白(2001 年12月3日提交的美國申請流水號10/005,429))；通過引用將其公開內(nèi)容并入本文。本發(fā)明的多核苷酸也可疊加疾病或除草劑抗性所需的性狀(例如煙曲霉毒素脫 毒基因(美國專利號5，792，931)；無毒性和疾病抗性基因(Jones etal. (1994) Science 266 789 ；Martin et al. (1993) Science 262 1432 ；Mindrinos et al. (1994)Cell 78 1089)；導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體例如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺 合酶抑制劑例如草胺磷或草丁膦(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和加 工或加工產(chǎn)品所需性狀例如高油(例如美國專利號6，232，529)；修飾油(例如脂肪酸去 飽和酶基因(美國專利號5，952，544 ；WO 94/11516))；修飾淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶 (AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)，和淀粉脫支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑
33料(例如美國專利號5. 602，321 ； β-酮硫解酶，聚羥基丁酸酯合酶和乙酰乙酸-CoA還原 酶(Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170 =5837-5847)促進(jìn)聚羥基脂肪酸酯(PHAs)表 達(dá))；通過引用將其公開內(nèi)容并入本文。也可將本發(fā)明的多核苷酸與提供農(nóng)業(yè)性狀例如雄 性不育(例如參見美國專利號5. 583，210)、莖強(qiáng)度、開花時間或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀例如細(xì)胞周 期調(diào)控或基因打靶(例如WO 99/61619、W0 00/17364和WO 99/25821)的多核苷酸組合；通 過引用將其公開內(nèi)容并入本文。通過任何方法可獲得這些疊加組合，所述方法包括但不限于，通過任何常規(guī)或頂 交(TopCross)方法的雜交育種植物，或基因轉(zhuǎn)化。如果通過基因轉(zhuǎn)化植物疊加序列，可在 任何時候按任何順序組合感興趣多核苷酸序列。例如，含有一個或多個所需性狀的轉(zhuǎn)基因 植物可作為靶以通過隨后轉(zhuǎn)化導(dǎo)入更多性狀。性狀可按共轉(zhuǎn)化方案與轉(zhuǎn)化盒的任何組合提 供的感興趣多核苷酸同時導(dǎo)入。例如，如果導(dǎo)入兩個序列，這兩個序列可包含在單獨的轉(zhuǎn)化 盒(反式)或包含在相同轉(zhuǎn)化盒(順式)。序列的表達(dá)可由相同啟動子或不同啟動子驅(qū)動。 在某些情況下，可能希望導(dǎo)入會抑制感興趣多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可與其他抑制盒或 過表達(dá)盒的任何組合相組合，以在植物中生成性狀的所需組合。還認(rèn)為使用位點特異性重 組體系可將多核苷酸序列疊加在所需基因組位置上。參見例如W099/25821，W099/25854, W099/25840，W099/25855和W099/25853，通過引用將它們?nèi)坎⑷氡疚?。以解釋而非限制的方式提供如下實施例。實驗實施? 靶序列，沉默元件和抑制增強(qiáng)元件經(jīng)RNAi阻斷昆蟲基因功能可產(chǎn)生針對靶昆蟲的特異活性。通過轉(zhuǎn)基因植物遞送 dsRNA可增強(qiáng)這種特異性。如上所述，提供了方法和組合物，其通過抑制增強(qiáng)元件和沉默元 件的聯(lián)合表達(dá)增加RNAi的水平，所述抑制增強(qiáng)元件含有靶序列或其片段或變體。圖1提供 了來自鱗翅目的全長靶序列的非限制性實例，其可用于設(shè)計用于聯(lián)合表達(dá)的適宜抑制增強(qiáng) 元件和/或沉默元件。表1提供了可用于本發(fā)明方法的引物和它們各自的靶序列的非限制 實例。在特定實施方式中，抑制增強(qiáng)元件含有希望被抑制的部分或完整序列。例如，SEQ ID N0S:l-58所示序列。這種抑制序列可置于適宜的調(diào)控元件的控制之下，并可以是用于 遞送沉默元件的相同或不同轉(zhuǎn)化載體的部分，或作為用于共轉(zhuǎn)化感受態(tài)植物或細(xì)胞、或二 次轉(zhuǎn)化此前用沉默元件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植物的第二載體。表1 (注意表1所示的正義引物序列和反義引物序列可生成在3’端具有2個胸
