專利名稱：用于細胞粘附、培養(yǎng)和分離的方法、表面改性培養(yǎng)板和組合物的制作方法
技術領域：
本專利申請要求于2008年2月21日提交的臨時申請No. 61/030, 544的優(yōu)先權。本發(fā)明涉及哺乳動物細胞培養(yǎng)領域，并且提供了用于細胞粘附于固體基底表面、 在固體基底表面上培養(yǎng)以及從固體基底表面分離的方法和組合物，所述表面含有至少約 0. 5%的N，0和N的總數大于或等于17. 2%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表面不含 飼養(yǎng)細胞層和吸附層。在本發(fā)明的一個實施例中，用能夠抑制Mio激酶活性的化合物處理 細胞。在另一個實施例中，用能夠抑制Mio活性的化合物處理細胞。
背景技術：
哺乳動物細胞培養(yǎng)是生命與健康科學中許多進程之一。涉及貼壁依賴性細胞的哺 乳動物細胞培養(yǎng)和分析用容器通常由玻璃或聚合物(例如聚苯乙烯)構成，其經常需要額 外的表面處理以允許細胞粘附到容器表面。這樣的處理可以包括在表面施加吸附層，例如， 通過吸附、接枝或等離子體聚合技術。作為另外一種選擇，表面處理可以借助于容器表面自 身的化學改性，其可以通過(例如)大氣華、射頻真空等離子體、直流輝光放電和微波等離 子體處理等實現。這些表面處理改變表面內的元素組成和化學基團。所得的具體化學組成 取決于表面處理方法、能量和時間以及所用氣體的組成。例如，US5449383公開了一種基底，其包括本體聚合材料和適于支持細胞生長的聚 合物薄層，該薄層包含耐再定位的聚合物，該聚合物包含等離子體聚合的酰胺單體，該單體 具有用于細胞粘附的酰胺基團，其中所述酰胺單體選自二甲基甲酰胺和具有式R1-CO-N (R2) R3的酰胺，其中R1為脂族、脂環(huán)族或芳族基團，它們中每一個都可任選地由鹵素原子或羥基 取代，R2和R3各自獨立地為氫或烷基，并且其中所述聚合物薄層促進所述細胞的粘附和增 殖。又如，EP0348969A1公開了一種用于聚合物表面內皮化的方法，包括用由含有氮 氣的氣態(tài)物質生成的等離子體接觸聚合物表面，以此將所述聚合物表面改性成含有表面氨 基，并將足夠的內皮細胞施加到所述改性表面以在所述含氨基的表面上形成細胞的鋪滿 層，而無需細胞增殖。又如，EP0092302A2公開了一種用于影響在基底上的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的生 長的方法，其特征在于通過對該基底的表面進行等離子體處理來改性該基底的表面化學， 該等離子體由碳、氫、氧、氮、硫、磷、鹵素或這些元素中任何一者的化合物產生。又如，US 6，617，152B2公開了一種用于處理聚合物基底表面的設備，包括(a)氣 體入口、微波能源和等離子混合室，該等離子混合室與氣體入口和微波能源流體連通；(b) 雙室處理區(qū)，其具有包含在外處理室中的內處理室，所述內處理室有一個開口與所述外部 腔室流體連通；(c)所述等離子混合室與所述外處理室通過小孔流體連通；(d)連接到所述 外部腔室的真空出口線；以及(e)在此處將所述內處理室中的所述開口與所述小孔對齊， 所述開口與所述小孔隔開預定的距離。
在一個例子中，US 2003/0180903A1公開了一種聚合物基底，其具有可以在其上培 養(yǎng)細胞的工作表面，其中表面氧含量為至少25%，這由用于化學分析的電子顯微鏡在約50 埃的深度測得。在一個例子中，W02006114098公開了一種用于外科手術植入物和細胞弓I導組織培 養(yǎng)表面的微結構生物相容性材料。選擇生物材料表面的微結構以促進未分化的ES細胞的 生長；促進ES細胞的神經元分化；或促進ES細胞的分化。又如，Bigdeli等人(J. Biotechnol. 133 :146-153,2008(《生物技術》，第 133 卷 第146-153頁，2008年))描述了一種適應和/或選擇待培養(yǎng)的人ES細胞的方法，使得人 ES細胞在無飼養(yǎng)細胞條件下不分化并無需用胞外基質蛋白預處理固體基底表面，該方法 涉及(i)將培養(yǎng)基由人二倍體胚肺成纖維細胞條件培養(yǎng)基更換為新生軟骨細胞條件培養(yǎng) 基；(ii)然后將細胞從小鼠胚胎飼養(yǎng)細胞層通過酶法傳代至經Matrigel 處理的培養(yǎng)板， 然后傳代至Costar 培養(yǎng)板，最后傳代至I^imaria 培養(yǎng)板；以及(iii)再次換回第一次 使用的培養(yǎng)基。經此方法處理的很少人ES細胞會產生已建立細胞系，表明此方法涉及選擇 適于培養(yǎng)條件的人ES細胞。改變表面自身元素組成和化學基團的表面處理已成功用于制備適于培養(yǎng)多種類 型哺乳動物細胞的聚合物固體基底。然而，使用某些類型的哺乳動物細胞(例如，多能干細 胞和人胚腎(HEK) 293細胞)時，弱粘附和/或培養(yǎng)方面有明顯的限制。Graham 等人(J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977 (《普通病毒學雜志》，第 36 卷第 59-72 頁，1977年))公開了 HEK293細胞系的生成?？梢栽趯EK293細胞加入培養(yǎng)容器之前，通過使用(例如)胞外基質蛋白、聚賴 氨酸、聚鳥氨酸或聚乙烯亞胺在固體基底表面制備吸附層來促進HEK293細胞粘附。然而， 制備吸附層很耗時，并且通常得到非無菌的固體基底，其儲存壽命比裸露固體基底更短。因 此，明顯需要用于促進HEK293細胞粘附到不含吸附層的固體基底的方法和材料。目前培養(yǎng)多能干細胞、尤其是胚胎干(EQ細胞的方法要求復雜的培養(yǎng)條件，例 如，在具有飼養(yǎng)細胞層的固體基底表面上或在具有胞外基質蛋白的吸附層的固體基底表面 上培養(yǎng)胚胎干細胞。采用這些方法的培養(yǎng)體系通常使用飼養(yǎng)細胞或胞外基質蛋白，這些飼 養(yǎng)細胞或胞外基質蛋白取自與培養(yǎng)中的干細胞的物種不同的物種(異種材料)。通過暴露 于飼養(yǎng)細胞獲得的培養(yǎng)基，即未分化ES細胞之外的細胞的條件培養(yǎng)基，可以用于培養(yǎng)ES細 胞，并且可以在培養(yǎng)基中添加動物血清。例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnol. 18 :399-404,2000(《自然-生物 技術》，第 18 卷第 399-404 頁，2000 年))和 Thompson 等人(Science 282:1145-1147， 1998(《科學》，第282卷第1145-1147頁，1998年))公開了使用小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng) 細胞層來培養(yǎng)取自人囊胚的ES細胞系。又如，Xu等人(Nature Biotechnology 19 :971_974，2001 (《自然-生物技術》，第 19卷第971-974頁，2001年))公開了在無分化無飼養(yǎng)細胞層的人ES細胞培養(yǎng)之前，使用 Matrigel 和層粘連蛋白處理固體基底表面。又如，Vallier等人(J. Cell Sci. 118 :4495-4509,2005(《細胞科學雜志》，第 118 卷第4495-4509頁，2005年))公開了在無分化無飼養(yǎng)細胞層的人ES細胞培養(yǎng)之前，使用胎 牛血清處理固體基底表面。
又如，W02005014799公開了用于哺乳動物細胞維持、增殖和分化的條件培養(yǎng)基。 W02005014799描述了 “根據本發(fā)明制備的培養(yǎng)基由鼠細胞、尤其是那些分化的和無限增殖 化的轉基因肝細胞(稱為MMH(Met鼠肝細胞))的細胞分泌活性調整?！庇秩?，Wanatabe等人(Nature Biotechnol. 35 :681_686，2007 (《自然-生物技術》， 第35卷第681-686頁，2007年))描述了“ROCK抑制劑允許分離的人胚胎干細胞成活”，并且 證實減少了分離誘導的細胞凋亡，增加了克隆率(從大約增加到大約27%)，促進了基 因轉移后的亞克隆，該文獻使用小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養(yǎng)細胞，使用膠原和Matrigel 作為胞外基質蛋白，使用Y-27632或法舒地爾抑制ROCK。此外，用Y-27632處理的分離的人 ES細胞可避免無血清懸浮培養(yǎng)中的細胞凋亡。又如，Peerani等人(EMBO Journal 26 :4744-4755,2007(《歐洲分子生物學組織 雜志》，第沈卷第4744-4755頁，2007年))描述了“人胚胎干細胞(hESC)培養(yǎng)物中的空間 結構的復雜性產生影響hESC命運的異質微環(huán)境(小生境(niche))。本研究證明可以通過 改造hESC小生境特性來控制hESC的分化率和分化軌跡。小生境的大小和組成調節(jié)分化誘 導因子和抑制因子之間的平衡。在機制上，Smadl信號的小生境大小依賴空間梯度是由于 hESC和hESC來源的胚外內胚層(EXE)之間的拮抗相互作用產生。這些相互作用由骨形成 蛋白2(BMP》的EXE定位分泌及其拮抗劑生長分化因子3 (⑶F3)的hESC定位分泌介導。 由⑶F3、BMP2和Smadl的小干擾RNA(siRNA)以及Rho相關激酶(ROCK)抑制劑處理的hESC 的縮微成像證明，對Smadl激活的獨立控制可以挽救hESC的集落大小依賴分化。我們的結 果首次示出了 Smadl在整合空間信息和小生境大小依賴控制hESC自我更新和分化中的作田 ，，又如，Koyanagi，M等人(J Neurosci Res. 2007 Sep 7 [Epubahead of print](《神 經科學研究雜志》，2007年9月7日(先于印刷版的電子版)))描述了“已發(fā)現Mio-GTP酶 參與包括神經元的多種細胞類型的細胞凋亡，但還未完全理解其作用機制。在此，我們研究 了他0和ROCK在胚胎干細胞來源的神經元前體細胞移植期間發(fā)生的細胞凋亡中的作用。我 們發(fā)現神經元前體細胞的分離激活Mio并誘導細胞凋亡。用Mio抑制劑C 3胞外酶和/或 ROCK抑制劑Y-27632處理減少了 20-30%的分離誘導的細胞凋亡(失巢凋亡)量。膜空泡 化(其是細胞凋亡的早期形態(tài)標志)、半胱天冬酶3的切割和細胞色素c從線粒體的釋放也 因ROCK的抑制而減少。這些結果表明神經元前體細胞的分離誘發(fā)細胞死亡的內源性通路， 其至少部分地由Mio/ROCK通路介導。此外，在一個動物移植模型中，Mio和/或ROCK的抑 制可減少移植細胞的急性細胞凋亡。移植后，腫瘤壞死因子α和神經生長因子前體在移植 物周圍高表達。ROCK抑制也可減少由這些炎性細胞因子促進的細胞凋亡。綜上所述，這些 結果表明Mio/ROCK信號的抑制可以改善細胞替代療法中移植細胞的存活。又如，Yoneda等人(J. Cell Biol. 170 :443-453, August 3,2005(《細胞生物學雜 志》，第170卷第443-453頁，2005年8月3日))描述了“據推定，同源哺乳動物rho激酶 (ROCK I和II)是功能冗余的，主要依據是激酶構造過表達。作為Iih0 GTP酶的下游效應 子，它們主要的底物為肌球蛋白輕鏈和肌球蛋白磷酸酶。這兩個激酶都參與微絲束組裝和 平滑肌收縮。在此，成纖維細胞對纖粘蛋白的粘附性的分析揭示，雖然ROCK II豐度更高，但 是其活性通常低于ROCK I。盡管存在持久性ROCKII和結合有鳥嘌呤核苷三磷酸的I^hoA， 由siRNA引起的ROCK I特異性減少會導致應力纖維和粘著斑的喪失。相反，微絲細胞骨架因ROCK II的下調而增強。對涂布有纖粘蛋白的小珠的吞噬攝取在清除ROCK II的細胞中 強烈下調，但在缺少ROCK I的細胞中并不下調。這些效應部分源于ROCKpleckstrin同源 結構域的不同脂質結合偏好。ROCK II連接磷脂酰肌醇3，4，5P3，并對其水平敏感，而ROCK I無此性質。因此，內源ROCK被不同調控并繼而涉及不同的肌球蛋白隔室。”又如，Harb等人(PloS ONE 3(8) :e3001. oi 10. 1371/journal. pone. 0003001, August 2008(《公共科學圖書館·綜合》，第3卷第8期第e3001頁，數字對象唯一標識符 (doi) 10. 1371/journal. pone. 0003001，2008 年 8 月))公開了 Rho-Rock-肌球蛋白信號 軸在小鼠和人ES細胞中調控基本細胞-細胞通訊中的重要作用，并將有助于人類多能干細 胞在醫(yī)學相容的無異質環(huán)境中的擴增[原文如此]。使用異種材料可能不適用于采用多能干細胞的某些應用。可以使用可替代材料。 例如，Stojkovic 等人(Stem Cells 23 :895-902,2005(《干細胞》，第 23 卷第 895-902 頁， 2005年))公開了在無分化無飼養(yǎng)細胞層的人ES細胞培養(yǎng)之前，使用人血清處理固體基底表面。一種可替代的培養(yǎng)體系采用添加了能夠促進ES細胞增殖的生長因子的無血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ；19 Oct 2005(《生殖生物學》，數字對象唯一標識符10. 1095/biolreprod. 105. 046870,2005年10月19日))公開了一種無飼養(yǎng)細胞、無血清培養(yǎng)體系，其中ES細胞維持于添加有能夠引發(fā) ES細胞自我更新的不同生長因子的非條件血清置換培養(yǎng)基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568_574，2OO6 (《干細胞》，第 24 卷第 568-574頁，2006年))公開了用于在不含成纖維細胞或條件培養(yǎng)基情況下使用添加有堿性 成纖維細胞生長因子(FGF)的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人ES細胞的方法。又如，US20050148070公開了一種在無血清和無成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的限定培養(yǎng) 基中培養(yǎng)人ES細胞的方法，此方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質、至少一種 轉鐵蛋白或轉鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，該 培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎血清，并且含有至少約lOOng/ml能夠激活FGF信號受體的 FGF，其中提供該生長因子的來源不只是成纖維細胞飼養(yǎng)層，此培養(yǎng)基支持干細胞在無飼養(yǎng) 細胞或條件培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。又如，US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細胞，包括未分化的靈長類原始干細 胞的限定培養(yǎng)基。在溶液中，此培養(yǎng)基與培養(yǎng)中的干細胞相比基本上是等滲的。在給定培 養(yǎng)物中，具體的培養(yǎng)基包含基本培養(yǎng)基以及各自一定量的堿性FGF、胰島素和抗壞血酸，這 些成分對于基本上支持原始干細胞的未分化生長是必需的。又如，US6800480描述“在一個實施例中，提供了用于以基本上未分化狀態(tài)生長靈 長類來源的原始干細胞的細胞培養(yǎng)基，其包括低滲透壓、低內毒素堿性培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基對 于支持靈長類來源的原始干細胞的生長是有效的。堿性培養(yǎng)基混合了有效支持靈長類來源 的原始干細胞生長的營養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細胞和衍生自飼養(yǎng)細胞的胞外基質組分的基質。 該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子。”又如，US20050244962描述“在一個方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長類胚胎干 細胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎血清(優(yōu)選地也基本上不含任何動物血清)的培養(yǎng)物中，并在存在由不只是成纖維細胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細胞生長因子情況下培養(yǎng) 干細胞。在一種優(yōu)選的形式中，通過添加足夠的成纖維細胞生長因子，此成纖維細胞飼養(yǎng)層 (以前維持干細胞培養(yǎng)所需)變成了非必需的?！庇秩?，W020050653M公開了一種基本上不含飼養(yǎng)層和血清的限定的等滲培養(yǎng)基， 其包含a.基本培養(yǎng)基；b. —定量的堿性成纖維細胞生長因子，其足以支持基本上未分化 的哺乳動物干細胞的生長；c. 一定量的胰島素，其足以支持基本上未分化的哺乳動物干細 胞的生長；以及d. —定量的抗壞血酸，其足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞的生長。又如，W02005086845公開了一種用于維持未分化干細胞的方法，所述方法包括 將干細胞暴露于一定量的轉化生長因子β (TGFβ)蛋白家族中的一個成員、成纖維細胞生 長因子(FGF)蛋白家族中的一個成員或煙酰胺(NIC)，使得足以在未分化的狀態(tài)下維持細 胞足夠時間，從而獲得所需結果。多能干細胞為研究和藥物篩選提供潛在資源。目前，人ES細胞系的大規(guī)模培養(yǎng)是 困難的，并且?guī)砹藝谰魬?zhàn)。針對這些挑戰(zhàn)的可能解決方案是以單細胞形式傳代和培養(yǎng) 人ES細胞。單細胞更適合標準組織培養(yǎng)技術，例如，計數、轉染等。例如，Nicolas等人提供了一種用于從單細胞生產和擴增人ES細胞系的方法， 此單細胞通過慢病毒載體進行遺傳修飾，然后通過熒光激活細胞分選來分離(Stem Cells Dev. 16 :109-118,2007(《干細胞與發(fā)育》，第16卷第109-118頁，2007年))。又如，美國專利申請US2005158852公開了一種“用于改善人胚胎干細胞單細胞生 長和存活的方法。此方法包括以下步驟獲得未分化hES單細胞；將未分化單細胞與胞外基 質混合以包圍該細胞；以及在含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的生長環(huán)境中，將該混合物接種到飼養(yǎng)細胞 上”。