專利名稱：肺癌和食管癌相關基因adamts18的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測和診斷癌癥的方法以及用于治療和預防癌癥的方法。
_2] 優(yōu)先權本申請要求2009年8月24日提交的美國臨時申請No. US 61/275，039的權益，通過述及將其完整內容收入本文。
背景技術：
原發(fā)性肺癌是大多數國家中癌癥死亡的首要原因(NPL I)，而食管鱗狀細胞癌 (ESCC)是消化道的一種最常見的致命惡性腫瘤(NPL 2)。盡管手術技術和輔助化療有改進，晚期肺或食管癌的患者往往因病情進展而致命(NPL 1-2)。因此，了解這兩種主要胸部癌癥的生物學和開發(fā)更加有效的治療來改善患者的存活是極端重要的(NPL 3)。特異性分子靶向的概念已被應用于創(chuàng)新性癌癥治療策略的開發(fā)?，F在，臨床實踐中有兩種主要辦法可用治療性單克隆抗體和小分子作用劑(NPL 4)。至今，多種靶向療法諸如貝伐單抗、西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、索拉非尼(sorafenib)、和舒尼替尼已進行了治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的II期和III期試驗考察(NPL 4-8) 0在常規(guī)化療的基礎上添加針對血管發(fā)生性蛋白血管內皮生長因子(貝伐單抗)或表皮生長因子受體(西妥昔單抗)的治療性抗體已經給NSCLC患者提供了顯著的存活收益(NPL 4-5)。已顯示兩種小分子表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑——埃羅替尼和吉非替尼對一部分晚期NSCLC患者有效(NPL 6-7)。用兩種口服多重靶向受體酪氨酸激酶抑制劑索拉非尼 (c-RAF、b-RAF、血管內皮生長因子受體2和3、血小板衍生生長因子受體h、和KIT的抑制劑)和舒尼替尼(血小板衍生生長因子受體、KIT、FLT3、和血管內皮生長因子受體的抑制劑)進行的II期研究提示它們在治療晚期NSCLC中的功效(NPL 8)。然而，毒性問題限制了這些治療方案用于選定的患者，而且即使應用了所有可用類型的治療，呈現積極響應的患者的比例仍然非常有限(NPL 4-8)。為了分離用于診斷、治療、和/或預防肺癌和食管癌的潛在分子靶，先前借助由27，648種基因或表達序列標簽組成的cDNA微陣列對來自101名肺癌和19名ESCC患者的癌細胞實施了基因組范圍的基因表達譜分析(NPL 3，9-14)。為了驗證各基因產物的生物學和臨床病理學意義，通過臨床肺和食管癌材料的腫瘤組織微陣列分析與RNA干擾技術的組合建立了篩選系統(NPL15-33)。通過此篩選系統鑒定ADAMTS18為小細胞肺癌細胞中上調的因子 (W02007/013665)。ADAM家族中有兩個亞群膜錨定ADAM和分泌型ADAMTS。ADAM成員包含多個共同的域，包括原肽域、金屬蛋白酶域、解聯蛋白域、富半胱氨酸域、EGF樣域、跨膜域和胞質域，而ADAMTS成員在原肽域、金屬蛋白酶域和解聯蛋白域之外還含有血小板反應蛋白基序、富半胱氨酸域和間隔域(NPL 34)。雖然ADAMTS是可溶性蛋白質，但是它們似乎大多藉由其血小板反應蛋白基序或間隔區(qū)來結合胞外基質(NPL 35)。除ADAMTS10和-12外， ADAMTS均經由在位于原-域和催化域之間的弗林蛋白酶樣識別位點處發(fā)生的蛋白水解加工而被調節(jié)(NPL 35-36)。已記錄肺癌(NPL 16，37-45)和其它癌癥(NPL 37)，諸如腦腫瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等中數種ADAM和ADAMTS的生成的失調。盡管有這些報告，ADAMTS18 的激活在人癌癥進展中的意義及其作為治療靶的臨床潛力尚無完全記載。引用表專利文獻[PTL 1JPCT/JP2006/315254非專利文獻[NPL 1]Ahmedin J，Rebecca S，Elizabeth W, et al. Cancer statistics，2007. CA Cancer J Clin 2007 ；57 43-66[NPL 2] Shimada H，Nabeya Y，Ochiai T，et al. Surgery 2003;133:486-94[NPL 3]Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53[NPL 4]Thatcher N. Lung Cancer 2007 ；57Suppl 2 S 18-23[NPL 5] Sandler A, Gray R, Perry MC，et al. N Engl J Med 2006 ；355 :2542_50[NPL 6] Shepherd FA, Rodrigues Pereira J，Ciuleanu T，et al. N Engl J Med 2005 ；353 123-32[NPL 7]Thatcher N，Chang A, Parikh P，et al. Lancet 2005;366:1527-37[NPL 8]Cesare G，Paolo M, Filomena G，et al. Oncologist 2007 ；12 :191_200[NPL 9]Kikuchi T，Daigo Y, Katagiri T，et al. Oncogene 2003;22:2192-205[NPL 10]Kakiuchi S，Daigo Y，Tsunoda T，et al.Mol Cancer Res 2003 ；1 485-99[NPL ll]Kakiuchi S，Daigo Y，Ishikawa N，et al. Hum Mol Genet 2004 ；13 3029-43[NPL 12]Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N，et al. Int J Oncol 2006;28:799-805[NPL 13]Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75[NPL 14] Yamabuki T，Daigo Y，Kato T，et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84[NPL 15] Suzuki C，Daigo Y，Kikuchi T，et al. Cancer Res 2003;63:7038-41[NPL 16] Ishikawa N，Daigo Y，Yasui W, et al. Clin Cancer Res 2004 ；10 8363-70[NPL 17]Kato T，Daigo Y，Hayama S，et al. Cancer Res 2005;65:5638-46[NPL 18]Furukawa C，Daigo Y，Ishikawa N，et al. Cancer Res 2005 ；65 7102-10[NPL 19] Ishikawa N，Daigo Y，Takano A，et al. Cancer Res 2005;65:9176-84[NPL 20] Suzuki C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25[NPL 21] Ishikawa N，Daigo Y，Takano A，et al. Cancer Sci 2006 ；97 :737_45[NPL 22]Takahashi K，Furukawa C，Takano A，et al. Cancer Res2006 ；66 9408-19[NPL 23]Hayama S，Daigo Y，Kato T，et al. Cancer Res 2006;66:10339-48[NPL 24]Kato T,Hayama S,Yamabuki Y,et al. Clin Cancer Res2007 ;13 :434_42[NPL 25]Suzuki C，Takahashi K，Hayama S，et al. Mol Cancer Ther 2007 ；6 542-51[NPL26]Yamabuki T,Takano A,Hayama S，et al. Cancer Res 2007 ；67 :2517-25Hayama S，Daigo Y，Yamabuki T，et al. Cancer Res 2007 ；67 :4113-22Kato T，Sato N，Hayama S，et al. Cancer Res 2007 ；67 :8544-53Taniwaki M,Takano A,Ishikawa N，et al. Clin Cancer Res 2007 ；13 [NPL 30]Ishikawa N，Takano A，Yasui W, et al. Cancer Res 2007 ；67 :11601-11[NPL 31]Mano Y，Takahashi K，Ishikawa N，et al. Cancer Sci 2007 ；98
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7癥，或抑制癌細胞生長中使用而配制的。本發(fā)明的藥物組合物包括針對ADAMTS18基因的反義核苷酸或雙鏈分子(例如siRNA)，其抑制ADAMTS18基因的表達。本發(fā)明的還有另一個目的是提供針對ADAMTS18基因的反義核苷酸或雙鏈分子 (例如siRNA)的用途，特別是在癌癥治療和預防的背景中，更特別的是肺癌和食管癌的治療和/或預防。更具體地，本發(fā)明提供下述[I]至[26][I] 一種用于在受試者中檢測或診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法，包括測定源自受試者的生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平的步驟，其中所述表達水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示所述受試者罹患或有風險發(fā)生癌癥，其中所述表達水平是通過選自下組的任何方法測定的(a)檢測 ADAMTS18 基因的 mRNA ；(b)檢測由ADAMTS18基因編碼的蛋白質；和(c)檢測由ADAMTS18基因編碼的蛋白質的生物學活性，[2] [I]的方法，其中所述表達水平比所述正常對照水平高至少10%，[3] [I]或[2]的方法，其中該生物學活性為細胞增殖活性、N-糖基化活性、侵襲活性或基質金屬蛋白酶(MMP)活性，[4] 一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；(b)檢測該多肽或片段和該測試物質之間的結合；并(c)選擇結合該多肽或片段的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質，[5] 一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；(b)檢測該多肽或片段的生物學活性；(C)將該多肽或片段的生物學活性與在該物質不存在時檢測到的生物學活性比較；并(d)選擇阻抑該多肽的生物學活性的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質，[6] [5]的方法，其中該生物學活性為細胞增殖活性、N-糖基化活性、侵襲活性或基質金屬蛋白酶(MMP)活性，[7] 一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其包括下述步驟(a)使測試物質與表達ADAMTS18基因的細胞接觸；(b)檢測ADAMTS18基因的表達水平；(c)將該表達水平與在該測試物質不存在時檢測到的表達水平比較；并(d)選擇降低該表達水平的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質，[8] 一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與其中導入有載體的細胞接觸，該載體包含ADAMTS18基因的轉錄調節(jié)區(qū)和在該轉錄調節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；(b)測量所述報告基因的表達水平或活性；(C)將該表達水平或活性與在該測試物質不存在時檢測到的表達水平或活性比較；和(d)選擇降低該表達水平或活性的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質，[9] 一種雙鏈分子，其在導入表達ADAMTS18基因的細胞中時抑制該基因的表達， 其中該雙鏈分子包含有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包含與選自SEQ ID NO : 11和12的靶序列對應的核苷酸序列，且該反義鏈包含與該有義鏈的靶序列互補的核苷酸序列，使得該有義和反義鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子，[10] [9]的雙鏈分子，其中該有義鏈與反義鏈在該靶序列處雜交以形成該雙鏈分子，該雙鏈分子長度為19-25個核苷酸對，[11] [9]或[10]的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為單一多核苷酸構建體，其包含經單鏈連接的所述有義鏈和所述反義鏈，[12] [11]的雙鏈分子，其具有通式5’ -[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A]為有義鏈，其包含與選自SEQ ID NO 11和12的靶序列對應的核苷酸序列，[B]為單鏈且由3至23個核苷酸組成，且[A’ ]為反義鏈，其包含與選自SEQ ID NO 11和12的靶序列互補的核苷酸序列，[13] 一種載體，其編碼[9]至[12]中任一的雙鏈分子，[14]載體，它們包含包括有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中之任一種， 其中所述有義鏈核酸包含與SEQ ID NO :11或12對應的核苷酸序列，且所述反義鏈核酸由與該有義鏈互補的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導入表達ADAMTS18基因的細胞中時抑制細胞增殖，[15] 一種在受試者中治療或預防癌癥的方法，包括對所述受試者施用藥學有效量的針對ADAMTS18基因的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子抑制 ADAMTS18基因的表達，[16] [15]的方法，其中該雙鏈分子為[9]至[12]中任一的雙鏈分子，[17] [15]的方法，其中該載體為[13]或[14]的載體，[18] [I]至[8]和[15]至[17]任一的方法，其中該癌癥選自肺癌和食管癌，[19] 一種用于治療或預防癌癥的組合物，該組合物包含藥學有效量的針對 ADAMTS 18基因的雙鏈分子或包含所述雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子抑制ADAMTS18基因的表達，和可藥用的擔載體，[20] [19]的組合物，其中該雙鏈分子為[9]至[12]中任一的雙鏈分子，[21] [19]的組合物，其中該載體為[13]或[14]的載體，[22] [19]至[21]中任一的組合物，其中該癌癥選自肺癌和食管癌，[23] 一種用于診斷或檢測癌癥的試劑盒，包含用于檢測ADAMTS18基因的轉錄或翻譯產物的試劑，[24] [23]的試劑盒，其中該試劑包含結合ADAMTS18基因的轉錄產物的核酸或結合ADAMTS18基因的翻譯產物的抗體，
[25]用于診斷或檢測癌癥的試劑，其包含結合ADAMTS18基因的轉錄產物的核酸或結合ADAMTS18基因的翻譯產物的抗體，并[26] [23]或[24]的試劑盒，或[25]的試劑，其中該癌癥選自肺癌和食管癌。本文中描述的方法的一個優(yōu)點是在檢測到肺癌和食管癌的明顯臨床癥狀之前就鑒定出疾病。根據下面的詳細描述及根據權利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點會變得明顯。本領域技術人員會理解，本發(fā)明的一個或多個方面能符合某些目的，而一個或多個其它方面能符合某些其它目的。每個目的可以不是在它的所有方面同等適用于本發(fā)明的每一個方面。因此，前述目的可視為關于本發(fā)明的任何一個的備選。本發(fā)明的這些和其它目的和特征在閱讀下面的詳細描述連同附圖和實施例之后會變得更加清楚明白。然而，要理解，上面的發(fā)明概述和下面的詳細描述都是優(yōu)選實施方案，而非對本發(fā)明或本發(fā)明其它備選實施方案的限制。附圖簡述在考慮下面的附圖簡要描述和發(fā)明詳細描述及其優(yōu)選實施方案之后，本發(fā)明的各個方面和應用對熟練技術人員會變得明顯[圖la-b]圖I描繪肺癌和食管癌和正常組織中ADAMTS18的表達部分A描繪通過半定量RT-PCR分析檢測的15例臨床肺癌(肺ADC、肺SCCjP SCLC ;頂部小圖)和15種肺癌細胞系(底部小圖)中ADAMTS18基因的表達。部分B描繪通過半定量RT-PCR分析檢測的10例臨床ESCC(頂部小圖)和10種食管癌細胞系(底部小圖)中ADAMTS18基因的表達。[圖lc-d]圖I描繪肺癌和食管癌和正常組織中ADAMTS18的表達部分C描繪通過半定量RT-PCR分析檢測的5例臨床ESCC的癌性組織和正常組織中ADAMTS18基因的表達。部分D描繪通過Northern印跡分析檢測的正常人組織中ADAMTS18的表達。[圖2]圖2描繪針對ADAMTS18的siRNA對NSCLC和ESCC細胞的生長的抑制頂部小圖描繪半定量RT-PCR的結果，通過半定量RT-PCR分析確認DMSl 14和TE4細胞中響應針對 ADAMTS18 的 siRNA (si-ADAMTS18-#l 或 #2)或對照 siRNA (EGFP 或 LUC)ADAMTS18 的表達。中部和底部小圖描繪對用si-ADAMTS18或對照siRNA轉染的腫瘤細胞進行的MTT和集落形成測定的結果。[圖3a]圖3描繪外源ADAMTS18對細胞生長的影響在部分A中，左邊小圖描繪通過Western印跡檢測的C0S-7細胞中外源ADAMTS18的瞬時表達。右邊小圖描繪用 ADAMTS18cDNA或對照siRNA轉染的C0S-7細胞的MTT測定的結果。[圖3b]圖3描繪外源ADAMTS18對細胞生長的影響在部分B中，描繪外源 ADAMTS18對細胞生長的影響。左邊小圖描繪通過Western印跡檢測的A549細胞中外源 ADAMTS 18的瞬時表達，而右邊小圖描繪用ADAMTS18cDNA或對照siRNA轉染的A549細胞的 MTT測定的結果。[圖4a_b]圖4描繪外源ADAMTS18蛋白的翻譯后修飾、亞細胞定位和向培養(yǎng)基中的分泌在部分A中描繪與N-糖苷酶一起溫育后外源ADAMTS18蛋白的Western印跡的結果。在部分B中描繪與DAPI免疫共染色，通過抗FLAG檢測的C0S-7細胞中外源ADAMTS18 蛋白的亞細胞定位。[圖4c_d]圖4描繪外源ADAMTS18蛋白的翻譯后修飾、亞細胞定位和向培養(yǎng)基中的分泌在部分C中描繪通過半定量RT-PCR分析檢測的C0S-7細胞中ADAMTS18的表達。 在部分D中描繪通過Western印跡分析檢測的外源ADAMTS18蛋白向培養(yǎng)基中的分泌。[圖5a]圖5描繪通過將ADAMTS18導入哺乳動物細胞中而誘導的對細胞侵襲的增強、及外源或內源ADAMTS18的MMP活性在部分A中描繪測定的結果，證明ADAMTS18表達質粒轉染后Madrigal基質中C0S-7細胞的侵襲性質。顯示了吉姆薩染色(放大倍數， xlOO;下部小圖)和侵襲穿過經Matrigel包被的濾膜的細胞的相對數目(上部小圖)。測定在一式兩份的孔中進行兩次。[圖5b_d]圖5描繪通過將ADAMTS18導入哺乳動物細胞中而誘導的對細胞侵襲的增強、及外源或內源ADAMTS18的MMP活性在部分B中描繪與Matrigel測定同時實施的細胞生長測定的結果。在部分C中描繪通過MMP測定試劑盒評估的C0S-7細胞中外源 ADAMTS 18的MMP活性。在部分D中描繪si_ADAMTS18#l對DMS114細胞中內源ADAMTS18的 MMP活性的阻抑。發(fā)明詳述雖然任何與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明的實施方案，但是現在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料。然而，在描述本發(fā)明的材料和方法之前，要理解，本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案、 等，因為這些可依照常規(guī)實驗和優(yōu)化而變化。還要理解，該描述中使用的術語只是出于描述特定樣式或實施方案的目的，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權利要求來限制。通過述及明確地將此說明書中提到的每一篇出版物、專利或專利申請的公開內容完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開。