專利名稱：基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種新的基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療的實(shí)現(xiàn)，為人類許多疾病如癌癥、心腦血管疾病、先天免疫性疾病和神經(jīng)性疾病的治愈帶來了希望。實(shí)踐表明，基因治療在臨床應(yīng)用中一個關(guān)鍵的障礙是缺乏安全有效地基因傳遞載體系統(tǒng)?；騻鬟f系統(tǒng)主要包括病毒載體和非病毒載體，其中病毒類基因遞送系統(tǒng)是迄今為止最為成熟， 應(yīng)用最廣的基因載體系統(tǒng)。雖然病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但許多缺點(diǎn)限制了病毒載體的應(yīng)用，比如非特異性，免疫原性，易被酶類降解等。如2000年美國賓州大學(xué)以重組病毒為載體的基因治療藥物在臨床試驗(yàn)中造成ー個18歲受試者死亡的悲劇以及腺病毒有選擇性的促腎上腺皮質(zhì)作用的報(bào)道。與病毒載體比較而言，非病毒載體在安全性方面更具有優(yōu)勢，同時穩(wěn)定性好且免疫原性低。因而非病毒類基因遞送系統(tǒng)的研究備受國內(nèi)外學(xué)者和專家的青睞。目前，研究最多的非病毒基因遞送載體主要包括陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物兩大類，它們均被證實(shí)可通過靜電作用與核酸形成復(fù)合物，在體外可有效地傳送核酸進(jìn)入細(xì)胞。其中陽離子聚合物包括聚こ烯亞胺(Polyethylenimine, PEI)、聚賴氨酸(Poly (L-Iysine),PLL)和樹狀高分子(Dendrimers)等。盡管 PEI、PLL 和 PAMAM 的體外轉(zhuǎn)染效應(yīng)相對較高，但它們存在毒性大，價(jià)格昂貴，難以用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染等缺點(diǎn)。在細(xì)胞水平，聚合物所帯的正電荷可造成細(xì)胞膜的損傷，甚至細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)水平，荷正電的聚合物可結(jié)合血液組分如紅血球和/或血清蛋白。根據(jù)深入研究，PEI/DNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)釋放出質(zhì)粒DNA后，PEI骨架仍然在機(jī)體內(nèi)滯留、蓄積，從而導(dǎo)致細(xì)胞和機(jī)體毒性；陽離子脂質(zhì)體和PAMAM表面攜帯大量正電荷，與細(xì)胞表面或血液中帶負(fù)電的多糖蛋白復(fù)合物如紅細(xì)胞和血清白蛋白成分發(fā)生靜電作用，往往導(dǎo)致細(xì)胞膜毒性等不利影響。為了降低陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體表面的電荷，増加系統(tǒng)體內(nèi)循環(huán)時間，研究者提出ー些策略來解決這些問題如用蛋白質(zhì)和隱形分子PEG修飾屏蔽電荷以及連接用于治療細(xì)胞的活性靶向配體，使其在與DNA相互作用時，形成弱正電性或不帶電的親水粒子。這種系統(tǒng)對短DNA寡核苷酸的體內(nèi)外遞送均顯示了很大的潛力。但是，應(yīng)用于遞送質(zhì)粒時，遞送效率顯著降低。因而迫切需要研究高效、低毒、經(jīng)濟(jì)而且可以真正應(yīng)用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的非病毒基因遞送系統(tǒng)。聚0 -氨基酯(PbAE)是ー類由ニ丙烯酸酯與氨基化合物發(fā)生Michael加成聚合得到高分子聚合物。由于PbAE結(jié)構(gòu)中存在酯鍵，在體內(nèi)生理?xiàng)l件下PbAE聚合物可以發(fā)生水解，降解成小分子化合物，毒性大大降低。有關(guān)PbAE作為傳遞載體方面已有文獻(xiàn)報(bào)道，可做為基因傳遞載體，或者藥物傳遞載體，或作為化療藥物和基因藥物的同時傳輸載體。PbAE是轉(zhuǎn)染效率高的非病毒基因治療載體，毒性作用低，且可生物降解，有希望進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但現(xiàn)有技術(shù)合成陽離子聚合物PbAE的化學(xué)方法是有胺、酯兩種單體在反應(yīng)溶劑中反應(yīng)制得，需要進(jìn)ー步分離純化，得到產(chǎn)物。無論從實(shí)驗(yàn)室工作還是エ業(yè)化生產(chǎn)，從設(shè)備及環(huán)保角度都會帶來很多麻煩。因而本領(lǐng)域需要一種有效、方便、無需純化和避免使用有機(jī)溶劑的合成PbAE的方法，用于體內(nèi)治療載體的研究。科學(xué)家們利用高通量合成與篩選技術(shù)，從2000個PbAE結(jié)構(gòu)化合物中篩選轉(zhuǎn)染效率高的聚合物，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率高的遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 PEI25kDa和Lipofectamine2000，與腺病毒相當(dāng)，并且細(xì)胞毒性顯著低于PEI。盡管如此，目前PbAE僅用于體外轉(zhuǎn)染，還未見體內(nèi)轉(zhuǎn)染的報(bào)道。這是因?yàn)镻bAE/DNA復(fù)合物表面帶大量正電荷，對血清穩(wěn)定性差，體內(nèi)循環(huán)時間短，基因難以長期穩(wěn)定表達(dá)。所以，降低PbAE/DNA復(fù)合物表面帶正電荷是體內(nèi)轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵所在。靜電包衣是通過正負(fù)電荷相吸的理論對陽離子聚合物與DNA形成的復(fù)合物進(jìn)行物理性修飾，在復(fù)合物表面形成荷負(fù)電的包衣層。這種三元復(fù)合物無細(xì)胞毒性和紅細(xì)胞凝集作用，可有效保護(hù)DNA不被降解，在細(xì)胞內(nèi)被捕獲后可成功逃逸，并且表現(xiàn)出較高轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是制備一種基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明通過陽離子高分子材料聚P -氨基酯自主壓縮質(zhì)粒DNA或SiRNA形成ニ元復(fù)合物后，用多羧基聚合物通過靜電作用對ニ元復(fù)合物進(jìn)行物理修飾，形成三元核酸遞釋系統(tǒng)。