又如，Sidhu等人(Stem Cells Dev. 15 :61_69，2006 (《干細胞與發(fā)育》，第15卷第 61-69頁，2006年))描述了通過流式細胞術進行單細胞制備物的分選，首次報道了三種衍 生自親本系hES3的人ES細胞克隆hES 3. 1、3. 2和3. 3。然而，人ES細胞作為單細胞的傳代和培養(yǎng)導致遺傳異常和多能性喪失。培養(yǎng)條件 對于多能性和遺傳穩(wěn)定性的保持是重要的。通常，通過人工或用酶學試劑(例如膠原酶、釋 放酶(Iiberase)或分散酶(dispase))進行人ES細胞系的傳代。例如，Draper等人注意到“在三種獨立的人胚胎干細胞系中，在五種獨立的情形 下，涉及17號染色體長臂的獲得的核型改變”的存在(Nature Biotechnol. 22 =53-54, 2004 (《自然-生物技術》，第22卷第53巧4頁，2004年))。又如，Buzzard等人描述，“我們曾經只檢測到一個核型改變事件......考慮到我們的方法與大部分其他研究組所用的方法完全不同，所用的培養(yǎng)方法可能對我們的結果......有一些影響。通常我們在7天后通過首先用破碎的移液管邊緣分離集落來傳代人ES細胞......細胞分離的酶學或化學方法未并入該方法中。我們推測這可以解釋我們擁有的hES(人ES)細胞的相對細胞遺傳彈性(cytogenetic resilience)。”(Nature Biotechnol. 22 :381-382, 2004 (《自然-生物技術》，第 22 卷第 381-382 頁，2004 年))。又如，Mitalipova等人.描述了“批量傳代方法......能夠在培養(yǎng)物的擴大傳代后保持非整倍性細胞群，但可用于更短的周期(高達至少15次傳代)，而無核型異常......可以在長期人工增殖條件下，隨后在要求比人工傳代方法單獨能夠提供的數量更多的hES細胞的實驗中進行有限的批量傳代后，保持hES細胞中的正常核型?！?(Nature Biotechnol. 23 19-20，2005(《自然-生物技術》，第 23 卷第 19-20 頁，2005 年))。又如，Heng等人描述了 “結果證明第二個方案(用輕輕抽吸進行胰蛋白酶化)比 第一個方案(用劃痕進行膠原酶處理)對細胞活力的危害更小。這繼而轉化為更高的凍融 存活率?！?Biotechnology and Applied Biochemistry 47 :33-37,2007(《生物技術與應 用生物化學》，第47卷第33-37頁，2007年))。又如，Hasegawa等人描述，“我們已經建立了耐完全分離的hES細胞亞系。這些 細胞顯示具有高傳代效率和高克隆效率，并且它們保持分化成三個胚層的能力?！?(Stem Cells 24 :2649-2660,2006(《干細胞》，第 24 卷第洸49-2660 頁，2006 年))。因此，明顯需要用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法和組合物，包括在不含飼養(yǎng)細胞和 吸附層、同時保持細胞多能性的情況下培養(yǎng)多能干細胞。

發(fā)明內容
在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于細胞粘附于固體基底表面、在固體基底表面 上培養(yǎng)以及從固體基底表面分離的方法和組合物，所述表面含有至少約0. 5%的N，0和N 的總數大于或等于17.2%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表面不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種促進細胞粘附于表面的方法，所述表面包含 至少約0.5%的N，0和N的總數大于或等于17.2%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表 面不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層，所述方法包括以下步驟a.獲得細胞懸浮液，b.用至少一種選自以下物質的化合物處理該細胞懸浮液能夠抑制Mio激酶活性 的化合物和能夠抑制Mio活性的化合物，以及c.將該細胞懸浮液添加到表面，并使細胞粘附。在一個實施例中，在細胞粘附于表面后，對細胞進行培養(yǎng)。在一個替代實施例中， 去除此至少一種化合物。在一個實施例中，通過去除此至少一種化合物來從表面分離細胞。在一個實施例中，細胞懸浮液為細胞群懸浮液。在一個替代實施例中，細胞懸浮液 為單細胞懸浮液。在一個實施例中，細胞為多能干細胞。在一個替代實施例中，細胞為干細胞。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種促進細胞粘附于表面的方法，所述表面包含 至少約0. 9%的N，0和N的總數大于或等于22. 3%，接觸角為至少約13. 9度，并且所述表 面不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層，所述方法包括以下步驟a.獲得細胞懸浮液，以及b.將該細胞懸浮液添加到表面，并使細胞粘附。


圖1示出了人ES細胞系Hl的細胞相差顯微圖(虹)，這些細胞以用LIBERASE處理的細胞群形式在表面改性培養(yǎng)板2、3或4上傳代兩次。也示出了培養(yǎng)在用稀釋比為1 30 的Matrigel 處理的培養(yǎng)板上、Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的人ES細胞系Hl的細胞圖象。圖2示出了 10 μ M Υ-27632對人ES細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板的影響。該圖示 出了人ES細胞系Hl的細胞相差顯微圖(虹)，這些細胞以細胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3 和4上傳代兩次。然后在含有10 μ M Υ-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板2、 3或4上傳代細胞。在拍照之前培養(yǎng)細胞四天。將在不存在Υ-27632的情況下培養(yǎng)的細胞 作為對照。圖3示出了對培養(yǎng)在本發(fā)明表面改性培養(yǎng)板上的人ES細胞進行化合物處理的時 間進程示意圖。人ES細胞系Hl細胞以用LIBERASE處理的細胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3 或4上傳代四次，并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中。傳代后的前兩天用ΙΟμΜ的他0激酶抑制 劑Υ-27632或0. 5ng/ml的Iih0抑制劑(胞外酶C3轉移酶的細胞可滲透形式)處理細胞。 用Mio激酶抑制劑Y-27632處理細胞，隨后每次在表面改性培養(yǎng)板3上傳代后的前兩天用 Y-27632處理細胞，經過這些處理的細胞稱為“7s”。用Iih0激酶抑制劑Y-27632處理細胞， 隨后每次在表面改性培養(yǎng)板4上傳代后的前兩天用Y-27632處理細胞，經過這些處理的細 胞稱為“3s”。每次傳代后，用Mio抑制劑處理細胞兩天，再用Mio激酶抑制劑Y-27632處理 細胞兩天，隨后在表面改性培養(yǎng)板3上傳代后的前兩天用Y-27632處理細胞，經過這些處理 的細胞稱為“5s”。每次傳代后，用Mio抑制劑處理細胞兩天，再用Mio激酶抑制劑Y-27632 處理細胞兩天，隨后在表面改性培養(yǎng)板4上傳代后的前兩天用Y-27632處理細胞，經過這些 處理的細胞稱為“Is”。圖4示出了在根據圖6概括的方案處理的人ES細胞中，由qRT-PCR測定的多能性 與分化相關標記物的表達。圖5示出了人ES細胞系Hl細胞中的多能性標記物的表達，這由流式細胞術在第 4代(p4)、第9代(p9)以及第10、11或12代(plO、pll、或pl2)測定。圖6示出了人ES細胞系Hl的細胞免疫熒光圖象，這些細胞以用LIBERASE處理的 細胞群形式在表面改性培養(yǎng)板4上連續(xù)傳代，并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中。在表面改性培 養(yǎng)板4上培養(yǎng)了傳代11次的細胞中檢測到多能性標記物相關蛋白的表達。每次傳代后，用 10 μ M的Υ-27632處理細胞兩天。圖7示出了人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上培養(yǎng)后形成定形內胚層的能力。人ES 細胞系Hl細胞以用LI BERASE處理的細胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3或4上傳代11次， 并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中。在第8代(ρ8)和第10或11代(plO-11)，用含有0. 5% FBS、 100ng/ml激活素A和20ng/ml Wnt3a的DMEM :F12培養(yǎng)基處理細胞兩天，然后用含有2% FBS和lOOng/ml激活素A的DMEM :F12培養(yǎng)基再處理細胞三天。此圖上的Y軸示出了由流 式細胞術測得的陽性CXCR4細胞百分數。還可參見表5。圖8示出了人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上培養(yǎng)后形成胰內胚層的能力。人ES細 胞系Hl細胞以用LIBERASE處理的細胞群形式在表面改性培養(yǎng)板3或4上傳代八次，并培養(yǎng) 于MEF條件培養(yǎng)基中。在第8代(p8)，通過用含有0. 5% FBS、100ng/ml激活素A和20ng/ ml Wnt3a的DMEM :F12培養(yǎng)基處理細胞兩天，然后用含有2% FBS和lOOng/ml激活素A的 DMEM :F12培養(yǎng)基再處理細胞三天，從而使細胞分化成定形內胚層。用含有2% FBSUOOng/ ml FGF-IO和1 μ M環(huán)巴胺-KAAD的DMEM :F12培養(yǎng)基處理四天后，細胞進一步分化成胚胎前腸。用含有 B-27、100ng/ml FGF-10、1 μ M 環(huán)巴胺-KAAD 和 2 μ M 視黃酸的 DMEM :F12 培養(yǎng)基處理四天后，細胞分化成胰內胚層。對細胞進行免疫熒光染色，以檢測PDX-I (綠色) 和E-鈣粘蛋白(紅色)，并用Hoechst染料(藍色)確定總細胞數目。圖9示出了在表面改性培養(yǎng)板上培養(yǎng)的人ES細胞形成胚狀體的能力。圖10示出了在表面改性培養(yǎng)板4上培養(yǎng)的人ES細胞的核型。圖11示出了用Rho激酶抑制劑(得自EMD biosciences的Y-27632、得自Sigma 的Y-27632、法舒地爾和羥基法舒地爾)處理對人ES細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板的影響。 在含有所列濃度的所示化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞三天。用結晶紫為細胞染色并拍照。圖12示出了 Y-27632對人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性的劑量反應。第 一天將在特定濃度(0、1、2、4或10μΜ&Υ-2763》下的各種濃度的Mio激酶抑制劑Y-27632 添加到培養(yǎng)物中。然后，從第二天開始在含有ΙΟμΜ Y-27632的培養(yǎng)基中維持細胞五天，并 每天更換培養(yǎng)基。在第五天將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板上去除，用0. 5%的結晶紫為細胞染色并拍 照。圖13示出了在含或不含10 μ M Y-27632的表面改性培養(yǎng)板2、3或4上傳代四天 后，人ES細胞集落的形成。圖14示出了在用含或不含ΙΟμΜ Y-27632的Matrigel 處理平板上傳代四天后， 人ES細胞集落的形成。圖15示出了用Y-27632連續(xù)和間歇處理人ES細胞對細胞在表面改性培養(yǎng)板上粘 附性的差異。圖16描述了人ES細胞系H9的細胞圖象，這些細胞以單細胞形式傳代，并在含⑶ 或不含(A) 10 μ M Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板3上接種。接種M小 時后拍照。圖17描述了來自人ES細胞系H9的細胞的多能性相關標記物的表達，使 用TrypLE Express將這些細胞以單細胞形式傳代5次，并接種到含或不含10 μ M Y-27632 (Y)的表面改性培養(yǎng)板3和4上。X軸上列出了多能性標記物，Y軸上示出了陽性 細胞的百分比。圖18描述了來自人ES細胞系H9的細胞的細胞總數，這些細胞以單細胞形式傳 代，并接種到表面改性培養(yǎng)板3和4上。檢測10 μ M的Υ-27632⑴對在Matrigel 上傳代 的細胞(初始型(nai_ve)，N)和在表面改性培養(yǎng)板上傳代10次的細胞(適應型，A)的細胞 數目的影響。X軸上列出了不同的細胞條件，Y軸示出了除以IO4后的細胞數目。圖19描述了來自人ES細胞系H9的細胞的生長速率，在此項研究之前，將這些細 胞以單細胞形式在Matrigel 處理培養(yǎng)板上傳代。將細胞以104/cm2的密度接種，并在含或 不含10 μ M Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板3和4上培養(yǎng)。Y軸示出了在 接種后2、3或4天收集的細胞數目(除以IO4)。圖20描述了來自人ES細胞系H9的細胞的生長速率，在此項研究之前，將這些細 胞以單細胞形式在表面改性培養(yǎng)板上傳代10次。將細胞以IOVcm2的密度接種，并在含或 不含10 μ M Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中、于表面改性培養(yǎng)板3和4上培養(yǎng)。Y軸示出了在 接種后2、3或4天收集的細胞數目(除以IO4)。圖21描述了來自人ES細胞系H9的細胞的圖象，這些細胞以單細胞形式傳代，并接種到96孔板格式的表面改性培養(yǎng)板2-4和13上。MEF條件培養(yǎng)基含有10 μ M的Υ-27632。 接種48小時后拍照。圖22示出了來自人ES細胞系Η9的細胞的能力，這些細胞以單細胞形式傳代，并 接種到表面改性培養(yǎng)板3和4上以分化成定形內胚層。通過用流式細胞術測量CXCR的表 達來確定定形內胚層形成的程度。研究了 10 μ M Υ-27632對定形內胚層形成的影響。在擴 增期間用Υ-27632處理細胞。將在Matrigel 上擴增和分化的細胞作為對照。Y軸示出了 由流式細胞術測得的陽性CXCR4細胞的百分比。圖23示出了來自人ES細胞系H9的細胞的能力，這些細胞以單細胞形式傳代，并 接種到表面改性培養(yǎng)板3和4上以分化成胰內胚層。將細胞接種到表面改性培養(yǎng)板上，培 養(yǎng)于含10 μ M Υ-27632的MEF條件培養(yǎng)基中，并在分化前在表面改性培養(yǎng)板上傳代8次。Y 軸示出了通過q-PCR在后方前腸期(PF)和表達激素的內分泌細胞期(EN)測定的胰分化標 記物(Ngn3、Pdxl、胰島素)表達增加的倍數。圖M示出了人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性。將第50代人H9 ES細胞 以1 2的稀釋比接種到表面3和4以及CellBIND 和Primaria 上。在接種24小時后 將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結晶紫為細胞染色并拍照。箭頭指示的是集落。圖25示出了人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性。將第50代人H9 ES細胞 以1 2的稀釋比接種到含各種濃度￥-27632(0、1、2、4、10和20微摩爾)的表面3和4以 及CellBIND 和I^imaria 上。在接種M小時后將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結晶 紫為細胞染色并拍照。集落在孔上是黑點。箭頭用于突出顯示未處理孔上的集落。圖沈示出了人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上的粘附性。將第53代人H9ES細胞以 1 3的稀釋比接種到含或不含Y-27632(0或20微摩爾)的表面2-4和13以及CellBIND 和I^imaria 上。在接種48小時后將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結晶紫為細胞染色 并拍照。集落在孔上是黑點。箭頭用于突出顯示未處理孔上的集落。圖27示出了將人H9 ES細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板14和15上的第一次試驗(10 月)和第二次試驗(12月)，以及將人Hl ES細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板14和15的試驗。 將第42代和第53代的人H9 ES細胞、第57代的人Hl ES細胞以1 2或1 3的稀釋比 接種到含20微摩爾Y-27632的改性表面上。在接種M-48小時后將培養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除， 用0.5%的結晶紫為細胞染色并拍照。集落在孔上是黑點。箭頭用于突出顯示培養(yǎng)板上的 集落。圖觀示出了人ES細胞在限定培養(yǎng)基mTeSR 中在表面改性培養(yǎng)板4上的粘附性。 將第50代人H9 ES細胞以1 2的稀釋比接種到在孔中含或不含Y-27632(0或20微摩爾) 的改性表面上，孔用蛋白(0. 明膠、2%BSA、0.3^ig/ml大鼠I型膠原、稀釋比為1 1000 的Matrigel 或稀釋比為1 5000的Matrigel )處理或不處理。在接種48小時后將培 養(yǎng)基從培養(yǎng)板去除，用0. 5%的結晶紫為細胞染色并拍照。集落在孔上是黑點。圖四示出了用靜滴法在11周內測量的表面改性培養(yǎng)板的水接觸角。在表面處理 和消毒一周后進行第一次測量。每個數據點代表平均接觸角(每一滴測量一次，共7滴)。 在與表面1-4和13相同的實驗條件下測量在Nuclon Delta 和CellBIND 培養(yǎng)板上的接觸 角，但在第一次測量之前，進行表面處理和消毒12周以上(在第一次測量之前消毒Nuclon Delta * —周)。
