專利名稱：使用肺癌特異性甲基化標(biāo)記基因檢測肺癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用肺癌特異性生物標(biāo)記物檢測肺癌的方法，尤其是用于肺癌診 斷的生物標(biāo)記物，其可檢測P⑶HGA12的甲基化作用，它的5’ UTR或外顯子1區(qū)域在轉(zhuǎn)化的 肺癌細(xì)胞內(nèi)特異性地甲基化；和使用該生物標(biāo)記物檢測肺癌和其發(fā)展階段的方法。
背景技術(shù)：
在20世紀(jì)抽煙變得普遍之前，肺癌是一個非常稀有的疾病。肺癌的發(fā)生率快速增 長，在西方國家，肺癌在男性和女性中均是最多發(fā)的癌癥。在韓國，肺癌通常發(fā)生在男性中， 它的發(fā)病率在女性中也驚人得增長。肺癌發(fā)病率的這種增長是歸根于抽煙、空氣污染和工 業(yè)污染等等。即使在藥物科學(xué)發(fā)達(dá)的現(xiàn)代，肺癌病人的5年生存率，尤其是實體瘤患者(除了血 癌患者)小于50%，所有癌癥患者中的大約2/3在晚期被診斷，大多數(shù)是在癌癥診斷后兩年 內(nèi)死亡。癌癥治療中的這種拙劣的結(jié)果不僅是治療方法的問題，還因為在早期診斷癌癥和 精確地確診晚期癌癥，和在癌癥治療后實施癌癥患者的跟蹤(follow-up)并不容易。
最近，基因檢測方法被積極地用于診斷癌癥的嘗試。在它們中，典型的方法是使用 PCR技術(shù)確定是不是ABL =BCR(Abelson鼠科白血病病毒致癌基因同源體斷裂點叢集區(qū)) 的融合基因，其是存在于血液中的白血病的基因指示物。此外，已嘗試另一個方法，由癌細(xì) 胞表達(dá)的基因的存在性通過RT-PCR檢測和印跡檢測，由此診斷血液細(xì)胞中癌細(xì)胞的存在。 然而，這個方法具有缺點它只能運用于某些癌癥，包括前列腺癌和惡性黑色素瘤，具有較 高的錯誤陽性率。而且，它難于在這種方法中的檢測和讀取的標(biāo)準(zhǔn)化，它的應(yīng)用也受到限 制(Kopreski, M. S.等人，Clin. Cancer Res. ,5 :1961,1999 ；Miyashiro, I. et al. , Clin. Chem. ,47 =505,2001)。另外，最近已積極地嘗試使用在血清或血漿中的DNA的基因檢測。 使用從癌癥中分離的DNA以分析癌癥特異性基因異常，比如致癌基因和腫瘤抑制基因的突 變、缺失和功能喪失，允許癌癥的診斷。同時，正在嘗試通過基因或者抗體測試來檢測在肺癌患者的痰或者支氣管肺泡灌 洗液中癌細(xì)胞或者致癌基因的存在的方法(Palmisano，W.A.等人，Cancer Res. ,60 =5954, 2000 ；Sueoka，E.等人，Cancer Res. ,59 1404，1999)。然而，為了準(zhǔn)確地診斷涉及大量的基 因異常和顯示不同突變的癌癥，需要能夠以準(zhǔn)確和自動的方式同步分析大量基因的方法， 但這樣的方法仍未建立。因此，最近提出通過測量DNA甲基化的診斷癌癥的方法。DNA甲基化主要發(fā)生在特 異性基因的啟動子區(qū)域的CpG島的胞嘧啶上，因此阻斷了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而特異性基 因的表達(dá)被沉默。如此，腫瘤抑制基因的啟動子CpG島的甲基化的分析是非常有助于癌癥 研究的?；钴S的嘗試已經(jīng)用于分析啟動子CpG島的甲基化，通過比如甲基化特異性PCR(此 后，稱為“MSP” )的方法或者自動的堿基配對和使用分析結(jié)果診斷和篩選癌癥的方法。雖然存在啟動子CpG島的甲基化是否直接誘導(dǎo)致癌基因或是在致癌基因中導(dǎo)致 二級反應(yīng)的爭論，已肯定在不同癌癥中的腫瘤抑制基因、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞循環(huán)調(diào)控基因和類似物是高度甲基化的(hyper-methyl ationed)，從而這些基因的表達(dá)被沉默。尤其是， 眾所周知特異性基因的啟動子區(qū)域的高甲基化發(fā)生在致癌基因的早期。因此，腫瘤相關(guān)的基因的啟動子甲基化是癌癥的重要指標(biāo)，可以用于許多應(yīng)用中， 包括癌癥的診斷和早期檢測，致癌基因的風(fēng)險預(yù)測，癌癥預(yù)后的預(yù)測，治療后的隨診，抗癌 治療的反應(yīng)的預(yù)測。事實上，最近已經(jīng)活躍地嘗試檢查血液、痰、唾液、糞便或者尿液中的 腫瘤相關(guān)基因的啟動子甲基化，和利用檢測結(jié)果診斷和治療不同的癌癥(Esteller，Μ.等 人，Cancer Res. ,59 :67，1999 ；Sanchez-Cespedez，Μ.等人，Cancer Res. ,60 892,2000 ； Ahlquist, D.A. et al. , Gastroenterol. , 119 1219,2000)。最近，通過不同檢查診斷肺癌是可能的，如果疑似肺癌的癥狀存在，實施胸部 X-射線的檢測、顯微檢測、視頻成像檢測、活組織切片檢查、轉(zhuǎn)移的檢測或類似的檢查確定 是否癥狀是肺癌或確定肺癌的發(fā)展階段。然而，這種檢查方法需要昂貴的系統(tǒng)，是花費大 的，具有難度的，不適于肺癌早期診斷，另外，存在取樣的困難。這樣，考慮到具有小于3cm 的腫瘤尺寸的一期肺癌患者的5年存活率大于70%，在病變的尺寸是小的時候，早期診斷 肺癌是最好的辦法。因此，迫切得需要發(fā)展比各種現(xiàn)有肺癌檢查方法更有效的檢查方法。也 就是，需要開發(fā)新的肺癌特異性生物標(biāo)記物，其可診斷早期的肺癌，處理大量的樣品和具有 高度敏感性和特異性。