除非另有定義，否則這里使用的所有技術和科學術語均具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員所共同理解的相同的意思。如果有沖突，當以本說明書，包括定義為準。定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非另有明確說明。與物質(例如多肽、抗體、多核苷酸、等)聯用的術語“分離的”和“純化的” 表示該物質基本上不含至少一種也可包括于天然來源中的物質。如此，分離的或純化的抗體指基本上不含細胞材料諸如碳水化合物、脂質、或其它來自衍生該蛋白質(抗體)的細胞或組織來源的污染性蛋白質的抗體，或當化學合成時基本上不含化學前體或其它化學品的抗體。術語“基本上不含細胞材料”包括這樣的多肽制備物，其中多肽被與用于分離或重組生產它的細胞的細胞成分分離。因此，基本上不含細胞材料的多肽包括這樣的多肽制備物， 其具有少于約30%、20%、10%、或5% (按干重計)的異源蛋白質(在本文中也稱作“污染性蛋白質”)。當多肽系重組產生時，其還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，包括具有少于約20%、 10%、或5%的蛋白質制備物體積的培養(yǎng)基的多肽制備物。當多肽通過化學合成產生時，其優(yōu)選基本上不含化學前體或其它化學品，包括具有少于約30 %、20%、10 %、5 % (按干重計)的蛋白質制備物體積的與該蛋白質合成有關的化學前體或其它化學品的多肽制備物。 例如，在蛋白質制備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍染色等等之后出現單一條帶，可以顯示特定蛋白質制備物含有分離的或純化的多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體和多肽是分離的或純化的?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子，諸如cDNA分子，當通過重組技術產生時，可基本上不含其它細胞材料或培養(yǎng)基，或當化學合成時可基本上不含化學前體或其它化學品。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明抗體的核酸分子是分離的或純化的。術語“多肽”、“肽”、和“蛋白質”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該等術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經過修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細胞中在翻譯后經過修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎化學結構(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結合)但具有經過修飾的R基團或經過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結構但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號來指稱。除非另有明確陳述，術語“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和 “核酸分子”可交換使用，并且與氨基酸類似，以普遍接受的單字母代碼來表示。類似于氨基酸，它們涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸、 或核酸分子可包含DNA、RNA或其組合。除非另有定義，術語“癌癥”指過表達ADAMTS18基因的癌癥，特別是肺癌，包括腺癌(ADC)、鱗狀細胞癌(SCC)、大細胞癌(LCC)、和小細胞肺癌(SCLC)，和食管癌。如本文中使用的，術語“雙鏈分子”指抑制靶基因表達的核酸分子，包括例如短干擾RNA (siRNA ；例如雙鏈核糖核苷酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA (shRNA))和短干擾DNA/ RNA(siD/R-NA ;例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發(fā)夾嵌合物 (shD/R-NA))。在本文中，“雙鏈分子”也稱作“雙鏈核酸”、“雙鏈核酸分子”、“雙鏈多核苷酸”、“雙鏈多核苷酸分子”、“雙鏈寡核苷酸”和“雙鏈寡核苷酸分子”。如本文中使用的，術語“靶序列”指靶基因的mRNA或cDNA序列內的這樣的核苷酸序列如果將靶向該序列的雙鏈分子導入表達靶基因的細胞中的話，會導致靶基因的整個mRNA的翻譯受到阻抑。對于基因的mRNA或cDNA序列內某個核苷酸序列，如果包含與靶序列對應的序列雙鏈分子抑制表達該基因的細胞中該基因的表達，則可確定其為靶序列。當靶序列用cDNA序列來顯示時，使用雙鏈cDNA的有義鏈序列(即mRNA序列轉變成DNA序列的序列)來限定靶序列。雙鏈分子包含具有與靶序列對應的序列的有義鏈，和具有與靶序列互補的序列的反義鏈，而且該反義鏈與該有義鏈在互補序列處雜交以形成雙鏈分子。在本文中，短語“與...對應”表示依照構成雙鏈分子有義鏈的核酸的種類來轉換靶序列。例如，當靶序列以DNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有RNA 區(qū)時，該RNA區(qū)內的堿基“t”用堿基“u”替換。另一方面，當靶序列以RNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有DNA區(qū)時，該DNA區(qū)內的堿基“u”用“t”替換。例如，當靶序列以RNA序列SEQ ID NO : 11或12顯示且雙鏈分子的有義鏈具有由DNA構成的3’側半區(qū)時，“與靶序列對應的序列”為 “5 ^ -GCCAGUAUCUCAAGAAATT-3 ' ”(對于 SEQ ID NO 11)或 “ 5 ' -GGGCACAACUTTGGUATGA-3 ' ”(對于 SEQ ID NO : 12)。還有，對于雙鏈分子的反義鏈，與靶序列互補的序列可依照構成反義鏈的核酸的種類來限定。例如，當靶序列以 RNA序列SEQ ID NO :11或12顯示且雙鏈分子的反義鏈具有由DNA構成的5’側半區(qū)時， “與靶序列互補的序列”為 “ 3 ' -CGGUCAUAGAGTTCTTTAA-5 ' ”(對于 SEQ ID NO : 11)或 “3' -CCCGUGUUGAAACCATACT-5' ” (對于 SEQ ID NO :12)。另一方面，當雙鏈分子由RNA構成時，與SEQ ID NO :11或12中所示靶序列對應的序列為SEQ ID NO :11或12的RNA序列，且與SEQ ID NO :11或12中所示靶序列對應的互補序列為 RNA 序列 “ 3 ' -CGGUCAUAGAGUUCUUUAA-5 ' ”(對于 SEQ ID NO : 11)或 “3' -CCCGUGUUGAAACCAUACU-5' ” (對于 SEQ ID NO :12)。除了與靶序列對應的序列及其互補序列之外，雙鏈分子還可具有一個或兩個長度為2至5個核苷酸的3’突出端(例如im)和/或連接有義鏈和反義鏈的環(huán)序列以形成發(fā)
夾結構。本文中使用的術語“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導入細胞的標準技術，包括其中以DNA為模板轉錄RNA的那些。所述siRNA包括有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。所述siRNA可如此構建使得單個轉錄物具有靶基因的有義核酸序列與其互補的反義核酸序列，例如，發(fā)夾結構。所述siRNA可為dsRNA或shRNA。本文中使用的術語“dsRNA”指包含相互互補序列的兩個RNA分子的構建體，所述兩個RNA分子通過所述互補序列退火以形成雙鏈RNA分子。所述兩條鏈的核苷酸序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因的非編碼區(qū)域的核苷酸序列的RNA分子。在本說明書中使用的術語“shRNA”是指具有莖-環(huán)結構的siRNA，其包含彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)(即有義鏈和反義鏈)。兩個區(qū)的互補程度和方向足以使兩個區(qū)之間發(fā)生堿基配對，所述第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接在一起，而所述環(huán)是因為環(huán)區(qū)內的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈(intervening single-strand) ”在本說明書中使用的術語“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA 二者的雙鏈多核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說明書中，雜合體表示這樣的分子，其中由DNA組成的多核苷酸和由RNA組成的多核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導入細胞的常規(guī)技術。所述siD/R-NA包括有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。siD/R-NA可以這樣構建，使單個轉錄物同時具有來自靶基因的有義核酸序列和互補反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/R-NA可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術語“dsD/R-NA”是指這樣兩個分子的構建體，所述兩個分子包含彼此互補的序列并且已經藉由所述互補序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因的非編碼區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA 的兩個分子中的一個或兩個由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者一個分子由RNA組成而另一個由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術語“shD/R-NA”是指具有莖-環(huán)結構的siD/R-NA，其包含彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。所述區(qū)的互補程度和方向足以使它們之間發(fā)生堿基配對，第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，所述環(huán)是因為在環(huán)區(qū)內的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈”。本說明書中使用的“分離的核酸”是指從本來的環(huán)境(例如自然出現時的自然環(huán)境)中被取出，從而與其自然狀態(tài)相比發(fā)生了合成性的改變的核酸。在本發(fā)明的背景中，分離的核酸包括DNA、RNA和它們的衍生物。I. ADAMTS18 多核苷酸和 ADAMTS18 多狀本發(fā)明部分基于下述發(fā)現自患病患者獲得的肺癌和食管癌細胞中ADAMTS18基因的表達升高。人ADAMTS18基因的核苷酸序列顯示于SEQID NO :1，而且也可作為GenBank 登錄號匪199355獲得。在本文中，ADAMTS18基因涵蓋人ADAMTS18基因以及其它動物的 ADAMTS18基因，包括但不限于非人靈長類動物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛，而且進一步包括等位突變體和在其它動物中找到的與ADAMTS18基因對應的基因。由人ADAMTS18基因編碼的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :2，而且也可作為 GenBank登錄號NP 955387. I獲得。在本發(fā)明的背景中，由ADAMTS18基因編碼的多肽稱作 “ADAMTS18”，而且有時稱作“ADAMTS18多肽”或“ADAMTS18蛋白”。依照本發(fā)明的一個方面，功能性等同物也包括在ADAMTS18蛋白中。在本文中， 蛋白的“功能性等同物”為具有與該蛋白等同的生物學活性的多肽。也就是，任何保留 ADAMTS18蛋白的生物學能力的多肽可用作本發(fā)明中的每種蛋白的此類功能性等同物。ADAMTS 18蛋白的生物學活性包括例如對細胞分化的調節(jié)活性和癌細胞增殖活性 (癌細胞增殖增強活性)。另外，ADAMTS18蛋白的生物學活性可包括N-糖基化活性、侵襲活性和MMP (基質金屬蛋白酶)活性。此類功能性等同物包括那些對ADAMTS18蛋白的天然存在氨基酸序列替代、刪除、 添加、和/或插入一個或多個氨基酸的?；蛘?，多肽可以是包含與ADAMTA18蛋白的序列(例如SEQ ID NO 2)具有至少約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優(yōu)選至少約90%至95% 同一性，甚至更優(yōu)選96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。在其它實施方案中，多肽可以由在嚴格條件下與ADAMTS18基因的天然存在核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。短語“嚴格(雜交)條件”指下述條件，在該條件下，核酸分子會與其靶序列雜交，通常在核酸的復雜混合物中，但沒有與其它序列的可檢測的雜交。嚴格條件取決于序列，而且在不同情況中會有所變化。較長的序列在較高的溫度發(fā)生特異性雜交。對于核酸雜交詳盡指導可見于 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地，嚴格條件選擇為在限定的離子強度和pH，比特定序列的熱熔點(Tm)低約5-10°C。Tm是如下的溫度 (在限定的離子強度、pH、和核酸濃度下)，其中50%的與靶互補的探針在平衡時與靶序列雜交(因為靶序列過量存在，所以在Tm，在平衡時50%的探針被占據)。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實現。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。例示性的嚴格雜交條件可以如下50%甲酰胺、5x SSCJP I % SDS,在 42°C溫育，或 5x SSC、I % SDS、在 65°C溫育，用 O. 2x SSC 和 O. I % SDS 在 50°C清洗。在本發(fā)明的背景中，用于分離編碼與人ADAMTS18蛋白在功能上等同的多肽的 DNA的雜交條件可由本領域技術人員常規(guī)選擇。例如，可如下進行雜交在68攝氏度用 “Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)進行30分鐘或更長的預雜交,添加經過標記的探針，并在68攝氏度溫育I小時或更長。下面的清洗步驟可在例如低嚴格度條件中進行。一種例示性的低嚴格度條件可包括42°C、2x SSC、0. 1% SDS，優(yōu)選50°C、2x SSC,O. 1% SDS。常常優(yōu)選使用高嚴格條件。一種例示性的高嚴格條件可包括在室溫在2x SSC.0. 1% SDS中清洗3次各20分鐘，然后在Ix SSC、0. 1% SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘， 并在Ix SSC、0. I % SDS中在50攝氏度清洗2次各20分鐘。然而，數種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴格度，而且本領域技術人員可選擇合適的因素以達到所需的嚴格度。一般而言，蛋白中一個、兩個或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白的功能。事實上，已知突變的或經過修飾的蛋白(即包含通過替代、刪除、插入和/或添加而修飾一個、兩個或更多個氨基酸殘基的氨基酸序列的肽)保留原始的生物學活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6 (1984) ；ZoIIer and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982))。因而，本領域技術人員會認識到，對氨基酸序列進行個別添加、刪除、插入、或替代，這改變單個氨基酸或少數氨基酸，或者被認為是“保守修飾”的那些修飾——其中蛋白的改變產生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明的背景中可接受的。如此，在一個實施方案中，本發(fā)明的肽可具有在人ADAMTS18序列中添力卩、插入、刪除、和/或替代一個、兩個或甚至更多個氨基酸的氨基酸序列。只要保持蛋白的活性，氨基酸突變的數目不受特別限制。然而，一般優(yōu)選改變氨基酸序列的5%或更少。因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，在此類突變體中要突變的氨基酸數目一般為30個氨基酸或更少，優(yōu)選20個氨基酸或更少，更優(yōu)選10個氨基酸或更少，更優(yōu)選 6個氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選3個或4個氨基酸或更少。要突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)楸３衷摪被岬膫孺溙匦缘牧硪环N氨基酸(稱為保守性氨基酸替代的過程)。氨基酸側鏈特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W， Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能團或特征的側鏈 脂肪族側鏈(G，A，V，L，I，P);含有羥基基團的側鏈(S，T，Y);含有硫原子的側鏈(C，M);含有羧酸和酰胺的側鏈(D，N, E，Q);含有堿的側鏈(R，K，H);和含有芳香族的側鏈(H，F，Y， W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領域是公知的。例如，下列8個組各種包含彼此構成保守性替代的氨基酸I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；
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6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守性修飾多肽包括在本發(fā)明的ADAMTS18蛋白中。然而，本發(fā)明并不僅限于此，而且ADAMTS18蛋白包括非保守性修飾，只要它們保留ADAMTS18蛋白的至少一種生物學活性即可。另外，經過修飾的蛋白并不排除多態(tài)變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼的。此外，本發(fā)明的ADAMTS18基因涵蓋編碼ADAMTS18蛋白的此類功能性等同物的多