圖30示出了用帶正電的結晶紫的表面反應性測量的表面改性培養(yǎng)板上的負電荷 密度。檢測每個表面的三個樣品，對來自每個樣品的解吸結晶紫的吸光度測量重復進行三 次。給出了九次測量的平均值和標準偏差。圖31示出了固體基底表面和Y-27632對培養(yǎng)于化學成分限定的無血清 ftx)293a-CDMTM培養(yǎng)基(A)或培養(yǎng)于添加有10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基(B)中的HEK 293 細胞的粘附性和生長的影響。將HEK293細胞接種在具有CellBIND 表面、Nunclon Delta 表面或表面4的96孔板中。粘附于這些表面的HEK293細胞的數目作為培養(yǎng)條件和Y-27632 濃度的函數顯示。細胞受到(i)在培養(yǎng)過程中用Y-27632連續(xù)處理96小時(Y-27632 96 小時接觸)；或(ii)在培養(yǎng)過程中用Y-27632連續(xù)處理48小時，隨后更換培養(yǎng)基，然后在 培養(yǎng)過程中在不含Y-27632情況下處理48小時(Y-2763248小時接觸/48小時不接觸)。 在不含有Y-27632的培養(yǎng)基(不含Y-2763》中培養(yǎng)的HEK293細胞以與在含有Y-27632的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞同樣的方式操作，也就是說，不更換培養(yǎng)基的情況下培養(yǎng)96小時，或 處理48小時后更換培養(yǎng)基。當施加濃度為2. 0和5. 0 μ M時，Y-27632可促進HEK293細胞 粘附于表面4和CellBIND 表面。孵育48小時后去除Y-27632導致大量細胞從表面4和 CellBIND 表面分離。示出了三次測量的平均值和標準偏差。圖32示出了固體基底表面以及Mio激酶抑制劑Y-27632和H-1152對HEK293細 胞在添加有10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基中的生長的影響。將HEK293細胞接種到具有表面 4(A)或未處理的(但用25kGy的、射線照射過)聚苯乙烯表面(B)的Multidish M孔培養(yǎng)板上。圖33示出了 H-1152和表面4對HEK293細胞粘附性和形態(tài)的影響。將HEK293細 胞接種到Multidish 12孔培養(yǎng)板中的添加有10%胎牛血清和H-1152的EMEM培養(yǎng)基中，并 在自動的、位于培養(yǎng)箱內的顯微鏡內孵育67小時。A中的生長曲線和B中的顯微照片示出了 H-1152對HEK293細胞在表面4上的粘附性和生長的一般影響，以及更換培養(yǎng)基對HEK293 細胞在含或不含H-1152的表面4上的粘附性和形態(tài)的影響。圖；34示出了生長在含或不含2. 5μΜ Y-27632的表面4和NunclonDelta 表面上 的HEK293細胞的3次傳代的生長曲線。通過胰蛋白酶化將生長在添加有10%胎牛血清的 EMEM培養(yǎng)基中的HEK293細胞傳代3次。圖35示出了 I^ho激酶抑制對人胚胎干細胞系Hl的細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板 么“和⑴以及押加虹化““上的影響。在所有表面上，孔A和B為對照孔。孔C和D含有 ΙΟμΜΥ-27632。孔 E 和 F 含有 3 μ M Η1152 甘氨酰(H1152_glycyl)。孔 G 禾口 H 含有 10 μ M Η1152甘氨酰。圖36示出了他0激酶抑制對人胚胎干細胞系Hl細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板30上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM Η1152甘氨酰的吸附層。圖37示出了他0激酶抑制對人胚胎干細胞系Hl細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板31上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM H1152甘氨酰的吸附層。圖38示出了他0激酶抑制對人胚胎干細胞系Hl細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板32上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM H1152甘氨酰的吸附層。圖39示出了他0激酶抑制對人胚胎干細胞系Hl細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板33上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM Η1152甘氨酰的吸附層。圖40示出了他0激酶抑制對人胚胎干細胞系Hl細胞粘附于表面改性培養(yǎng)板34上 的影響。(一)=未處理。(RI) = 3μΜ Η1152甘氨酰。(MG)=稀釋比為1 30的MATRIGEL 的吸附層。(MG+RI)=稀釋比為1 30的MATRIGEL+3yM H1152甘氨酰的吸附層。圖41示出了用靜滴法在40周內測量的表面改性培養(yǎng)板的水接觸角。圖42示出了用靜滴法測量的表面改性培養(yǎng)板的水接觸角。圖43示出了用帶正電的結晶紫的表面反應性測量的表面改性培養(yǎng)板上的負電荷也/又。圖44示出了用帶正電的結晶紫的表面反應性測量的表面改性培養(yǎng)板4、22-M和 29上的負電荷密度。檢測每個表面的三個樣品，對來自每個樣品的解吸結晶紫的吸光度測 量重復進行三次。將表面4、22-對和四的負電荷密度歸一化到Nunclon Delta 表面的負 電荷密度。給出了九次測量的平均值和標準偏差。
具體實施例方式為了以不受限制的方式清晰說明本公開，將本發(fā)明的具體實施方式
分成下列描述 或闡明本發(fā)明某些特征、實施例或應用的小節(jié)。^X如本文所用，“吸附層”是指在固體基底表面上通過共價鍵(也稱為接枝)或非共 價鍵(也稱為吸附)將分子附著在表面上而形成的一層。用于制備吸附層的分子可以為 (例如)蛋白質分子，其可包括(例如)胞外基質蛋白、氨基酸等，還可以為非生物分子，例 如，聚乙烯亞胺?！?β細胞系”是指這樣的細胞，其具有轉錄因子PDX-I和下列轉錄因子中的至少一 種的陽性基因表達NGN-3、Nkx 2. 2、Nkx6. l、NeuroD、Isl-1、HNF_3 3、MAFA、Pax4 和 Pax6。 表達β細胞系特征性標記物的細胞包括β細胞。如本文所用，“表達定形內胚層系特征性標記物的細胞”是指表達下列標記物中 的至少一種標記物的細胞S0X-17、GATA-4、HNF-3 β、GSC、CerU Nodal、FGF-8、短尾蛋白 (Brachyury)、Mi χ 樣同源盒蛋白、FGF-4CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF_17、GATA_6、 CXCR4、C-Kit、⑶99或0TX2。表達定形內胚層系特征性標記物的細胞包括原條前體細胞、原 條細胞、中內胚層細胞和定形內胚層細胞。如本文所用，“表達胰內胚層系特征性標記物的細胞”是指表達下列標記物中的至 少一種標記物的細胞PDX-1、HNF-I β、PTF-I α、HNF-6或HB9。表達胰內胚層系特征性標 記物的細胞包括胰內胚層細胞。如本文所用，“表達胰內分泌系特征性標記物的細胞”是指表達下列標記物中的至 少一種標記物的細胞NGN-3、NeuroD, Islet-U PDX-U NKX6. 1、Pax_4、Ngn-3 或 PTF-1 α。 表達胰內分泌系特征性標記物的細胞包括胰內分泌細胞、表達胰激素的細胞、分泌胰激素 的細胞和β細胞系的細胞。
如本文所用，“定形內胚層”是指具有以下特征的細胞這些細胞來自原腸胚形 成期間的外胚層并形成胃腸道及其衍生物。定形內胚層細胞表達下列標記物CXCR4、 HNF-3 β、GATA-4、S0X-17, Cerberus、0TX2、鵝素(goosecoid)、c_Kit、CD99 和 Mixll。“胞外基質蛋白”是指通常在體內或胎盤內的細胞間發(fā)現的蛋白質分子。胞外基質 蛋白可以來自組織、體液(例如血液)或非重組細胞條件培養(yǎng)基或重組細胞條件培養(yǎng)基或 細菌條件培養(yǎng)基。如本文所用，“胚外內胚層”是指表達下列標記物中的至少一種標記物的細胞群 S0X-7、AFP 禾P SPARC?！癏EK293細胞”是指由正常人胚腎細胞培養(yǎng)物轉化而來的細胞系，如Graham等人 (J. Gen. Virol. 36 =59-72,1977)所述，并且也指衍生自此親本細胞系的任何細胞。如本文所用，“標記物”是指在所關注細胞內差異表達的核酸或多肽分子。在上下 文中，差異表達是指對于陽性標記物而言表達水平升高，對于陰性標記物而言表達水平下 降。與其他細胞相比，所關注細胞中的核酸或多肽標記物的可檢測水平足夠高或足夠低，使 得可以使用本領域已知的多種方法識別所關注細胞，并將所關注細胞與其他細胞區(qū)分開。如本文所用，“基質”是指細胞可粘附的三維支架。如本文所用，“中內胚層細胞”是指表達下列標記物中的至少一種標記物的細胞 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、S0X-17, DKK4、HNF-3 β、GSC、FGF-17, GATA-6。如本文所用，“胰內分泌細胞”或“表達胰激素的細胞”是指能夠表達下列激素中的 至少一種激素的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，“分泌胰激素的細胞”是指能夠分泌下列激素中的至少一種激素的細 胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，“原條前體細胞”是指表達下列標記物中的至少一種標記物的細胞 Nodal 或 FGF-8。如本文所用，“原條細胞”是指表達下列標記物中的至少一種標記物的細胞短尾 蛋白、Mi χ樣同源盒蛋白或FGF-4。如本文所用，“表面，，是指旨在用于細胞培養(yǎng)或分析的固體基底容器或基質的分子 最外層?？梢苑謩e用X射線光電子能譜(XPQ、原子力顯微鏡(AFM)和接觸角測量來分析表 面的元素組成、粗糙度和潤濕性?！氨砻娓男耘囵B(yǎng)板”是指含有在實例16、17和沈中描述的表面1-34中的任何 一種表面的容器，或含有以商品名為Nunclon Delta 、Costar 、Falcon , CellBIND 和 I^imaria 出售的表面的培養(yǎng)板。容器可以(例如)由諸如聚苯乙烯(PS)、環(huán)烯烴共聚物 (COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或苯乙烯丙烯腈共聚物(SAN)等聚合物制 成。干細胞為未分化細胞，可定義為其在單細胞水平具有自我更新和分化以產生后代 細胞的能力，包括自我更新的祖細胞、非更新的祖細胞和最終分化的細胞。干細胞的特征還 在于其具有在體外由多種胚層(內胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細胞系的功能細胞 的能力、移植后產生多種胚層的組織的能力以及注射入囊胚后基本上有助于大部分(如果 不是所有的話)組織形成的能力。根據它們的發(fā)育潛能將干細胞分為(i)全能干細胞，意指能夠產生所有胚胎或胚外細胞類型；(ii)多能干細胞，意指能夠產生所有胚胎細胞類型；(iii)專能干細胞，意 指能夠產生一個亞群的細胞系，但這些細胞系都位于特定的組織、器官或生理系統(tǒng)內(例 如，造血干細胞(HSC)能夠產生包括HSC(自我更新)、血細胞限制性寡能祖細胞和為血液正 常組分的所有細胞類型和成分(如血小板)的后代；(iv)寡能干細胞，意指能夠產生比專 能干細胞更為限制的亞群的細胞系；以及(ν)單能干細胞，意指能夠產生單個細胞系(如精 子發(fā)生干細胞)。分化是這樣一個過程，通過該過程，非特化的(“非定向的”)或少特化的細胞可 獲得特化細胞(例如，神經細胞或肌細胞)的特征。分化的細胞或誘導分化的細胞是已經 在細胞譜系中占據更特化的(“定向的”)位置的細胞。當應用于分化過程時，術語“定向 的”是指已經在分化通路中進行到一定程度的細胞，其中在正常情況下，該細胞將繼續(xù)分化 成特定的細胞類型或一個亞群的細胞類型，并且在正常情況下，不能分化成不同的細胞類 型或回復至更少分化的細胞類型。去分化是指這樣一個過程，通過該過程，細胞回復至細 胞譜系內更少特化的(或定向的)位置。如本文所用，細胞譜系限定了細胞遺傳性，也就是 說，它來自哪種細胞和它能夠產生什么細胞。細胞譜系將細胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計 劃內。譜系特異性標記物是指與所關注譜系的細胞表型特異性相關并能夠用于評價非定向 細胞向所關注譜系的分化的特征。各種術語用于描述培養(yǎng)中的細胞。“維持”通常是指在促進細胞生長和/或分裂條 件下，在生長培養(yǎng)基中接種細胞，這些條件可以或不可以產生更大的細胞群?！皞鞔笔侵冈?促進細胞生長和/或分裂條件下，從一個培養(yǎng)容器移去細胞并將它們接種到第二個培養(yǎng)容 器的過程。細胞或細胞系的特定群體有時是指或特征在于其已傳代的次數。例如，一個已傳 代了十次的培養(yǎng)細胞群可以指Pio培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)，即，將細胞從組織分離后的第一次培 養(yǎng)，指定為Po。第一次傳代培養(yǎng)后，細胞被描述為第二培養(yǎng)物(Pl或第1代)。第二次傳代 培養(yǎng)后，細胞成為第三培養(yǎng)物(P2或第2代)，以此類推。本領域的技術人員應當理解，在傳 代期間，可以有多次群體倍增；因此，培養(yǎng)物的群體倍增數大于傳代數。細胞在傳代間隔的 時間內的擴增(即，群體倍增數)取決于多種因素，包括(但不限于)接種密度、基底、培養(yǎng) 基、生長條件和傳代間隔的時間。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種促進細胞粘附于表面上的方法，該表面含有 至少約0. 9%的N，0和N的總數大于或等于22. 3%，接觸角為至少約13. 9度，并且該表面 不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層，該方法包括以下步驟a.獲得細胞懸浮液，以及b.將細胞懸浮液添加到表面，并使細胞粘附。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種促進細胞粘附于表面上的方法，該表面含有 至少約0.5%的N，0和N的總數大于或等于17.2%，接觸角為至少約13. 9度，并且該表面 不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層，該方法包括以下步驟a.獲得細胞懸浮液，b.用選自下列物質的至少一種化合物處理細胞懸浮液能夠抑制Mio激酶活性的 化合物和能夠抑制Mio活性的化合物，以及c.將細胞懸浮液添加到表面，并使細胞粘附。
在一個實施例中，該細胞懸浮液為細胞群懸浮液。在一個替代實施例中，該細胞懸 浮液為單細胞懸浮液。在一個實施例中，該細胞為多能干細胞。在一個替代實施例中，該細胞為干細胞。在一個實施例中，該表面具有吸附層。在一個實施例中，該吸附層為胞外基質 組分，例如，衍生自基底膜或可以形成一部分粘附分子受體-配體偶聯物的胞外基質組 分。在一個實施例中，該吸附層由MATRIGEL(Becton Dickenson)制成。MATRIGEL是由 Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細胞制備的可溶性制品，其在室溫形成凝膠，從而形成重組基 底膜。蛋白質吸附層也可以由層粘連蛋白、纖粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等單 獨或以各種組合形成。在一個實施例中，細胞在粘附于表面后進行培養(yǎng)。在一個替代實施例中，在細胞粘 附于表面后，去除此至少一種化合物。在一個實施例中，通過去除此至少一種化合物來從表 面分離細胞。在一個實施例中，用能夠抑制Iih0激酶活性的至少一種化合物處理該細胞懸浮 液。在一個替代實施例中，用能夠抑制Mio活性的至少一種化合物處理該細胞懸浮液。在 一個替代實施例中，用能夠抑制I^ho激酶活性的至少一種化合物和能夠抑制Mio活性的至 少一種化合物處理該細胞懸浮液。能夠抑制他0激酶活性的此至少一種化合物選自以下物質Y-27632、法舒地爾和羥基法舒地爾。在一個實施例中，能夠抑制Iiho激酶活性的此至少一種化合物為Υ-27632。能夠抑制Iih0激酶活性的此至少一種化合物可以在約0. 1 μ M至約100 μ M的濃度 下使用。在一個實施例中，能夠抑制Mio激酶活性的此至少一種化合物在約10 μ M的濃度 下使用。在一個實施例中，能夠抑制Iiho活性的此至少一種化合物為Mio GTP酶抑制劑。在一個實施例中，能夠抑制Iih0活性的此至少一種化合物為胞外酶C3轉移酶。能夠抑制Iih0活性的此至少一種化合物可以在約0. 01 μ g/ml至約5 μ g/ml的濃 度下使用。在一個實施例中，能夠抑制Mio活性的此至少一種化合物在約0. 5 μ g/ml的濃 度下使用。表面改性培養(yǎng)板適用于本發(fā)明的表面改性培養(yǎng)板可以為其表面經過改性的容器，該表面包含至少 約0. 5%的N，0和N的總數大于或等于17. 2%，并且接觸角為至少約13. 9度。作為另外一 種選擇，該表面可以為三維基質，例如，細胞可以粘附于其上的多孔支架。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約0. 5%的 N，0和N的總數大于或等于17.2%，并且接觸角為至少約13.，度。在一個替代實施例中， 表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約0. 5%的N，0和N的總數大于或等于 19.5%，并且接觸角為至少約13. 9度。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1.3%的 N，0和N的總數為至少約24. 9%，并且接觸角為至少約20. 7度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板1。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1. 