腺嘧啶殘基。) 表2公開的數(shù)據(jù)是如下得到的
微滴飼喂測驗對第一齡幼蟲飼喂在含有藍(lán)色食品色素的20%蔗糖溶液中的21bpdsRNA引物對 (50微摩爾)。該引物在任一端具有2bp的突出端。引物序列是基于來自秋夜娥內(nèi)部cDNA 文庫的基因。靶基因的選擇是基于對文獻(xiàn)的瀏覽，文獻(xiàn)指出，在其他物種中，它們是可擾亂 的靶，或基于預(yù)測該基因?qū)ハx的發(fā)育或生理至關(guān)重要。兩小時之后，大部分幼蟲消耗了溶 液。然而，僅將具有藍(lán)色胃道的幼蟲轉(zhuǎn)移至干凈的人工飲食中(沒有dsDNA并入飲食)。經(jīng) 計算，昆蟲消耗了大約200nl的流體。48小時之后，檢查與飼喂蔗糖的昆蟲和飼喂陰性對照 Ambion弓丨物的昆蟲陰性對照相比生長遲緩的昆蟲。注射測驗向初生或第二齡秋夜娥注射濃度為2 μ g/μ 1的多種RNA引物對。使用30 X放 大倍數(shù)的解剖顯微鏡，在顯微操作器和微量移液器的輔助下進(jìn)行注射。每只昆蟲注射大約 200nL，并注射到昆蟲的血腔而非胃道中。注射Ambion陰性對照引物對的顯示出接近100% 的存活率。僅有的一例死亡很可能是由于機(jī)械性損傷。這些注射測驗顯示了基于該濃度 下的所測試秋夜娥序列的大部分引物對的強(qiáng)烈的殺昆蟲活性。然后注射濃度范圍為2 μ g/ μ -ο. 125yg/yl的2個引物。在最高級觀察到死亡，而在更低級，觀察到生長遲緩。估計 EC50濃度為大約0.1?；陲嬍车木植匡曃箿y驗用濃度為0.67 μ g/μ 1的引物對進(jìn)行測驗。在100 μ 1飲食中應(yīng)用5 μ 1樣品，4次 觀察/樣品。實驗重復(fù)4次。在72小時，評分昆蟲的生長遲緩和死亡率。在這些測驗中， 某些引物對證實了不一致的活性，而一些引物對證實了一致的活性。不一致很可能是至少 部分地出于計分者(我)對生長遲緩的不一致定義。我們希望通過采用掃描分析儀以今后 計分平板并對4次觀察中的生長遲緩和必要一致性設(shè)定嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，來解決這個問題。同時， 已經(jīng)為生長遲緩制定更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，這應(yīng)該會幫助消除可能在一次實驗重復(fù)中得分而在 另一次中不得分的邊際檢出(marginal calls) 0所有引物對均在0.67、0.33和0. 16yg/y 1進(jìn)行劑量反應(yīng)。觀察通常劑量反應(yīng)數(shù) 據(jù)，并基于EC50數(shù)據(jù)辨別引物對。許多引物對證實了在最高級的活性。在數(shù)個其他情況中， 引物對在兩個最高級具有活性，但未證實在最低級的活性。在一個情況中，引物對在兩個最 高級具有明顯死亡甚至在0.16 μ g/μ 1級生長遲緩。這些數(shù)據(jù)總結(jié)在下表中。注意表2 所示的正義引物序列和反義引物序列可生成在3’端具有2個胸腺嘧啶殘基。
實施例2.玉米轉(zhuǎn)化用含有本發(fā)明沉默元件的質(zhì)粒轟
元件可操作連接至玉米Ubi 1-5UTR-Ubi 1內(nèi)含子和可選擇標(biāo)記基因PAT(Wohlleben et al. (1988) Gene 70 :25_37)，其賦予除草劑雙丙磷抗性。在特定實施方式中，構(gòu)建體具有2 個反向的相同2-300bp靶基因片段，它們之間具有“內(nèi)含子”片段以便形成發(fā)卡環(huán)。這個構(gòu) 建體可與dMMB啟動子連接。該質(zhì)粒還含有包含靶害蟲序列或其片段或變體的抑制增強(qiáng)元 件?？蛇x地，在單獨的質(zhì)粒中提供了可選擇標(biāo)記基因。如下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方如下。靶組織的制備剝?nèi)ニ?，表面?0%次氯酸鈉漂白劑加0. 5%微去垢劑滅菌20分鐘，并用滅菌水 清洗兩次。切離未成熟胚，并胚軸側(cè)朝下放置(胚子葉側(cè)朝上)，每板25個胚，在560Y培養(yǎng) 基上4小時，然后排列在2. 5cm的靶區(qū)域內(nèi)準(zhǔn)備用于轟擊。制備了含有感興趣沉默元件的質(zhì)粒載體，該沉默元件可操作連接至玉米 Ubil-5UTR-Ubil內(nèi)含子。