因此，本申請的發(fā)明人已申請并獲得了用于癌癥診斷的微陣列和試劑盒的專利， 包括克隆癌癥特異性表達(dá)降低的基因LAMA2(層粘連蛋白分區(qū)蛋白a2(laminin merosin alpha 2))、FABP4 (脂肪酸結(jié)合蛋白4)、GSTA2 (谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶A2)，、STMN2 (類微管 去穩(wěn)蛋白 2(stathm in-like 2))，))、NR4A2 (核受體亞族 4、組 Α、成員 2)，、DSCR1L1 (類 唐氏綜合癥關(guān)鍵區(qū)域基因-1 1 (down syndrome critical region gene 1-like 1)),)、 Α2Μ(α-2-巨球蛋白)和 SEPPl (硒蛋白 P、原生質(zhì)血漿 1 (selenoprotein P, plasma, 1))(韓 國專利注冊號10-0617649)。本申請的發(fā)明人已作出許多努力開發(fā)能夠有效診斷肺癌的診斷試劑盒，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 肺癌和它的進(jìn)展階段可通過利用rcDHGA12的(GenBank NM_032094)基因的甲基化的5，UTR 或者甲基化的外顯子1的區(qū)域檢測甲基化程度來診斷，其在肺癌細(xì)胞中特異性甲基化，作 為癌癥特異性標(biāo)記物，由此完成了本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種包括基因甲基化區(qū)域的用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物，所 述基因在肺癌中特異性甲基化。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用肺癌診斷生物標(biāo)記物來檢測肺癌和它的進(jìn) 展階段的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其包括癌癥特異性表 達(dá)降低基因PCDHGA12 (GenBank NM_032094、原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)的甲基化的5’ UTR 或外顯子1區(qū)域。本發(fā)明還提供用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其包括一個或多個甲基化的CpG島， 且由SEQ ID NO 2到4的任一堿基序列表示。本發(fā)明還提供檢測肺癌和它的進(jìn)展階段的方法，所述方法包括以下步驟(a)從 臨床樣品中分離DNA ；和(b)在分離的DNA中檢測肺癌特異性基因P⑶HGA12(GenBankNM_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)的5’ UTR或外顯子1區(qū)域的甲基化作用。本發(fā)明的其它特征和實施例將從以下描述和所附權(quán)利要求中更為明確。


圖1是發(fā)現(xiàn)用于肺癌診斷的甲基化生物標(biāo)記物P⑶HGA12的過程的示意圖。圖2顯示通過亞硫酸鹽測序法測量基因區(qū)域㈧的甲基化程度、和UTR和外顯子 區(qū)域(B)的甲基化程度，以確定在正常細(xì)胞和肺細(xì)胞株中PCDHGA12的甲基化程度的結(jié)果。圖3顯示在正常細(xì)胞中和四種肺細(xì)胞中通過焦磷酸測序法測量P⑶HGA12基因的 甲基化程度的結(jié)果。圖4顯示通過焦磷酸測序法測量P⑶HGA12基因在五種正常組織和四種成對的肺 癌組織中的甲基化程度的結(jié)果。圖5顯示測量正常人(η = 51)和肺癌患者(η = 81)的痰細(xì)胞的基因組DNA的甲 基化作用的結(jié)果。圖6顯示利用正常和肺癌細(xì)胞株以及正常和肺癌患者的每個的痰DNA測量 PCDHGA12基因的啟動子甲基化程度的結(jié)果。
具體實施例方式一方面，本發(fā)明涉及肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其包括肺癌特異性表達(dá)降低的基因 PCDHGA12 (GenBank ΝΜ_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12的甲基化的5，UTR或者甲基化的 外顯子1區(qū)域。在本發(fā)明中，甲基化的5’UTR(非編譯區(qū))或者甲基化的外顯子1區(qū)域優(yōu)選包括至 少一個甲基化的CpG 二核苷酸，且5，UTR和外顯子1區(qū)域優(yōu)選由SEQ ID NO :1表示。篩選甲基化標(biāo)記基因的方法的一個例子可以是包括以下步驟的方法(1)僅從轉(zhuǎn) 化細(xì)胞株和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株中選擇DNA-高度甲基化的基因；(2)包括轉(zhuǎn)化的 肺癌細(xì)胞和鄰近那些的非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因表達(dá)譜，產(chǎn)生一份在非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中更高表達(dá) 的基因的列表；(3)用甲基化抑制劑處理轉(zhuǎn)化的肺癌(細(xì)胞)株，產(chǎn)生一份與非處理的轉(zhuǎn)化 的肺癌細(xì)胞系比較，在用甲基化抑制劑處理的轉(zhuǎn)化的肺癌細(xì)胞株中更高程度表達(dá)的基因的 列表；和⑷比較從上述步驟(1)、(2)、(3)中獲取的基因列表，觀察在上述三個列表中都 存在的基因，作為由從非轉(zhuǎn)化狀態(tài)轉(zhuǎn)變到轉(zhuǎn)化的肺癌細(xì)胞形式的細(xì)胞的基因組中由甲基化 調(diào)控的標(biāo)記基因。在本發(fā)明中，通過上述篩選方法從肺癌細(xì)胞株的基因組DNA中篩選而來的肺癌特 異性表達(dá)降低基因P⑶HGA12在5’ UTR和外顯子1區(qū)域中具有甲基化的CpG島。在另一方面，本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物，其包括一個或多個甲基化的CpG島，且由 SEQ ID NO :2和3的任何一個堿基序列表示。在本發(fā)明中，DNA片段優(yōu)選分離自肺癌特異性表達(dá)降低的基因P⑶HGA12 (GenBank NM_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)。在本發(fā)明中，肺癌特異性表達(dá)降低的基因P⑶HGA12的5’UTR和外顯子1區(qū)域在肺 癌細(xì)胞株中的Rl (SEQ ID N0:2)、R2(SEQ ID NO 3)和R3 (SEQ ID NO 4)區(qū)域中具有甲基 化。