7%的N，0和N的總數為至少約四.6%，并且接觸角為至少約14. 3度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板2。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約2. 0%的 N，0和N的總數為至少約30.7%，并且接觸角為至少約18. 4度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板3。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約2. 的 N，0和N的總數為至少約30.2%，并且接觸角為至少約17. 4度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板4。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1.8%的 N，0和N的總數為至少約觀.2%，并且接觸角為至少約18. 8度，該培養(yǎng)板在本文是指表面 改性培養(yǎng)板13。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約1.0% 的N，0和N的總數為至少約27.8%，并且接觸角為至少約44. 3度，該培養(yǎng)板以商品名 CELLBIND 出售。在一個實施例中，表面改性培養(yǎng)板包括一種培養(yǎng)板，其表面包含至少約10. 2% 的N，0和N的總數為至少約23.0%，并且接觸角為至少約39. 5度，該培養(yǎng)板以商品名 PRIMARIA 出售。表面改件培養(yǎng)板的特件描沭在一個實施例中，可以用X射線光電子能譜(XPQ來分析表面改性培養(yǎng)板表面 的元素組成。XPS，也稱為化學分析電子能譜(ESCA)，用作確定什么元素或原子存在于固 體基底表面(可以檢測濃度小于0.1原子百分數的除氫和氦以外的所有元素)并確定 這些元素或原子的鍵合環(huán)境的方法。作為一個例子，對聚苯乙烯(只含有碳和氫)固體 樣品的XPS分析通常將給出大于97%的碳、小于3%的氧和0%的氮(不能檢測氫；由于 聚苯乙烯鏈在表面的氧化，例如，由于輻射消毒，可以檢測到不同水平的氧)(Brevig et al. . , Biomaterials 26 :3039-3053,2005 ；Shen and Horbett, J.Biomed. Mater. Res. 57 336-345, 2001 (Brevig等人，《生物材料》，第洸卷第3039-3053頁，2005年；Shen和 Horbett,《生物醫(yī)學材料研究雜志》，第57卷第336-345頁，2001年))。在一個實施例中，可以用原子力顯微鏡(AFM)來分析表面改性培養(yǎng)板的表面粗糙 度?？梢杂肁FM以低于1 A的水平分辨率和低于0. 1 A的垂直分辨率為表面原子或分子成 像。在一個實施例中，可以通過測量接觸角來分析表面改性培養(yǎng)板的表面潤濕性。例 如，使用靜滴法進行的接觸角測量提供了固體基底表面和液體表面之間相互作用的信息。 接觸角描述停留在固體基底表面上的液滴的形狀，其是固體基底表面上的液體接觸角，并 在液、固和氣三相交界的接觸線處的液體內測得。具有大于90°的水接觸角的表面稱為疏 水的，具有小于90°的水接觸角的表面稱為親水的。在極其親水的表面，也就是說，對水具 有高親和力的表面，小水滴將完全鋪展(有效接觸角為0° )。在一個實施例中，通過測量結晶紫與表面的反應性來分析表面改性培養(yǎng)板表面的 負電荷密度。結晶紫帶有正電荷，使得其能夠結合到帶負電的分子和分子部分上，例如，聚 合物表面上的帶負電的官能團。如果表面具有相同的粗糙度和面積，則具有高結晶紫反應性的表面比具有低結晶紫反應性的表面具有更高密度的負電荷。多能干細胞多能干細胞的特件描述多能干細胞可以表達一種或多種階段特異性胚胎抗原(SSEA) 3和4、以及可使用 稱為 Tra-1-60 和 Tra-1-81 的抗體檢測的標記物(Thomson et al.，Science 282 :1145 1998 (Thomson等人，《科學》，第282卷第1145頁，1998年))。多能干細胞在體外的分化導 致SSEA-4、Tra-1-60和 ει-1-81表達的喪失(如果存在的話)以及SSEA-I表達的增加。 未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸酶活性，其可以通過用4%的多聚甲醛固定細胞，然 后用Vector Red作為底物顯影來檢測，如制造商所述(Vector Laboratories (Burlingame Calif.))。未分化的多能干細胞通常也表達Oct-4和TERT，如由RT-PCR所檢測。增殖的多能干細胞的另一期望表型是有潛能分化成所有三個胚層的細胞內胚 層、中胚層和外胚層組織?？梢酝ㄟ^如下方式來確定干細胞的多能性例如，將細胞注射入 重癥聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4%的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后對其進行組 織學檢測，找出來自三個胚層的細胞類型的證據。作為另外一種選擇，可以通過產生胚狀體 并評估胚狀體中三個胚層相關的標記物的存在來確定多能性?？梢允褂脴藴蔊帶技術并比較已公布的相應靈長類物種的核型來分析增殖的多 能干細胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細胞，其意指細胞為整倍體，其中所有人 染色體都存在并且沒有明顯的改變。多能干細胞的來源可以使用的多能干細胞類型包括，衍生自妊娠后形成的組織的已建立多潛能細胞 系，妊娠后形成的組織包括取自妊娠期間任何時期(通常但不一定在妊娠約10-12周之前) 的胚前組織(例如，囊胚)、胚胎組織或胎兒組織。非限制性例子為已建立的人ES細胞系或 人胚胎生殖細胞系，例如，人ES細胞系H1、H7和H9 (WiCell)。也可設想的是，在此類細胞的 初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細胞將是直接取自源組織的原 代多能細胞。也適用的是，取自已經在不存在飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)的多能干細胞群以及 已經在存在飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)的多能干細胞群的細胞。也適用的是，人ES細胞系的突 變體，例如，BGOlv(BresaGen(Athens, GA))。也適用的是，來源于成人體細胞的細胞，例如， 在 Takahashi et alCell 131 1-12 (2007) (Takahashi 等人于《細胞》，第 131 卷第 1-12 頁 2007年)中公開的細胞。在一個實施例中，按照Thomson等人(美國專利No. 5，843，780 ;Science 282 1145，1998(《科學》，第沘2 卷第 1145 頁，1998 年)；Curr. Top. Dev. Biol. 38 :133ff.， 1998(《發(fā)育生物學當代論題》，第38卷第133頁幾段，1998年)；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995 (《美國科學院院刊》，第92卷第7844頁，1995年)所描述方法制備人 ES細胞。多能干細胞的培養(yǎng)在一個實施例中，在按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)之前，將多能干細胞培養(yǎng)在以多種方 式支持多能干細胞的飼養(yǎng)細胞層或胞外基質蛋白上。例如，將多能干細胞培養(yǎng)在支持多能 干細胞增殖而不進行大量分化的飼養(yǎng)細胞層上。使用以下物品支持多能干細胞在飼養(yǎng)細胞 層上無分化的生長(i)獲得含有飼養(yǎng)細胞層的培養(yǎng)容器；以及(ii)通過預先與另一細胞類型共培養(yǎng)來調整的培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基，例如，無血清或甚至化學成分限定的培養(yǎng)基。又如，將多能干細胞培養(yǎng)在基本上不含飼養(yǎng)細胞、但支持多能干細胞增殖而不進 行大量分化的培養(yǎng)體系中。使用以下物品支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)中無分化的生 長(i)具有一種或多種胞外基質蛋白的固體基底表面上的吸附層；以及(ii)通過預先與 另一細胞類型共培養(yǎng)來調整的培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基，例如，無血清或甚至化學成分限定 的培養(yǎng)基。在一個替代實施例中，將多能干細胞培養(yǎng)在表面改性培養(yǎng)板上，該表面改性培養(yǎng) 板包含至少約0.5%的N，0和N的總數大于或等于17.2%，并且接觸角為至少約13. 9度， 并培養(yǎng)于通過預先與另一細胞類型共培養(yǎng)調整的培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基中，例如，無血清 或甚至化學成分限定的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以在US20020072117中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的例子?？梢?在US6642048中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子?？梢栽赪02005014799 中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子?？梢栽赬u等人(Stem Cells 22: 972-980,2004(《干細胞》，第22卷第972-980頁，2004年))中找到適用于本發(fā)明的細胞 培養(yǎng)基的另外一個例子。可以在US20070010011中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外 一個例子?？梢栽?Cheon 等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ； 190ct 2005 (Cheon等人，《生殖生物學》，數字對象唯一標識符10. 1095/biolreprod. 105. 046870， 2005年10月19日))中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子?？梢栽?Levenstein 等人(Stem Cells 24 :568-574,2006(《干細胞》，第 24 卷第 568_574 頁，2OO6 年))中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子。可以在US20050148070中找到 適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子。可以在US20050233446中找到適用于本發(fā) 明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子。可以在US6800480中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基 的另外一個例子?？梢栽赨S20050244962中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個 例子?？梢栽赪020050653M中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子。可以在 W02005086845中找到適用于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的另外一個例子。合適的培養(yǎng)基也可以由下列組分制成，例如，Dulbecco改進的fegle培 養(yǎng)基(DMEM)、Gibco#l 1965-092、Knockout Dulbecco 改進的 Eagle 培養(yǎng)基(K0 DMEM), Gibco#10829-018, Ham ‘ s F12/50 % DMEM 基本培養(yǎng)基、200mM L-谷氨酰胺、 Gibco#15039-027、非必需氨基酸溶液、Gibcolll40_050、β -巰基乙醇、Sigma#M7522、人重 組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、Gibco#13256-029。多能干細胞的分化在本發(fā)明的一個實施例中，使多能干細胞在培養(yǎng)過程中增殖，同時保持其多能性。 可通過檢測多能性相關標記物的表達水平的變化來測定細胞多能性隨時間變化。作為另外 一種選擇，還可通過檢測分化相關標記物或另一細胞類型相關標記物的表達水平的變化來 監(jiān)測多能性的變化。在一個替代實施例中，使多能干細胞在培養(yǎng)過程中增殖，并以促進其分化為另一 細胞類型的方式處理多能干細胞。其他細胞類型可為表達定形內胚層系特征性標記物的細 胞。作為另外一種選擇，細胞類型可為表達胰內胚層系特征性標記物的細胞。作為另外一 種選擇，細胞類型可為表達胰內分泌系特征性標記物的細胞。作為另外一種選擇，細胞類型可為表達β細胞系特征性標記物的細胞。根據本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可通過本領域的任何合適方法分化為多種 其他細胞類型。例如，根據本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可分化為神經細胞、心肌細胞、肝細胞寸。例如，根據W02007030870中公開的方法，根據本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可 分化為神經祖細胞和心肌細胞。又如，根據美國專利6，458，589中公開的方法，根據本發(fā)明的方法處理的多能干 細胞可分化為肝細胞。例如，根據 D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 23 :1534-1541, 2005 (D' Amour 等人，《自然-生物技術》，第23卷第1534-1541頁，2005年)中公開的方法，多能干細胞可 分化為表達定形內胚層系特征性標記物的細胞。例如，根據Shinozaki et al. , Development 131 1651-1662，2004 (Shinozaki 等 人，《發(fā)育》，第131卷第1651-1662頁，2004年)中公開的方法，多能干細胞可分化為表達定 形內胚層系特征性標記物的細胞。例如，根據McLean et al.，Stem Cells 25 :29-38, 2007 (McLean 等人，《干細胞》， 第25卷第四-38頁，2007年)中公開的方法，多能干細胞可分化為表達定形內胚層系特征 性標記物的細胞。例如，根據 D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour 等人，《自然-生物技術》，第M卷第1392-1401頁，2006年)中公開的方法，多能干細胞可 分化為表達定形內胚層系特征性標記物的細胞。定形內胚層系特征性標記物選自SOX17、GATA4、Hnf-3 0、GSC、Cerl、Nodal、FGF-8、 短尾蛋白、Mix樣同源盒蛋白、FGF-4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF-17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99以及0TX2。適用于本發(fā)明的細胞為表達至少一種定形內胚層系特征性 標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達定形內胚層系特征性標記物的細胞為原條前體 細胞。在一個替代方面，表達定形內胚層系特征性標記物的細胞為中內胚層細胞。在一個 替代方面，表達定形內胚層系特征性標記物的細胞為定形內胚層細胞。例如，根據 D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour 等人，《自然-生物技術》，第M卷第1392-1401頁，2006年)中公開的方法，多能干細胞可 分化為表達胰內胚層系特征性標記物的細胞。胰內胚層系特征性標記物選自Pdxl、HNF-I β、PTFla、HNF-6、HB9和PR0X1。適用 于本發(fā)明的細胞為表達至少一種胰內胚層系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面， 表達胰內胚層系特征性標記物的細胞為胰內胚層細胞。根據本領域的任何方法可使多能干細胞分化為表達胰內分泌系特征性標記物的 細胞。例如，根據 D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour 等人，《自然-生物技術》，第M卷第1392-1401頁，2006年)中公開的方法，多能干細胞可 分化為表達胰內分泌系特征性標記物的細胞。例如，根據 D，Amour et al.，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401, 2006 (D' Amour等人，《自然-生物技術》，第M卷第1392-1401頁，2006年)中公開的方法，多能干細胞可 分化為表達胰內分泌系特征性標記物的細胞。胰內分泌系特征性標記物選自NGN-3、神經源性分化蛋白(NeuroD)、Islet-U Pdx-UNKX6. l、Pax-4、Ngn-3以及PTF-I α。在一個實施例中，胰內分泌細胞能夠表達至少 一種以下激素胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的細胞為表達至少 一種胰內分泌系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達胰內分泌系特征性標記 物的細胞為胰內分泌細胞。胰內分泌細胞可為表達胰激素的細胞。作為另外一種選擇，胰 內分泌細胞可為分泌胰激素的細胞。在本發(fā)明的一個方面，胰內分泌細胞為表達β細胞系特征性標記物的細胞。表 達β細胞系特征性標記物的細胞表達Pdxl以及至少一種以下轉錄因子NGN-3、Nkx2. 2、 Nkx6. 