該遞釋系統(tǒng)可有效壓縮和包裹質(zhì)粒DNA或siRNA，增強(qiáng)TCS的溶酶體逃逸功能，保護(hù)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)不被降解，從而提高基因的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率。該遞釋系統(tǒng)其具有與市售產(chǎn)品相比穩(wěn)定性増加，毒性低，轉(zhuǎn)染有效，可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，且可借助功能化基團(tuán)和配體實(shí)現(xiàn)靶向傳遞的效果。本發(fā)明選用聚P -氨基酯陽離子聚合物材料與質(zhì)粒DNA形成PbAE/DNA ニ元體系作為三元體系的內(nèi)核。本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種エ藝合理，生產(chǎn)成本低，操作簡單，不需要分離純化，避免使用有機(jī)溶劑的聚￠-氨基酯及化學(xué)合成方法。解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供ー種可生物降解的聚3-氨基酯聚合物。本發(fā)明可降解的聚3-氨基酯是由5-氨基-I-戊醇，I，4- 丁ニ醇雙丙烯酸酯，通過Michael加成制備而得。該聚3 -氨基酯是可生物降解的基因傳送聚合物之一，與非生物可降解的陽離子聚合物比較，毒性低，更具有體內(nèi)傳送基因的潛力。這種聚￠-氨基酯及化學(xué)合成方法，其合成原料組分及含量為(胺與酯的質(zhì)量比)為I. I 1-1.5 I。合成方法按質(zhì)量比分別精密稱取適量5-氨基-I-戊醇，I，4- 丁ニ醇雙丙烯酸酷，置于三頸瓶中，磁力攪拌的條件下油浴95°C，反應(yīng)12h，全程氮?dú)獗Ｗo(hù)，得粘稠狀黃色液體。其中可降解的聚￠-氨基酯的分子量為5-10kDa。其反應(yīng)方程式為
權(quán)利要求
1.基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)，其特征在于，采用聚β-氨基酯陽離子聚合物材料與質(zhì)粒DNA形成PbAE/DNA 二元體系作為三元體系的內(nèi)核,靜電包衣修飾后得三兀核-殼式聚合物載體系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的靜電包衣修飾的材料選自羧甲基聚組氨酸、透明質(zhì)酸或聚Y -谷氨酸，包衣材料與核酸的質(zhì)量比為O. 5 1-20 I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的陽離子聚合物聚β -氨基酯PbAE是通過胺和酯兩種單體Michael制成。
4.制備權(quán)利要求I的基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)的方法，其特征在于，其包括步驟 將陽離子聚合物聚β -氨基酯PbAE與含有報(bào)告基因或治療基因的質(zhì)粒DNA或小干擾RNA于醋酸鈉緩沖液中按質(zhì)量比5 1-80 I混合后，渦旋5-15s，經(jīng)自組裝壓縮得到PbAE/DNA或PbAE/siRNA 二元載體系統(tǒng)；對二元載體系統(tǒng)進(jìn)行靜電包衣修飾，得到三元核_殼式聚合物載體系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述的陽離子聚合物聚β_氨基酯PbAE通過下述方法合成 按質(zhì)量比分別精密稱取反應(yīng)單體5-氨基-I-戊醇，1,4- 丁二醇雙丙烯酸酯，置于三頸瓶中，磁力攪拌的條件下油浴95°C，反應(yīng)8-12h，全程氮?dú)獗Ｗo(hù)，得粘稠狀黃色液體； 所述的5-氨基-I-戊醇，1，4_ 丁二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量比為1.1 1-1.5 I。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述的陽離子聚合物PbAE的化學(xué)合成原理為Michael 加成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述的陽離子聚合物PbAE的化學(xué)合成方法中，反應(yīng)溫度95°C，反應(yīng)時間8-12h，避光，氮?dú)獗Ｗo(hù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述的陽離子聚合物PbAE的化學(xué)合成方法中，反應(yīng)過程不需要加催化劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述的陽離子聚合物PbAE的化學(xué)合成方法中，反應(yīng)過程不需要加反應(yīng)溶劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述的陽離子聚合物PbAE的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為直鏈?zhǔn)?，可生物降解?br> 全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于靜電包衣的三元非病毒核酸遞釋系統(tǒng)TCS及其制備方法。本發(fā)明通過陽離子高分子材料聚β-氨基酯自主壓縮質(zhì)粒DNA或siRNA形成二元復(fù)合物后，用多羧基聚合物通過靜電作用對二元復(fù)合物進(jìn)行物理修飾，形成三元核酸遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明可有效壓縮和包裹質(zhì)粒DNA或siRNA，增強(qiáng)TCS的溶酶體逃逸功能，保護(hù)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)不被降解，從而提高基因的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率。
文檔編號C08G73/00GK102851304SQ201110182809
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者沙先誼, 顧吉晉, 方曉玲 申請人:復(fù)旦大學(xué)