使用以下的CaCl2沉淀程序，將質(zhì)粒DNA加含有PAT選擇性標(biāo)記 的質(zhì)粒DNA沉淀到1. 1 μ m(平均直徑)鎢沉淀上100 μ 1制備的水中鎢顆粒；10 μ 1 (1 μ g) Tris EDTA 緩沖液中的 DNA (1 μ g 總 DNA) ； 100 μ 1 2. 5Μ CaCl2 ；禾口 10 μ 1 0. IM 精脒。向鎢顆粒懸浮液中依次加入每種試劑，而維持在多管渦旋器上。對最終混合液 做短暫的超聲處理，并在恒定渦旋下溫育10分鐘。在沉淀期后，將試管短暫離心，移除液 體，并用500ml 100%乙醇清洗，離心30秒。再次移除液體，并在最終的鎢顆粒沉淀中加入 105μ 1100%乙醇。對于顆粒槍轟擊，對鎢/DNA顆粒做短暫的超聲處理，并將10 μ 1點樣于 在每個巨載體(macrocarrier)的中心，使其在轟擊之前干燥約2分鐘。樣品平板在顆粒槍中水平#4下轟擊。用從每管制備的顆粒/DNA中取出的共十等 份，對所有樣品進(jìn)行650PSI下的單次射擊。轟擊之后，將胚在560Y培養(yǎng)基中保持2天，然后轉(zhuǎn)移至含有3mg/升雙丙氨磷的 560R選擇培養(yǎng)基中，并每兩周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。選擇大約10周之后，將選擇抗性的愈傷組織 克隆轉(zhuǎn)移至288J培養(yǎng)基中，以啟動植物再生。體細(xì)胞胚成熟(2-4周)之后，將發(fā)育良好的 體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)并轉(zhuǎn)移至有光培養(yǎng)室中。大約7-10天之后，將發(fā)育中的 小苗轉(zhuǎn)移至試管中的272V無激素培養(yǎng)基中7-10天，直至小苗良好建成。然后將植株轉(zhuǎn)移 至含有盆栽土的淺箱插孔中(等于2.5"盆栽)，在生長箱中生長1周，之后在溫室中再生 長1-2周，然后轉(zhuǎn)移至典型的600盆栽(1.6加侖)并生長至成熟。監(jiān)測植物并為適當(dāng)標(biāo)記 評分。例如，可以進(jìn)行FAW飼喂測驗。在這種測驗中，使用Icm木塞鉆孔器或葉片沖壓器， 從轉(zhuǎn)基因植物切離葉片圓盤。每株植物制備6個葉片圓盤。將葉片置于在500μ1 0.8%瓊 脂之上的24孔微孔板中。用2個初生秋夜娥(或任何感興趣的害蟲)侵染每個葉片圓盤， 然后用聚酯膜密封該板。為每個孔留個小通氣孔，然后將板儲存在28°C生長箱中。96小時 時，對測驗的死亡率、生長遲緩和葉片消耗評分。轟擊培養(yǎng)基(560Y)含有4. Og/1 N6基礎(chǔ)鹽(SIGMA C-1416)，1. Oml/1埃里克松 維生素混合物(1000X SIGMA-1511)，0. 5mg/l 硫胺素 HCl，120. Og/Ι 蔗糖，1.0mg/l 2，4_D 和2. 88g/l L-脯氨酸(用KOH調(diào)整pH至5. 8之后，以D-I H2O恢復(fù)體積)；2. Og/Ι結(jié)冷 膠(Gelrite)(以D-I H2O恢復(fù)體積之后加入)；和8. 5mg/l硝酸銀(滅菌培養(yǎng)基并冷卻至 室溫之后加入)。選擇培養(yǎng)基(560R)含有4. Og/1 N6基礎(chǔ)鹽(SIGMA C-1416)，1. Oml/1埃 里克松維生素混合物(1000X SIGMA-1511)，0. 5mg/l硫胺素HCl，30. Og/Ι蔗糖和2. Om/12,
524-D (用KOH調(diào)整pH至5. 8之后，以D-I H2O恢復(fù)體積)；3. Og/Ι結(jié)冷膠(以D-I H2O恢復(fù) 體積之后加入)；和0. 85mg/l硝酸銀和3. Omg/1雙丙氨磷(都在滅菌培養(yǎng)基并冷卻至室溫 之后加入)。植物再生培養(yǎng)基(288J)含有4. 3g/l MS 鹽(GIBC0 11117-074)，5. Oml/IMS 維生 素原溶液(O. IOOg煙酸，0. 02g/l硫胺素HCL, 0. 10g/l吡哆醇HCL和0. 40g/l甘氨酸(用精 致 D-I H2O 恢復(fù)體積)(Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15 473)，100mg/l 肌 醇，0. 5mg/l玉米素，60g/l蔗糖和1. Oml/1的0. ImM抗壞血酸(調(diào)整pH至5. 6之后，用精 致D-I H2O恢復(fù)體積)；3. Og/Ι結(jié)冷膠(以D-I H2O恢復(fù)體積之后加入)；和1. Omg/1吲哚 乙酸和3. Omg/1雙丙氨磷(滅菌培養(yǎng)基并冷卻至60°C之后加入)。