1、神經源性分化蛋白、Isl-I、HNF-3 β、MAFAJaxA和1^x6。在本發(fā)明的一個方面，表 達β細胞系特征性標記物的細胞為β細胞。本發(fā)明通過(但不限于)以下實例進一步說明。SM實例1細胞群形式的人胚胎干細胞的傳代和維持人ES細胞系Hl和Η9最初維持在經絲裂霉素C滅活的原代小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF)上。人ES細胞在重復傳代過程中從MEF飼養(yǎng)層轉移到Matrigel (Becton-Dickins on (Bedford, MA))上。用Matrigel 處理表面低生長因子Matrigel 在4°C解凍后以1 30的比例稀 釋于冷的DMEM/F12anvitrogen(Carlsl3ad，CA))。將足以覆蓋表面的體積加入每個6cm培 養(yǎng)皿Qml)或6孔板的每個孔(Iml)中，并在室溫下孵育1小時。處理過的表面在數小時 之內使用或在4°C下最多保存兩周。人ES 細胞培養(yǎng)通過在含有 lmg/ml 的膠原酶 IV (Sigma-Aldrich ( . Louis,MO)) 的DMEM/F12中孵育10分鐘，然后用移液管刮取，從而從飼養(yǎng)層獲得未分化的人ES細胞集 落(來自H9或Hl細胞系)。細胞團通過600 X g離心四分鐘進行沉淀，用2ml移液管輕輕地 分散該沉淀，以將集落破碎成小細胞群。將這些細胞群接種到Matrigel 處理的培養(yǎng)皿上 的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基經小鼠胚胎成纖維細胞(MEF-CM)調整，還添加了 bFGF(8ng/ml ；R&D Systems (Minneapolis,MN))，接種密度為每6cm培養(yǎng)皿5ml生長培養(yǎng)基中接種50-150個集 落。每天更換培養(yǎng)基。MEF-CM中位于Matrigel 上的集落變大，并在其覆蓋70-80%的表 面積時(大約每3-4天)進行傳代。與飼養(yǎng)層上維持的人ES細胞(圖1)類似，集落中的 人ES細胞具有較高的細胞核細胞質的比率并且具有明顯的核仁。分化細胞所占比例小 于培養(yǎng)細胞總數的5%。就Matrigel 上的MEF-CM中的細胞的常規(guī)傳代而言，將細胞在含有l(wèi)mg/ml膠原 酶IV的DMEM/F12中孵育最多60分鐘，并通過有力的DMEM/F12流沖洗伴以刮取將細胞從 培養(yǎng)皿中移除。將細胞沉淀、分散并以1 3或1 4的比率接種。實例2單細胞形式的人胚胎干細胞的傳代根據轉讓給Lif必can Inc的美國專利申請LFS5163USPSP中公開的方法，以單細胞形式培養(yǎng)細胞系H9的人ES細胞。用TrypLE Express在37°C下處理五分鐘的方法進 行細胞傳代，并以10，000細胞/cm2基底表面的密度進行接種。實例3使用無胞外基質蛋白/組分和飼養(yǎng)細胞的表面改件培養(yǎng)板來講行的人胚胎干細 朐的粘附、培養(yǎng)和多能件保持細胞系Hl的人ES細胞，至第49代時維持于Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的MEF條 件培養(yǎng)基中，在研究之前該培養(yǎng)板經低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液處理。通過 lmg/ml膠原酶分離或人工刮取，將細胞從表面分離以進行傳代。然后將這些細胞接種于表面改性培養(yǎng)板(6孔格式)的兩個未處理孔上。另外，每 個培養(yǎng)板的一個孔用0. 無異源人明膠處理作為對照。還將細胞直接接種于costar (目 錄號 3516 ； Corning (Corning, NY)) >Falcon (目錄號 351146 ；Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ))以及Nunclon Delta (目錄號 140675 ;Thermo Fisher Scientific (Roskilde， Denmark))6孔板的未處理和明膠處理孔上，以用作陰性對照，并且還接種于用低生長因子 Matrigel 的1 30稀釋液處理的孔上，以用作陽性對照。在所有處理中，細胞均維持于 MEF條件培養(yǎng)基中。我們觀察到兩代之后，表面改性培養(yǎng)板2、3和4具有粘附的ES細胞集落，這些集 落在酶分離后重新粘附于培養(yǎng)板并生長。表面改性培養(yǎng)板2、3或4上的明膠或未處理孔中， 粘附率或生長率沒有明顯差異。從用低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液處理的培養(yǎng)板上機械分離的細胞較 弱粘附于表面改性培養(yǎng)板2、3和4，而用lmg/ml膠原酶進行酶分離的細胞能較好粘附于表 面改性培養(yǎng)板2、3或4的明膠或未處理孔中。加入表面改性培養(yǎng)板1和5-12以及未處理或明膠處理的NunclonDelta 培養(yǎng)板、 hlcon 培養(yǎng)板以及Costar 培養(yǎng)板的Hlp49ES細胞不粘附。相同的細胞粘附于用低生長 因子Matrigel 的1 30稀釋液處理的培養(yǎng)板上，這表明該細胞能夠粘附于基底表面。對接種于低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液上的Hl細胞系ES細胞來說，其 正常傳代時間為3-4天，然而接種于表面改性培養(yǎng)板2、3和4上的細胞在準備傳代之前需 要培養(yǎng)7天。這可能是由于處理表面上的粘附率的下降，因為與表面2、3和4相比，在接種 后更多初始集落立即明顯存在于Matrigel 處理表面上。將第50代(p50)細胞按1 2的比率分離，并收集半數該樣品，以用于RNA純化 和多能性標記物表達水平檢測(表1)。每個樣品的另一半重新接種于表面改性培養(yǎng)板。這 一代(P51)形成的集落在其準備傳代前仍需要培養(yǎng)7天，僅培養(yǎng)4天后長成的小集落示于 圖1中。這些集落維持典型ES細胞集落形態(tài)。表面改性培養(yǎng)板2、3和4上的細胞在傳代4次時停止培養(yǎng)，通過qRT_PCR分析樣 品的多能性標記物(表幻并且使樣品分化為定形內胚層細胞(DE)的命運。傳代4次的細 胞保持以下典型多能性標記物的表達0ct4、Nanog, Sox2和TERT。此外，該細胞具有能夠 在含有 DMEM/F12、100ng/ml 激活素 A、20ng/ml Wnt3a 和 0. 5-2. 0% FBS (表 3)的培養(yǎng)基中 分化為定形內胚層細胞的命運，這表明到第4代細胞仍保持多能性。實例4^gJirsa / m^mmmmm^mmm.mmamfmKm.m^mmmm.mmu^mim :Rh0 抑制和 Rh0 mmmmm^m細胞系Hl的人ES細胞，在第49代時維持于Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的MEF條 件培養(yǎng)基中，在研究之前該培養(yǎng)板經低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液處理。通過 lmg/ml膠原酶分離，將細胞從表面分離以進行傳代。然后將這些細胞接種于表面改性培養(yǎng)板(6孔格式)的未處理孔上。還將細胞直 接接種于Costar 、i^ilcon 和Nunclon Delta 6孔板的未處理和明膠處理孔上以用作陰 性對照，并接種于低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液處理的孔上以用作陽性對照。在 所有處理中，細胞均維持于MEF條件培養(yǎng)基中。在第49代時加入表面改性培養(yǎng)板1和5-12以及加入未處理或明膠處理的 Nunclon Delta 培養(yǎng)板和Costar 培養(yǎng)板的Hl細胞系的人ES細胞不粘附，然而，其卻粘 附于表面改性培養(yǎng)板2、3和4。相同的細胞粘附于低生長因子Matrigermi 30稀釋 液處理的培養(yǎng)板，這表明該細胞能夠粘附于基底表面。對接種于低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液上的Hl ES細胞來說，其正常傳 代時間為3-4天，然而接種于表面改性培養(yǎng)板2、3和4上的細胞在準備傳代之前需要培養(yǎng)7 天。這可能是由于表面改性培養(yǎng)板上的粘附率的下降，因為與表面改性培養(yǎng)板2、3和4相 比，在接種后更多初始集落立即明顯存在于Matrigel 處理表面。將第50代(p50)細胞按1 2的比率分離，并收集半數該樣品，以用于RNA純化 和多能性標記物表達水平檢測(表1)。每個樣品的另一半重新接種于表面改性培養(yǎng)板。這 一代(P51)形成的集落在其準備傳代前仍需要培養(yǎng)7天，僅培養(yǎng)4天后長成的小集落示于 圖1中。這些集落維持典型ES細胞集落形態(tài)。由于傳代的推遲，將該細胞以1 2的比率分離，并將傳代4次的半數樣品接種于 MEF條件培養(yǎng)基或添加有10 μ M濃度的Iih0激酶(ROCK)抑制劑Υ-27632的MEF條件培養(yǎng)基 中，以用于改善細胞生長動力學。傳代后將細胞保存于接種培養(yǎng)基中48小時，此時該培養(yǎng) 基被更換成新鮮的不添加MEF的條件培養(yǎng)基。添加1(^11濃度的￥_27632可顯著提高該細胞(ρ52)的接種效率并且在接種4天 后集落生長明顯改善(圖2)。此外，在膠原酶分離之前，Hl細胞系人ES細胞還經過0. 5ng/ ml細胞滲透形式的Mio抑制劑C3外轉移酶處理，這也可提高細胞接種效率。雖然接種于10 μ M Υ-27632中的細胞可在接種后4天傳代，但無ROCK抑制劑情況 下接種的細胞在接種后4天仍不能分離。用Mio抑制劑C 3外轉移酶處理的細胞在接種后 4天仍不能傳代，并且細胞表現出更趨向于分化為類成纖維細胞形態(tài)。因此，在第4代時經 Rho抑制劑處理的細胞的所有后代均用Υ-27632進行處理(圖3)。細胞在表面改性培養(yǎng)板3和4上進一步傳代至至少10代并檢測多能性相關標記 物的存在qRT_PCR檢測基因；流式細胞術檢測細胞表面標記物的表達；以及免疫熒光法檢 測細胞表面和核蛋白(圖4-6)。通過檢測細胞分化為定形內胚層、胰內胚層以及形成由三 胚層構成的胚狀體的能力來確定細胞的多能性(圖7-9)。還檢測了細胞的核型穩(wěn)定性，我 們觀察到細胞可保持正常核型(圖10)。實例5I^h0激酶抑制對人胚胎干細胞粘附和分離的影響細胞系H9的人ES細胞，至第40代時維持于Nunclon Delta 培養(yǎng)板上的MEF條件培養(yǎng)基中，在研究之前該培養(yǎng)板經低生長因子Matrigel 的1 30稀釋液處理。通過 lmg/ml膠原酶分離或人工刮取，將細胞從表面分離以進行傳代。然后將這些細胞接種于含有增加量的以下Iih0激酶抑制劑之一的表面改性培養(yǎng) 板 2、3、4 和 13(12 孔格式)上Y-27632(得自 Sigma(St. Louis，M0)或 EMD(San Diego, CA))、法舒地爾(Sigma)或羥基法舒地爾(Sigma)，并維持3天，每天更換培養(yǎng)基和化合物。 在第三天結束時，去除培養(yǎng)基并用結晶紫(0.5%的水溶液)染色培養(yǎng)板以觀察集落。我們觀察到第三天，在含有增加量的Iih0激酶抑制劑的表面改性培養(yǎng)板2、3、4和 13上有粘附的ES細胞集落。通過使用Υ-27632(10μΜ)能獲得最佳結果，盡管某些集落在 存在Mio激酶抑制劑、法舒地爾以及羥基法舒地爾情況下可觀察到粘附和生長(圖11)。通過在培養(yǎng)第一天用一系列接種濃度的Υ-27632處理細胞，我們試圖檢測 Υ-27632的最佳劑量以促進細胞結合。培養(yǎng)第一天后，在隨后的時間里用ΙΟμΜ濃度的 Υ-27632處理細胞。我們觀察到促進ES細胞粘附和生長的最大濃度為10 μ M(圖12)，并且 這種情況出現在表面改性培養(yǎng)板2、3、4、13和Cel 1BIND (Corning(Corning，NY))上。還檢測了使用單一劑量Υ-27632連續(xù)處理細胞對粘附和生長的影響。該細胞分 別用0、1、4或10 μ M的Υ-27632處理4天。在未處理(0 μ Μ)的表面改性培養(yǎng)板上觀察到 一些結合，而在表面改性培養(yǎng)板2、3、4、13上，促進ES細胞粘附和生長的最佳濃度為10 μ M Y-27632 (表 4)。因為相對于未處理的細胞(圖1 來說，添加ROCK抑制劑在表面改性培養(yǎng)板2、 3和4上顯著增強接種和生長動力學，我們希望能確定這是由于恰當的細胞粘附的保持還 是由于提高的細胞增殖而引起的。我們觀察到Mio激酶抑制并不提高細胞增殖，因為用 Y-27632處理的細胞同未處理細胞的生長密度相似(圖14)。相反，Y-27632處理能保持細 胞粘附于表面并允許其以正常增殖動力學生長(圖15)。從ES細胞接種的含有Mio激酶抑 制劑的生長培養(yǎng)基中去除Mio激酶抑制劑，可導致細胞從表面分離。通過在懸浮液中培養(yǎng) ES細胞來實現分化為3胚細胞系的胚狀體形成。因此，雖然如預期一樣隨后重新使用Mio 激酶抑制劑能恢復細胞的粘附(圖15)，但在樣品中觀察到ES細胞培養(yǎng)物的大量分化，其 中樣品經過如下處理將Mio激酶抑制劑去除后培養(yǎng)M小時，使細胞分離、生長于懸浮液中 24小時，再重新使用Iih0激酶抑制劑。實例6使用I~rypLEa Express傳代的H9人ES細胞在Y-27632處理時在表面改性培養(yǎng)板 上旱現改善的粘附件H9人ES細胞在表面改性培養(yǎng)板上的初始傳代。使用10 μ M Y-27632連續(xù)處理可 促進粘附。四種表面改性培養(yǎng)板2、3、4和13是如此的。Η9細胞接種于表面3上M小時 后的圖像示于圖16中。實例7使用TirpLEia Express傳代的H9人胚胎干細胞單細胞在表面改性培養(yǎng)板上保持 多能件人ES細胞是多能性的并能夠分化為所有細胞系。細胞的多能狀態(tài)必須由其上生 長細胞的表面來保持。為了檢測表面改性培養(yǎng)板是否能保持人ES細胞多能性，用膠原酶將 人ES細胞傳代38次以及用TrypLE Express傳代38次，然后在表面改性培養(yǎng)板3 (表面3)、表面改性培養(yǎng)板4(表面4)或以1 30稀釋的Matrigel 上傳代5次。將10 μ M的 Υ-27632加入指示樣品的培養(yǎng)基。使用流式細胞術評估多能性標記物Tra-l-60、Tra-l-81、 SSEA-3和SSEA-4的表達。結果示于圖17中。陽性細胞的百分比示于y軸。生長于表面改 性培養(yǎng)板3和4上的人ES細胞單細胞可保持其多能性。實例8Rho激酶抑制可促講來自人胚胎干細胞系H9的細胞的粘附和牛長，這㈣細胞從 Matrigel"中轉移到表面牛培養(yǎng)板卜.時以單細胞,形式牛長研究了 Y-27632在人ES細胞粘附和細胞生長方面的作用與表面改性培養(yǎng)板的相 關性。用膠原酶將H9人ES細胞傳代38次，并用TirpLETMEXpresS傳代50次，然后接種于 表面改性培養(yǎng)板3或4上(初始細胞)。作為另外一種選擇，用膠原酶將H9人ES細胞傳代 38次，并用TripleExpress傳代38次，然后在表面改性培養(yǎng)板3 (表面3，適應細胞)，或表 面改性培養(yǎng)板4 (表面4，適應細胞)上傳代9次。細胞以IOVcm2的密度，在含或不含10 μ M Y-27632的條件下接種于MEF條件培養(yǎng)基中并生長兩天。結果示于圖18中。Y-27632促進 了初始細胞對表面改性培養(yǎng)板3和4的粘附。Y-27632不促進適應細胞對表面改性培養(yǎng)板 3和4的粘附。表面改性培養(yǎng)板3促進了初始細胞的粘附和/或生長。表面改性培養(yǎng)板4 促進了適應的人ES細胞的粘附和/或生長。這些細胞經過總共4天的跟蹤觀察(圖19和 20)。在用ΙΟμΜ的Y-27632于表面改性培養(yǎng)板3上培養(yǎng)時，初始單細胞呈現增加的生長 率，顯示出微弱優(yōu)勢(圖19)。適應的單細胞呈現增加的生長率，不需ΙΟμΜ的Υ-27632(圖 20)。實例9表面改性培養(yǎng)板可用于篩選化合物96孔構型和分子生物篩選協(xié)會(SBQ標準形式的表面改性培養(yǎng)板可用于在存在 10 μ M Y-27632的情況下培養(yǎng)單人胚胎干細胞。接種在96孔板的微孔中的H9單細胞的圖 像如圖21中所示。這允許直接在96孔板中進行化合物的篩選而不會妨礙細胞或吸附層， 例如分別為小鼠胚胎成纖維細胞或Matrigel 。實例10培養(yǎng)于表面改件培養(yǎng)板上的單胚胎干細胞能夠分化成定形內胚層—個目標是將人胚胎干細胞分化成不同的細胞系。為了確定表面改性培養(yǎng)板能否 支持分化，將人胚胎干細胞用膠原酶傳代38次以及用TrypLETMEXpresS傳代38次，接下來 在表面改性培養(yǎng)板3 (表面幻或表面改性培養(yǎng)板4 (表面4)上傳代9次。作為陽性對照， 讓人胚胎干細胞在MatrigelTMl 30稀釋液中生長。在指明的細胞樣品的擴增過程中向培 養(yǎng)基中添加ΙΟμΜ Y-27632。細胞擴增后，評估培養(yǎng)的細胞形成定形內胚層的能力。簡而言 之，將70%匯合度的培養(yǎng)物用含有l(wèi)OOng/ml激活素A、10ng/ml Wnt 3a以及0. 5% FBS的 DMEM-F12培養(yǎng)基處理兩天。處理后用含有100ng/ml激活素A以及2% FBS的DMEM/F12處 理3天。通過流式細胞術由CXCR4蛋白的表達水平鑒定分化成定形內胚層的細胞(圖22)。 陽性細胞的百分比在y軸上表示。以單細胞培養(yǎng)的人胚胎干細胞在存在或不存在Y-27632 的情況下可在表面改性培養(yǎng)板3和4上分化成定形內胚層。實例11在表面改件培養(yǎng)板上培養(yǎng)的單胚胎干細胞能夠分化成胰腺內胚層