在本發(fā)明的一個實施例中，來自肺癌患者的肺癌組織中的P⑶HGA12基因的R1、R2 和R3顯示高甲基化水平，在成對的肺癌組織和在其附近的正常組織中的Rl區(qū)域的甲基 化 在40個臨床樣品中的34個(即，臨床樣品的85% )中顯示，且在36個臨床樣品，這些組 織中的R3區(qū)域的甲基化高(即，臨床樣品的90%)。這個表示肺癌可以有效地通過測量 P⑶HGA12基因的R1、R2和R3區(qū)域的高度甲基化作用來診斷。在另一方面，本發(fā)明涉及檢測肺癌或其發(fā)展階段的方法，該方法包括以下步驟 (a)從臨床樣品中分離DNA ；和(b)在分離的DNA中檢測PCDHGA12 (GenBank NM_032094，原 粘鈣蛋白Y亞族A，12)基因的5’ UTR或外顯子1區(qū)域的甲基化程度。在本發(fā)明中，甲基化的檢測優(yōu)選在具有從由下組中選擇的序列的DNA區(qū)域中實 施,該組由 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4 組成。在本發(fā)明中，甲基化的檢測優(yōu)選使用選自下組中的一種方法，該組由PCR、甲基化 特異性PCR、實時甲基化特異性PCR、利用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的PCR、定量PCR、基 于DNA芯片的檢測方法(DNA chip-based detection method)、焦磷酸測序法和亞硫酸鹽測 序法組成，且所述臨床樣品是來自疑似癌癥的患者或?qū)⒈辉\斷的對象中的組織、細(xì)胞、血液 或尿液。通過在本發(fā)明的實施例中使用的篩選甲基化作用的生物標(biāo)記基因的方法，不僅可 以篩選肺癌，還可以篩選向癌癥發(fā)展的組織的各種混合體型階段差異性地甲基化的基因。 篩選的基因可用于肺癌篩選、風(fēng)險評估、預(yù)后、疾病識別、病癥階段的診斷和治療性靶標(biāo)的 選擇。在肺癌中的甲基化的基因和在肺癌不同階段的異常的識別，使得肺癌的準(zhǔn)確和有 效地早期診斷成為可能，允許多重基因的甲基化圖譜和治療性干預(yù)的新靶標(biāo)的識別。此外， 根據(jù)本發(fā)明的甲基化數(shù)據(jù)可與其它非甲基化相關(guān)的生物標(biāo)記物檢測方法結(jié)合以獲取肺癌 診斷的更為精確的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的方法，肺癌在不同階段或時期的進(jìn)展可通過從樣品中獲取的一個或 多個核酸生物標(biāo)記物的甲基化程度的測量進(jìn)行診斷。通過比較從肺癌的每個階段的樣品中 分離出的核酸的甲基化程度與從沒有細(xì)胞增殖性異常的肺部組織中的樣品中分離出的一 個或多個核酸的甲基化程度，可檢測樣品中肺癌的具體階段。這里，甲基化程度可以為高度 甲基化。在本發(fā)明的一個實施方式中，核酸可以在基因的調(diào)控區(qū)域中被甲基化。在另一個 實施方式中，涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因可通過檢測基因的調(diào)控區(qū)域外部的甲基化來診斷，因為 甲基化作用由基因的外部向內(nèi)部發(fā)展。在本發(fā)明的另一個實施方式中，樣品中的肺部組織細(xì)胞的異常生長(發(fā)育異常) 可以使用試劑盒通過對于P⑶HGA12 (NM_032094,原粘鈣蛋白Y亞族A，12基因的5’UTR和 外顯子1區(qū)域的甲基化程度檢測來診斷的。本發(fā)明的診斷性試劑盒的使用可確定樣品中肺部組織細(xì)胞的異常生長(發(fā)育異 常的進(jìn)展)。本發(fā)明的診斷性方法包括確定一個或多個從樣品中分離的核酸的甲基化狀態(tài)， 其中所述一個或多個核酸的甲基化程度是與從肺部組織細(xì)胞的沒有異常生長(發(fā)育異常) 的樣品中分離的核酸的甲基化程度進(jìn)行比較。本發(fā)明的另一個實施方式中，甲基化基因標(biāo)記物的使用允許可能形成肺癌的細(xì)胞的早期診斷。當(dāng)確定在癌癥細(xì)胞中甲基化的基因在臨床上或形態(tài)學(xué)上正常表象的細(xì)胞中甲 基化時，這就表明該正常表象的細(xì)胞向癌癥發(fā)展。這樣，肺癌可在早期通過在正常表象的細(xì) 胞中的肺癌特異性基因的5’ UTR和外顯子1區(qū)域的甲基化作用而診斷。本發(fā)明的甲基化標(biāo)記基因的使用允許樣品中肺部組織細(xì)胞的異常生長(發(fā)育異 常的進(jìn)展)的檢測。本發(fā)明的檢測方法包括將含有至少一個從臨床樣品中分離出來的核酸 的樣品與至少一種能夠確定核酸甲基化狀態(tài)的試劑接觸，其中該核酸的甲基化作用不同于 沒有異常生長(發(fā)育異常的進(jìn)展)的樣品中存在的核酸的相同區(qū)域的甲基化狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，肺癌的進(jìn)展的可能性可通過使用上面描述過的試 劑盒檢查顯示正常的顯型的樣品中的標(biāo)記基因的5’ UTR和外顯子1區(qū)域的甲基化來診斷。 樣品可以是固體或液體組織、細(xì)胞、尿液、血清或者血漿。本發(fā)明中，檢測POTHGA12基因的5’UTR和外顯子1區(qū)域的甲基化的方法包括以下 步驟(a)從臨床樣品中分離樣品DNA ； (b)用重亞硫酸鹽處理分離的DNA ； (c)利用能夠擴(kuò) 增包括P⑶HGA12基因的5’UTR和外顯子1區(qū)域的CpG的片段的引物擴(kuò)增經(jīng)處理的DNA ；和 (d)對步驟(c)中擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序以測定PCDHGA12基因的甲基化作用。