無激素培養(yǎng)基(272V)含 有 4. 3g/l MS 鹽(GIBC0 11117-074)，5. Oml/1 MS 維生素原溶液(0. 100g/l 煙酸，0. 02g/l 硫胺素HCL, 0. 10g/l吡哆醇HCL和0. 40g/l甘氨酸，用精致D-I H2O恢復(fù)體積)，0. lg/Ι肌 醇和40. Og/Ι蔗糖(調(diào)整pH至5. 6之后，用精致D-I H2O恢復(fù)體積)；和6g/l細(xì)菌用瓊脂 (用精致D-I H2O恢復(fù)體積之后加入)，滅菌并冷卻至60°C。實施例3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化用本發(fā)明的沉默元件和抑制增強(qiáng)元件(例如，實施例2所述的那些)進(jìn)行農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，采用Zhao的方法(美國專利第5，981，840號和PCT專利公開文本 W098/32326 ；通過引用將它們的內(nèi)容并入本文)。簡而言之，從玉米中分離未成熟的胚，并 將胚與農(nóng)桿菌懸浮液接觸，其中細(xì)菌能夠?qū)⒑谐聊鸵种圃鰪?qiáng)元件的多核苷酸轉(zhuǎn)移 至至少一個未成熟胚的至少一個細(xì)胞中(步驟1:感染步驟)。在該步驟中，將未成熟胚浸 沒在農(nóng)桿菌懸浮液中以啟動接種。將胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。 在感染步驟后，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟胚。共培養(yǎng)期之后，涉及任選的“靜息”步驟。在 該靜息步驟中，在已知抑制農(nóng)桿菌生長的至少一種抗生素的存在下孵育胚，而不添加植物 轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3 靜息步驟)。將未成熟胚培養(yǎng)在含抗生素但不含選擇劑的固體培 養(yǎng)基中，以消除農(nóng)桿菌和進(jìn)行被感染細(xì)胞的靜息階段。接下來，將接種胚培養(yǎng)在含有選擇劑 的培養(yǎng)基中，并回收生長轉(zhuǎn)化的愈傷組織(步驟4 選擇步驟)。將未成熟胚培養(yǎng)在含選擇 劑的固體培養(yǎng)基中，以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇性生長。然后將愈傷組織再生成植物(步驟5:再生 步驟)，并將在選擇性培養(yǎng)基中生長的愈傷組織培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上以再生成植物。實施例4 大豆胚轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件將大豆胚生成懸浮培養(yǎng)物(cv. Jack)維持在35ml液體培養(yǎng)基SB196 (參見以下配 方)中，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上150rpm振蕩，26°C，且用冷白色熒光按16 8小時晝/夜的光 周期以60-85 μ E/m2/s光強(qiáng)度照射。通過將約35mg組織接種至35ml新鮮液體SB196中， 每7天至兩周對培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)(優(yōu)選的繼代培養(yǎng)間隔是每7天)。用以下實施例所述的質(zhì)粒和DNA片段通過顆粒槍轟擊方法(Klein et al. (1987) Nature, 327 70)，轉(zhuǎn)化大豆胚生成懸浮培養(yǎng)物。大豆胚生成懸浮培養(yǎng)啟動每月啟動兩次大豆培養(yǎng)，每次啟動間隔5-7天。從種植45-55天后的可用大豆植物上采摘帶未成熟種子的豆莢，將其去殼并置于 滅菌品紅盒中。通過將大豆種子在含1滴乳色皂液的5%次氯酸鈉溶液(95ml高壓滅菌蒸餾水加5ml次氯酸鈉和1滴皂液)中振蕩15分鐘進(jìn)行滅菌。充分混合。使用21升瓶的滅 菌蒸餾水洗滌種子，將小于4mm的那些置于單個顯微載玻片。切除種子的小末端，從種皮中 擠出子葉。將子葉轉(zhuǎn)移至含有SBl培養(yǎng)基的平板中(每板25-30個子葉)。用纖維帶包裹 平板并儲存8周。此后切下次生胚，并將其在SB196液體培養(yǎng)基中放置7天。制備轟擊用DNA轟擊使用含有沉默元件和抑制元件(例如實施例2所述的那些)和選擇性標(biāo)記基 因的完整質(zhì)?；駾NA質(zhì)粒片段。