在完成定形內胚層方案之后，將細胞在含有FGF-7(50ng/ml ；R&DSystems)、音猬 因子抑制劑、KAAD環(huán)巴胺(2. 5 μ M ；Sigma-Aldrich)以及2% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中孵 育3天。這時候，擴增過程中未用Y-27632處理的細胞與表面改性培養(yǎng)板3和4分離。將在 擴增過程中用Y-27632處理過的細胞在含有FGF-7 (50ng/ml)、KAAD環(huán)巴胺(2. 5 μ Μ)、視黃 酸(lyM;Sigma-Aldrich)以及 1 % B27 (Invitrogen)的 DMEM-F12 中再孵育四天(后方前 腸期，PF)。這段時間后，將細胞在含有 Exendin 4 (50ng/ml ；Sigma-AIdrich)、DAPT (1 μ M ； Calbiochem)以及1 % Β27的DMEM-F12中再孵育四天。分化持續(xù)至胰腺內胚層期(EN)。這 需要使用含 50ng/ml HGF、IGF(R&D Systems)以及 Exendin 4(50ng/ml)和 1%B27 的 CMRL 培養(yǎng)基(Invitrogen)處理三天。在PF和EN期從表面改性培養(yǎng)板3和4的一個孔中采集 RNA樣本。然后，在此步驟，將這些樣本通過實時PCR分析胰腺標記物Pdxl、Nkx6. l、Nkx2. 2、 Pax4、NeuroD, HNF3b、Ptfla、胰島素以及AFP。在這段時期重復評估相同的胰腺內胚層標 記物。將從相同細胞系未處理的人胚胎干細胞獲得的RNA樣本進行實時PCR分析，與處理 過的樣本作為平行對照。將處理過的樣本歸一化到設為1倍變化的未處理對照樣本。監(jiān)測 Pdxl和胰島素表達并在表面改性培養(yǎng)板之間進行比較。從表面改性培養(yǎng)板3和4上處理的細胞中觀察到了胰腺內胚層標記物的誘導，然 而在表面改性培養(yǎng)板3上處理的細胞表達量更高(圖23)。在擴增期間在存在Y-27632的 情況下兩種表面改性培養(yǎng)板均能支持單人胚胎干細胞向后方前腸和胰腺內胚層分化，而在 擴增時間未用Y-27632處理的單細胞在后前腸分化前分離。實例12Hl和H9人胚胎干細胞,粘附到表面牛培養(yǎng)板卜.并誦過用Y-27632處理細朐而 曾 強粘附將之前接種到用1 30 Matrigel 處理過的塑料器皿上并在添加了 8ng/ml bFGF 的MEF條件培養(yǎng)基中生長的第49代H9人胚胎干細胞用LIBERASE處理，并接種到表面改 性培養(yǎng)板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中，不進行其他處理或添加更高濃度的 Y-27632。我們觀察到，在將H9人胚胎干細胞接種到表面改性培養(yǎng)板后M小時和48小時， 在表面 2-4 和 13、CellBIND 以及 Primaria (目錄號 353846，BectonDickinson，Franklin Lakes, NJ)上通過結晶紫染色可觀察到小型集落(圖M_26)。此外，通過添加Y-27632改 善了 H9人胚胎干細胞集落的粘附，這一影響具有劑量反應關系(圖25)。相對于未處理的 人胚胎干細胞，在人胚胎干細胞粘附方面，低濃度的Y-27632 (1至2微摩爾)顯示出極微的 改善(圖25)，而較高濃度的Y-27632 (4至20微摩爾)促進了人胚胎干細胞與表面改性培 養(yǎng)板的粘附(通過結晶紫染色測量)(圖25和26)。除了通過向細胞培養(yǎng)基中添加Y-27632對人胚胎干細胞粘附進行動態(tài)調節(jié)外，我 們還觀察到在存在Y-27632的情況下人胚胎干細胞對各種表面改性塑料制品具有不同的 粘附率。例如，即使在存在持續(xù)的Y-27632處理的情況下，細胞也較少粘附到CellBIND 培 養(yǎng)板上并隨著時間的推移極可能與CellBIND 培養(yǎng)板分離，而在用他0激酶抑制劑Y-27632 處理時，細胞更多地粘附到表面改性培養(yǎng)板3、4、13或I^imaria 上且不大可能與之分離 (圖 25 禾口 26)。實例13在存在Y-27632的情況下來自人胚胎干細胞系Hl和H9的細胞以不同的比率在表
將之前接種到用1 30MatrigelTM處理過的塑料器皿上并在添加了 8ng/ml bFGF 的MEF條件培養(yǎng)基中生長的Hl和H9人胚胎干細胞用LIBERASE處理，并接種到表面改性 培養(yǎng)板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中，不進行其他處理或添加20微摩爾的 Y-27632。在將H9人胚胎干細胞接種到表面改性培養(yǎng)板14和15后48小時，在添加了 20 微摩爾Y-27632的培養(yǎng)基中觀察到了小型集落(粘附和集落形成在各實驗之間不同)(圖 27)。Hl人胚胎干細胞還在表面14和15上添加了 20微摩爾Y-27632的培養(yǎng)基中粘附并形 成集落，并且這比對H9人胚胎干細胞觀察到的結合更普遍。這些數據表明人胚胎干細胞在 固體基底表面上的粘附和集落形成存在細胞系間變化性。實例14人胚胎干細胞粘附到使用限定培養(yǎng)基的表面改件培養(yǎng)板上將第49代H9人胚胎干細胞在限定培養(yǎng)基mTeSR 中于Matrigel 處理過的塑料 器皿上傳代2次。然后將細胞用LIBERASE處理并接種到表面改性培養(yǎng)板Nunc4上mTeSR 培養(yǎng)基中。將細胞接種在含有或不含20微摩爾Y-27632的培養(yǎng)基中。在接種細胞之前還 將微孔用各種蛋白處理30分鐘(無處理、0. 明膠、2% BSA、.3%ig/ml大鼠I型膠原、 1 lOOOMatrigel 或1 5000MatrigelTM)，以測定這些蛋白是否可以促進人胚胎干細胞 在含有或不含Y-27632的限定培養(yǎng)基中的粘附(圖觀)。我們觀察到，在不存在Y-27632的 情況下，接種到表面改性培養(yǎng)板的限定培養(yǎng)基中的人胚胎干細胞即使在存在細胞外基質蛋 白(如I型膠原或1 lOOOMatrigel )的情況下仍不粘附。然而，向限定培養(yǎng)基mTeSR 中加入20微摩爾Y-27632時，人胚胎干細胞粘附到表面Nimc4上。此外，這種粘附在未處理 的孔中以及用0. 明膠、2% BSA和0. 34mg/ml大鼠I型膠原處理過的孔中是相當的。在 含有低濃度Matrigel (1 1000和1 5000稀釋比)的微孔中，人胚胎干細胞的粘附小 幅增加，然而這些濃度的Matrigel 均不足以在不含Y-27632的情況下促進細胞粘附。這 些結果表明在存在ROCK抑制劑Y-27632的情況下，人胚胎干細胞可在表面改性培養(yǎng)板上的 限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且大約1 1000或1 5000的低濃度Matrigel 即可改善這種粘 附。實例15培養(yǎng)瓶形式的表面改性培養(yǎng)板可促進人胚胎干細胞的粘附以及向定形內胚層和 胰腺內胚層的分化將之前接種到用1 30 Matrigel 處理過的塑料器皿上并在添加了 8ng/ml bFGF 的MEF條件培養(yǎng)基中生長的Hl和H9人胚胎干細胞用LIBERASE處理，并按1 2或1 3 的接種密度接種到具有改性表面的各種尺寸的培養(yǎng)瓶T25、T75、T150和T175上。將細胞 接種到添加了 8ng/mlbFGF和20微摩爾Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基中。然后讓人胚胎干細 胞集落生長，每日更換添加了 8ng/ml bFGF和20微摩爾Y-27632的MEF條件培養(yǎng)基，直到 平板達到大約50%的匯合度。這時將培養(yǎng)基換成含有2% BSAU00ng/ml激活素A、20ng/ ml Wnt3a以及20微摩爾Y-27632的DMEM/F12培養(yǎng)基，將細胞在這種培養(yǎng)基中保持2天并 每日更換培養(yǎng)基。在第3天和第4天，將培養(yǎng)基換成含有2% BSAU00ng/ml激活素A以及 20微摩爾Y-27632的DMEM/F12培養(yǎng)基。然后用TrypLE讓細胞與表面分離，并通過流式細 胞術分析定形內胚層(DE)表面標記物CXCR4的表達。我們觀察到，在這些條件下，人胚胎干細胞分化成高CXCR4陽性群體，CXCR4+高達幾乎90%，表明細胞大部分都分化成了定形 內胚層(表5)。此外，由于從培養(yǎng)基中除去Y-27632導致了細胞與塑料表面分離，因此在細 胞生長或分化期間細胞與培養(yǎng)表面的粘附依賴于ROCK抑制的維持。我們希望確定由從培養(yǎng)瓶形式的表面改性培養(yǎng)板上獲得的定形內胚層能否形成 胰腺內胚層。為此，我們用含有Y-27632 (20微摩爾)、FGF-7 (50ng/ml)、KAAD環(huán)巴胺(2. 5 微摩爾)以及B27 (Invitrogen)的DMEM-F12培養(yǎng)基將細胞再孵育四天，然后在該培養(yǎng) 基中添加視黃酸(1微摩爾，Sigma-Aldrich)繼續(xù)孵育四天，將細胞分化到胰腺內胚層期。 采集RNA樣本并通過實時PCR分析胰腺標記物Pdxl。將處理過的樣本歸一化到設為1倍變 化的未處理的對照樣本。我們觀察到相對于未分化的人胚胎干細胞，樣本中PDXl的水平升 高，分化細胞中的mRNA水平至少比未分化的人胚胎干細胞細胞中觀察到的相應水平高256 倍。實例16表面處理以及表面改件培養(yǎng)板通過用電暈等離子體或微波等離子體處理注射成型件來制備表面改性培養(yǎng)板 (表6)。用于注射成型的聚合材料為聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚碳酸酯與聚苯乙烯的共混物、 以及環(huán)狀烯烴共聚物。將表面改性培養(yǎng)板單個包裝在塑料袋中，然后通過Y照射(25kGy) 滅菌，最后保存在室溫下直到用于細胞培養(yǎng)或表面表征實驗。分別使用與表面改性培養(yǎng)板 19、33和34相同的聚合材料模制表面改性培養(yǎng)板18、30和31-32，但不進行等離子體處理。 表面14和31不進行γ照射處理。電暈等離子體處理在僅有一個電極的金屬真空室內進行，電極處于室內并與室內 電絕緣(C-Lab Plasma ；Vetaphone A/S，Denmark)。金屬壁作為反電極(接地)。自調電暈 發(fā)生器產生電場，提供充足的能量以在整個真空室內產生等離子體。將待處理的工件放置 在真空室的底部。關閉真空室并排空至10_2毫巴的壓力。在此壓力下，將通向真空泵的閥 關閉，啟用電暈發(fā)生器。設定發(fā)生器以產生2000W的輸出功率。激勵等離子體5至60秒。 然后打開進氣閥(空氣)，將室內壓力恢復至大氣壓。微波等離子體處理在石英真空室(300-E型，用于表面改性培養(yǎng)板5-12 ；440型，用 于表面改性培養(yǎng)板14和15 ；二者均得自^Technics PlasmaGmbH,Germany)中進行。生成等 離子體的能量由室外的2. 43GHz微波發(fā)生器提供。將待處理的工件放在室內的玻璃板上。 關閉真空室并排空至0. 3到0. 5毫巴之間的壓力。讓通向真空泵的閥門保持打開，通過用 進氣閥調節(jié)氣流(空氣或氧氣)使壓力維持在所需值。然后啟用微波發(fā)生器。設定發(fā)生器 以產生500或600W的輸出功率。然后關閉泵閥，打開進氣閥，使室內壓力升至大氣壓。表6示出了通過電暈等離子體或微波等離子體制備表面改性培養(yǎng)板時使用的功 率、時間、壓力和氣體。實例17^mm^mm.mmm^^水接觸角將表面改性培養(yǎng)板1-4和13單個包裝在塑料袋中、滅菌并在整個測試周期內保存 在室溫下。在表面處理和滅菌后一周進行第一次接觸角測量，然后在如圖四中給出的時間 點再次進行測量。所有接觸角測量均使用靜止液滴法以及得自FIBRO Systems AB(Sweden)的PG-X測量頭(由攝像機和計算機軟件(v. 3. 1)組成的測角計)進行。使用正切傾斜 (tangent leaning)法計算接觸角。根據制造商說明，在靜態(tài)模式下使用自動滴加程序滴加 4. 0 μ L MilliQ水滴。每滴的接觸角測量一次(每個時間點向每個樣本滴7滴)。對于每個 時間點，使用新樣本以避免前面的測量帶來的任何影響。Nimclon Delta 和CellBIND 表 面上的測量在與表面1-4和13上的測量相同的實驗條件下進行，但表面處理和滅菌的完成 時間在第一次測量前不止12周(Nunclon Delta *在第一次測量前一周滅菌)。圖四示出 了表面改性培養(yǎng)板1-4和13具有相似的親水性，且親水性高于(較低的水接觸角)Nunclon Delta 和CellBIND 表面。表面改性培養(yǎng)板1_4和13的親水性在表面處理和滅菌后可穩(wěn) 定至少12周。以前有文獻提到CellBIND 具有13. 4度的接觸角G度的標準偏差)(Corning Technical Report (2005), Corning CellBIND Surface :AnImproved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1) (Corning 技術報告(2005)，Corning CellBIND 表面一種用于增強細胞粘附的改良表面(CLS-AN-057REV1))，見于http:// catalog2. corning. com/Lifesciences/media/pdf/t_CelIBIND_Improved_Surface_CLS_ AN_057. pdf)。負電荷密度測定了表面改性培養(yǎng)板1-4和13、Nunclon Delta 表面、CellBIND 表面、 Primaria 表面、Falcon 表面以及未經處理(但經過滅菌)的聚苯乙烯表面(全部為3cm 培養(yǎng)皿的形式)上的負電荷密度。將3ml結晶紫水溶液(0.015%W/v)分配到每個培養(yǎng)皿 中，然后將培養(yǎng)皿在室溫和輕搖(50rpm)下孵育60分鐘。為了去除未結合到表面上的結晶 紫，將培養(yǎng)皿用:3ml MilliQ水洗滌三次，然后在60°C下過夜干燥。通過加入1.5ml 0. IM的 溶于乙醇溶液(99% )的HC1，并在室溫和輕搖(50rpm)下將培養(yǎng)皿孵育2分鐘，以解吸結 合到表面上的結晶紫。使用EnVision 2100微板讀數器(Perkin Elmer ；ffaltham,MA,USA) 在590nm處測定含有解吸結晶紫的HCl JtOH溶液的吸光度。校正吸光度值，去除HCl JtOH 溶液的背景吸光度。每種表面測量三個培養(yǎng)皿的負電荷密度，對每個培養(yǎng)皿重復測量三次 吸光度。表面改性培養(yǎng)板的負電荷密度如圖30所示。表面1-4和13的負電荷密度相似，但 較長的表面處理時間(以5-60秒的間隔)往往導致較低的表面負電荷密度。表面1-4和 13相對于CellBIND 表面和2007年處理的Nunclon Delta 表面具有明顯更低的負電荷密 度。表面1-4和13具有與2005年處理的Nunclon Delta 表面相同水平的負電荷密度，而 且其負電荷密度明顯高于Primaria 表面、Falcon 表面和未處理(但經過滅菌)的聚苯 乙烯表面。2005年處理的Nunclon Delta 表面的負電荷密度低于2007年處理的Nunclon Delta 表面，表明經表面處理的聚苯乙烯的負電荷隨時間略有減少。CellBIND 的高水平 負電荷密度不是由較高的表面粗糙度和表面積引起的(參見本實例中的AFM分析)。X射線光電子能譜(XPS)使用XPS對表面改性培養(yǎng)板1-4和13-15以及具有Nunclon Delta 、Costar 、 Falcon , CellBIND 和I^imaria 表面的培養(yǎng)板進行分析。通過從培養(yǎng)板上切片并將其 用彈簧夾固定在不銹鋼樣本夾持器上將樣本置于X射線源下。使用Alk α輻射照射樣本 (1486eV)。樣本與分析儀呈45°度角進行分析。使用由儀器供應商Wiysical Electronics提供的軟件包對光譜進行曲線擬合。軟件采用市售的Matlab 例程以用于數據處理。用于 分析的儀器為Wiysical Electronics MOO型X射線光電子能譜儀。在每種表面的兩個培 養(yǎng)板的每一個中，對培養(yǎng)板的表面處理部分直徑約1毫米的區(qū)域中最外層的2至5納米深 度進行分析。以原子百分比為單位的表面元素組成如表7中所示。所有表面改性培養(yǎng)板的表面 均含有碳、氧和氮(在XPS中不檢測氫)。表面1-4、表面13以及CellBIND 表面比其他分 析表面含有更多的氧。表面1-4和表面13-15比Primaria 含有更少的氮，但比Nunclon Delta , Costar ,Falcon 以及CellBIND 培養(yǎng)板的表面含有更多的氮。氧和氮含量與較 長的表面處理時間正相關(表面1-4和13)，使用30或60秒電暈等離子體處理(分別為表 面3和表面4)得到了這兩種元素的最高水平。表面3和4的元素組成相似。表面2和13 的元素組成相似，并且相對于表面1的元素組成來說其更類似于表面3和4。為了鑒定和定量表面中碳的鍵合環(huán)境，通過使用可在文獻中找到的物質的峰寬和 能級對Cls譜峰進行曲線擬合(最佳卡方擬合)(表8)。濃度以原子百分數為單位進行記 錄，其通過原子濃度與面積百分數相乘得到。表面2-4和13在碳鍵合環(huán)境方面相似。表 面2-4和13中C*-C-0-C-C*鍵合環(huán)境的碳比例要低于其他分析表面。表面2-4和13中 0-[C = 0]-0鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。還鑒定了表面2-4和13以及表 面1、CellBIND 表面和/或Primaria 表面之間的相似性。表面1-4和13中C-O-C或 C-NH3+鍵合環(huán)境(光譜中能級相同)的碳比例要高于其他分析表面。表面2-4、表面13以 及I^rimaria 表面中C_0_C* = 0鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。表面2_4、表面 13以及CellBIND 表面中CO3鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。表面1_4、表面13 以及CeLLBIND 表面中C = 0鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。表面1_4、表面13、 CellBIND 表面以及I^imaria 表面中C_
_C鍵合環(huán)境的碳比例要高于其他分析表面。 能量損失峰由芳族Π —Π *躍遷產生，是表面芳香性的指示。Ols譜峰幾乎為高斯型，不能進行曲線擬合。為了鑒定和定量表面中氮的鍵合環(huán) 境，通過使用可在文獻中找到的物質的峰寬和能級對Nls譜峰進行曲線擬合(最佳卡方擬 合)(表9)。濃度以原子百分數為單位進行記錄，其通過原子濃度與面積百分數相乘得到。 從Nunclon Delta 、CellBIND 、Costar 以及i^alcon 表面獲得的Nls信號較弱，因此不 可能對這些表面中的氮進行鍵合環(huán)境鑒定。表面改性培養(yǎng)板1-4和13的Nls光譜難以區(qū) 別，示出了由兩個代表性Nls光譜的曲線擬合產生的數據。表面1-4和13在-NH3+鍵合環(huán) 境中的氮比例要高于表面14、15和I^rimaria 表面。-NH2鍵合環(huán)境中的氮僅在表面14和 15以及Primaria 表面中檢出。-NO2鍵合環(huán)境中的氮僅在表面1_4和13中以及在表面15 的一個樣本中檢出。-NO3鍵合環(huán)境中的氮僅在表面15和I^rimaria 表面中檢出。CellBIND 之前被描述為通過ESCA分析具有70. 4 %碳、29. 0 %氧、0. 6 %氮和 <0.01%其他元素的元素組成，以及相對高濃度的C-