在本發(fā)明的一個實施例方式中，將側(cè)檢測方法可通過使用試劑盒實施該檢測方法 來進(jìn)行。用于本發(fā)明中的試劑盒包括劃分區(qū)域從而在其內(nèi)部容納樣品的載體工具；和一 個或多個容器，包括第一容器，其包含靈敏地割裂未甲基化的胞嘧啶的試劑；第 二容器，其 包含擴(kuò)增包含CpG的核酸的引物；第三容器，其包含用于檢測斷裂的或非未斷裂的核酸的 存在的工具。用于本發(fā)明中的引物包括在SEQ ID NO :5至21的序列中提出的序列，和它們 的任何功能性組合和片段。載體的工具適用于包含一個或多個容器的工具，比如小瓶、管、 和類似物，每個容器的工具包含一個用于本發(fā)明的方法的獨立的要素。根據(jù)本發(fā)明說明書， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定在容器工具中必要試劑的分配。例如，容器工具中的一個可包 括包含了甲基化敏感性限制酶的容器。一個或多個容器工具還可以包含與感興趣的核酸位 點互補(bǔ)的引物。另外，一個或多個容器工具還可以包含所述甲基化敏感性限制酶的同裂酶。本發(fā)明的另一個實施方式中，使用所述試劑盒檢測肺癌的方法包括以下步驟(1) 從臨床樣品中分離基因組DNA ； (2)用甲基化敏感性限制酶處理分離出來的基因組DNA ； (3) 使用能夠擴(kuò)增用于本發(fā)明的肺癌診斷的生物標(biāo)記物的引物擴(kuò)增經(jīng)處理的基因組DNA;和 (4)確定經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物中用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物的存在與否。在這個方法中，存在該生 物標(biāo)記物片段的樣品可診斷為肺癌或肺癌進(jìn)展階段。為了確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否， 試劑盒可額外包含能夠與在嚴(yán)格條件下用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物雜交的片段。可用于本發(fā)明中確定用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物的存在與否的方法還可以包括 重亞硫酸鹽測序法、焦磷酸測序法、甲基化特異性PCR、甲基化熒光檢測、使用甲基化DNA結(jié) 合蛋白的PCR和DNA芯片陣列。如在此所用的，術(shù)語“細(xì)胞轉(zhuǎn)化”指的是細(xì)胞的特征從一個形式向另一個形式的變 化，比如正常向異常變化、非腫瘤向腫瘤變化、未分化向分化變化、干細(xì)胞向非干細(xì)胞變化。 此外，轉(zhuǎn)化作用可通過細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、表現(xiàn)型、生物化學(xué)表征和類似性質(zhì)而識別。如在此所用的，術(shù)語癌癥的“早期檢測”指的是在轉(zhuǎn)移之前發(fā)現(xiàn)癌癥的可能性，優(yōu) 選在可觀察到組織或者細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化之前。此外，術(shù)語細(xì)胞轉(zhuǎn)化的“早期檢測”指的是 細(xì)胞在其形態(tài)學(xué)上顯示已轉(zhuǎn)化之前的早期階段經(jīng)受轉(zhuǎn)化的高度可能性。
如在此所用的，術(shù)語“高度甲基化”指的是CpG島的甲基化。如在此所用的，術(shù)語 “樣品”或者“臨床樣品”指的是其廣義，包括任何從個體、體液、細(xì)胞株、組織培養(yǎng)獲取的生 物樣品，取決于實施檢測的類型。從哺乳動物中獲取組織活檢和體液的方法在本領(lǐng)域是公 知的。肺部組織活檢是優(yōu)選的來源。甲基化生物標(biāo)記的篩選在本發(fā)明中，篩選在細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化時或細(xì)胞形態(tài)學(xué)上改變時的甲基化的生物標(biāo) 記基因。如在此所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指的是細(xì)胞或組織在形態(tài)學(xué)上從一個形式向另一個形 式的變化，比如正常狀態(tài)向異常狀態(tài)變化、非腫瘤狀態(tài)向腫瘤狀態(tài)變化、或者未分化狀態(tài)向 分化狀態(tài)變化。依照本發(fā)明，向肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的甲基化的生物標(biāo)記物基因被系統(tǒng)地篩選。例 如，篩選生物標(biāo)記基因的方法可為包含以下步驟的方法(1)使用甲基化特異性結(jié)合蛋白 MBD2bt從轉(zhuǎn)化細(xì)胞株和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞株中僅僅選擇性地分離甲基化的DNA ； (2)擴(kuò)增每個 DNA，用熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增的DNAs ； (3)將每個標(biāo)記的DNAs雜交到能夠測量甲基化的微陣列 上；(4)基于雜交的結(jié)果，篩選在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選高度甲基化的基因；(5)比較轉(zhuǎn)化的肺癌 細(xì)胞和其附近非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因表達(dá)譜，產(chǎn)生一份在非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中更高度表達(dá)的一系列基 因的列表；(6)用甲基化抑制劑處理轉(zhuǎn)化肺癌細(xì)胞株，產(chǎn)生相比于非處理的轉(zhuǎn)化的肺癌(細(xì) 胞)株，在經(jīng)處理的轉(zhuǎn)化的肺癌中具有更高表達(dá)的一系列基因的列表；和(7)比較從步驟 (5)和(6)中獲取的基因譜，觀察所有三個基因列表中都存在的基因作為標(biāo)記基因，其是通 過在從非轉(zhuǎn)化狀態(tài)轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)化的肺癌細(xì)胞形式的細(xì)胞基因組中的甲基化調(diào)控的。