使用Promega 方案和應(yīng)用指南，第二版(106頁)所述方 法，常規(guī)制備和純化轟擊用質(zhì)粒DNA。通過凝膠分離雙消化質(zhì)粒，獲得攜帶感興趣沉默元件 的質(zhì)粒片段。在每種情況中，在適宜感興趣質(zhì)粒的0. 5ml特定酶混合物中消化100 μ g質(zhì)粒 DNA。通過 SeaPlaque GTG 瓊脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)的凝膠電 泳分離所得的DNA片段，并從瓊脂糖凝膠上切下含有感興趣沉默元件的DNA片段。使用瓊 脂酶(GELase)消化酶按照生產(chǎn)商的方案從瓊脂糖純化DNA。將50 μ 1等份的含有3mg金顆粒(3mg金)的滅菌蒸餾水加入5 μ 1的1 μ g/ μ 1 DNA溶液(如上制備的完整質(zhì)粒或DNA片段)，50 μ 1 2. 5Μ CaCl2和20 μ 1 0. IM精脒。將混 合物在水平3的渦旋振蕩器上振蕩3分鐘并在臺式微量離心機(jī)旋轉(zhuǎn)10秒。用400 μ 1100% 乙醇清洗之后，通過在40 μ 1100%乙醇中超聲處理而懸浮沉淀。將5 μ 1 DNA懸浮液分散在 彈道PDS1000/HE儀器盤的每一飛盤上。每5 μ 1等份含有每次轟擊(即每盤)大約0. 375mg
^^ ο 組織制備和DNA轟擊將大約150-200mg的7天齡胚懸浮培養(yǎng)物置于空的、無菌60 X 15mm培養(yǎng)皿并用塑 料網(wǎng)覆蓋皿。轟擊組織，每平板1或2槍，膜破壞壓力設(shè)定為1100PSI，箱體抽空至27-28英 寸汞柱的真空。離保留/阻擋屏(retaining/stopping screen)大約3. 5英寸放置組織。轉(zhuǎn)化胚的選擇采用潮霉素(當(dāng)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT基因用作選擇性標(biāo)記時)或氯磺隆 (chlorsulfuron)(當(dāng)乙酰乳酸合酶ALS基因用作選擇性基因標(biāo)記時)選擇轉(zhuǎn)化胚。潮霉素(HPT)選擇轟擊之后，將組織置于新鮮SB196培養(yǎng)基中，并如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊之后六 天，將SB196更換成含30mg/L潮霉素選擇劑的新鮮SB196。每周更新選擇性培養(yǎng)基。選擇 之后4-6周，可以觀察到從未轉(zhuǎn)化、壞死胚生成簇中生長出的綠色轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠 色組織，并接種到多孔板中，以生成新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化胚生成懸浮培養(yǎng)物。氯磺隆(ALA)選擇轟擊之后，用新鮮SB196培養(yǎng)基將組織分配在2個燒瓶中，并如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。 轟擊之后6-7天，將SB196更換成含lOOng/L氯磺隆選擇劑的新鮮SB196。每周更新選擇性 培養(yǎng)基。選擇之后4-6周，可以觀察到從未轉(zhuǎn)化、壞死胚生成簇中生長出綠色轉(zhuǎn)化組織。取 出分離的綠色組織，并接種到含SB196的多孔板中，以生成新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化胚生成 懸浮培養(yǎng)物。大豆體細(xì)胞胚再生成植株為了從胚生成懸浮培養(yǎng)物獲得整株植物，組織必須再生。胚成熟
按16 8小時光周期，90-120μΕ/πι28的光強(qiáng)度，在冷白色熒光(Phillips冷白色 Econowatt F40/CW/RS/EW)和 Agro (Phillips F40Agro)燈泡(40 瓦)下，將胚在 SB196 中 26°C下培養(yǎng)4-6周。此后，將胚簇取出至固體瓊脂培養(yǎng)基SB1661-2周。然后將簇在培養(yǎng)基 SB103上繼代培養(yǎng)3周。在此期間，可從簇中取出單個胚，并篩選適當(dāng)標(biāo)記或當(dāng)害蟲攝取植 物時植物防治害蟲的能力。胚干燥和萌發(fā)通過將成熟的單個胚置于空的、小皮式培養(yǎng)皿盤(35X10mm)中大約4_7天，將其 干燥。用纖維帶密封平板(形成小的濕度箱)。將干燥的胚植入SB71-4培養(yǎng)基，將其在其 中保留至在以上所述相同培養(yǎng)條件下萌發(fā)。從萌發(fā)培養(yǎng)基中取出萌發(fā)的小苗，并用水充分 清洗，然后植入24室包裝盤的Redi-Earth中，用透明塑料圓頂覆蓋。2周之后，移除圓頂將 并植物再鍛煉一周。如果小苗看起來壯實，將它們轉(zhuǎn)植在10”盆栽的Redi-Earth中，每盆 多至3棵小苗。10-16周之后，收獲成熟的種子，壓碎并分析蛋白。