核苷酸。II.診斷癌癥II-1.用于診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法發(fā)現ADAMTS18基因的表達在患有癌癥，尤其是肺癌和食管癌細胞的患者中特異性升高。因而，ADAMTS18基因，及其轉錄和翻譯產物可以在診斷上用作過表達ADAMTS18基因的癌癥，諸如肺癌和食管癌的標志物。此外，通過測量源自受試者的生物樣品，諸如細胞樣品中ADAMTS18基因的表達，能診斷或檢測肺癌或食管癌。此類診斷或檢測可通過在源自受試者的樣品和正常樣品之間比較ADAMTS18基因的表達水平來實施。更特別地，本發(fā)明提供了一種用于在受試者中檢測或診斷癌癥和/或發(fā)生癌癥的傾向性的方法，其通過測定源自受試者的生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平來進行。要通過本方法診斷或檢測的優(yōu)選癌癥包括肺癌和食管癌。在本發(fā)明的背景中，“肺癌”包括小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。類似地，“NSCLC”包括腺癌、鱗狀細胞癌(SCC)和大細胞癌?；蛘?，本發(fā)明提供了一種用于檢測或鑒定源自受試者的肺或食管組織樣品中的癌細胞的方法，所述方法包括測定源自受試者的組織樣品中ADAMTS18基因表達水平的步驟， 其中所述表達水平與正常對照水平相比的升高指示組織中存在或懷疑存在癌細胞。此類結果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護士、或其它從業(yè)人員診斷受試者患有疾病或傾向于發(fā)生疾病?；蛘?，本發(fā)明可以給醫(yī)生提供有用信息來診斷受試者患有疾病。 例如，依照本發(fā)明，當關于自受試者獲得的組織中癌細胞的存在有疑問時，醫(yī)生通過考慮這項觀察和其它方面，包括組織的病理學發(fā)現、血液中的已知腫瘤標志物的水平、或受試者的臨床過程等，會做出臨床決策。例如，血液中的一些公知的診斷性肺癌標志物包括ACT、BFP、 CA 19-9, CA50、CA72-4、CA130、CA602、CEA、IAP、KMO-U SCC、SLX、SPU Span-1, STN、TPAjP 細胞角蛋白19片段?；蛘撸褐械脑\斷性食管腫瘤標志物諸如CEA、DUPAN-2、IAP、NSE、 SCC、SLX和Span-I也是公知的。就是說，在一個具體實施方案中，依照本發(fā)明，也可提供檢查受試者狀況的中間結果。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測癌癥的診斷標志物的方法，該方法包括檢測源自受試者的生物樣品中ADAMTS18基因的表達(作為癌癥的診斷標志物) 的步驟。優(yōu)選的要通過本方法診斷的癌癥包括肺癌和食管癌。在本發(fā)明的背景中，術語“診斷”意欲涵蓋預測和似然性分析。本方法意欲用于臨床以對關于治療模式作出決定，治療模式包括治療介入、診斷標準諸如疾病的分期，以及針對癌癥的疾病監(jiān)視和監(jiān)測。根據本發(fā)明，還可提供用于檢查受試者狀況的中間結果。所述中間結果可與其它信息結合起來以協助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員確定受試者罹患所述疾病?；蛘?，本發(fā)明可用于檢測源自受試者的組織中的癌性細胞，并給醫(yī)生提供有用信息來診斷受試者患有所述疾病。要通過本方法診斷的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性哺乳動物包括但不限于人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。為實施診斷，優(yōu)選從要對其進行診斷的受試者采集生物樣品。任何生物學材料均可作為用于測定的生物樣品，只要它能由于癌癥而包括目標的ADAMTS18基因轉錄或翻譯產物。所述生物樣品包括，但不限于，身體組織與體液，例如血液，痰，與尿液。生物樣品優(yōu)選含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，更優(yōu)選源自懷疑為癌性的組織的肺或食管上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，并將其用為生物樣品?；蛘?，生物樣品可以是自懷疑為癌性的區(qū)域收集的組織樣品。優(yōu)選地，所述組織樣品可以是肺組織樣品或食管組織樣品。根據本發(fā)明，測定在所述源自患者的生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平。表達水平可在轉錄產物(即mRNA)水平確定，使用本領域熟知的方法。舉例而言，ADAMTS18基因的mRNA可通過雜交方法(例如,Northern雜交)使用探針定量。所述檢測可在濾器、芯片或陣列上實施。對檢測包括ADAMTS18基因在內的多個基因(例如，多種癌癥特異性基因) 的表達水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領域技術人員可利用ADAMTS18基因的序列信息制備上述探針。舉例而言，ADAMTS18基因的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物例如染料或同位素來標記，且所述基因的表達水平可以作為發(fā)生雜交的標記物的強度來加以檢測。進一步，ADAMTS18基因的轉錄產物可通過基于擴增的檢測技術(例如，RT-PCR) 使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制備。舉例而言，用于實施例的引物(SEQ ID N0:3和4)可用于通過RT-PCR的檢測，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件與低嚴格條件下與ADAMTS18基因的mRNA雜交。如本文中使用的，短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地，嚴格條件的溫度選擇為比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm) 低大約5°C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被占據。典型地，嚴格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約 0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現。探針或引物可以是特定大小。該大小選自下組至少10個核苷酸、至少12個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸、至少30個核苷酸，而且探針和引物的大小范圍可以為5-10個核苷酸、10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-25個核苷酸和 25-30個核苷酸?；蛘?，本發(fā)明的診斷或檢測可以通過檢測ADAMTS18基因的翻譯產物(即蛋白質) 來進行。例如，可以確定ADAMTS18蛋白的量。測定作為翻譯產物的蛋白量的方法包括免疫測定，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，任何抗體片段或經修飾抗體(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測,只要它們保留對ADAMTS18蛋白的結合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于ADAMTS18的翻譯產物檢測其基因的方法，可利用針對ADAMTS18蛋白的抗體通過免疫組織化學分析觀察其染色的強度。即，觀察到強染色表明所述蛋白質的存在增加， 且同時表明ADAMTS 18的高表達水平。另外，翻譯產物可基于其生物學活性來檢測。具體而言，在本文中證明了 ADAMTS18 蛋白涉及癌細胞生長。因此，可使用ADAMTS18蛋白的癌細胞生長促進能力作為生物樣品中存在的ADAMTS18蛋白的指標。在本文中，細胞生長促進活性也稱作“細胞增殖活性”或“細胞增殖增強活性”。另外，除ADAMTS18基因的表達水平外，亦可確定其它癌癥相關基因，例如已知在肺癌或食管癌中有差異表達的基因的表達水平，以提高所述診斷的準確性。如上所述，本發(fā)明的方法將源自受試者的生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平與“對照水平”比較。在本發(fā)明的背景中，短語“對照水平”指在對照樣品中檢測到的ADAMTS18基因的表達水平，而且涵蓋正常對照水平和癌癥對照水平二者。短語“正常對照水平”指在正常健康個體中或在已知沒有罹患癌癥的個體群體中檢測到的ADAMTS18基因表達水平。正常對照指沒有肺癌和食管癌臨床癥狀的個體。正常對照水平可使用自非癌性組織獲得的正常細胞來測定?！罢φ账健币部梢允窃谝阎獩]有罹患肺癌或食管癌的個體或群體的正常健康組織或細胞中檢測到的ADAMTS18基因的表達水平。另一方面，短語“癌癥對照水平”指在罹患肺或食管癌的個體或群體的癌性組織或細胞中檢測到的ADAMTS 18基因的表達水平。源自受試者的樣品中檢測到的ADAMTS18基因表達水平較之正常對照水平的升高表明受試者(獲得樣品的來源)罹患或有風險發(fā)生肺癌或食管癌。在本發(fā)明的背景中，源自受試者的樣品可以是任何自待測受試者(例如已知具有或懷疑具有癌癥的患者)獲得的組織。例如，組織可包括上皮細胞。更特別地，組織可以是癌性上皮細胞?；蛘?，可以將樣品中的ADAMTS18基因表達水平與ADAMTS18基因的癌癥對照水平比較。樣品的表達水平和癌癥對照水平之間的相似性表明受試者(獲得樣品的來源)罹患或有風險發(fā)生癌癥。在本文中，當基因表達水平較之對照水平增加了例如10%，25%或50%的話，或增加至少O. I倍、至少O. 2倍、至少O. 5倍、至少2倍，至少5倍，至少10倍或者更多，則認為基因表達水平是“增加”的。因而，若生物樣品中癌標志物基因(包括ADAMTS18基因)的表達水平較之響應癌標志物基因的正常對照水平增加了例如10 %或更多、25 %或更多、或 50%或更多，或者增加到超過I. I倍、超過I. 5倍、超過2. O倍、超過5. O倍、超過10. O倍、 或更多，則可認為它是升高的。靶基因的表達水平可通過檢測(例如測定)核酸探針對樣品中基因轉錄物的雜交強度來確定。對照水平可以與測試生物樣品同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性) 已知的受試者收集和保存的樣品?；蛘?，對照水平可以借助統計方法，根據通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的ADAMTS18基因表達水平獲得的結果加以確定。 進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數據庫。而且，根據本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自患者的樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中ADAMTS18基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值 +/-3S. D.的范圍可以用作標準值?？傊?，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則會稱作“癌性對照水平”。在本發(fā)明的背景中，當 ADAMTS18基因的表達水平相比正常表達水平有所提高或與癌性對照水平相似，則受試者可診斷為正罹患或有風險發(fā)生癌癥。進一步，當比較多種癌癥相關基因的表達水平時，樣品與癌性參照之間基因表達模式的相似性表明受試者正罹患或有風險發(fā)生癌癥。測試生物樣品的表達水平與對照水平間的差異，可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照核酸(例如管家基因)的表達水平加以標準化。示例對照基因包括，但不僅限于，肌動蛋白、甘油醛_3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白P1。另外，本發(fā)明提供了 ADAMTS18基因作為癌性標志物的用途。ADAMTS18基因特別可用作肺癌和食管癌性標志物。例如，可以通過檢測ADAMTS18基因的表達水平作為癌性標志物來確定生物樣品是否含有癌性細胞，尤其是肺或食管癌性細胞。具體地，生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平與正常對照水平相比升高表明該生物樣品含有癌性細胞。 ADAMTS18基因的表達水平可通過如上所述檢測該基因的轉錄產物或翻譯產物來確定。ΙΙ-2.評估癌癥治療的功效在正常和癌性細胞之間差異表達的ADAMTS18基因還允許對癌癥治療的過程進行監(jiān)視，而且上述用于診斷癌癥的方法可用于評估治療對癌癥的效力。具體地，治療對癌癥的效力可以通過確定來自接受治療的受試者的細胞中ADAMTS18基因的表達水平進行評估。 如果期望，在不同的時間點，治療前、治療中和/或治療后，從受試者獲得測試細胞群體。 ADAMTS18基因的表達水平可以例如按照上文“ΙΙ-1.用于診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法”項下描述的方法加以確定。在本發(fā)明的語境中，用來與檢測到的表達水平比較的對照水平優(yōu)選是從沒有暴露于目標處理的細胞內的ADAMTS18基因表達獲得的。如果ADAMTS18基因的表達水平與從正常細胞或不含癌細胞的細胞群體獲得的對照水平進行比較，則表達水平相似表明目標治療是有效的，表達水平不同表明治療的臨床結果或預后不利。另一方面，如果比較是針對從癌細胞或含有癌細胞的細胞群體獲得的對照水平，則表達水平不同表明是有效的治療，而表達水平相似表明臨床結果或預后不利。而且，可以根據本發(fā)明的方法比較ADAMTS18基因在治療之前和之后的表達水平， 以評估治療的效力。具體地，將治療后來自受試者的生物樣品中檢測到的表達水平(即治療后水平)與來自同一受試者的在治療開始前獲得的生物樣品中檢測到的表達水平(即治療前水平)進行比較。治療后水平與治療前水平相比降低，表明目標治療是有效的，而治療后水平與治療前水平相比增加或相似則表明臨床結果或預后不利。如這里所使用的，術語“有效”是指治療導致受試者體內被病理上調基因的表達降低，被病理下調基因的表達增加或者癌的大小、普遍性或轉移潛力降低。當預防性地應用感興趣的治療時，“有效”是指治療可延緩或防止腫瘤的形成，或者延緩、防止或減輕癌癥的至少一種臨床癥狀。受試者體內腫瘤狀況的評估可以用標準臨床規(guī)程實施。此外，治療的有效性可以聯合任何已知的用于診斷癌癥的方法加以確定。癌癥可以通過例如鑒定癥狀性異常，例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲不振、惡心、嘔吐和全身性不適、虛弱和黃疸，來加以診斷。以本發(fā)明的方法和組合物在“預防”和“防范”的語境下有用為限，這兩個術語在本文中可互換使用，指降低源自疾病的死亡率或發(fā)病率負擔的任何活動。預防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病的進展與癥狀的出現、以及通過恢復功能和減輕疾病相關并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負面影響的活動。或者，預防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴重性(例如降低腫瘤的增殖和轉移等)的廣泛的預防性療法。治療和/或預防癌癥和/或預防其手術后復發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術去除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉移。癌癥的有效治療和/或預防可降低患癌個體死亡率及改善其預后，降低其血液中腫瘤標志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構成有效治療和/或預防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。III.試劑盒和試劑本發(fā)明還提供了用于檢測或診斷癌癥的試劑，即ADAMTS18基因的能檢測轉錄或翻譯產物的試劑。此類試劑的例子包括能夠在源自受試者的生物樣品中(a)檢測 ADAMTS 18 基因的 mRNA ；(b)檢測 ADAMTS18 蛋白；和 / 或(c)檢測ADAMTS18蛋白的生物學活性，的試劑。合適的試劑包括特異性結合或鑒定ADAMTS18基因的轉錄產物的核酸。例如，特異性結合或鑒定ADAMTS18基因的轉錄產物的核酸包括例如具有與ADAMTS18基因轉錄產物一部分互補的序列的寡核苷酸(例如探針和引物)。此類寡核苷酸例如對感興趣基因的mRNA 特異性的引物和探針，它們可基于本領域公知的方法來制備。或者，抗體可例示用于檢測該基因的翻譯產物的試劑。可提到上文‘n-ι.用于診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法’項下描述的探針、引物、和抗體作為此類試劑的合適例子。這些試劑可用于上文所述癌癥，特別是肺癌和食管癌的診斷或檢測。使用這些試劑的測定形式可以是Northern雜交或夾心式ELISA，二者都是本領域公知的。檢測試劑可以以試劑盒的形式包裝在一起。例如，可以將檢測試劑包裝在不同的容器中。另外，檢測試劑可以與檢測必需的其它試劑包裝在一起。例如試劑盒可包括作為檢測試劑的核酸或抗體(或與固體基質結合，或與使其與基質結合的試劑分開包裝)、對照試劑(陽性和/或陰性)、和/或可檢測標記物。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)和用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器。這些試劑之類的可以包含在帶有標簽的容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。試劑盒中還可以包括實施測定的說明(例如書面說明書、 磁帶、VCR、CD-ROM 等)。雖然本試劑盒適合于檢測和診斷肺癌和食管癌，但是它也可用于評估癌癥預后和 /或監(jiān)測癌癥治療的功效。作為本發(fā)明的一個方面，可以將用于診斷或檢測癌癥的試劑固定在固體基質上， 諸如多孔條(porous strip)，以形成至少一個用于檢測癌癥的位點。多孔條的測量或檢測區(qū)可以包括多個位點，每個位點都含有檢測試劑(例如核酸)。測試條也可以包含陰性和/ 或陽性對照的位點?；蛘?，對照位點可以設置于與測試條不同的條上。任選的是，不同檢測位點可以包含不同量的固定化檢測試劑(例如核酸)，即第一個檢測位點的量較多，后續(xù)位點的量較少。添加測試生物樣品后，展現出可檢測信號的位點數目提供了樣品中的ADAMTS 18基因表達水平的定量指標(quantitative indication)。檢測位點的形狀可以設置成任何合適的可檢測形狀，一般為跨越測試條寬度的條狀或點狀。IV.篩詵方法使用ADAMTS18基因、由該基因編碼的多肽或其片段、或該基因的轉錄調節(jié)區(qū)，有可能篩選改變該基因的表達或由基因編碼的多肽的生物學活性的物質。此類物質可作為藥物用于治療或預防癌癥，特別是肺癌和食管癌。因此，本發(fā)明提供了使用ADAMTS18基因、由該基因編碼的多肽或其片段、或該基因的轉錄調節(jié)區(qū)篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法。通過本發(fā)明的篩選方法分離的物質是預期抑制ADAMTS18基因的表達、或該基因的翻譯產物的活性的物質，因此是用于治療或預防可歸于例如細胞增殖性疾病的疾病，諸如癌癥(特別是肺癌和食管癌)的候選者。就是說，認為通過本方法篩選的物質具有臨床好處且可進一步測試其在動物模型或測試受試者中預防癌細胞生長的能力。在本發(fā)明的背景中，待通過本篩選方法鑒定的物質可以是任何化合物或包含數種化合物的組合物。而且，在本發(fā)明的篩選方法中暴露于細胞或蛋白的測試物質可以是單種化合物或多種化合物的組合。當在方法中使用化合物組合時，各化合物可以順次或同時加以接觸。任何測試物質，例如，細胞提取物、細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構建體， 例如反義RNA、siRNA、核酶、等等)以及天然化合物，均可用于本發(fā)明的篩選方法中。在本文所述篩選中有用的測試物質也可以是特異性結合感興趣蛋白或其缺失原蛋白的體內生物學活性的部分肽的抗體。也可使用本領域熟知的很多組合文庫方法中的任何途徑來獲得本發(fā)明的測試物質，包括(I)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries),(3)需要解卷積(deconvolution)的合成文庫法，(4) “一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文庫法，以及(5)使用親和層析選擇的合成文庫法。使用親和層析選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145-67)。合成分子文庫方法的例子可在現有技術中找到(Deffitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 6909-13 ；Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al., J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al. , Science 1993, 2611303-5 ；Care11 et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ；Carell et al.,Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 :2061 ；Gallop et al. , J Med Chem 1994,37:1233-51)?；衔镂膸炜商峁┯谌芤褐?