這里所用的術(shù)語“核酸”或者“核酸序列”指的是寡核苷酸、核苷或者聚核苷酸，或 它們的 片段，基因組或合成的單鏈或雙鏈DNA或RNA、基因組或合成的有義鏈或反義鏈DNA 或RNA、肽核酸(PNA)、天然的或者合成的任何類似DNA或類似RNA材料。對于本領(lǐng)域技術(shù) 人員明確的是，當(dāng)核酸是RNA時，脫氧核糖核苷A、G、C和T分別被核苷酸A、G、C和U替換。只要有可檢測差異性甲基化的CpG島，任何的核酸可以用于本發(fā)明。CpG島是核酸 序列中CpG富集區(qū)域。甲基化作用在本發(fā)明中，可以使用任何純化或非純化形式的核酸樣品，只要其包含或推測包 含具有靶位點的核酸序列(例如含有CpG的核酸)。一個能夠被差異性甲基化的核酸區(qū)域 是CpG島，一個相對于其它二核苷酸CpG的核酸區(qū)域具有增強(qiáng)密度的核酸序列。CpG雙聯(lián) 體在脊椎動物DNA中以僅約20%的頻度發(fā)生，其可從G*C配對的比例中預(yù)期。在特定區(qū)域 中，CpG雙聯(lián)體的密度達(dá)到預(yù)期值，相對于剩余的基因組增加了十倍；CpG島具有平均G*C 配對的含量大約60%，相比于在大量DNA中40%的平均值。該島具有大約一千到兩千堿基 對-DNA典型的長度。在人類基因中有大約45，000這種島。在許多基因中，CpG島開始于啟動子的上游，向下游延伸至轉(zhuǎn)錄區(qū)域。在啟動子上 的CpG島的甲基化通常抑制基因的表達(dá)。該島還可以環(huán)繞基因編碼區(qū)域的5’區(qū)域和編碼 區(qū)域的3’區(qū)域。這樣，CpG島可在包括含有啟動子區(qū)域的調(diào)控區(qū)域中的編碼序列的上游的 核酸序列的多重區(qū)域、在編碼區(qū)域中(例如，外顯子)、編碼區(qū)域的下游，例如，在增強(qiáng)區(qū)域 和在內(nèi)含子中內(nèi)找到。通常，含CpG的核酸是DNA。然而，本發(fā)明的方法可適用，例如，包含DNA、或者DNA和含有mRNA的RNA的樣品，其中DNA或者RNA可以是單鏈的或者雙鏈的，或者DNA-RNA雜 交鏈也可能包括在樣品中。還可以使用核酸的混合物。待測的特異性核酸序列可以是更大分子的片段，或者 初始就以離散的分子存在，從而特異序列構(gòu)成整個核酸。待研究的序列不必初始就以純化 的形式存在；核酸可以是復(fù)合混合物的較小的一部分，例如含在整個人類DNA的核酸中。包 含在樣品中用于甲基化的CpG島的檢測的核酸可以通過多種技術(shù)，如Sambrook等人描述的 技術(shù)(Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N. Y. , 1989)提取。核酸可包含調(diào)控區(qū)域，其是編碼核酸的信息或者控制核酸的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。調(diào) 控區(qū)域包括至少一個啟動子?！皢幼印笔亲阋灾敢D(zhuǎn)錄的最小序列，且調(diào)控啟動子-依賴 型基因表達(dá)中的細(xì)胞型特異性、組織特異性，或者經(jīng)外部信號或者試劑誘導(dǎo)。啟動子可定位 于基因5’或3’區(qū)域。啟動子的全部或部分內(nèi)的核酸的數(shù)量可以是用于測量CG島的甲基 化作用。而且，通常認(rèn)為靶標(biāo)基因啟動子的甲基化天然地從外邊界向內(nèi)發(fā)展。因此，細(xì)胞轉(zhuǎn) 化的早期階段可通過分析啟動子區(qū)域的這些外部區(qū)域的甲基化來檢測。從實驗對象中分離的核酸是從實驗對象中取得的生物樣品中獲取的。如果想要檢 測肺癌或肺癌發(fā)展的階段，核酸可以通過刮取或活組織檢查從肺部組織中分離出來。這樣 的樣品可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種醫(yī)學(xué)程序獲取。 如這里所用的，術(shù)語“高度甲基化”指的是在腫瘤細(xì)胞的特異性CpG位點或在由 CpG島組成的特異性堿基序列區(qū)域的甲基化是高于在正常細(xì)胞中的。樣品本發(fā)明描述肺癌的早期診斷和采用肺癌特異性基因甲基化。本發(fā)明的發(fā)明人已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)肺癌特異性基因甲基化還發(fā)生在鄰近腫瘤區(qū)域的組織中。因此，在肺癌的早期診斷 方法中，任何樣品，包括液體或固體組織，可以被用于檢查肺癌特異性基因的甲基化的存在 性。這樣的樣品包括，但不限于，痰、血清或者血漿。甲基化檢測的方法差異性甲基化_甲基化_特異性PCR的檢測當(dāng)基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理時，如果被甲基化，在5’-CpG_3’區(qū)域內(nèi)的胞嘧啶 保持完整，但是，如果沒有被甲基化，胞嘧啶變成尿嘧啶。因此，基于經(jīng)重亞硫酸鹽處理之后 轉(zhuǎn)變的堿基序列，對應(yīng)于具有5’-CpG-3’堿基序列的區(qū)域的PCR引物組被構(gòu)建。這里，構(gòu)建 的引物組是兩種引物組對應(yīng)于甲基化堿基序列的引物組，和對應(yīng)于非甲基化堿基序列的 引物組。