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培養(yǎng)基配方
SB 196-FN低鹽液體增殖培養(yǎng)基(每升)_ MS FeEDTA-IOOX 原液 1IOml
MS硫酸鹽-100 X原液2IOml
FN低鹽鹵化物-100X原液3 IOml FN 低鹽 P，B，Mo-100 X 原液 4 IOml B5 維生素(lml/L)1. Oml
2,4-D (10mg/L 終濃度)1. Oml
KNO32.83gm
(NH4) 2S040 . 46 3gm
天冬酰胺1. Ogm
蔗糖(1%)IOgm
pH 5. 8
FN低鹽原溶液 原液 #IOOOml
IMS Fe EDTA IOOX 原液 Na2EDTA*3. 724g
2. 784g
FeS04-7H20
500ml
1. 862g 1. 392g
*首先添加，在暗瓶中溶解同時攪拌 2MS硫酸鹽IOOX原液
MgS04-7H20 MnSO4-H2O ZnS04-7H20 CuS04-5H20
37. Og 1. 69g 0. 86g 0. 0025g
3FN低鹽鹵化物IOOX原液
CaCl2-2H20 KI
30. Og 0. 083g
18. 5g 0. 845g 0. 43g 0.00125g
15. Og 0.0715g
55
CoC12-6H20 0. 0025g 0. 00125g4FN 低鹽 P，B，Mo 100 X 原液KH2PO418. 5g 9. 25gH3BO30. 62g 0. 31gNa2Mo04-2H20 0. 025g 0. 0125gSBl 固體培養(yǎng)基(每升)含有:lpkg. MS 鹽(Gibco/BRL-Cat#l 1117-066) ； Iml B5 維生素 1000 X 原液；31. 5g 蔗糖；2ml 2，4_D(20mg/L 終濃度)；pH 5. 7 ；和 8g TC 瓊脂。SB 166 固體培養(yǎng)基(每升)含有:lpkg. MS 鹽(Gibco/BRL_Cat#l 1117-066) ； Iml B5維生素1000X原液；60g麥芽糖；750mg MgCl2六水合物；5g活化木炭；pH 5. 7 ；和2g結(jié)冷膠。SB 103 固體培養(yǎng)基(每升)含有:lpkg. MS 鹽(Gibco/BRL_Cat#l 1117-066) ； Iml B5維生素1000X原液；60g麥芽糖；750mg MgCl2六水合物；pH 5. 7 ；和2g結(jié)冷膠。SB 71-4固體培養(yǎng)基(每升)含有1瓶Gamborg，s B5鹽w/蔗糖(Gibco/ BRL-Cat#21153-036) ；pH 5. 7 ；禾口 5g TC 瓊脂。2,4-D原液是從Phytotech cat#D 295預(yù)制獲得的-濃度是lmg/ml。在_20°C等份儲存的B5維生素原液(每100ml)含有IOg肌醇；IOOmg煙酸；IOOmg 吡哆醇HCl;和Ig硫胺素。如果溶液不能足夠快地溶解，可應(yīng)用熱攪拌盤低水平加熱。氯 磺隆原液含有在lmg/ml的0. OlN氫氧化銨。本文所用的冠詞“一個(a)”或“一個(an)”是指一個或多于一個(即至少一個) 的冠詞的語法客體。通過舉例的方式，“一個元件”表示一個或多個元件。說明書提及的所有公開文本和專利申請指示了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。 所有公開文本和專利申請通過引用并入本文，以致如同每篇公開文本或?qū)＠暾埦唧w且單 獨地被指出通過引用并入本文。盡管為了清楚理解的目的，已經(jīng)通過解釋和實施例的方式，較詳細(xì)地描述了上述 發(fā)明，但是顯而易見的是，可在所附權(quán)利要求范圍之內(nèi)進(jìn)行某些變化和修改。
權(quán)利要求
植物細(xì)胞，其含有(a)第一異源多核苷酸，其含有可操作連接至在所述植物細(xì)胞中有活性的啟動子的靶害蟲序列沉默元件；和(b)第二異源多核苷酸，其含有可操作連接至在所述植物細(xì)胞中有活性的啟動子的抑制增強(qiáng)元件，所述抑制增強(qiáng)元件包含所述靶害蟲序列或其片段或變體。
2.如權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞，其中所述沉默元件和抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表達(dá)增加 了該害蟲靶序列特異抑制性RNA在所述植物細(xì)胞中的濃度。