參見 Houghten, Bio/Techniques 1992,13:412-21)或珠子上(Lam, Nature 1991,354: 82-4)、芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、細菌上(美國專利 5，223，409)、孢子上 (美國專利 5，571，698，5，403，484 與 5，223，409)、質粒上(Cull et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386-90 ; Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ;美國專利申請 2002103360)。盡管測試物質文庫的構建是本領域眾所周知的，在下文中還是進一步提供了鑒定測試物質和構建用于本篩選方法的這些測試物質的文庫的指導。在本文中，揭示了阻抑ADAMTS18的表達水平和/或生物學活性導致癌細胞生長的阻抑。因此，當某種物質阻抑ADAMTS18的表達和/或活性時，該阻抑指示受試者中的潛在治療效果。在本發(fā)明的背景中，潛在治療效果指具有合理預期的臨床好處。此類臨床好處的例子包括但不限于(a)ADAMTS18基因表達的減少，(b)受試者中癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、或轉移潛力的降低，(C)預防癌癥發(fā)生，或(d)預防或緩解癌癥的臨床癥狀。A.分子律樽:對具有目標性質的化合物的分子結構和/或對ADAMTS18蛋白的分子結構的知識為人們構建測試物質文庫提供了便利。預篩選適于進一步評估的受試物質的方法之一，利用對受試物質與其靶標的相互作用進行計算機建模。計算機建模技術為選定分子的三維原子結構的可視化以及會與該分子相互作用的新化合物的合理設計提供了可能。三維構建典型地依賴于來源于選定分子的X-射線晶體分析或NMR成像的數據。分子動力學需要力場數據。計算機圖形系統為預測新化合物如何連接靶分子，以及實驗操作化合物和靶分子的結構以完善結合特異性提供了可能。為了預測當分子和化合物之一或二者都發(fā)生細小改變時分子-物質相互作用是什么樣的，需要分子力學軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯著分子設計程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅動的界面。上文一般性描述的分子建模系統的一個實例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動力學功能。QUANTA執(zhí)行構建、圖形建模和分子結構分析。利用QUANTA可進行分子相互行為的互動性構建、修飾、可視化和分析。關于與特異蛋白相互作用的藥物的計算機建模主題已經發(fā)表了多篇文獻，其例子包括 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ;Ripka, New Scientist 1988，54-8 ;McKinlay&Rossmann， Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989,29: 111-22 ；Perry&Davies, Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40,141-62 ;以及關于核酸組分模型受體的 Askew et al.，JAm Chem Soc 1989，111 1082-90o其它可篩選并圖形描述化學物質的計算機程序可以從例如Mississauga， Ontario，Canada 的 BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc 公司、Cambridge，Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見例如DesJarlais et al.，J Med Chem 1988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24 ；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993，259 :1445_50。一旦鑒定出推定的抑制劑，可使用組合化學技術基于鑒定出的推定抑制劑的化學結構構建任何數量的變體，如下所述。所得的推定抑制劑文庫可使用本發(fā)明的方法篩選，以鑒定適于治療和/或預防癌癥和/或預防癌癥術后復發(fā)的物質，特別是肺癌和食管癌。B.組合化學合成測試物質的組合文庫可以作為合理藥物設計程序的一部分來制備，合理藥物設計程序涉及有關已知抑制劑中存在的核心結構的知識。這種策略使得文庫可以保持合理的規(guī)模，便于進行高通量篩選?；蛘?，可通過簡單地合成構成文庫的分子家族的所有排列，來構建簡單的，特別是短的、聚合物性的分子文庫。后一種方法的一個實例是由所有長度為6個氨基酸組成的肽文庫。這種肽文庫包含所有六氨基酸序列排列。這種類型的文庫稱作線性組合化學文庫。組合化學文庫的制備是本領域技術人員所熟知的，可以通過化學或生物合成來產生。組合化學文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ;Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37 :487-93 ;Houghten et al.，Nature 1991，354 :84-6) 也可以使用其它用于產生化學多樣性文庫的化學。這些化學包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布 WO 91/19735)，被編碼的肽(例如WO 93/20242)，隨機生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美國專利5，288，514)，diversomer如乙內酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多月太(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非妝類妝模擬物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 9217-8)，小化合物文庫的模擬物有機合成(analogous organic synthese) (Chen et al.， J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氛基甲酸鹽(Cho et al.，Science 1993,261 1303)，和 / 或妝酸勝酸酯(peptidylphosphonates) (Campbell et al.，J Org Chem 1994， 59:658)，核酸文庫(見 Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology 1995 補充; Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文庫(見例如美國專利5，539，083)，抗體文庫(見例如 Vaughan et al. ,Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文庫(見例如 Liang et al. ,Science 1996，274 :1520-22 ;美國專利 5，593，853)，和有機小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec I ；6 (6) 624-31 ;類異戊二烯(isoprenoids)，美國專利 5，569，588 ;噻唑焼酮(thiazoIidinones) 和偏硫雜氮雜環(huán)己焼(metathiazanone)，美國專利5，549，974 ;卩比咯焼(pyrrolidines)， 美國專利5，525，735和5，519，134 ;嗎啉代化合物，美國專利5，506，337;苯并二氮卓， 5，288，514;等)。用于制備組合文庫的設備是可商購的(見例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY, Symphony, Rainin，Woburn, MA，433A Applied Biosystems, Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有多種組合文庫本身也是商業(yè)可得的(見例如 ComGenex，Princeton，N. J.，Tripos，Inc.，St. Louis，MO，3D Pharmaceuticals，
23Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。C.其它候詵物:另一種手段是使用重組細菌噬菌體來產生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott&Smith，Science 1990, 249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ；Devlin et al. , Science 1990，249 :404-6)，可以構建非常大的文庫 (例如106-108個化學實體)。再一種手段主要使用化學方法，其實例包括Geysen方法 (Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987，102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251:767-73)。Furka 等 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ； Furka, Int J Peptide Protein Res 1991,37 :487-93), Houghten (美國專利 4，631，211) 和Rutter等(美國專利5，010, 175)記載了產生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動劑或拮抗劑加以測試。適體是由緊密結合特定分子祀的核酸構成的大分子。Tuerk和Gold(Science. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通過指數式富集進行的配體系統性進化)方法來選擇適體。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文庫(例如IO15種不同分子)可用于篩選。通過本發(fā)明任何篩選方法篩選到的化合物的一部分結構通過添加、刪除、和/或置換方式被轉換而得到的化合物，包括在通過本發(fā)明篩選方法鑒定的物質之內。此外，當所篩選的測試物質是蛋白質時，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定該編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的DNA。所得的DNA 可用于制備作為治療或預防癌癥的候選物的測試物質。IV-1.基于蛋白質的篩詵方法依照本發(fā)明，ADAMTS18基因的表達對于癌細胞，特別是肺癌和食管癌細胞的生長和/或存活是至關重要的。另外，在本發(fā)明中證明了 ADAMTS18蛋白具有N-糖基化活性、侵襲活性及MMP (基質金屬蛋白酶)活性。因而，會假設阻抑ADAMTS18多肽功能的物質抑制癌細胞的生長和/或存活，并因此可用于治療或預防癌癥。因此，本發(fā)明提供了使用ADAMTS18 多肽來篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法。另外，本發(fā)明還提供了使用ADAMTS18 多肽來篩選用于抑制癌細胞生長和/或存活的候選物質的方法。除了 ADAMTS18多肽之外，該多肽的片段也可用于本篩選，只要該片段保留天然存在的ADAMTS18多肽的至少一種生物學活性。在優(yōu)選的實施方案中，ADAMTS 18多肽的片段可包括該多肽的金屬蛋白酶域(例如SEQ ID NO 2的293至494)?；蛘撸珹DAMTS18的成熟多肽(例如SEQ ID NO 2的285至1221)可用于本發(fā)明的篩選方法。ADAMTS 18蛋白可借助體外翻譯系統在體外產生。要與測試物質接觸的ADAMTS18多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質或與其他多肽融合的融合蛋白。用于本發(fā)明方法的多肽或片段可從自然界作為天然存在蛋白質通過常規(guī)純化方法獲得，或基于所選擇的氨基酸序列通過化學合成獲得。例如，可用于合成的常規(guī)肽合成法包括I)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；
2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；3) Peptide Synthesis (日語)，Maruzen Co. , 1975 ；4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日語)，Maruzen Co. , 1985 ；5) Development of Pharmaceuticals (第二 卷)(日語)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；6)W099/67288 ;和7) Barany G. &Merrif ield R. B. , Peptides Vol.2, “Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press, New York,1980，100-118。或者，可通過用于產生多肽的任何已知基因工程方法來獲得該蛋白質(例如 Morrison J. , J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；CIark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology (Wu等人編輯)1983,101 :347-62)。例如，首先制備以可表達形式(例如位于包含啟動子的調節(jié)序列的下游)包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的適合的載體，然后轉化入合適的宿主細胞，接著培養(yǎng)宿主細胞以產生蛋白質。更具體的說，通過將編碼ADAMTS18 多肽的基因插入用于表達外來基因的載體諸如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3. I、pCAGGS或 PCD8，在宿主(例如動物)細胞等中表達該基因。啟動子可用于表達?？墒褂萌魏纬Ｓ玫膯幼樱ɡ?SV40 早期啟動子(Rigby in Williamson(編)，Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982,83-141)、EF_ α 啟動子(Kim et al. ,Gene 1990,91 217-23)、CAG啟動子(Niwa et al. ,Gene 1991，108 :193)、RSV LTR啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 :684-704)、SR α 啟動子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 1988， 8 :466)、CMV 立即早期啟動子(Seed et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1987,84:3365-9)、 SV40 晚期啟動子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，I :385-94)、腺病毒晚期啟動子(Kaufman et al. ,Mol Cell Biol 1989，9 :946)、HSV TK 啟動子等?？筛鶕魏畏椒▽⑤d體導入宿主細胞以表達ADAMTS18基因，例如電穿孔法(Chu et al. ,Nucleic Acids Res 1987，15 :1311-26)、磷酸鈣法(Chen et al. , Mol Cell Biol 1987，7 :2745-52)、DEAE 右旋糖苷法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 1984,12 :5707-17 ；Sussman et al.，Mol Cell Biol 1985，4 :1641-3)、脂轉染法(Deri jard B，Cell 1994，7 :1025-37 ;Lamb et al.， Nature Genetics 1993,5 :22-30 ；Rabindran et al. , Science 1993,259 :230-4)等。所述多肽或其片段可進一步連接其他物質，只要該多肽及片段保留至少一種生物學活性即可?？衫玫奈镔|包括肽、脂質、糖和糖鏈、乙?；⑻烊缓秃铣删酆衔锏?。可使用此類修飾來賦予該多肽及片段別的功能或使其穩(wěn)定。例如，對于多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識別位點(表位)導入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達為包含該表位的融合蛋白?；蛘撸梢允褂蒙唐坊谋砦?抗體系統(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。能夠利用其多克隆位點表達與例如β_半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S轉移酶和綠色熒光蛋白(GFP)形成的融合蛋白的載體是可商購的。本文中還提供了如下的融合蛋白，其通過導入僅由數個到十二個(adozen)氨基酸構成的小型表位加以制備，使得融合不會改變原多肽的性質?？梢允褂美缍嘟M氨酸 (His-標簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因 10蛋白(T7-標簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標簽)、E-標簽(單克隆噬菌體上的一種表位)等表位，和識別它們的抗體作為檢測多肽之間的結合活性的表位-抗體系統 (Experimental Medicine 13:85-90(1995))。IV-1-1.鑒定與多肽結合的物質與蛋白質結合的物質可能改變編碼該蛋白質的基因的表達或該蛋白質的生物學活性。因此，作為一方面，本發(fā)明提供了一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法， 包括步驟a)將測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；b)檢測多肽或片段與測試物質之間的結合(或結合活性)；并c)選擇與多肽結合的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。依照本發(fā)明，可評估測試物質抑制細胞生長或候選物質用于治療或預防ADAMTS18 相關疾病(例如癌癥)的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了使用ADAMTS18多肽或其片段篩選用于抑制細胞生長的候選物質或用于治療或預防ADAMTS18相關疾病(例如癌癥)的候選物質的方法，其包括下述步驟a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；b)檢測該多肽或片段和該測試物質之間的結合(或結合活性)；并c)將b)的結合與測試物質或化合物的治療效果關聯起來?；蛘?，依照本發(fā)明，還可評估或評價測試物質或化合物治療或預防癌癥的潛在治療效果。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于評估或評價測試物質治療或預防與 ADAMTS 18過表達有關的癌癥或抑制癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使測試物質與由ADAMTS18的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測該多肽和該測試物質之間的結合活性；并(c)將潛在治療效果和測試物質關聯起來，其中當物質結合多肽時，顯示潛在治療效果。在本發(fā)明的背景中，可以將治療效果與對ADAMTS18多肽或其功能性片段的結合水平關聯起來。例如，當測試物質結合ADAMTS18多肽或其功能性片段時，該測試物質可鑒定或選擇為具有所需治療效果的候選物質?；蛘?，當測試物質不結合ADAMTS18多肽或其功能性片段時，該測試物質可鑒定為沒有顯著治療效果的物質。在本發(fā)明中，揭示了阻抑ADAMTS18表達降低癌細胞生長。如此，通過篩選結合 ADAMTS18多肽的候選物質，可鑒定出可用于治療或預防癌癥的候選物質。這些候選物質可通過二次和/或更進一步篩選來評估治療或預防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療劑。