當(dāng)基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，然后使用上述兩種引物組通過PCR擴(kuò)增時，若基 因組DNA被甲基化，PCR產(chǎn)物是采用對應(yīng)于甲基化堿基序列的引物在PCR混合物中檢測，但 若基因組DNA未甲基化，基因組DNA在采用對應(yīng)于非甲基化的堿基序列的引物在PCR混合 物中檢測。這種甲基化可以通過瓊脂糖凝膠電泳定量分析。差異性甲基化_實時甲基化特異性PCR的檢測實時甲基化特異性PCR是從甲基化特異性PCR方法改良的實時測量方法，包括用 重亞硫酸鹽處理基因組DNA，設(shè)計對應(yīng)于甲基化堿基序列的PCR引物，和利用引物進(jìn)行實時 PCR0檢測基因組DNA的甲基化的方法包括以下兩種方法一種使用與擴(kuò)增的堿基序列互補(bǔ) 的TanMan探針的檢測方法；和使用Sybergreen的檢測方法。這樣，實時甲基化特異性PCR 允許甲基化的DNA的選擇性的定量分析。這里，標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用體外甲基化DNA樣品繪制，在堿基序列中未包含5’ -CpG-3’序列的基因還擴(kuò)增為用于標(biāo)準(zhǔn)化的陰性對照組，以定量分 析甲基化的程度。差異性甲基化_焦磷酸測序法的檢測焦磷酸測序法是從重亞硫酸鹽測序法改良而來的定量的實時測序法。類似于 重亞硫酸測序法，基因組DNA是經(jīng)重亞硫酸鹽測序法轉(zhuǎn)化的，然后，構(gòu)建對應(yīng)于未包含 5’ -CpG-3’堿基序列的區(qū)域的PCR引物。特定地，基因組DNA是經(jīng)重亞硫酸鹽處理，使用 PCR引物擴(kuò)增，然后使用測序引物作用于實時堿基序列分析。甲基化的程度是通過分析 5’ -CpG-3’區(qū)域內(nèi)的胞嘧啶和胸腺嘧啶的數(shù)量來作為甲基化指標(biāo)來表達(dá)。差異性甲基化-PCR的檢測-使用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR、定量PCRJP DNA芯片陣列當(dāng)僅僅特異性地結(jié)合到甲基化的DNA的蛋白與DNA混合時，蛋白僅特異性地結(jié)合 甲基化DNA。這樣，不管是使用甲基化特異性結(jié)合蛋白的PCR還是DNA芯片陣列都允許選擇 性地僅分離甲基化的DNA。基因組DNA與甲基化特異性結(jié)合蛋白混合，然后僅選擇性地分離 甲基化DNA。分離的DNA是使用對應(yīng)于啟動子區(qū)域的PCR引物擴(kuò)增的，然后DNA的甲基化是 通過瓊脂糖凝膠電泳測量。另外，DNA的甲基化還可以通過定量PCR法進(jìn)行測量，用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋 白分離的甲基化DNA可通過熒光探針標(biāo)記，雜交到含互補(bǔ)探針的DNA芯片上，從而測量DNA 甲基化。這里，甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白可以是，但不限于，McrBt0差異性甲基化檢測_甲基化敏感性限制酶差異性甲基化的檢測可通過將核酸樣品與僅剪切非甲基化的CpG位點的甲基化 敏感性限制內(nèi)切酶接觸來完成。在單獨的反應(yīng)中，樣品進(jìn)一步接觸甲基化敏感性限制酶的同裂酶，其均剪切甲基 化的和非甲基化的CpG位點，從而剪切甲基化核酸。特異性引物加入到核酸樣品中，核酸是經(jīng)通過任何傳統(tǒng)方法擴(kuò)增。在經(jīng)甲基化敏 感性限制酶處理的樣品中擴(kuò)增的產(chǎn)物是存在的，但經(jīng)與甲基化敏感性限制酶的同裂酶處理 的樣品中擴(kuò)增的產(chǎn)物是不存在的，說明甲基化已發(fā)生在被經(jīng)分析的核酸區(qū)域。然而，在經(jīng)甲 基化敏感性限制酶處理的樣品中擴(kuò)增的產(chǎn)物的不存在，與同經(jīng)甲基化敏感性限制酶的同裂 酶處理的樣品中的擴(kuò)增的產(chǎn)物的不存在一起表明在被分析的核酸區(qū)域沒有發(fā)生甲基化。如用于此處的，術(shù)語“甲基化敏感性限制酶”是指限制酶(例如，SamI)，其包括CG 作為它的識別位點的部分，當(dāng)C被甲基化時與當(dāng)C未被甲基化時相比，具有活性。甲基化敏 感性限制酶的非限制性例子包括MspI、HpaII、BssHII、BstUI和NotI。這樣的酶可以單獨 或者聯(lián)合使用。其它甲基化敏感性限制酶的例子包括，但不限于SacII和EagI。甲基化敏感性限制酶的同裂酶是限制酶，其與甲基化敏感性限制酶識別相同的識 別位點，但均剪切甲基化的和非甲基化的CGs。其例子包括Mspl。本發(fā)明的引物設(shè)計成“充分地”互補(bǔ)于將擴(kuò)增的位點的每個鏈，包括如上所述的適 當(dāng)?shù)腉或者C核苷酸。這意味著引物在聚合反應(yīng)條件下必須充分互補(bǔ)地與它們各自的鏈雜 交。本發(fā)明的引物可用于擴(kuò)增反應(yīng)中，其是酶鏈反應(yīng)(例如，PCR)在其中靶位點經(jīng)過許多 反應(yīng)步驟呈現(xiàn)指數(shù)級增長。典型地，一個引物與位點的陰性(_)鏈(反義引物)具有同源 性，另一個引物與陽性(+)鏈(有義引物)具有同源性。在引物退火到變性的核酸之后，核酸鏈通過例如DNA聚合酶I (Klenow)的酶和如核苷酸的反應(yīng)物延伸，結(jié)果，合成了新的包括 靶位點序列的+和-鏈。當(dāng)新合成靶位點用作模版并進(jìn)行變性、引物退火和延伸的重復(fù)循 環(huán)時，發(fā)生靶位點序列的指數(shù)級合成。結(jié)果反應(yīng)產(chǎn)物是離散的核酸二聚體，具有對應(yīng)于采用 的特異性引物的末端的終端(termini)。擴(kuò)增反應(yīng)是本領(lǐng)域中常用的PCR。然而，還可以使用可選的方法比如實時PCR或者 使用等溫酶的線性擴(kuò)增。