3.如權(quán)利要求1或2所述的植物細(xì)胞，其中所述第一和第二多核苷酸穩(wěn)定并入所述細(xì) 胞的基因組中。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的植物細(xì)胞，其中所述害蟲是昆蟲害蟲。
5.如權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其中所述昆蟲害蟲選自(a)草盲蝽屬的成員；(b)蚜蟲；(c)蚜科的成員；和(d)鱗翅目的成員。
6.如權(quán)利要求5所述的植物細(xì)胞，其中所述的鱗翅目的成員包括草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)0
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的植物細(xì)胞，其中所述沉默元件編碼發(fā)卡RNA。
8.如權(quán)利要求7所述的植物細(xì)胞，其中所述沉默元件按以下順序含有第一片段，第二 片段和第三片段，其中(a)所述第一片段含有與所述靶害蟲序列具有至少90%序列互補(bǔ)性的至少約18個核 苷酸；(b)所述第二序列含有足夠長的環(huán)，以允許所述沉默元件轉(zhuǎn)錄成發(fā)卡RNA；和(c)所述第三片段含有與所述第一片段具有至少85%互補(bǔ)性的至少約18個核苷酸。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
10.如權(quán)利要求9所述的植物細(xì)胞，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓薹屬、向日葵、棉花或苜蓿。
11.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
12.如權(quán)利要求11所述的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物是玉米、小麥、水稻、大麥、高粱或黑麥。
13.植物或植物部分，其含有權(quán)利要求1-12中任一項所述的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的植物或植物部分，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的 聯(lián)合表達(dá)增加了所述害蟲靶序列特異抑制性RNA在所述植物或植物部分的韌皮部中的濃度。
15.來自權(quán)利要求13或14中任一項所述植物的轉(zhuǎn)基因種子。
16.增加靶害蟲序列特異抑制性RNA濃度的方法，其包括將第一多核苷酸和第二多核 苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，所述第一多核苷酸含有所述害蟲靶序列的沉默元件和所述第二多核苷 酸含有抑制增強(qiáng)元件，所述抑制增強(qiáng)元件包含所述靶害蟲序列或其變體或片段，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的聯(lián)合表達(dá)增加了所述植物細(xì)胞中害蟲靶序2列特異抑制性RNA在所述植物細(xì)胞中的濃度。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸穩(wěn)定并入 所述植物細(xì)胞的基因組。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述沉默元件和所述抑制增強(qiáng)元件的聯(lián)合表 達(dá)增加了所述害蟲靶序列特異抑制性RNA在含有所述植物細(xì)胞的植物的韌皮部中的濃度。
19.如權(quán)利要求16、17或18所述的方法，其中所述害蟲是昆蟲害蟲。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述害蟲選自(a)草盲蝽屬的成員；(b)蚜蟲；(c)蚜科的成員；和(d)鱗翅目的成員。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的鱗翅目的成員包括草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)0
22.如權(quán)利要求16-21中任一項所述的方法，其中所述沉默元件編碼發(fā)卡RNA。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述含有沉默元件的多核苷酸按以下順序含有第 一片段，第二片段和第三片段，其中(a)所述第一片段含有與所述靶多核苷酸具有至少90%序列互補(bǔ)性的至少約18個核 苷酸；(b)所述第二片段含有足夠長的環(huán)，以允許所述沉默元件轉(zhuǎn)錄成發(fā)卡RNA；和(c)所述第三片段含有與所述第一片段具有至少85%序列互補(bǔ)性的至少約18個核苷酸。