-C、C = 0和C00H/R基團(Corning Technical Report (2005), Corning Cel 1BIND Surface :An Improved Surface for Enhanced Cell Attachment (CLS-AN-057 REV1) (Corning 技術報告(2005)，Corning CellBIND 表面一種用于增強細胞粘附的改良表面(CLS-AN-057REV1))，見于http:// catalog2. corning. com/Lifesciences/media/pdf/t_CelIBIND_Improved_Surface_CLS_ AN_057. pdf)。
PrimariaTM之前被描述為通過ESCA分析具有74.6%碳、14.1%氧、ll.l%氮和 0.2%其他元素的元素組成，主要具有腈(Cen)和脲[HN(C = O)NH]碳-氮鍵合環(huán)境。原子力顯微鏡(AFM)使用AFM對表面改性培養(yǎng)板1-4和13以及具有Nunclon Delta 和CellBIND 表 面的培養(yǎng)板進行分析。使用Digital Instruments多模式原子力顯微鏡以輕敲模式對樣本 進行分析。所用探針為TESP7型輕敲模式探針。將樣本用雙面膠帶粘附到樣本盤上。分析 培養(yǎng)板表面處理部分的10 μ mX 10 μ m和500nmX500nm區(qū)域。以納米為單位的表面平均粗 糙度(Ra)和最大高度(Rmax)如表10中所示。像具有Nunclon Delta 和CellBIND 表面 的培養(yǎng)板一樣，表面改性培養(yǎng)板1-4和13相對光滑，并且在兩種掃描的任一種中Ra和Rmax 都不與表面處理時間相關。旨在用于細胞培養(yǎng)的未處理的聚苯乙烯和氧化聚苯乙烯表面 以及Primaria 表面的分析已由Shen和Horbett進行過描述(J. Biomed. Mater. Res. 57 336-345,2001)所有三種表面的表面粗糙度約為4nm。實例18與人胚胎干細胞粘附和集落形成相關的表面元素組成和接觸角表面元素組成的XPS分析、表面接觸角測量以及人胚胎干細胞粘附和集落形成實 驗的結果匯總在表11中給出。在不存在能夠抑制Iiho或Iiho激酶的化合物的情況下，僅在表面改性培養(yǎng)板2-4 和13、CellBIND 培養(yǎng)板和Primaria 培養(yǎng)板上觀察到了人胚胎干細胞粘附到固體基底表 面上并在其上形成集落(每IOcm2表面至少15個集落)(細胞以細胞群懸浮液的形式存在 于表面上)。表面改性培養(yǎng)板2-4和13支持細胞粘附、集落形成和傳代。經過大約三次傳 代后，人胚胎干細胞在表面改性培養(yǎng)板2-4和13上的生長速率自發(fā)下降(僅在不存在Mio 抑制和Iih0激酶抑制的情況下)，然而細胞形態(tài)表明細胞尚未分化。此外，對于在表面3上 傳代4次的細胞，保持了多能標記物的表達。CellBIND 培養(yǎng)板支持人胚胎干細胞的粘附和 集落形成，但在第一次傳代前觀察到了細胞的分化?；趯毎螒B(tài)的觀察，Primaria 培 養(yǎng)板支持人胚胎干細胞的粘附和集落形成，無分化信號(未檢測傳代)。表面的氧(例如， 表面2與表面14對比)和氮(例如，Primaria 與Costar 對比；以及表面2和表面13與 CellBIND 對比)含量對于在不存在Mio抑制和Mio激酶抑制的情況下表面支持人胚胎干 細胞粘附和集落形成的能力均有影響。含有至少約0.9%的氮、氮和氧含量的總和為至少約 22. 3%以及水接觸角為至少約13. 9度的表面在不存在Mio抑制和Mio激酶抑制的情況下 支持人胚胎干細胞的粘附和集落形成。在存在能夠抑制Iiho或Iih0激酶的化合物的情況下，在表面改性培養(yǎng)板1-15、表面 改性培養(yǎng)板19、表面改性培養(yǎng)板33、表面改性培養(yǎng)板34、CellBIND 和I^imaria 上觀察到 了人胚胎干細胞粘附到固體基底表面上并在其上形成集落(每IOcm2表面至少15個集落) (細胞以細胞群懸浮液的形式存在于表面上)。我們注意到，在促進人胚胎干細胞粘附和 集落形成方面，表面2-4和13以及Primaria 要優(yōu)于表面1、19、33和34以及CellBIND ， 后者又優(yōu)于表面5-12、14和15。在表面改性培養(yǎng)板3和4上，并在存在Iih0激酶抑制劑 的情況下，人胚胎干細胞粘附并形成擴增且可傳代至少十次的集落，從而產生具有正常核 型的多能細胞(僅對在表面4上生長的細胞檢測了核型)。表面的氧(例如，CellBIND 與NuncIonDelta 對比)和氮(例如，Primaria 與Costar 對比；以及表面2禾口 13與CellBIND 對比)含量對于在存在Mio激酶抑制的情況下表面支持人胚胎干細胞粘附和集 落形成的能力均有影響。含有至少約0.5%的氮、氮和氧含量的總和為至少約17. 2%以及 水接觸角為至少約13. 9度的表面在存在Mio激酶抑制的情況下支持人胚胎干細胞的粘附 和集落形成。含有至少約0. 5%的氮、氮和氧含量的總和為至少約17. 3%但低于19. 9%以 及水接觸角為至少約9. 4度的表面在存在Mio激酶抑制的情況下，一些支持人胚胎干細胞 的粘附和集落形成(表面14)，另一些則不支持(表面22-24)。我們注意到，將他0激酶抑制劑從表面改性培養(yǎng)板4上培養(yǎng)的人胚胎干細胞培養(yǎng) 物中除去導致了人胚胎干細胞與固體基底表面分離。細胞可通過采用Mio激酶抑制劑重新 處理而重新粘附到表面上。假定人胚胎干細胞的酶消化法傳代是一種潛在的應激源，并可 導致核型不穩(wěn)定，那么采用在人胚胎干細胞傳代期間暫時移除MlO激酶抑制劑的方法，可 消除酶消化法傳代的應激。還采用了無動物成分培養(yǎng)基、Rho激酶抑制和表面改性培養(yǎng)板4來說明人胚胎干 細胞的粘附和集落形成。用細胞外基質蛋白對表面改性培養(yǎng)板4進行預處理得到了更多的 集落，但僅僅是在存在Mio激酶抑制的情況下。除了通過以集群傳代細胞來保持集落式培養(yǎng)條件的酶方法來傳代人胚胎干細胞 外，人胚胎干細胞還可使用像TrypLE 或Accutase 的酶以單細胞傳代。在存在或不存在 Rho激酶抑制劑的情況下，使用粘附到表面改性培養(yǎng)板3和4上的TrypLE 將人胚胎干細胞 集落解離成單細胞懸浮液，并形成可傳代至少5次的集落，產生具有多能性標記物的細胞。通過以單細胞懸浮液的形式傳代細胞制備的人胚胎干細胞培養(yǎng)物，從中除去Iih0 激酶抑制劑不會導致人胚胎干細胞與固體基底表面分離，但會導致集落比未除去Mio激酶 抑制劑時生長得更快。實例19用Y-27632處理促講HEK293細胞在表面改件培養(yǎng)板上的粘附將人胚腎細胞^3(HEK293，ECACC no. 85120602)保持在含10%胎牛血清(FBS ； Lonza)的fegle最低必需培養(yǎng)基(EMEM ；Lonza, Verviers, Belgium)中。讓細胞適應于 ft~0293a-CDM培養(yǎng)基(Lonza)，這是一種針對貼壁細胞HEK293的培養(yǎng)進行了優(yōu)化的化學成 分確定的無血清培養(yǎng)基，適應方法是采用順序比率為3 1、1 1、1 3、1 7及最終O 1 的含血清EMEM和ft~0293a-CDM培養(yǎng)基進行逐步的數次傳代。為了維持和適應，將HEK293細 胞按 2. OXlO4 個細胞 /cm2 的密度接種于 75-cm2 帶 Nunclon Delta 表面(Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)的培養(yǎng)瓶中，在達到70-80%的匯合度時采用胰蛋白酶/ 乙二胺四乙酸解離細胞以進行傳代。將按照1. 0,4. O 或 10 μ M 的濃度添加了 Y-27632 (Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)的PrM93a-CDM培養(yǎng)基(100 μ 1)分配到帶有表面4、Nunclon Delta 表面或CellBIND 表面的平底96孔板上。將另外的100 μ 1具有ΗΕΚ293細胞的ft~0293a-CDM培養(yǎng)基加到孔 中O X IO4個細胞/cm2)。然后將培養(yǎng)物在37°C下以及空氣中含5% CO2的潮濕氣氛中孵 育(i)96小時；或(ii) 48小時，接下來采用200 μ 1 Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS ；Lonza) 將培養(yǎng)物洗滌一次，然后添加200 μ 1無Υ-27632的ftx)293a-CDM培養(yǎng)基，最后將培養(yǎng)物再 孵育48小時。然后，使用得自Roche (Switzerland)的乳酸脫氫酶(LDH)活性試劑盒測定孔中的活細胞數。簡單地說，先用ft~0293a-CDM培養(yǎng)基洗滌孔，然后將貼壁細胞在100μ 1含有2% (v/v) Triton X-100 (Sigma Chemical Co)的 DPBS 中于 37°C下孵育 30 分鐘進行裂解。將 裂解物、100 μ 1催化劑和染料試劑混合物混合并在25°C暗處孵育30分鐘。通過加入50 μ 1 1. OM的HCl停止反應，然后采用微板讀數器(Genios Pro ；Tecan, Austria)在490nm處測 量吸光度。采用從這些樣品和標準品(含有得自已知數量的細胞的LDH)得到的A490值計 算細胞數。固體基底表面和Y-27632對ft~o293a-CDM培養(yǎng)基中的HEK293細胞的粘附和生長 的影響如圖31a所示，其中持續(xù)暴露于Y-2763296小時被標記為“Y_2763^^!接觸”，而持 續(xù)暴露于Y-2763248小時接下來改變培養(yǎng)基并在不含Y-27632的情況下孵育48小時被標 記為“Υ-2763Μ !接觸/4 不接觸”。在不存在Y-27632的情況下，HEK293細胞粘附到所 有三種表面上。孵育48小時后改變培養(yǎng)基導致了在96小時的孵育后測得的培養(yǎng)物中的細 胞數明顯更少。當以2. 0和5. 0 μ M的濃度應用時，Υ-27632促進了 ΗΕΚ293細胞在表面4 和CellBIND 表面上的粘附。孵育48小時后除去Y-27632導致了細胞與所有三種表面明 顯分離。進行了另一個類似的實驗，但采用2.0\104個未適應的冊1(293細胞/(^2的接 種密度，以及整個實驗均采用添加了 10% FBS的EMEM。固體基底表面和Y-27632對添加 了 10% FBS的EMEM中的HEK293細胞的粘附和生長的影響如圖31b所示，其中持續(xù)暴露于 Y-2763296小時被標記為“Y_2763^Mi接觸”，而持續(xù)暴露于Y-2763248小時接下來改變培 養(yǎng)基且在不含Y-27632的情況下孵育48小時被標記為“Υ-2763Μ !接觸/4 不接觸”。在 不存在Y-27632的情況下，HEK293細胞粘附到所有三種表面上。孵育48小時后改變培養(yǎng) 基導致了在96小時的孵育后測得的培養(yǎng)物中的細胞數明顯更少。當以2. 0和5. 0 μ M的濃 度應用時，Υ-27632促進了 ΗΕΚ293細胞在表面4和CellBIND 表面上的粘附。48小時的孵 育后除去Y-27632導致了細胞與表面4和CellBIND 明顯分離。實例20用Y-27632和H-1152處理促進HEK293細胞在表面改性培養(yǎng)板上的生長將HEK293 細胞保持在含 10 % FBS (Lonza)的 EMEM (Lonza)中。在達到 70-80 % 的 匯合度時采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解離細胞以進行傳代，按2. OX IO4個細胞/cm2的 接種密度接種到 75-cm2 帶 Nunclon Delta 表面(Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)的培養(yǎng)瓶中。將添加了10% FBS 且含有 1.0、5.0、10、15或2(^] Y-27632 (Sigma Chemical Co.)或者 0· 4、1· 2、1· 6、2· 4 或 2. 8 μ M Η-1152 (Calbiochem，EMD Chemicals Inc., Darmstadt, Germany)的EMEM(500 μ 1)分配到Multidish M孔板中，它們要么帶有表面4 要么帶有未處理的(但經、輻照，25kGy)聚苯乙烯表面。將另外500 μ 1添加了 10% FBS 且含有ΗΕΚ293細胞的EMEM加到孔中(2. OXlO4個細胞/cm2)。將培養(yǎng)物置于IncuCyte Plus (Essen Instruments, Michigan, USA)中，然后在 37°C下以及空氣中含 5% CO2 的潮濕 氣氛中孵育。hcuCyte Plus是一種自動成像平臺，被構造為安裝在CO2培養(yǎng)箱內，設計 為提供動力學、非侵入性活細胞成像，方法是在用戶定義的時間以及培養(yǎng)物中的位置采集 細胞的相襯圖像。儀器的主要度量指標是培養(yǎng)物匯合度，即被細胞覆蓋的表面的分數。將 HEK293細胞無操作孵育72小時，且每2小時在一式三份培養(yǎng)物的9個位置采集圖像。使用IncuCyte Plus軟件(v. 3. 4. 1. 25966)確定培養(yǎng)物匯合度。增加Y-27632和H-1152的濃度促進了 HEK293細胞在表面4上的粘附和生長(圖 32a)。未處理的細胞培養(yǎng)表面和Y-27632或H-1152對HEK293粘附和生長的影響如圖32b 所示。在存在10 μ M Y-27632和0.6-1. 2μ M H-1152的情況下，對ΗΕΚ293細胞的生長和粘 附略有促進。然而，與表面4相比，在未處理的細胞培養(yǎng)表面上，對HEK293細胞的生長和粘 附的促進不太顯著。實例21用H-1152處理促講HEK293細胞,的牛長和對表面牛培養(yǎng)板的粘附
將 HEK293 細胞保持在含有 10 % FBS (Lonza)的 EMEM (Lonza)中。在達到 70-80 % 的匯合度時采用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸解離細胞以進行傳代，并按2. OX IO4個細胞/cm2 的接種密度接種于 75-cm2 帶 NunclonDelta 表面(Thermo Fisher Scientif ic, Roskilde, Denmark)的培養(yǎng)瓶中。將添加了10 % FBS 且含有 0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. 0,2. 4 或 2. 8 μ MH-1152 的 EMEM(l.Oml)分配到帶有表面4的Multidish 12孔板中。將另外1.0ml添加了 10% FBS且 含有HEK293細胞的EMEM加到孔中0 X IO4個細胞/cm2)。將培養(yǎng)物置于hcuCyte Plus 中，在37°C下以及空氣中含5% CO2的潮濕氣氛中孵育42小時(每6小時采集一次圖像)。 然后通過移液移除Iml培養(yǎng)基，再加入1. Oml添加了 10% FBS且含有0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、 1. 0、1. 2和1. 4μΜ H-1152的EMEM。將培養(yǎng)物再次置于IncuCyte Plus中，然后在隨后的 25小時內每小時采集一次圖像。在一式三份培養(yǎng)物的9個位置采集圖像，使用hcuCyte Plus軟件確定培養(yǎng)物匯合度。檢索通過hcuCyte Plus在HEK293細胞培養(yǎng)物(在存在或 不存在Η-1152(0.6μΜ)的情況下生長)的特定位置采集到的圖像，并以相襯顯微圖示出， 用于比較以下時間點的ΗΕΚ293培養(yǎng)物形態(tài)孵育開始時(0小時)，臨近改變培養(yǎng)基前(42 小時)，改變培養(yǎng)基后1小時(43小時)，以及最后為孵育52小時后。在不存在Η-1152以及存在0. 2μΜ或0. 4μΜ Η-1152的情況下，孵育42小時后 改變50%的培養(yǎng)基導致了培養(yǎng)物匯合度的顯著降低(圖33a)。在存在0.64 11、0.84皿或 1.4μΜ H-1152的情況下，改變培養(yǎng)基造成的影響甚微。在存在H-1152的情況下生長在表 面4上的HEK293細胞對固體基底表面的覆蓋比在不存在H-1152的情況下生長在表面4上 的HEK293細胞更均勻(圖33b)。在不存在H-1152的情況下，HEK293細胞形成大型集群， 而在存在H-1152的情況下，HEK293細胞形成具有較低細胞密度的較小集群。實例22用Y-27632處理促進HEK293細胞在表面改性培養(yǎng)板上生長三代將添加了 10% FBS且含有5. ΟμΜ Υ-27632的EMEM (500 μ 1)分配到帶有表面4 或Nunclon Delta 表面的Multidish 24孔板的孔中。將另外500 μ 1添加了 10% FBS且 含有ΗΕΚ293細胞的EMEM加到孔O. 0X IO4個細胞/cm2)中，將培養(yǎng)物在37°C下以及空氣 中含5% CO2的潮濕氣氛中孵育3天。通過用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Lonz^Verviers， Belgium)在37°C下處理2分鐘讓細胞傳代，采用NucleoCount細胞計數器(ChemometecA/ S，Allerefd, Denmark)測定總細胞數。對于連續(xù)傳代，將HEK293細胞按2. OX IO4個細胞 /cm2的密度接種。HEK293細胞在表面4和NunclonDelta 表面上的生長因存在2. 5 μ M Y-27632 而增強(圖;34)。