測試物質與ADAMTS18多肽的結合可以例如通過使用針對該多肽的抗體的免疫沉淀來檢測。因此，為了進行上述檢測，優(yōu)選用于篩選的ADAMTS18多肽或其片段含有抗體識別位點。用于篩選的抗體可以是識別ADAMTS18多肽的抗原區(qū)(例如表位)的抗體。制備此類抗體的方法是本領域眾所周知的，并且任何方法都可用于本發(fā)明中來制備上述抗體及其等價物?；蛘?，ADAMTS 18多肽或其片段可作為在其N-或C-末端包含單克隆抗體的識別位點(表位)的融合蛋白而得到表達。所述抗體的特異性已被揭示是針對該多肽的N-或 C-末端的?？墒褂檬惺鄣谋砦?抗體系統(Experimental Medicine 1995,13:85-90)。通過利用其多克隆位點能表達具有例如β -半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體是市售的，并能用于本發(fā)明。此外，本領域還已知含有小得多的表位的融合蛋白，所述表位可通過與針對它的抗體的免疫沉淀而得以檢測(Experimental Medicine 1995,13:85-90)。上述由幾個到幾十個氨基酸組成的、不會改變ADAMTS18多肽或其片段的特性的表位也可用于本發(fā)明。例子包括多組氨酸(His標簽)、流感病毒聚集體(influenza aggregate) HA、人c_myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7標簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV標簽)、E標簽(單克隆噬菌體上的一種表位)等，而且識別它們的單克隆抗體可作為表位-抗體系統用于篩選結合 ADAMTS18 多肽的蛋白質(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。谷胱甘肽S-轉移酶(GST)也是一種熟知的作為要通過免疫沉淀進行檢測的融合蛋白的配對物(counterpart)。當GST用作為要與ADAMTS18多肽或其片段融合以形成融合蛋白的蛋白質時，可用針對GST的抗體或與GST特異性結合的物質，諸如谷胱甘肽(例如谷胱甘肽-Sepharose 4B),來檢測該融合蛋白。在免疫沉淀中，通過添加抗體UPjljADAMTSlS多肽或其片段自身，或標記到該多肽或片段上的表位)到ADAMTS18多肽和測試物質的反應混合物中形成免疫復合物。如果測試物質具有與該多肽結合的能力，那么所形成的免疫復合物應由ADAMTS18多肽、測試物質和抗體組成。反之,如果測試物質缺乏上述能力,那么所形成的免疫復合物僅由ADAMTS18 多肽和抗體組成。因此，可通過例如測量所形成的免疫復合物的大小來檢查測試物質與 ADAMTS18多肽結合的能力。任何用于檢測化合物大小的方法皆可使用，包括層析、電泳等。 例如，當小鼠IgG抗體用于檢測時,蛋白A或蛋白G Sepharose可用于定量所形成的免疫復合物。免疫沉淀詳見例如Harlowet al. ,Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52。SDS-PAGE分析被普遍使用于分析經免疫沉淀的蛋白，可以利用結合蛋白的分子量使用合適濃度的凝膠來分析該蛋白。檢測可以使用常規(guī)染色方法，諸如考馬斯染色或銀染色來實現，或者，對于難以檢測的蛋白質，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，標記細胞中的蛋白，并檢測該蛋白。當蛋白的分子量已知時，可以直接從 SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測定其序列。此外，用于篩選與其結合的物質的ADAMTS18多肽或其片段可結合于載體?？捎糜诮Y合多肽的載體的例子包括不溶性多糖，諸如瓊脂糖、纖維素和右旋糖苷；及合成樹脂，諸如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；優(yōu)選可以使用由上述材料制備的市售的珠和板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。使用珠時，可以將其填入柱子?；蛘?，在本領域中也已知使用磁珠，可以借助磁性容易地分離結合在珠上的多肽和物質。多肽與載體的結合可根據常規(guī)方法進行，諸如化學鍵合和物理吸附?；蛘?，多肽可藉由特異性識別蛋白質的抗體與載體結合。此外，還可以借助于相互作用的分子，諸如親合素與生物素的組合來進行多肽與載體的結合。利用上述結合于載體的ADAMTS18多肽或其片段的篩選包括例如將測試物質與結合于載體的多肽接觸，溫育該混合物，洗滌載體，并檢測和/或測量與結合于載體的物質。 該結合可在緩沖液中進行，例如但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要所述緩沖液不抑制該結合即可。
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當上述結合于載體的ADAMTS18多肽或其片段和組合物(例如細胞提取物、細胞裂解物等)用作為篩選方法中的測試物質時，這樣的方法通常被稱為親和層析。例如，可將 ADAMTS18多肽固定在親和柱的載體上，然后將含有能與該多肽結合的物質的測試物質施加于該柱子。在上樣測試物質后，洗滌柱子，接著用合適的緩沖液洗脫與多肽結合的物質。在本發(fā)明中，作為檢測或定量所結合物質的手段，可以使用利用表面等離子體共振現象的生物傳感器。當使用這樣的生物傳感器時，僅使用少量的多肽，而無需標記(例如 BIAcore, Pharmacia),即可以表面等離子體共振信號的形式實時觀察ADAMTS18多肽與測試物質之間的相互作用。因此,有可能利用生物傳感器,如BIAcore，來評估多肽與測試物質之間的結合。通過將固定在載體上的特定蛋白質暴露于與可特定蛋白質結合的分子，來在合成化合物、或者天然物質庫或隨機噬菌體肽展示文庫中篩選此類分子的方法，以及基于組合化學技術(ffrighton et al.，Science 1996,273 :458-64 ；Verdine, Nature 1996,384 11-3)來分離蛋白質和化合物的高通量篩選方法，也是本領域技術人員周知的。這些方法還可用于篩選與ADAMTS18蛋白或其片段結合的物質(包括激動劑和拮抗劑)。當測試物質為蛋白質時,例如West-Western印跡分析(Skolnik et al. , Cell 1991,65 :83-90)可用于本發(fā)明的方法。具體來說，可通過首先利用噬菌體載體(例如ZAP) 由預期表達至少一種與ADAMTS18多肽結合的蛋白質的細胞、組織、器官或培養(yǎng)細胞(例如PC細胞系)制備cDNA文庫，在LB-瓊脂糖上表達由cDNA文庫的載體編碼的蛋白質，將所表達的蛋白質固定在濾膜上，讓經過純化和標記的ADAMTS18多肽與上述濾膜反應，并根據ADAMTS18多肽的標記物來檢測表達與ADAMTS18多肽結合的蛋白質的噬斑，從而獲得與 ADAMTS18多肽結合的蛋白質。在此方法中，標記物質，諸如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、mI)、g| (例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶)、熒光物質(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、若丹明)和生物素/親合素等，可用于ADAMTS18多肽的標記。當蛋白質用放射性同位素標記時，可通過液體閃爍法進行檢測或測量?；蛘撸數鞍踪|用酶標記時，可通過添加酶的底物來檢測底物的酶促改變諸如利用吸收光度計(absorptiometer) 檢測顏色產生來檢測或測量。此外，在熒光物質用作為標記物的情況下，可利用熒光光度計來檢測或測量所結合的蛋白質。此外，可通過利用特異性結合ADAMTS18多肽或融合至ADAMTS18多肽的肽或多肽 (例如GST)的抗體來檢測或測量結合至蛋白質的ADAMTS18多肽。在本發(fā)明篩選中使用抗體的情況下，該抗體優(yōu)選用上述標記物質之一進行標記，并基于該標記物質進行檢測或測量?；蛘撸墒褂冕槍DAMTS18多肽的抗體作為第一抗體，用標記有標記物質的第二抗體來檢測該抗體。此外，可利用蛋白G或蛋白A柱來檢測或測量在此篩選中與ADAMTS18多肽結合的抗體。要在本篩選方法中使用的抗體可以使用本領域公知的技術來制備。要用于制備抗體的抗原可來源于任何動物物種，但優(yōu)選來源于哺乳動物，諸如人、小鼠、家兔、或大鼠，更優(yōu)選來自人。用作抗原的多肽可以重組生產或自天然來源分離。要用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白質或自完整蛋白質衍生的部分肽?？梢杂每乖庖呷魏尾溉閯游?；然而，優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常使用哨齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。 嚙齒目動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如野兔、鼠兔、和家兔。靈長目動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫動物的方法是本領域公知的。腹膜內注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑諸如弗氏(Freund)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的載體進行免疫。如上所述進行免疫后，通過標準方法檢驗血清中所需抗體的量的增加?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w從經過免疫的哺乳動物(該哺乳動物經檢驗其血清中所需抗體增加)收集血液,并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，以及從所述血清中分離的、含有該多克隆抗體的級分?？梢允褂美缗悸撚心繕硕嚯牡挠H和柱從僅識別該多肽的級分中制備免疫球蛋白G或M，并進一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。為了制備單克隆抗體，從經過抗原免疫并如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動物收集免疫細胞，并進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細胞融合的優(yōu)選的親本細胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細胞而獲得的特性的骨髓瘤細胞。根據已知的方法,例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))的方法，可與將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞進行融合。通過在標準選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基) 中進行培養(yǎng)，可以選擇出由細胞融合得到的雜交瘤。通常，細胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進行數天至數周，這段時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細胞死亡。然后，進行標準有限稀釋(standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細胞。除了上述用抗原免疫非人動物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用抗原、 表達該抗原的細胞或其溶胞物免疫人淋巴細胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細胞。 然后，使經過免疫的淋巴細胞與能夠無限分裂的人源骨髓瘤細胞諸如U266融合，以產生生成所需的能夠與所述抗原結合的人抗體的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請 No. (JP-A)Sho 63-17688)。隨后可以將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并可以抽取腹水。所得單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或攜帶目標抗原的親和柱進行純化。針對ADAMTS18多肽的抗體不僅可用于本篩選方法，而且可用于檢測生物樣品中的該多肽作為癌癥標志物，如“II.診斷癌癥”中描述的。它們可進一步充當感興趣多肽的激動劑和拮抗劑的候選者。另外，此類抗體(充當拮抗劑的候選物)可應用于涉及ADAMTS 18 多肽的疾病，包括如下文描述的肺癌和食管癌，的抗體治療。如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術來重組制備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies， published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細胞諸如雜交瘤或經免疫淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導入宿主細胞以制備重組抗體。此類重組抗體也可用于本篩選的背景中。此外，篩選中使用的抗體等可以是抗體片段或經過修飾的抗體，只要它們保留初始的結合活性。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或將來自H鏈和L鏈的Fv 片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al. , Proc Natl Acad Sci USA 85 =5879-83 (1988)) ο更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段?；蛘撸梢詷嫿ň幋a抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在合適的宿主細胞中表達(參見例如 Co et al. , J Immunol 152 :2968-76 (1994) ；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178 :476-96(1989) ；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178 :497-515 (1989) ；Lamoyi, Methods Enzymol 121 :652-63 (1986) ；Rousseaux et al. , Methods Enzymol 121 :663-9(1986) ；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9 132-7(1991))?？贵w可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾?？赏ㄟ^化學修飾抗體來獲得修飾抗體。這些修飾方法是本領域常規(guī)的?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至同質。例如，可依照用于一般蛋白質的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當選擇和組合的柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等來分出和分離抗體(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988));然而,本發(fā)明并不局限于此。蛋白A柱和蛋白 G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F. F. (Pharmacia)。除親和層析外的例示性層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。可以通過液相層析來進行層析規(guī)程,諸如HPLC和FPLC?；蛘?，在本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可使用利用細胞的雙雜交系統 (“MATCHMAKER雙雜交系統”、“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交測定試劑盒”、“MATCHMAKER單雜交系統”(Clontech) ;“HybriZAP雙雜交載體系統(Stratagene) ” ；參考文獻Dalton et al. ,Cell 1992，68 :597-612 和 Fields et al. ,Trends Genet 1994,10:286-92)。在雙雜交系統中，將ADAMTS18多肽或其片段與SRF結合區(qū)或GAL4結合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。由預期表達至少一種與ADAMTS18多肽結合的蛋白質的細胞制備cDNA文庫，使得該文庫在表達時是與VP16或GAL4轉錄活化區(qū)融合的。然后將cDNA文庫導入上述酵母細胞，并從檢測為陽性的克隆分離出來源于所述文庫的cDNA(當在酵母細胞中表達出能與ADAMTS18 多肽結合的蛋白質時，兩者的結合激活報告基因，使陽性克隆可被檢出)。通過將上述分離的cDNA導入大腸桿菌并表達蛋白質,可以制備由該cDNA編碼的蛋白質。除了 HIS3基因外，合適報道基因的例子包括但不限于Ade2基因、IacZ基因、CAT 基因、螢光素酶基因等。認為通過這種篩選分離的物質是ADAMTS18多肽的激動劑或拮抗劑的候選物。術語“激動劑”指通過與多肽結合從而激活其功能的分子。與此相反，術語“拮抗劑”指通過與多肽結合而抑制其功能的分子。此外，通過這種篩選作為拮抗劑被分離的物質是抑制ADAMTS18多肽與分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白質)體內相互作用的候選者。IV-1-2.通過檢測多肽的生物學活性來鑒定物質本發(fā)明還提供了使用ADAMTS18多肽或其片段來篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，包括下述步驟a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；b)檢測步驟(a)的該多肽或片段的生物學活性；并c)選擇與在測試物質不存在時的生物學活性相比降低該多肽的生物學活性的測試物質。依照本發(fā)明，可評估測測試物質抑制細胞生長或候選物質用于治療或預防 ADAMTS18相關疾病的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了使用ADAMTS18多肽或其片段篩選用于抑制細胞生長的候選物質或用于治療或預防ADAMTS18相關疾病的候選物質的方法，包括下述步驟a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其功能性片段接觸；b)檢測步驟(a)的該多肽或片段的生物學活性；并c)將b)的生物學活性與測試物質的治療效果關聯起來?；蛘?，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于評估或評價測試物質治療或預防與 ADAMTS 18過表達有關的癌癥或抑制癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使測試物質與由ADAMTS18基因的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)的該多肽的生物學活性；并(C)將潛在治療效果和測試物質關聯起來，其中當與在測試物質不存在時檢測到的由ADAMTS18基因的多核苷酸編碼的多肽的生物學活性相比，該物質阻抑所述多肽的生物學活性時，顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，可以將治療效果與ADAMTS18多肽或其功能性片段的生物學活性關聯起來。例如，當與在測試物質不存在時檢測到的水平相比，該測試物質阻抑或抑制 ADAMTS18多肽或其功能性片段的生物學活性時，該測試物質可鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質。或者，當與在測試物質不存在時檢測到的水平相比的，該測試物質不阻抑或抑制ADAMTS18多肽或其功能性片段的生物學活性時，該測試物質可鑒定為沒有顯著治療效果的物質。在本發(fā)明中，揭示了阻抑ADAMTS18表達降低癌細胞生長。因此，通過篩選阻抑該多肽的生物學活性的候選物質，可鑒定出可用于治療或預防癌癥的候選物質。這些候選物質可通過二次和/或更進一步篩選來評估治療或預防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療劑。