24.如權(quán)利要求16-23中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓薹屬、向日葵、棉花或苜蓿。
26.如權(quán)利要求16-23中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述單子葉植物是玉米、小麥、水稻、大麥、高粱或黒ο
28.防治害蟲的方法，其包括用含有第一多核苷酸和第二多核苷酸的植物細(xì)胞飼喂所 述害蟲，所述第一多核苷酸含有害蟲靶序列的沉默元件和所述第二多核苷酸含有抑制增強(qiáng) 元件，所述抑制增強(qiáng)元件包含所述靶害蟲序列或其片段或變體，其中所述害蟲靶序列或由 其編碼的多肽的表達(dá)水平被降低。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的聯(lián)合表達(dá)增 加了所述害蟲靶序列特異抑制性RNA在所述植物細(xì)胞中的濃度。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的聯(lián)合表 達(dá)增加了所述害蟲靶序列特異抑制性RNA在含有所述植物細(xì)胞的植物的韌皮部中的濃度。
31.如權(quán)利要求28、29或30所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸 穩(wěn)定并入所述植物細(xì)胞的基因組中。
32.如權(quán)利要求28-31中任一項所述的方法，其中所述害蟲是昆蟲害蟲。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述害蟲選自(a)草盲蝽屬的成員；(b)蚜蟲；(c)蚜科的成員；和(d)鱗翅目的成員。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的鱗翅目的成員包括草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)0
35.如權(quán)利要求28-34中任一項所述的方法，其中所述沉默元件含有發(fā)卡RNA。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述含有沉默元件的多核苷酸按以下順序含有第 一片段，第二片段和第三片段，其中(a)所述第一片段含有與所述靶多核苷酸具有至少90%序列互補(bǔ)性的至少約18個核 苷酸；(b)所述第二片段含有足夠長的環(huán)，以允許所述沉默元件轉(zhuǎn)錄成發(fā)卡RNA；和(c)所述第三片段含有與所述第一片段具有至少85%序列互補(bǔ)性的至少約18個核苷酸。
37.如權(quán)利要求28-36中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓薹屬、向日葵、棉花或苜蓿。
39.如權(quán)利要求28-36中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述單子葉植物是玉米、小麥、水稻、大麥、高粱或黒ο
全文摘要
提供了增加細(xì)胞中靶序列特異抑制性RNA濃度的方法和組合物。在一實施方式中，方法和組合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸含有可操作連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動子的靶害蟲序列沉默元件；所述第二多核苷酸含有可操作連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動子的抑制增強(qiáng)元件，所述抑制增強(qiáng)元件包含靶害蟲序列或其活性片段或變體。沉默元件和靶害蟲序列或其活性變體或片段的聯(lián)合表達(dá)，使得由沉默元件產(chǎn)生的抑制性RNA的擴(kuò)增超過沉默元件單獨表達(dá)可實現(xiàn)的擴(kuò)增。因而，本發(fā)明的多種方法和組合物提供了將抑制性RNA遞送至靶生物體的改良方法。
文檔編號C12N15/82GK101918563SQ200980102513
公開日2010年12月15日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月17日
發(fā)明者邁克爾·萊斯納 申請人:先鋒國際良種公司