另外，還可以使用多重擴(kuò)增反應(yīng)。差異性甲基化檢測_重亞硫酸鹽測序法檢測甲基化的含CpG的核酸的另一個方法包括以下步驟將含有核酸的樣品與修 飾未甲基化的胞嘧啶的試劑接觸；使用CpG特異性寡核苷酸引物擴(kuò)增在樣品中的含CpG的 核酸，其中寡核苷酸引物區(qū)分經(jīng)修飾的甲基化核苷酸和非甲基化核苷酸，檢測甲基 化核苷 酸。擴(kuò)增步驟是可選的和理想的，但不是必要的。該方法依賴于區(qū)分經(jīng)修飾的(例如，化學(xué) 修飾的)甲基化DNA和未甲基化的DNA的PCR反應(yīng)。這樣的方法在美國專利號為5，786，14 用于甲基化核酸的檢測的重亞硫酸鹽測序法中有描述?；自诎泻怂釁^(qū)域擴(kuò)增之后，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可與粘附于固相支持物(基底)上的已知 的基因探針雜交，來檢測核酸序列的存在。如用于此的，術(shù)語“基底”，當(dāng)用于關(guān)于物質(zhì)、結(jié)構(gòu)、表面或者材料時，表示包含非 生物學(xué)的、合成的、無生命的、平坦的或圓的表面的組合物，不是迄今為止已知的包括特異 性結(jié)合、雜交或催化識別位點或大量的不同的識別位點或者超過包括表面、結(jié)構(gòu)或者材料 的不同分子種類的數(shù)量的大量不同識別位點?；椎睦影?，但不限于，半導(dǎo)體、合成的 (有機(jī)的)金屬、合成半導(dǎo)體、絕緣體和摻雜物；金屬、合金、元素、化合物和礦物質(zhì)；合成的、 分裂的、侵蝕的、平版印刷的、印刷的、機(jī)械制造的和微制作的片、設(shè)備、結(jié)構(gòu)和表面；工業(yè)聚 合物、塑料、膜硅、硅酸鹽、玻璃、金屬和陶瓷；和木材、紙張、紙板、棉花、羊毛、布、機(jī)織織物 和非織物纖維、材料和織品；和具有雙重性的表面。本領(lǐng)域已知的多種類型的膜對核酸序列具有粘附力。這些膜的特異性非限制性例 子包括硝化纖維或者其它用于檢測基因表達(dá)的膜，比如聚氯乙烯、重氮化紙和其它市面上 可購買到的膜，比如GENESCREEN 、ZETAPROBE (Biorad)、和NYTRAN 。還可以包括珠、玻璃、 膠片和金屬基底。將核酸粘附到這些物體上的方法是本領(lǐng)域已知的?？蛇x地，篩選可在液 相中實施。雜交條件在核酸雜交反應(yīng)中，用于達(dá)到嚴(yán)格的特殊水平的條件將根據(jù)所要雜交的核酸的特 性而變化。例如，核酸的雜交區(qū)域的互補(bǔ)的長度、程度、核苷酸序列組成(例如，GC/AT含量) 和核酸類型(例如，RNA/DNA)可被認(rèn)為在所選的雜交條件下。另外的考慮是核酸中的一個 是固定的，例如，在濾器上。發(fā)展的更高的嚴(yán)格條件的例子如下室溫下的2X SSC/0. 1% SDS (雜交條件)；室 溫下的0. 2X SSC/0. 1% SDS (低嚴(yán)格條件)；在42°C的0. 2X SSC/0. 1% SDS (中等嚴(yán)格條 件)；和在大約68°C的0. IX SSC (高嚴(yán)格條件)。洗脫可以僅使用這些條件中的一個條件進(jìn)行實施，例如，高嚴(yán)格條件，或者可用的 條件中的每一個，例如，如上所列的順序每個10-15分鐘，重復(fù)任何或全部的所列步驟。然而，如上所述，優(yōu)化的條件將根據(jù)涉及的特殊的雜交反應(yīng)而變化，可以經(jīng)驗為主地決定。通 常，高嚴(yán)格條件是用于感興趣的探針的雜交。標(biāo)記感興趣的探針可被可檢測地標(biāo)記，例如，放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光的 化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或者酶。這樣的探針的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記是本領(lǐng)域眾所周知 的，可通過任何傳統(tǒng)方法實施。試劑盒本發(fā)明涉及用于在實驗對象中檢測異常細(xì)胞生長的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包 括劃分成其內(nèi)接收樣品的載體工具，一個或多個容器，包括第一容器，其包含敏感地割裂 未甲基化的胞嘧啶的試劑；第二容器，其包含擴(kuò)增含有CpG的核酸的引物；第三容器，其包 含用于檢測斷裂的或非斷裂的核酸的存在的工具。預(yù)期用于本發(fā)明的引物包括SEQ ID NO 5至21的表示的序列，和它們的任何功能性組合和片段。功能性組合或片段用作引物檢測 是否在基因組的區(qū)域發(fā)生甲基化。載體工具是適于包括一個或多個容器工具，比如小瓶、管和類似物，每個容器包含 一個用于該方法的分離要素。根據(jù)本發(fā)明的的說明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定在容器 中必要試劑的分配。例如，容器工具中的一個可包括含有甲基化敏感性限制酶的容器。一 個或多個容器工具可包括互補(bǔ)于感興趣的核酸位點的引物。另外，一個或多個容器工具可 包含甲基化敏感性限制酶的同裂酶。實施例在下文中，本發(fā)明將通過參考實施例將進(jìn)一步詳細(xì)描述。然而，可理解這些實施例 僅用于解釋目的，而不是構(gòu)建于限制本發(fā)明的范圍。實施例1 在肺癌細(xì)胞株中高度甲基化的基因的篩選在肺癌中高度甲基化的基因通過使用肺癌細(xì)胞株A549 (Korean Cell Line Bank(KCLB) 10185)和正常肺細(xì)胞株NHBE (Cambrex cc-2541)通過以下方式選擇。首先，每個細(xì)胞株中的500μ g的gDNA在超聲波下降解為300_400bp(Vibra Cell, S0NICS)大小，根據(jù)制造商提供的說明書使用Methylc aptureTM(Genomictree, Korea)從 每個細(xì)胞株中選擇性地富集甲基化的DNA。該富集的甲基化DNA使用GenomePl ex 全基因組 擴(kuò)增試劑盒(Complete Whole Genome Amplification Kit) (Sigma)經(jīng)擴(kuò)增，然后每個擴(kuò)增 的從細(xì)胞株A549和NHBE中衍生而來的甲基化的DNA分別經(jīng)Cy5_dUTP和Cy3_dUTP標(biāo)記，而 后混合。然后，根據(jù)Agilent的說明書將DNA雜交到含有CpG探針的CpG微陣列(Agilent)， 該探針由表示存在于人類基因組中的大約27，SOOCpG島表示，隨后進(jìn)行掃描。接下來，在 A549中高度甲基化的候選基因通過統(tǒng)計技術(shù)選擇(圖1和表1)。表1 在A549肺癌細(xì)胞株中高度甲基化的基因的列表