例如，當結合ADAMTS18蛋白的物質抑制上文所述癌癥活性時，可得出此類物質具有 ADAMTS 18特異性治療效果的結論。任何物質可用于篩選，只要它阻抑或降低ADAMTS18多肽的生物學活性。在本發(fā)明的背景中，短語“阻抑或降低生物學活性”涵蓋與不存在該物質時比使ADAMTS18的生物學活性阻抑至少10%，更優(yōu)選地阻抑至少25%、50%或75%，最優(yōu)選地阻抑至少90%。此類阻抑可充當本篩選方法的指標。在優(yōu)選的實施方案中，使用不表達ADAMTS18多肽的對照細胞。因而,本發(fā)明還提供了使用ADAMTS18多肽或其片段篩選用于抑制細胞生長的候選物質或用于治療或預防ADAMTS 18相關疾病的候選物質的方法，包括下述步驟a)在測試物質存在下培養(yǎng)表達ADAMTS18多肽或其功能性片段的細胞和不表達 ADAMTS 18多肽或其功能性片段的對照細胞；b)檢測表達該蛋白的細胞和對照細胞的生物學活性；并c)選擇與在對照細胞中及在所述測試物質不存在時檢測到的增殖相比抑制表達該蛋白的細胞中生物學活性的測試化合物。依照本發(fā)明，證明了 ADAMTS18多肽是肺癌和食管癌細胞的生長或存活力必需的?？捎米骱Y選指標的ADAMTS18多肽生物學活性包括人 ADAMTS 18多肽的此類細胞生長促進活性。在本文中，細胞生長促進活性也稱作“細胞增殖活性”或“細胞增殖增強活性”。還有，ADAMTS18多肽具有N-糖基化活性、侵襲活性或基質金屬蛋白酶(MMP)活性。如此，這些活性也可用作篩選指標。當本方法中要檢測的生物學活性是細胞增殖增強活性時，它可例如，通過制備表達ADAMTS18多肽或其片段的細胞，在測試物質存在下培養(yǎng)該細胞，并測定細胞增殖速度， 測量細胞周期等，以及通過檢測傷口愈合活性、進行Matrigel侵襲測定和測量集落形成活性，來加以檢測。當評估細胞增殖增強活性時，優(yōu)選使用不表達ADAMTS18多肽的對照細胞。因而， 本發(fā)明還提供了使用ADAMTS18多肽或其片段篩選用于抑制細胞生長的候選物質或用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，包括下述步驟a)在測試物質存在下培養(yǎng)表達ADAMTS18多肽或其功能性片段的細胞；b)檢測表達該多肽的細胞的生物學活性；并c)選擇與在該測試物質不存在時檢測到的增殖相比抑制表達該多肽的細胞中生物學活性的測試物質。當本方法中要檢測的生物學活性是N-糖基化活性時，它可例如如下檢測使表達 ADAMTS 18多肽或其具有N-糖基化活性的功能性等同物的細胞或純化的ADAMTS18多肽與測試物質接觸，并在適合ADAMTS18多肽N-糖基化的條件下檢測該ADAMTS18多肽或該功能性等同物的N-糖基化水平。由此鑒定調控ADAMTS18多肽或功能性等同物的糖基化水平的測試物質。在本發(fā)明的背景中，ADAMTS 18多肽的N-糖基化水平可通過本領域已知的方法來測定。例如，可以通過比較分子量來檢測多肽的N-糖基化。通過添加糖苷鏈，N-糖基化的蛋白質的分子量比根據多肽的氨基酸序列計算的預測分子量要大。用于估算蛋白質分子量的方法是公知的?；蛘?，可使用放射性標記的N-糖基化供體來檢測對多肽添加糖苷鏈。可以例如通過SDS-PAGE電泳和熒光顯影來檢測放射性標記物向ADAMTS18蛋白的轉移?；蛘?，在反應后，可以通過過濾將ADAMTS18多肽與糖基供體分開，并通過閃爍計數對保留在濾器上的放射性標記物的量定量?？梢詫⑵渌线m標記物附著至糖基供體，諸如產色標記物和熒光標記物，而且檢測這些標記物向ADAMTS18多肽的轉移的方法是本領域已知的。或者，可通過選擇性識別多肽糖基化位點的試劑來測定ADAMTS18多肽的N-糖基化水平。例如，將 ADAMTS18多肽和候選物質在能夠糖基化多肽的條件下溫育后，可通過免疫學方法來檢測多肽的N-糖基化水平。任何使用識別糖基化多肽的抗體的免疫學技術均可用于該檢測。例如，用識別糖基化多肽的抗體進行的ELISA或免疫印跡可用于本發(fā)明。
代替使用抗體，可使用以高親和力選擇性結合糖苷鏈的試劑來檢測糖基化蛋白質。此類試劑是本領域已知的。例如，公知凝集素是糖苷鏈特異性探針。綴合有可檢測標記物諸如堿性磷酸酶的凝集素試劑有市售。細胞中多肽的N-糖基化水平可通過分離細胞裂解物來評估。例如，可使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠將多肽分離。將在凝膠中分離后的多肽轉移至硝酸纖維素膜，進行免疫印跡分析。當與本方法相關的要檢測的生物學活性是侵襲活性時，它可例如如下檢測制備表達ADAMTS18多肽的細胞，并使用例如Matrigel侵襲測定對侵襲細胞數計數，如圖5A所示。選擇可減少侵襲細胞數的物質作為用于治療或預防肺癌或食管癌的候選物質。當與本方法相關的要檢測的生物學活性是MMP活性時，它可例如如下檢測使表達ADAMTS18多肽或其功能性等同物的細胞或純化的ADAMTS18多肽或其功能性等同物與測試物質接觸，接著實施MMP測定來評估MMP活性。MMP測定可通過本領域公知的方法來進行。例如，MMP測定可使用包括MMP的底物的商品化測定試劑盒來進行。通過本篩選方法分離的物質是ADAMTS18多肽的拮抗劑的候選物，故而也是抑制該多肽與分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白質)的體內相互作用的候選物。IV-2.基于核苷酸的篩選方法IV-2-1.俥用ADAMTS18某閔的篩詵方法如上詳述，通過控制ADAMTS18基因的表達水平，可以控制癌癥的發(fā)病和進展。因此，通過使用ADAMTS18基因的表達水平作為指標的篩選可鑒定能用于治療或預防癌癥的物質。在本發(fā)明的上下文中，這樣的篩選可包括例如以下步驟a)將測試物質與表達ADAMTS18基因的細胞接觸；b)檢測ADAMTS18基因的表達水平；c)將表達水平與在不存在測試物質下檢測到的表達水平比較；并d)選擇降低表達水平的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。依照本發(fā)明，可評估測試物質抑制細胞生長或候選物質用于治療或預防癌癥的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了篩選用于阻抑癌細胞增殖的候選物質的方法，及篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法。在本發(fā)明的背景中，此類篩選可包括例如下述步驟a)使測試物質與表達ADAMTS18基因的細胞接觸；b)檢測ADAMTS18基因的表達水平；并c)將b)的表達水平與測試物質的治療效果關聯起來?；蛘?，在一些實施方案中，本發(fā)明還提供用于評估或估計測試物質治療或預防與 ADAMTS 18過表達有關的癌癥或抑制癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使候選物質與表達ADAMTS18的細胞接觸；并；(b)將潛在治療效果和測試物質關聯起來，其中當與對照相比，物質降低 ADAMTS 18的表達水平時，顯示潛在治療效果。在本發(fā)明的背景中，可以將治療效果與ADAMTS18基因的表達水平關聯起來。例如，當與在測試物質不存在時檢測到的水平相比，該測試物質降低ADAMTS18基因的表達水平時，可鑒定或選擇該測試物質作為具有治療效果的候選物質?；蛘撸斉c在測試物質不存在時檢測到的水平相比，該測試物質不降低ADAMTS18基因的表達水平時，可鑒定該測試物質為沒有顯著治療效果的物質。在本發(fā)明中，揭示了阻抑ADAMTS18表達降低癌細胞生長。因此，通過篩選降低 ADAMTS18表達水平的候選物質，可鑒定出可用于治療或預防癌癥的候選物質。這些候選物質可通過二次和/或更進一步篩選來評估其治療或預防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療劑?？赏ㄟ^將表達ADAMTS18基因的細胞與測試物質接觸，然后測定ADAMTS18基因的表達水平，從而鑒定抑制ADAMTS18基因的表達的物質。當然，也可使用一群表達該基因的細胞代替單個細胞進行該鑒定。在存在測試物質的條件下檢測到與不存在該物質的條件下的表達水平相比降低的表達水平表明該測試物質能作為ADAMTS18基因的抑制劑，提示該測試物質具有抑制癌癥用途的可能性，從而作為用于治療或預防癌癥的測試物質?；虻谋磉_水平可通過本領域眾所周知的方法來評估。例如，可遵循上文標題 ‘1-1.用于診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法’之下所述的方法來測定ADAMTS18基因的表達水平。用于上述鑒定的細胞或細胞群可以是任何細胞或任何細胞群，只要其表達 ADAMTS18基因即可。例如，該細胞或細胞群可以是或包含來源于組織的肺和食管上皮細胞。 或者，該細胞或細胞群可以是或包含來源于癌性細胞，包括肺癌和食管癌的永生化細胞。表達ADAMTS18基因的細胞包括例如從癌癥建立的細胞系(例如肺癌和食管癌細胞系諸如 NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549、PC-14、SK-MES-1、NCI-H520、NCI-H1703、NCI-H2170、 LU61、TE1、TE2、TE3、TE4、TE5、TE6、TE8、TE9、TE10、SBC-3、SBC-5、DMS114、DMS273 等)。此外，該細胞或細胞群可以是或包含已用ADAMTS18基因轉染的細胞。本發(fā)明的方法容許篩選各種上述測試物質，特別適用于篩選功能性核酸分子，包括反義RNA、siRNA等。IV-2-2.俥用ADAMTS18某閔轉錄調節(jié)區(qū)的篩詵方法根據另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括以下步驟a)使測試物質與其中導入有載體的細胞接觸，該載體包括ADAMTS18基因的轉錄調節(jié)區(qū)和在該轉錄調節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；b)檢測所述報告基因的表達或活性；c)將該表達水平或活性與在該物質不存在時檢測到的表達水平或活性比較；并d)選擇降低所述報告基因的表達或活性物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。依照本發(fā)明，可評估測試物質抑制細胞生長或候選物質用于治療或預防癌癥的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了篩選用于阻抑癌細胞增殖的候選物質的方法，及篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法。依照另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括下述步驟a)使測試物質與其中導入有載體的細胞接觸，該載體包括ADAMTS18的轉錄調節(jié)區(qū)和在該轉錄調節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；b)檢測所述報告基因的表達或活性；并c)將b)的表達水平與測試物質的治療效果關聯起來。
或者，在一些實施方案中，本發(fā)明還提供用于評估或評價測試物質治療或預防與 ADAMTS 18過表達有關的癌癥或抑制癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使測試物質與其中導入有載體的細胞接觸，該載體包括ADAMTS18的轉錄調節(jié)區(qū)和在該轉錄調節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；(b)測量所述報告基因的表達或活性；并(C)將潛在治療效果和測試物質關聯起來，其中當測試物質降低所述報告基因的表達或活性時，顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，可以將治療效果與所述報告基因的表達或活性關聯起來。例如，當與在測試物質不存在時檢測到的水平相比，該測試物質降低所述報告基因的表達或活性時， 該測試物質可鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質?；蛘?，當與在測試物質不存在時檢測到的水平相比，該測試物質不降低所述報告基因的表達或活性時，該測試物質可鑒定為沒有顯著治療效果的物質。在本文中，揭示了阻抑ADAMTS18表達降低細胞生長。因此，通過篩選降低報告基因的表達或活性的測試物質，可鑒定出可用于治療或預防癌癥的候選物質。這些候選物質可通過二次和/或更進一步篩選來評估治療或預防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療劑。適合的報道基因和宿主細胞是本領域眾所周知的。可使用ADAMTS18基因的轉錄調節(jié)區(qū)來制備篩選所需要的報道構建體，所述轉錄調節(jié)區(qū)可基于該基因的核苷酸信息作為含有轉錄調節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段自基因組文庫獲得。轉錄調節(jié)區(qū)可以是例如ADAMTS18基因的啟動子序列。篩選所需的報告構建體可以通過將報告基因序列連接于ADAMTS18基因的轉錄調節(jié)區(qū)來制備。本文中ADAMTS18基因的轉錄調節(jié)區(qū)域是如下的區(qū)域，從起始密碼子到上游至少500bp，優(yōu)選地上游l，000bp，更優(yōu)選地上游5，000或10，OOObp0含有轉錄調節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段可以從基因組文庫中分離或者可以通過PCR擴增。鑒定轉錄調節(jié)區(qū)的方法以及測定方案是眾所周知的(Molecular Cloning third edition chapter 17,2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。當使用與ADAMTS18基因的調節(jié)序列(例如啟動子序列)可操作連接的報告基因轉染細胞時，通過檢測報告基因產物的表達水平可以鑒定物質是抑制還是增強ADAMTS18 基因的表達。例示性報告基因包括但不限于螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、DiSCOSOma sp.紅色熒光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、lacZ和β -葡糖醛酸糖苷酶(⑶S)，而且宿主細胞為C0S7、HEK293、HeLa、Ade2基因、HIS3基因、和其它本領域公知的。用于檢測這些基因的表達的方法是本領域眾所周知的。可以用含有所述報告構建體的載體感染宿主細胞，并通過本領域眾所周知的方法檢測報告基因的表達或活性(例如使用光度計、吸收光度計、流式細胞儀等)。在本發(fā)明的背景中，短語“降低表達或活性”涵蓋比不存在化合物時使報告基因的表達或活性降低至少 10 %，更優(yōu)選地降低至少25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選地降低至少95 %。IV-3.選擇適合于特定個體的治療性物質或治療劑個體遺傳組成的差異可導致其代謝各種藥物的相對能力出現差異?？稍谑茉囌唧w內被代謝從而起到抗腫瘤物質作用的物質可在受試者的細胞中誘導癌性狀態(tài)特征性基因表達樣式向非癌性狀態(tài)特征性基因表達樣式的轉變，從而表現出自身。因此，利用在此披露的在癌性細胞與非癌性細胞之間差異表達的ADAMTS18基因，可以在來自選定受試者的測試細胞群中測試推定的癌癥治療性或預防性抑制劑，從而確定該物質在該受試者中是否為合適的癌癥抑制劑。為鑒定適合于特定受試者的癌癥抑制劑，將來自該受試者的測試細胞群暴露于候選治療性物質或治療劑，并測定ADAMTS18基因的表達。在本發(fā)明方法的背景中，測試細胞群含有表達ADAMTS18基因的癌細胞。優(yōu)選的， 測試細胞是肺和食管上皮細胞。具體來說，可在存在候選治療性物質或治療劑的條件下溫育測試細胞群，測量測試細胞群中ADAMTS18基因的表達，并將其與一個或多個對照譜，例如癌性參照表達序型或非癌性參照表達譜比較。測試細胞群中ADAMTS18基因的表達相對于含有癌細胞的參照細胞群的降低表明該物質具有治療潛力?；蛘?，測試細胞群中ADAMTS18基因的表達相對于不含癌癥的參照細胞群的相似性表明該物質具有治療潛力。V.用于治療或預防癌癥的藥物組合物通過本發(fā)明任何篩選方法篩出的物質，針對ADAMTS18基因的反義核酸和雙鏈分子(例如s i RNA)及針對ADAMTS 18多肽的抗體抑制或阻抑ADAMTS 18基因的表達或ADAMTS 18 多肽的生物學活性，還抑制或破壞癌細胞周期調節(jié)、癌細胞增殖和細胞侵襲。因此，本發(fā)明提供了用于治療或預防癌癥的組合物，其中該組合物包括通過本發(fā)明任何篩選方法鑒定出的物質，診斷ADAMTS18基因的反義核酸或雙鏈分子或針對ADAMTS18多肽的抗體。本發(fā)明的組合物可用于治療或預防癌癥，特別是諸如肺癌和食管癌的癌癥。該組合物可用作為用于人或其他哺乳動物的藥物，所述哺乳動物諸如小鼠、大鼠、 豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒和黑猩猩。在本發(fā)明的背景中，適合于詳述如下的本發(fā)明活性成分(包括所篩出的物質、反義核酸、雙鏈分子、抗體等)的藥物劑型包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔和舌下)、 陰道或腸胃外(包括肌內、皮下和靜脈內)施用的，或適于通過吸入或吹入施用的藥物劑型。優(yōu)選地，通過靜脈內施用。制劑任選以離散的劑量單位包裝。適合于供口服施用的藥物劑型包括各自包含預定量活性成分的膠囊、微囊劑、扁囊劑和片劑。適合的劑型還包括粉劑、酏劑、粒劑、溶液、混懸液和乳劑?；钚猿煞挚梢匀芜x以大丸劑(bolus)、藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)的形式施用?；蛘?，視需要，藥物組合物可以無菌溶液或與水或任何其他藥學上可接受的液體的混懸液注射的形式非口服施用。例如，可將本發(fā)明的活性成分與藥學上可接受的載體或介質混合，具體來說，為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、助懸物質、表面活性劑、穩(wěn)定劑、芳香劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、粘合劑等等，以通?？山邮艿乃幬锱渲品椒ㄋ蟮膯挝粍┝啃问酱嬖?。包含于上述制劑中的活性成分的量為可獲得的指定范圍內的合適劑量?？蓳饺肫瑒┖湍z囊中的添加劑的例子包括但不限于粘合劑，諸如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑，諸如結晶纖維素；溶脹劑，諸如玉米淀粉、明膠和海藻酸；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；甜味劑，諸如蔗糖、乳糖或糖精；及芳香劑，諸如薄荷油、白珠 (Gaultheria adenothrix)油和樓桃。片劑可通過壓縮或模制來制備，其中任選含有一種或多種配方成分。壓制片劑可通過如下方法制備將活性成分以自由流動的形式(諸如粉末或顆粒)任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑或分散劑混合，并在適當的機器中進行壓制。模制片劑可通過如下方法制備在適當的機器中對利用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物進行模制。所述片劑可根據本領域眾所周知的方法進行包衣。片劑可任選配制以提供活性成分在體內的緩釋或控釋。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。此外，當單位劑量形式為膠囊時,在上述成分之外還可包括液體載體,諸如油。口服液體制劑可以例如含水或含油混懸液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑的形式存在，或可以干燥產物存在用于在使用前與水或其他適合的媒介物復原。上述液體制劑可含有常規(guī)添加劑，諸如助懸劑、乳化劑、非水媒介物(可包括食用油類)或防腐劑。用于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與目標受者的血液等滲的溶質；及水性和非水性無菌懸浮液，其可含有助懸劑和增稠劑。所述制劑可以單位劑量或多劑量容器提供，例如密封的安瓿和小管， 還可以在冷凍干燥(凍干)條件下保存，這樣僅需要臨使用前添加無菌液體載體，例如鹽水、注射用水?；蛘撸商峁┯糜谶B續(xù)輸注的制劑。即配即用的注射溶液和混懸液可由前述類型的無菌粉劑、顆粒和片劑制備。此外，可使用適合于注射的媒介物諸如蒸餾水，按照普通的藥物配制方法配制供注射用的無菌混合物。生理鹽水、葡萄糖和其它等滲液體包括佐劑，諸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉可用作注射用的水溶液。它們可與適當的增溶劑，諸如醇，例如乙醇；多元醇，諸如丙二醇和聚乙二醇；及非離子型表面活性劑，諸如Polysorbate 80 (TM)和 HC0-50 一起使用。芝麻油或大豆油可用作為油質液體，可與苯甲酸芐酯或苯甲醇組合使用作為增溶劑，還可與緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液；鎮(zhèn)痛劑，諸如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，諸如苯甲醇和酚；和/或抗氧化劑一起配制。制備的注射劑可以裝入到合適的安瓿中。用于直腸給藥的制劑包括具有標準載體諸如可可脂或聚乙二醇的栓劑。用于口內局部給藥，例如口腔或舌下給藥的制劑包括錠劑和軟錠劑，其中錠劑在調味基質諸如鹿糖和阿拉伯膠或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質諸如明膠、甘油、蔗糖或阿拉伯膠中包含活性成分。對于鼻內施用活性成分，可使用液體噴霧劑、可分散粉劑，或以滴劑的形式使用。滴劑可用水性或非水性基質配制，該基質中還含有一種或多種分散劑、增溶劑或助懸劑。對于通過吸入給藥,可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurized pack)或其它遞送氣溶膠噴霧的便利裝置方便地遞送組合物。加壓包裝可含有適宜的推進劑，諸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下， 可通過提供遞送計量數量的閥門來確定劑量單位?；蛘?，對于通過吸入或吹入給藥，組合物可以采取干粉組合物的形式，例如活性成分與適合的粉末基質(諸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以單位劑量形式提供，例如膠囊、藥筒(cartridge)、凝膠(gelatin)或泡罩包裝(blister pack),借助吸入器或吹入器，可由上述單位劑量形式施用所述粉末。其它的制劑包括可釋放治療劑的可植入裝置和粘性貼片。期望時，可以采用適于緩釋活性成分的上述制劑。藥物組合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑、免疫抑制劑或防腐劑。應當理解，在上述具體提及的成分外，本發(fā)明的制劑可含有本領域對于所述制劑類型常用的其它藥劑，例如適于口服給藥的制劑可以含有調味劑。優(yōu)選的單位劑量制劑是含有如下文標題‘IV.用于治療或預防癌癥的方法’中所述的每種本發(fā)明活性成分或其適宜部分的有效劑量的那些制劑。V-1.包含所篩出的物質的藥物組合物本發(fā)明提供了包含通過上述本發(fā)明篩選方法鑒定出的任何物質、用于治療或預防癌癥的組合物。通過本發(fā)明方法鑒定出的物質可直接施用或根據以上詳述的任何常規(guī)藥物制備方法配制為劑量形式。