實例23人胚胎干細胞的粘附、培養(yǎng)和維持，使用不含細胞外基質蛋白/成分和飼養(yǎng)細胞 的表面改件培養(yǎng)板4、18和19將保持在1 30MATRIGEL包被的塑料器皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng) 基中的第42代Hl人胚胎干細胞通過LIBERASE 酶處理分離，然后按1 2的稀釋比按接 種到表面改性96孔板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中。將細胞接種到改性表 面4、18或19或者I^rimaria 上。為了確定Iiho激酶抑制對細胞與改性表面結合的影響， 我們采用IOmMRho激酶抑制劑Y-27632或者3或IOmM Rho激酶抑制劑H-1152甘氨酰處理 細胞。未經處理的細胞作為對照。培養(yǎng)M小時后吸出微孔中的液體，干燥細胞，然后用結 晶紫對孔染色。我們觀察到，在培養(yǎng)M小時后，胚胎干細胞集落在用Mio激酶抑制劑處理時粘附 到表面改性培養(yǎng)板4和19及I^imaria 板上并展開，然而在表面改性培養(yǎng)板18上未觀察 到相同的效果(圖35)。實例24人胚胎干細胞的粘附、培養(yǎng)和維持，使用不含細胞外基質蛋白/成分和飼養(yǎng)細胞 的表面改件培養(yǎng)板30、31、32、33和34將保持在1 30MATRIGEL包被塑料器皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng) 基中的第47代Hl人胚胎干細胞通過TrypLE 酶處理分離，然后按1 3的稀釋比接種到 表面改性96孔板上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中。將細胞接種到改性表面30、 31、32、33或34上。為了確定Iiho激酶抑制對細胞與改性表面結合的影響，我們采用3mM Mio激酶抑制劑H-1152甘氨酰處理細胞。未經處理的細胞作為對照。另外，將細胞接種到 用Matrigel 預處理過的表面改性培養(yǎng)板的孔中。在接種M小時后，將培養(yǎng)基用新鮮的添 加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基更換，對于在存在Mio激酶抑制劑的情況下接種的細 胞，向培養(yǎng)基添加3mM H-1152甘氨酰。培養(yǎng)48小時后吸出微孔中的液體，干燥細胞，然后 用結晶紫對孔染色。我們觀察到，在培養(yǎng)48小時后，胚胎干細胞集落在用Mio激酶抑制劑處理時粘附 到表面改性培養(yǎng)板33和34上并展開(分別為圖39和40)，然而在表面改性培養(yǎng)板30、31 或32上未觀察到相同的效果(分別為圖36-40)。實例25人胚胎干細胞的粘附、培養(yǎng)和維持，使用不含細胞外基質蛋白/成分和飼養(yǎng)細胞 的表面改性培養(yǎng)板22、23、24或四將保持在1 30MATRIGEL包被塑料器皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基 中的第46代Hl人胚胎干細胞通過Liberase 酶處理分離，然后按1 3的稀釋比接種到 表面改性60mm培養(yǎng)皿上添加了 8ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中。將細胞接種到表面改 性培養(yǎng)板3、4、22、23、M和四上。為了確定Iiho激酶抑制對細胞與改性表面結合的影響， 我們用3 μ M他0激酶抑制劑Η-1152甘氨酰處理細胞以接種細胞。在接種細胞M小時后， 將培養(yǎng)基用新鮮的添加了 8ng/ml bFGF和ImM Rho激酶抑制劑H-1152甘氨酰的MEF條件 培養(yǎng)基更換。接種到改性表面3、4或matrigel 包被塑料上的細胞作為對照。接種M和 48小時后，通過相襯顯微鏡觀察培養(yǎng)板。我們觀察到，培養(yǎng)48小時后，胚胎干細胞集落未粘附到表面改性培養(yǎng)板22、23、M或四上，無論是在存在還是不存在Mio激酶抑制劑的情況 下接種，而在存在Mio激酶抑制劑的情況下接種到表面改性培養(yǎng)板3或4上的細胞則確實 發(fā)生了粘附和展開。實例26X寸絲日腺翻牛絲面睡一棘ffi水接觸角將表面改性培養(yǎng)板1-4和13分別包裝在塑料袋中、滅菌，在室溫下保存40周的 測試期。在表面處理和滅菌后一周首次測量接觸角，然后在如圖41給出的時間點再次測 量。所有接觸角測量均如實例17所述完成。對Nunclon Delta 和CellBIND 表面的測 量在與對表面1-4和13的測量相同的實驗條件下進行，但表面處理和滅菌的完成時間在第 一次測量前不止12周(Nuclon Delta *在第一次測量前一周滅菌)。圖41表明表面改性 培養(yǎng)板1-4和13具有相似的親水性且親水性高于(較低的水接觸角)Nunclon Delta 和 CellBIND 表面。表面改性培養(yǎng)板1_4和13的親水性在表面處理和滅菌后可穩(wěn)定至少41 周。還在表面改性培養(yǎng)板5-12、22-M、29、30和33上測量了接觸角，這些培養(yǎng)板包裝 在塑料袋中并如實例16所述滅菌，然后在室溫下保存了 9周(保存了觀周的表面改性培養(yǎng) 板四例外)。表面改性培養(yǎng)板18、19、32和34為單個微孔的形式，因此不能用于測量接觸 角。表面改性培養(yǎng)板30和33為微孔板格式，其接觸角測量在板的背后而非孔內進行。如實 例17所述測量接觸角(對于高親水表面改性培養(yǎng)板四，施加一小滴2. 5 μ IMilliQ水)，但 分析一式三份樣品，每個樣品施加7滴。對具有Costar 、Falcon , Primaria 和Nunclon Delta 表面的板的測量在同樣的實驗條件下進行，但表面處理和滅菌的完成時間在第一次 測量前不止12周。圖42示出了表面改性培養(yǎng)板5-12的親水性高于(較低的水接觸角) Nunclon Delta 、Costar 和Falcon 表面。表面5-12的親水性與Primaria 表面的親 水性相當，并高于表面1-4和13的親水性(如圖41所示)。表面改性培養(yǎng)板22- 和33 的親水性與表面1-4和13的親水性相當(如圖41所示)，而表面30的親水性與Nunclon DeltaTM、C0StarTM和hlcon 表面的親水性相當。表面改性培養(yǎng)板四比其他被分析的表面 親水性明顯更強。負電荷密度測定了表面改性培養(yǎng)板5-12(均為5 11培養(yǎng)皿形式)、18、19、30、32、33和34 (均 為微孔形式)、表面改性培養(yǎng)板22-M和四(均為6cm培養(yǎng)皿形式)、CellBIND 表面(3cm 培養(yǎng)皿形式)、Primaria 表面(multidish 6孔培養(yǎng)板形式)以及Nunclon Delta 表面 (3cm培養(yǎng)皿形式)上的負電荷密度。將過量的結晶紫水溶液(0.015%重量體積比)加入 每種形式中(培養(yǎng)皿形式中加入0. 3%il/cm2，微孔形式中加入0. 13ml/cm2)，并在輕微搖動 (50rpm)下于室溫孵育60分鐘。為了去除未與表面結合的結晶紫，用:3ml MilliQ水沖洗培 養(yǎng)皿形式的培養(yǎng)板3次，并用350 μ 1 MilliQ水沖洗微孔形式的培養(yǎng)板3次，然后在60°C下 干燥過夜。通過加入0. 17ml/cm2溶于KOH溶液(99% )的0. IM HCl來解吸與表面結合的 結晶紫，然后在輕微搖動(50rpm)下于室溫孵育培養(yǎng)板2分鐘。使用EnVision 2100微板讀 數器(Perkin Elmer ；WaItham，MA，USA)在590nm測定含有解吸的結晶紫的HCl JtOH溶液 的吸光度。校正吸光度值，去除HCl JtOH溶液的背景吸光度。對于表面改性培養(yǎng)板5-12、ZZj^^jellBINDTMjrimaria 和Nunclon Delta ，各測量三個板的負電荷密度，并且每 個板的吸光度測量重復進行3次。對于表面改性培養(yǎng)板18、19、30、32、33和34而言，檢測 一個樣品并重復測量3次。表面改性培養(yǎng)板5-12的負電荷密度是類似的，并且這些表面的負電荷密度顯著 低于CellBIND 表面和Nunclon Delta 表面的負電荷密度，但顯著高于I^rimaria 表面的 負電荷密度(圖43)。表面改性培養(yǎng)板19、33和34的負電荷密度顯著高于表面改性培養(yǎng)板 18、30和32的負電荷密度，后者各自為用相同的聚合材料制成的未處理表面。將表面改性 培養(yǎng)板22-M和四的負電荷密度歸一化到Nunclon Delta 表面的負電荷密度，圖44示出 了表面改性培養(yǎng)板22-M的負電荷密度高于Nunclon Delta 表面的負電荷密度，而表面改 性培養(yǎng)板四的負電荷密度顯著低于Nunclon Delta 表面(和表面4)的負電荷密度。X射線光電子能譜(XPS)按照實例17中所述的方法，使用XPS分析表面改性培養(yǎng)板5-12、18、19、22-對、29、 30、31-34。以原子百分數為單位的表面元素組成示于表12中。除了表面改性培養(yǎng)板31和 32 (未進行等離子體處理)不含氮外，所有的表面都含有碳、氧和氮(XPS不能檢測氫)。表 面改性培養(yǎng)板5-12的氧含量低于表面改性培養(yǎng)板1-4和13，但顯著高于Costa/Mjalcon 和Nunclon Delta 表面(示于表7中)。表面改性培養(yǎng)板5_12通過微波等離子體處理制 備，而表面改性培養(yǎng)板1-4和13通過電暈等離子體處理制備。表面改性培養(yǎng)板19、33和 34通過電暈等離子體處理制備，但由其他非聚苯乙烯的聚合物注射成型(聚苯乙烯用于制 備表面改性培養(yǎng)板1-4和13)，這些表面改性培養(yǎng)板的氧含量與表面改性培養(yǎng)板1-4和13 的氧含量相當。表面改性培養(yǎng)板22-24的氧含量低于表面改性培養(yǎng)板1-4和13。表面改 性培養(yǎng)板四的氧含量與表面改性培養(yǎng)板1-4和13的氧含量相當。表面改性培養(yǎng)板5-12、 19,33和34的氮含量低于表面改性培養(yǎng)板1-4和13，但高于CostarTM、i^alconTM和Nunclon Delta 表面(示于表7中)。表面改性培養(yǎng)板四的氮含量明顯高于其他被分析的表面，包 括 I^rimaria 表面。通過使用可在文獻中找到的物質的峰寬和能級，對Cls譜峰進行曲線擬合(最佳 卡方擬合)，以確定和定量表面改性培養(yǎng)板中碳的鍵合環(huán)境(表13)。濃度以原子百分數 為單位進行記錄，可通過原子濃度與面積百分數相乘來得到。就碳鍵合環(huán)境而言，除表面 10、22-M和四以外，所有等離子體處理的表面均類似。表面19、33和34中的C_
_C的 碳比例顯著高于表面5-12、18、30和32以及表面1_4和13中的水平(示于表8中)。表 面5-12、19、33和34中的0_[C = 0]_0鍵合環(huán)境的碳比例低于表面1-4和13中的水平。 表面5-9、11、12、19、33和34中的O-C-O-C-O的碳比例顯著高于表面1-4和13中的水 平，但與Nunclon Delta 禾口 CellBIND 表面中的水平相當。表面5_12、19、33和34中的 C-O-C或C-NH3+鍵合環(huán)境(光譜中能級相同)的碳比例低于表面1-4和13中的水平，但高于 Costa/Mjalcon^^CellBIND 和 I^rimaria 表面中的水平。表面 19、33 和 34 中的 C-0-C* =0鍵合環(huán)境的碳比例高于表面5-12中的水平，并與表面1-4和13中的水平相當。表面 5-12中的C = 0鍵合環(huán)境的碳比例高于表面19、33和34中的水平，但低于表面1_4和13中 的水平。表面5-12中的CO 3_鍵合環(huán)境的碳比例高于表面19、33和34中的水平，并與表面 1-4和13中的水平相當。就碳鍵合環(huán)境而言，表面22-M類似。表面22-M中的C-
-C、 0-[C = 0]-0、C-O-C或C-NH 3+> C-O-C = 0*和C = 0中的碳比例顯著低于表面1_4禾Π 13中的水平。表面22-24中的CO 3_和O-C-O-C-C*鍵合環(huán)境的碳比例高于表面1_4和13中的 水平。表面四的碳鍵合環(huán)境不同于所有其他等離子體處理表面的碳鍵合環(huán)境。c-[o]-c中 的碳比例與表面1-4和13中的水平相當。表面29中的0-[C = 0]-0、C03_和C*-C_0-C-C* 鍵合環(huán)境的碳比例低于表面1-4和13中的水平。表面四中的C-O-C或C-NH3+、C-0-C* = 0和C = 0鍵合環(huán)境的碳比例高于表面1-4和13中的水平。能量損失峰由芳族Π —Π *躍 遷產成，是表面芳香性的指示。Ols譜峰幾乎為高斯型，不能進行曲線擬合。通過使用可在文獻中找到的物質的峰 寬和能級，對Nls譜峰進行曲線擬合(最佳卡方擬合)，以確定和定量表面中氮的鍵合環(huán)境 (表14)。濃度以原子百分數為單位進行記錄，可通過原子濃度與面積百分數相乘來得到。 除表面9以外，所有表面中的-NH3+鍵合環(huán)境的氮比例均低于表面1-4和13中的水平。表 面5-12、19、33和34中的-NH2鍵合環(huán)境的氮是變化的，但都高于表面1_4和13中的水平。 表面5-12、19、33和34的-NO2鍵合環(huán)境的氮是變化的，但都低于表面1_4和13中的水平。 表面5-12、19、33和34的-NO3鍵合環(huán)境的氮是變化的，但都高于表面1_4和13中的水平。 表面22-Μ和四的氮鍵合環(huán)境不同于其他等離子體處理表面。表面22-Μ和四中的-NH2 鍵合環(huán)境的氮比例是變化的，但都顯著高于表面1-4和13中的水平。表面22-Μ和四中 的-NO2鍵合環(huán)境的氮比例低于表面1-4和13中的水平。就0 = C-N-C = 0鍵合環(huán)境中的 氮比例而言，表面22-24和29與表面1-4和13是相當的。在整篇文檔中引用的出版物據此全文以引用方式并入。盡管上文已結合實例和優(yōu) 選實施例描述了本發(fā)明的各個方面，但應當理解本發(fā)明的范圍不受上述具體實施方式
的限 定，而受以下在專利法原則下合適解釋的權利要求書的限定。
^ ι50^,Km.m^mm^ HI 細朐,Φ多 能標記物的表達
權利要求
1.一種促進細胞粘附于表面的方法，所述表面含有至少約0. 5%的N、0和N的總和大 于或等于17.2%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層，所述方法包括以下 步驟a.獲得所述細胞的懸浮液，b.用至少一種選自以下物質的化合物處理所述細胞懸浮液能夠抑制Mio激酶活性的 化合物和能夠抑制Mio活性的化合物，以及c.將所述細胞懸浮液添加到所述表面，讓所述細胞粘附。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述0和N的總和大于或等于19.5%。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞在粘附于所述表面后進行培養(yǎng)。
5.根據權利要求4所述的方法，其中將至少一種化合物在所述細胞粘附于所述表面后 去除。
6.根據權利要求1所述的方法，其中通過去除至少一種化合物將所述細胞與所述表面 分離。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸浮液為細胞群懸浮液。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞懸浮液為單細胞懸浮液。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述表面為容器或基質的一部分。
10.一種促進細胞粘附于表面的方法，所述表面含有至少約0. 9%的N、0和N的總和大 于或等于22. 3%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層，所述方法包括以下 步驟a.獲得所述細胞的懸浮液，以及b.將所述細胞懸浮液添加到所述表面，并讓所述細胞粘附。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
12.根據權利要求10所述的方法，其中所述細胞在粘附于所述表面后進行培養(yǎng)。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述細胞懸浮液為細胞群懸浮液。
14.根據權利要求10所述的方法，其中所述細胞懸浮液為單細胞懸浮液。
15.根據權利要求10所述的方法，其中所述表面為容器或基質的一部分。
16.一種表面，所述表面為旨在用于細胞培養(yǎng)或分析的容器或基質的一部分，所述表面 含有至少約0. 9%的N、0和N的總和大于或等于22. 3%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼 養(yǎng)細胞層和吸附層，其中所述表面允許細胞的粘附和培養(yǎng)。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
18.根據權利要求16所述的表面，其中所述細胞在粘附于所述表面后進行培養(yǎng)。
19.一種組合物，包含a.表面，所述表面為旨在用于細胞培養(yǎng)或分析的容器或基質的一部分，所述表面含有 至少約0. 5%的N、0和N的總和大于或等于17. 2%、接觸角為至少約13. 9度且不含飼養(yǎng)細 胞層和吸附層，以及b.至少一種選自以下物質的化合物能夠抑制Mio激酶活性的化合物和能夠抑制Mio 活性的化合物。
20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述0和N的總和大于或等于19.5%。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述表面具有吸附層。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動物細胞培養(yǎng)領域，并提供了用于使細胞粘附于固體基底表面、在固體基底表面上培養(yǎng)以及與固體基底表面分離的方法和組合物，所述表面含有至少約0.5％的N、O和N的總和大于或等于17.2％、接觸角為至少約13.9度且不含飼養(yǎng)細胞層和吸附層。在本發(fā)明的一個實施例中，將所述細胞用能夠抑制Rho激酶活性的化合物處理。在另一個實施例中，將所述細胞用能夠抑制Rho活性的化合物處理。
文檔編號C12N5/0735GK102046779SQ200980106108
公開日2011年5月4日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權日2008年2月21日
發(fā)明者B·弗里耶, S·納爾遜, T·K·馬伍德, T·布雷維, V·尼爾森 申請人:森托科爾奧索生物科技公司