權(quán)利要求
用于肺癌診斷的生物標(biāo)記物包括肺癌特異性低調(diào)控基因PCDHGA12的甲基化的5’UTR和外顯子1區(qū)域(GenBank NM_032094，原粘鈣蛋白γ亞族A，12)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其特征在于，所述片段由至少包括 一個甲基化CpG 二核苷酸的SEQ ID NO :1表示。
3.肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其包含一個或者多個甲基化CpG島并由SEQID NO :2表示。
4.肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其包含一個或者多個甲基化CpG島并由SEQID NO :3表示。
5.肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其包含一個或者多個甲基化CpG島并由SEQID NO :4表示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任何一項所述的肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其特征在于，衍生于 肺癌特異性表達(dá)降低的基因POTHGA12 (GenBank ΝΜ_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)。
7.檢測肺癌或者它的發(fā)展階段的方法，該方法包括以下步驟(a)從臨床樣品中分離DNA；和(b)在分離的DNA中檢測PCDHGA12(GenBank NM_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)基 因的5’ UTR和外顯子1區(qū)域的甲基化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測肺癌或其發(fā)展階段的方法，其特征在于，所述PCDHGA12 基因的5，UTR和外顯子1區(qū)域的甲基化的檢測是在具有SEQ ID NO 1的序列的DNA區(qū)域 中實施的。
9.檢測肺癌或它的發(fā)展階段的方法，該方法包括以下步驟(a)從臨床樣品中分離DNA；和(b)在分離的DNA中檢測PCDHGA12(GenBank NM_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)基 因的5’ UTR區(qū)域的甲基化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測肺癌或者其發(fā)展階段的方法，其特征在于，所述檢測 P⑶HGA12基因的5’UTR區(qū)域的甲基化是在具有SEQ ID NO 2的序列的DNA區(qū)域中實施的。
11.檢測肺癌或者肺癌發(fā)展階段的方法，該方法包括以下步驟(a)從臨床樣品中分離DNA；和(b)在分離的DNA中檢測PCDHGA12(GenBank NM_032094，原粘鈣蛋白γ亞族Α，12)基 因的外顯子1區(qū)域的甲基化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的檢測肺癌或者其發(fā)展階段的方法，其特征在于，所述檢測 P⑶HGA12的外顯子1區(qū)域的甲基化是在具有SEQ ID NO 3或者4的DNA區(qū)域中實施。
13.根據(jù)權(quán)利要求7、9和11中任何一項所述的檢測肺癌和它的發(fā)展階段的方法，其特 征在于，所述甲基化的檢測是使用選自于PCR、甲基化特異性PCR、實時甲基化特異性PCR、 使用甲基化DNA-特異性結(jié)合蛋白的PCR、定量PCR、DNA芯片、焦磷酸測序法和重亞硫酸鹽 測序法組成的組中的方法進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求7、9和11中任何一項所述的檢測肺癌和它的發(fā)展階段的方法，其特 征在于，所述臨床樣品選自由從疑似患者或者待診斷的對象中獲取的組織、痰液、細(xì)胞、血 液和尿液組成的組中。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用肺癌特異性生物標(biāo)記物檢測肺癌的方法，尤其是肺癌診斷的生物標(biāo)記物，其可檢測其5’UTR或者外顯子1區(qū)域是在肺癌細(xì)胞中特異性甲基化的PCDHGA12基因的甲基化；和使用所述生物標(biāo)記物檢測肺癌和它的發(fā)展階段的方法。根據(jù)本發(fā)明的診斷試劑盒使得相比于傳統(tǒng)方法，在早期以準(zhǔn)確和快速的方式診斷肺癌成為可能，可用于肺癌和它的發(fā)展階段的預(yù)后和監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/68GK101970692SQ200980108952
公開日2011年2月9日 申請日期2009年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者吳泰禎, 安成晥, 文永鎬 申請人:基因特力株式會社