_5] V-2.包含雙鏈分子的藥物組合物針對ADAMTS18基因的雙鏈分子可用于降低該基因的表達水平。在此，術語“雙鏈分子”指抑制靶基因表達的核酸分子，包括例如短干擾RNA(siRNA ;例如雙鏈核糖核酸 (dsRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA))和短干擾DNA/RNA (siD/R-NA ;例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發(fā)夾嵌合物(shD/R-NA))，如“定義”中描述的。在本發(fā)明的背景中，雙鏈分子包含針對ADAMTS18基因的有義核酸序列和反義核酸序列。構建該雙鏈分子使得其包含靶基因(即ADAMTS18基因)的有義序列和互補反義序列二者的一部分，而且也可以是具有發(fā)夾結構的單一構建體，其中有義和反義鏈經單鏈連接。當將雙鏈分子導入細胞中時，雙鏈分子充當RISC復合物識別mRNA中同源序列的向導。鑒定出的靶mRNA受到Dicer核酸酶活性的切割和降解，藉此雙鏈分子最終降低或抑制由該RNA編碼的多肽的產生(表達)。因而，本發(fā)明的雙鏈分子可通過其生成在嚴格條件下與ADAMTS18基因的mRNA特異性雜交的單鏈的能力來加以限定。在本文中，mRNA中與自雙鏈分子生成的單鏈雜交的部分稱作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本發(fā)明中， “靶序列”的核苷酸序列不僅可使用mRNA的RNA序列來顯示，而且還可以使用自mRNA合成的cDNA的DNA序列來顯示。在本發(fā)明的背景中，雙鏈分子的長度優(yōu)選少于500、200、100、50或25個堿基對。更優(yōu)選地，雙鏈分子的長度為19-25個堿基對。例示性的針對ADAMTS18基因的雙鏈分子的靶序列包括SEQ ID NO :11和12的核苷酸序列。因此，例如，本藥物組合物可包括這樣的雙鏈 RNA 分子(即 siRNA)，其包含核苷酸序列 5' -GCCAGUAUCUCAAGAAAUU-3’ (對于 SEQ ID NO 11)和 5' -GGGCACAACUUUGGUAUGA-3’(對于 SEQ ID NO 12)作為有義鏈。為了增強雙鏈分子的抑制活性，可將3’突出端添加到有義和/或反義鏈中靶序列的3’末端。要添加的核苷酸的數目為至少2個，通常為2-10個，優(yōu)選2-5個。所添加的核苷酸在雙鏈分子的有義和/或反義鏈的3’末端形成單鏈。要添加的核苷酸優(yōu)選但不限于 “u” 或 “t”?？蓪⒂扇我夂塑账嵝蛄薪M成的環(huán)序列放置于有義序列與反義鏈之間，以便形成發(fā)夾環(huán)結構。因此，本發(fā)明的藥物組合物中包含的雙鏈分子可采取通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’ 或5’-[A’]-[B]-[A]-3’，其中[A]為含有對應于靶序列的序列的有義鏈，[B]為間插單鏈， 而[A’ ]為含有互補于[A]的序列的反義鏈。在本文中，包括對應于靶序列的序列的多核苷酸鏈可稱作“有義鏈”。在優(yōu)選的實施方案中，[A]為有義鏈；[B]為由3至23個核苷酸組成的單鏈多核苷酸；而[A’ ]為包括反義鏈的多核苷酸鏈，其包含靶序列的互補序列，與ADAMTS 18基因的mRNA或cDNA特異性雜交(即與有義鏈[A]的靶序列雜交的序列)。在本文中，包括靶序列的互補序列、與ADAMTS18基因的mRNA或cDNA特異性雜交的多核苷酸鏈可稱作“反義鏈”。[A]區(qū)與[A’]區(qū)雜交，然后形成由[B]區(qū)組成的環(huán)。環(huán)序列的長度可優(yōu)選為3_23個核苷酸。環(huán)序列例如可選自如下序列(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506. html) :CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002，418 :435_8。UUCG :Lee NS et al. , Nature Biotechnology 2002,20 :500-5 ；Fruscoloni P et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003,100(4) 1639-440UUCAAGAGA Dykxhoorn DM et al. ,Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003，4 :457_67?！癠UCAAGAGA(在 DNA 中為“ttcaagaga”)”是特別適合的環(huán)序列。此外，由23個核苷酸組成的環(huán)序列也提供有活性的siRNACJacque J-M et al. , Nature 2002,418:435-8)。適用于 ADAMTS18 基因的例示性的發(fā)夾 siRNA 包括，5’ -GCCAGUAUCUCAAGAAAUU- [b] -AAUUUCUUGAGAUACUGGC-3’；(SEQ ID NO: 11 的靶序列)；5’-AAUUUCUUGAGAUACUGGC_[b]_GC CAGUAUCUCAAGAAAUU-3’；(SEQ ID NO 11 的靶序列)和；5’-GGGCACAACUUUGGUAUGA-[b]_UCA UACCAAAGUUGUGCCC-3’；(SEQ ID NO :12 的靶序列)；5’ -UCAUACCAAAGUUGUGCCC-[b] -GGGCAC AACUUUGGUAUGA-3’ ； (SEQ ID NO :12 的靶序列)?？墒褂媚艿米?Ambion 網站(www. ambion. com/techlib/misc/siRNA finder, html)的siRNA設計計算機程序設計適合的本發(fā)明雙鏈分子的其它核苷酸序列。該計算機程序基于以下流程選擇用于雙鏈分子合成的核苷酸序列。雙鏈分子的靶位點的選擇:I.從目標轉錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描，尋找AA 二核苷酸序列。記錄每個AA的出現及其3’側鄰近的19個核苷酸作為潛在的祀位點。Tuschl et al. Genes Cev 1999,13(24) :3191_7，不推薦針對5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)和鄰近起始密碼子的區(qū)域 (75個堿基之內)設計siRNA，因為上述區(qū)域可能富含調節(jié)蛋白結合位點。UTR結合蛋白和 /或翻譯起始復合物可干擾siRNA內切核酸酶復合物的結合。2.將所述潛在靶位點與人基因組數據庫進行比較，不考慮與其它編碼序列顯著同源的任何祀序列?？刹捎每梢娪贜CBI服務器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/的 BLAST(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997,25 :3389-402 ；J Mol Biol 1990， 215 :403-10)進行同源性搜索。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，可優(yōu)選順著待評估的基因的長度選擇數個靶序列。本發(fā)明的雙鏈分子可使用本領域已知的任何化學合成方法來制備。例如，根據化學合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當的方法使它們退火到一起， 來獲得雙鏈分子。或者，本發(fā)明的雙鏈分子或siRNA分子也可用體外翻譯來合成。在此實施方案中，編碼包括靶序列和其反義的核苷酸序列的DNA在體外轉錄成雙鏈分子。在退火的一個實施方案中，將合成的單鏈多核苷酸以至少約3 7、例如約4 6、例如基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈分子解離的溫度，再緩慢冷卻。經退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術領域公知的常用方法來純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剩余的單鏈多核苷酸(例如利用適當的酶進行降解)的方法。
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所述位于靶序列側翼的調控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達能夠獨立地，或者以時間性或空間性方式被調控。所述雙鏈分子可通過將ADAMTS18基因模板克隆入載體(例如含有來自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III轉錄單元或人類HlRNA啟動子的載體)以在胞內進行轉錄。本領域已知用于將雙鏈分子導入細胞中的標準技術。例如，可以能與mRNA轉錄物結合的形式將雙鏈分子直接導入細胞。在這些實施方案中，雙鏈分子通常進行如下所述關于反義分子的修飾。其他修飾也是可用的，例如，偶聯有膽固醇的雙鏈分子顯示出具有改善的藥理特性(Song et al.，Nature Med 2003,9 :347-51)。這些常規(guī)使用的技術也可應用于本組合物中包含的雙鏈分子?；蛘?，編碼雙鏈分子的DNA可攜帶于載體(以下也稱為“siRNA載體”)中，而且雙鏈分子可以以能夠在體內表達雙鏈分子的載體的形式包含在本組合物中?？赏ㄟ^例如將靶序列足以抑制靶基因體內表達的部分克隆入在該序列側翼可操作連接有調節(jié)序列(例如來自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III轉錄單位或人HlRNA啟動子)的表達載體中，以容許兩條鏈都表達(通過該DNA分子的轉錄)的方式產生上述載體(Lee NS et al. ,Nature Biotechnology 2002，20 :500-5)。例如，通過第一啟動子(例如所克隆的DNA3’側的啟動子序列)轉錄與靶基因的mRNA反義的RNA分子，通過第二啟動子(例如所克隆的DNA 5’ 側的啟動子序列)轉錄對于靶基因的mRNA為有義鏈的RNA分子。有義鏈與反義鏈在體內雜交以產生用于沉默靶基因表達的雙鏈分子構建體。或者，有義和反義鏈可以在一個啟動子的幫助下一起轉錄。在這種情況下，有義和反義鏈可以經多核苷酸序列連接以形成具有二級結構，例如發(fā)夾的單鏈構建體。因而，本發(fā)明用于治療或預防癌癥的藥物組合物可包含雙鏈分子(例如siRNA)或在體內表達雙鏈分子的載體。特別地，本發(fā)明提供了用于治療或預防癌癥的藥物組合物，其包括抑制ADAMTS18基因表達的雙鏈分子，或在體內表達該雙鏈分子的載體。另外，本發(fā)明還提供了用于抑制癌細胞增殖的藥物組合物，該組合物包括抑制ADAMTS18基因表達的雙鏈分子，或在體內表達該雙鏈分子的載體。為了將雙鏈分子載體導入細胞，可使用轉染增強劑。FuGENE6 (Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、01igofectamine (Invitrogen)和 Nucleofector (Wako pure Chemical) 可用作為轉染增強劑。因此，本發(fā)明的藥物組合物可進一步包括上述轉染增強劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子或編碼它的載體在制備用于治療表達ADAMTS 18基因的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及下述雙鏈核酸分子在制備用于治療表達ADAMTS18基因的癌癥的藥物組合物中的用途該分子在過表達ADAMTS18基因的細胞內抑制該基因的表達，其中該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以SEQ ID NO :11或12的序列為靶標?；蛘撸景l(fā)明進一步提供在治療表達ADAMTS18基因的肺癌中使用的本發(fā)明雙鏈核酸分子?；蛘撸景l(fā)明還提供生產用于治療表達ADAMTS18基因的癌癥的藥物組合物的方法或工藝。該方法或工藝包括將藥學或者生理學可接受的載體與作為活性成分的下述雙鏈核酸分子一起制劑化的步驟，其中所述雙鏈核酸分子抑制細胞內ADAMTS18基因的表達，且該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以SEQ ID NO :11或12的序列為靶標。在另Iv實施方案中，本發(fā)明還提供生廣用于治療表達ADAMTS 18基因的癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法或工藝包括將活性成分與藥學上或生理學上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是這樣的雙鏈核酸分子，其在過表達ADAMTS18基因的細胞中抑制該基因的表達，該分子包含有義鏈與與其互補的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以SEQ ID NO 11或12的序列為靶標。V-3.包含反義核酸的藥物組合物靶向ADAMTS18基因的反義核酸可用于降低在癌性細胞，包括肺癌和食管癌細胞中上調的該基因的表達水平。此類反義核酸可用于治療癌癥，特別是肺癌和食管癌，因此也包含在本發(fā)明中。反義核酸通過與ADAMTS18基因的核苷酸序列或其相應的mRNA結合起作用，從而抑制該基因的轉錄或翻譯，促進mRNA的降解，和/或抑制該基因所編碼的蛋白質的表達。因此，結果是，反義核酸抑制ADAMTS18蛋白在癌性細胞中發(fā)揮功能。在此，短語 “反義核酸”指與靶序列特異性雜交的核苷酸，不但包括與該靶序列完全互補的核苷酸，還包括包含一個或多個核苷酸錯配的、與該靶序列互補的核苷酸。例如，本發(fā)明的反義核酸包括在ADAMTS18基因或其互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的跨度上具有至少70%或更高、 優(yōu)選至少80%或更高、更優(yōu)選至少90%或更高、甚至更優(yōu)選至少95%或更高同源性的多核苷酸。本領域中已知的算法可用于測定上述同源性。本發(fā)明的反義核酸通過與ADAMTS18基因的DNA或mRNA結合，作用于產生該基因所編碼蛋白質的細胞，抑制它們的轉錄或翻譯，促進mRNA的降解，并抑制該蛋白質的表達， 最終抑制該蛋白質發(fā)揮功能。通過與對核酸無活性的適合基質材料混合，可將本發(fā)明的反義核酸制備為外用制劑，例如搽劑(liniment)或審劑(poultice)。同樣，根據需要，通過添加賦形齊 、等滲齊 、增溶齊 、穩(wěn)定齊 、防腐齊 、鎮(zhèn)痛劑等，可將本發(fā)明的反義核酸配制成片劑、粉末、顆粒、膠囊、脂質體膠囊、注射劑、溶液、滴鼻劑和冷凍干燥劑。反義封固介質(antisense-mounting medium)也可用于增加耐久性和膜通透性。 所述反義封固介質的例子包括但不限于脂質體、聚L-賴氨酸、脂質、膽固醇、脂質轉染劑或它們的衍生物?？赏ㄟ^下列已知方法制備它們。本發(fā)明的反義核酸抑制ADAMTS18基因的表達并具有抑制該蛋白質生物學活性的用途。此外，包含本發(fā)明反義核酸的表達抑制劑是有用的，因為它們能抑制ADAMTS18蛋白的生物學活性。本發(fā)明的反義核酸還包括經過修飾的寡核苷酸。例如，硫代(thioated)寡核苷酸可用來賦予寡核苷酸以核酸酶抗性。V-4.包含抗體的藥物組合物可通過施用如下化合物抑制在癌癥，特別是肺癌和食管癌中過表達的ADAMTS18 基因的基因產物的功能，所述化合物能與該基因產物結合或以其它方式抑制其功能。針對 ADAMTS18多肽的抗體可作為這樣的化合物被提及，并可用作為用于治療或預防癌癥的藥物組合物的活性成分。本發(fā)明涉及針對ADAMTS18基因所編碼的蛋白質的抗體或該抗體的片段的應用。如本文中所使用的，術語“抗體”指具有特定結構、只與用于合成該抗體的抗原(即上調標志的基因產物)或與該抗體密切相關的抗原相互作用(即結合)的免疫球蛋白分子。包含用于合成抗體的抗原的分子和包含為抗體所識別的該抗原的表位的分子可作為與該抗體密切相關的抗原被提及。此外，用于本發(fā)明藥物組合物中的抗體可以是抗體片段或經過修飾的抗體，只要其與ADAMTS18基因所編碼的蛋白質結合即可(例如抗ADAMTS18抗體的免疫學活性片段)。 舉例來說，抗體片段可以是Fab、F (ab’)2、Fv或單鏈Fv (scFv)，其中來自H和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston JS et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1988,85:5879-83)。 可通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來產生這樣的抗體片段。或者，可構建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在適宜的宿主細胞中表達(參見例如Co MS et al.，J Immunol 1994，152 :2968-76 ；Better M et al.，Methods Enzymol 1989,178 476-96 ；Pluckthun A et al. ， Methods Enzymol 1989，178 :497-515 ;Lamoyi E， Methods Enzymol 1986，121 :652-63 ；Rousseaux J et al.，Methods Enzymol 1986，121 :663-9 ； Bird RE et al.，Trends Biotechnol 1991,9 :132-7) 0 可通過與多種分子諸如聚乙二醇 (PEG)偶聯來修飾抗體。本發(fā)明包括這樣的經過修飾的抗體?？赏ㄟ^化學修飾抗體來獲得經過修飾的抗體。上述修飾方法是本領域中常規(guī)的?；蛘?，用于本發(fā)明的抗體可以是具有來源于針對ADAMTS18多肽的非人抗體的可變區(qū)和來源于人抗體的恒定區(qū)的嵌合抗體，或包含來源于非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、來源于人抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū)的人源化抗體?？墒褂靡阎夹g制備上述抗體?？赏ㄟ^用嚙齒類動物的CDR或CDR序列替代人抗體的相應序列來進行人源化(參見如Verhoeyen et al. , Science 1988，239 :1534-6)。因而，這樣的人源化抗體是嵌合抗體，其中完整人可變域已被來自非人物種的相應序列所替代。在人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完整人抗體也是可以利用的。這樣的抗體可利用本領域已知的各種技術制備。例如，體外方法包括使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(例如 Hoogenboom et al.，J Mol Biol 1992,227:381-8)。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物例如內源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠來制備人抗體。該方法描述于例如美國專利Nos. 6，150，584 ;5，545，807 ;5，545，806 ； 5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;和 5，661，016。當要將所獲得的抗體施用于人體(抗體治療)時，優(yōu)選人抗體或人源化抗體，因為它們具有降低的免疫原性?？蓪⑷缟汐@得的抗體純化至均質。例如，可根據用于普通蛋白質的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，通過適當選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等,可以分開和分離抗體(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow and D Lane,Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如 Hyper D, POROS 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。除親和層析外，例示性的層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析,諸如HPLC和FPLC進行層析操作。VI.用于治療或預防癌癥的方法針對癌細胞中發(fā)生的特定分子變化的癌癥療法已經通過下述抗腫瘤藥物的臨床開發(fā)和管理機構的批準被認定為有效諸如用于治療晚期癌癥的曲妥單抗(trastuzumab) (Herceptin)、用于治療慢性髓細胞樣白血病的甲磺酸伊馬替尼(imatinib methylate) (Gleevec)、用于治療非小細胞肺癌(NSCLC)的吉非替尼(Iressa)、及用于治療B細胞淋巴瘤和套細胞淋巴瘤的利妥昔單抗(rituximab)(抗⑶20mAb) (Ciardiello F et al., Clin Cancer Res 2001, 7 :2958-70,Review ；Slamon DJ et al.，N Engl J Med 2001,344 783-92 ；Rehwald U et al.，Blood 2003,101 :420-4 ；Fang G et al.，Blood 2000,96 2246-53)。這些藥物臨床上是有效的，并且比傳統抗腫瘤劑具有更好的耐受性，因為它們僅僅靶向轉化細胞。因此，這些藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質量，而且驗證了分子靶向癌癥療法的理念。另外，當靶向藥物與標準化療組合使用時，可以增強標準化療的效力(Gianni L, Oncology 2002,63Suppl I :47-56 ；Klejman A et al. , Oncogene 2002,21 5868-76)。因此，未來的癌癥治療將很可能涉及將常規(guī)藥物與針對腫瘤細胞不同特性諸如血管發(fā)生和侵襲的靶特異性藥劑組合。這些調節(jié)方法可以離體(ex vivo)、體外(例如通過在作用劑的存在下培養(yǎng)細胞) 或體內(例如通過給受試者施用藥劑)來進行。所述方法包括施用蛋白質或蛋白質的組合、 或者核酸分子或核酸分子的組合，作為對抗差異表達基因的異常表達或其基因產物的異?；钚缘寞煼??？梢杂棉卓?即降低或抑制)過表達基因的活性的治療劑來治療特征在于基因和基因產物的表達水平或生物學活性(相對于未患有疾病或病癥的受試者)分別有所升高的疾病和病癥?？梢灾委熜曰蝾A防性的施用拮抗活性的治療劑。因此，在本發(fā)明背景中可利用的治療劑包括例如⑴過表達的ADAMTS18基因的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；(ii)針對過表達的基因或基因產物的抗體；(iii) 編碼過表達的基因的核酸；(iv) “功能不良的”(即由于過表達基因的核酸中的異源插入所致)的反義核酸或核酸；(V)雙鏈分子(例如siRNA);或(vi)調節(jié)劑(即改變過表達的多肽與其結合配偶體之間相互作用的抑制劑、拮抗劑)。功能不良的反義分子通過同源重組被用于“敲除”多肽的內源功能(參見例如Capecchi，Science 1989，244 :1288-92)。通過獲取患者組織樣品(例如從活檢組織)并在體外測定其RNA或肽水平、所表達的肽(或表達有所改變的基因的mRNA)的結構和/或活性，定量肽和/或RNA，從而可以容易的檢測出水平的升高。本領域中眾所周知的方法包括但不限于免疫測定(例如Western 印跡分析、免疫沉淀后續(xù)十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學等)和 /或用于檢測mRNA表達的雜交測定(例如Northern測定、斑點印跡、原位雜交等)。在疾病的明顯臨床癥狀出現之前進行預防性給藥，使得疾病或病癥得以預防或延遲其發(fā)展。本發(fā)明的治療方法可包括施用一種或多種可調制ADAMTS18基因產物的活性的作用劑的步驟?？烧{制蛋白質活性的作用劑的例子包括但不限于核酸、蛋白質、上述蛋白質的天然存在關聯配體、肽、肽模擬物和其他小分子。因此，本發(fā)明提供了通過降低ADAMTS18基因的表達或該基因產物的活性在受試者中治療或緩解癌癥癥狀、或預防癌癥的方法。本發(fā)明的方法特別適用于治療或預防肺癌和食管癌。
可預防性或治療性施用適合的治療劑給患有癌癥或有風險發(fā)生癌癥(或懷疑發(fā)生癌癥)的受試者。可通過使用標準臨床方法或通過檢測ADAMTS18基因的異常表達水平 (“上調”或“過表達”)或該基因產物的異?；钚詠龛b定這樣的受試者。根據本發(fā)明的一方面，通過本發(fā)明篩選方法鑒定的物質可用于治療或預防癌癥。 可使用本領域技術人員眾所周知的方法將這些物質施用給患者，例如，動脈內、靜脈內或經皮注射或鼻內、經支氣管、肌內或口服給藥。如果所述物質為DNA所能編碼的，則可將DNA 插入用于基因療法的載體，并可施用該載體給患者以實施該療法。根據待治療患者的體重、 年齡、性別、癥狀、狀況及給藥方法改變給藥劑量和方法；然而，本領域技術人員可常規(guī)選擇合適的劑量和給藥方法。例如，盡管與ADAMTS18多肽結合或調節(jié)該多肽活性的物質的劑量取決于上述多種因素，當正常體重成年人(60kg) 口服給藥時，該劑量通常為約O. Img到約IOOmg每天、優(yōu)選約L Omg到約50mg每天、更優(yōu)選約I. Omg到約20mg每天。當以注射劑形式向正常體重成年人^Okg)腸胃外給藥時，盡管根據患者、靶器官、癥狀和給藥方法存在一些差異，但靜脈內注射約O. Olmg到約30mg每天、優(yōu)選約O. Img 到約20mg每天、更優(yōu)選約O. Img到約IOmg每天的劑量是合適的。在其它動物的情況下，可通過轉換為60kg體重常規(guī)計算出合適的劑量。類似地，本發(fā)明的藥物組合物可用于治療或預防癌癥。可使用本領域技術人員眾所周知的方法將所述組合物施用于患者，例如動脈內、靜脈內或經皮注射或鼻內、經支氣管、肌內或口服給藥。對于前述每一種情況，可以約O. I-約250mg/kg每天的劑量范圍口服或通過注射來施用所述組合物，例如多肽和有機化合物。成人的劑量范圍通常為約5mg到約17. 5g/天、 優(yōu)選約5mg到約IOg/天、最優(yōu)選約IOOmg到約3g/天。片劑或其它以離散單元提供的單位劑量形式可方便地含有以這樣的劑量或者作為多個這樣的劑量有效的量，例如含有約5mg 到約500mg、通常為約IOOmg到約500mg。所用劑量依賴于多種因素，包括受試者的年齡、體重和性別，所治療的確切疾患及其嚴重程度。此外，給藥途徑也隨疾患及其嚴重程度而變化。然而無論怎樣，本領域技術人員都能在考慮上述因素的基礎上常規(guī)計算出合適的和最佳的劑量。具體來說，可通過將針對ADAMTS18基因的反義核酸直接施用于病痛部位或注射入血管中使之到達病痛部位，從而施用于患者。根據患者狀況，本發(fā)明的反義核酸衍生物的劑量可作適當調節(jié)并以所需量使用。例如，可施用O. l-100mg/kg、優(yōu)選O. l_50mg/kg的劑量范圍。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括將針對ADAMTS18基因的雙鏈分子施用于受試者的步驟。要施用的雙鏈分子的優(yōu)選例在“V-2.包含雙鏈分子的藥物組合物”項和下面的“VII.雙鏈分子和編碼它們的載體”項下描述。應理解，本發(fā)明的所述雙鏈分子降解亞化學計量的ADAMTS18基因。雖不愿拘于任何理論，認為本發(fā)明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規(guī)的癌癥療法相比，為實施治療效應而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領域技術人員在考慮了受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎上，能夠容易地確定本發(fā)明的雙鏈分子的有效量。一般而言，本發(fā)明雙鏈分子的有效量是在癌癥部位或其附近胞間濃度為大約I納摩爾(nM)到約ΙΟΟηΜ，優(yōu)選大約2nM到大約50nM，更優(yōu)選大約2. 5nM到大約ΙΟηΜ。 考慮可使用更多或更少量的雙鏈分子。本領域一般技術人員可方便地及常規(guī)地確定特定情況下所需的確切劑量。本發(fā)明的方法可用于抑制癌癥，例如肺癌，尤其是肺癌和食管癌，的生長或轉移。 為了治療癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈分子與不同于所述雙鏈分子的藥劑組合來施用于受試者。或者，本發(fā)明的雙鏈分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來施用于受試者。舉例而言，本發(fā)明所述雙鏈分子可與現在用于治療癌癥或預防癌癥轉移的治療方法(例如，放射療法，外科手術，以及使用化療劑的治療)組合施用。在本發(fā)明方法的背景中，雙鏈分子可以裸雙鏈分子的形式、以與投遞試劑相組合的形式，或者以表達雙鏈分子的重組質粒或者病毒載體的形式施用于受試者。用于與本發(fā)明的雙鏈分子組合施用的合適的投遞試劑包括Mirus Transit TKO親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚陽離子(例如聚賴氨酸)、或脂質體。一種優(yōu)選的投遞試劑是脂質體。脂質體能夠幫助將雙鏈分子投遞至特定的組織如視網膜或腫瘤組織中，還能夠增加雙鏈分子的血中半衰期。適合在本發(fā)明的背景中使用的脂質體可以是由常規(guī)的囊泡形成性脂質(vesile-forming lipids)形成的,囊泡形成性脂質通常包括中性或帶負電荷的磷脂，以及留醇，諸如膽固醇。對一些因素的考慮通?？梢詾橹|的選擇提供指導，如期望的脂質體大小以及在血流中的脂質體的半衰期等。有多種制備脂質體的方法是公知的，例如 Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ;美國專利第 4，235，871 號；第 4，501，728 號；第4，837，028號；第5，019，369號；將上述文獻的全部內容援引并入本說明書。優(yōu)選地，封裝本發(fā)明的雙鏈分子的脂質體包含能夠將脂質體輸送至癌癥部位的配體分子。優(yōu)選的配體是與腫瘤或血管內皮細胞中常見的受體結合的配體，例如與腫瘤抗原或內皮細胞表面抗原結合的單克隆抗體。特別優(yōu)選地，封裝本發(fā)明的雙鏈分子的脂質體經過了修飾以免被單核巨噬細胞和網狀內皮系統清除，例如，由于其結構的表面結合有調理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一個實施方案中,本發(fā)明的脂質體可以同時包括調理作用抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質體的調理作用抑制部分通常是與脂質體膜結合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當調理作用抑制部分化學地或物理地搭接在脂質體膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質的活性基團直接結合，則調理作用抑制部分與脂質體膜“結合”。這些調理作用抑制性親水性聚合物形成保護性表層，該表層顯著地減少巨噬-單核細胞系統(“麗S”)和網狀內皮系統(”RES”) 對脂質體的攝入；在例如美國專利第4，920，016號中對此有記載，后者的全部公開內容援引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質體相比，被調理作用抑制部分修飾過的脂質體能夠保留在血液循環(huán)中的時間顯著更長。出于以上理由，這樣的脂質體有時也被稱為“隱形”(stealth)脂質體。已知隱形脂質體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質體會高效率地蓄積。參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18 :6949_53。此外，RES 的攝入的減少阻止隱形脂質體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質體的毒性。因此，用調理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質體能夠將本發(fā)明的雙鏈分子輸送至腫瘤細胞。適用于修飾脂質體的調理作用抑制部分優(yōu)選為分子量約500 約40，000道爾頓、更優(yōu)選約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，諸如化學結合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經節(jié)苷脂，諸如神經節(jié)苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質酸、果膠酸、神經氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應而生成了羧基結合的羧基化多糖類或寡糖。優(yōu)選地，調理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質體有時稱為“PEG化脂質體”。調理作用抑制部分可以通過許多公知技術中的任何一種結合到脂質體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結合，然后再結合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。下項中討論了表達本發(fā)明的雙鏈分子的載體。這樣的表達至少一種本發(fā)明的雙鏈分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質體。將表達本發(fā)明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術領域的技術范圍內。本發(fā)明的雙鏈分子可以通過適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內施用途徑來施用。合適的腸內施用途徑包括口腔、直腸、或鼻內遞送。合適的非消化道施用途徑包括膀胱內和血管內施用(例如靜脈內推注、靜脈內輸注、動脈內推注、動脈內輸注和針對血管網絡的導管滴注)，組織周圍和組織內注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或其附近的區(qū)域，例如借助導管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過注射或輸注將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發(fā)明的雙鏈分子可以以單一劑量或分多個劑量來施用。當本發(fā)明的雙鏈分子的施用為輸注方式時，輸注可以是單個持續(xù)劑量，或者通過多次輸注來施用。優(yōu)選的是將作用劑直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優(yōu)選的是將作用劑多次注射到癌癥部位或其附近的組織中。本領域技術人員可以容易地確定用于對給定受試者施用本發(fā)明雙鏈分子的合適劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近?；蛘?，雙鏈分子可以在約3 約28日、更優(yōu)選約7 約10日的期間內每日一次或二次地施用給受試者。在優(yōu)選的劑量方案中，雙鏈分子可以在7日期間內一日一次地注射到癌癥部位或其附近。當劑量方案包括多次施用時，應該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量，可以包含在整個劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。在本發(fā)明中，可以用至少一種選自下組的活性成分來治療過表達ADAMTS18的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。要治療的癌癥的例子包括但不限于肺癌和食管癌。因而，在施用本發(fā)明的雙鏈分子作為活性成分之前，優(yōu)選確認要治療的癌細胞或組織中ADAMTS18的表達水平是否與相同器官的正常細胞相比升高。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療(過)表達 ADAMTS18的癌癥的方法，該方法可包括下列步驟i)檢測自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中ADAMTS18的表達水平；ii)將所述ADAMTS18表達水平與正常對照比較；并iii)對具有與正常對照相比過表達ADAMTS18的癌癥的受試者施用至少一種選自下組的成分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體?；蛘?，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含至少一種選自下組的成分，用于施用于具有過表達ADAMTS18的癌癥的受試者(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。換言之，本發(fā)明進一步提供了一種用于鑒定要用下述各項治療的受試者的方法(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(c)編碼它們的載體，該方法可包括測定源自受試者的癌細胞或組織中ADAMTS18的表達水平的步驟， 其中所述水平與該基因正常對照相比的升高指示該受試者具有可用本發(fā)明的雙鏈分子治
療的癌癥。下面會更加詳細地描述本發(fā)明治療癌癥的方法。要用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。
根據本發(fā)明，測定在自受試者獲得的癌細胞或組織中ADAMTS18的表達水平。使用本領域已知方法，可在轉錄(核酸)產物水平上確定表達水平。舉例而言，可使用雜交方法 (例如Northern雜交)、芯片或陣列、探針、RT-PCT來測定ADAMTS18的轉錄產物水平?；蛘?，可以檢測翻譯產物以進行本發(fā)明的治療。例如，可以確定觀察到的蛋白(SEQ ID NO 2)的量。作為另一種基于ADAMTS18基因的翻譯產物檢測其表達水平的方法，可利用針對 ADAMTS18蛋白的抗體通過免疫組織化學分析測量染色的強度。意即，在此測量中，強染色表明所述蛋白質的存在/水平增加，且同時表明ADAMTS18基因的高表達水平。用于檢測或測量ADAMTS18多肽和/或編碼它的多核苷酸的方法如上文(I.診斷癌癥)例示的。VII.雙鏈分子和編碼它們的載體在本文中，證明了包括SEQ ID NO :11或12之任一序列的siRNA阻抑表達 ADAMTS18基因的細胞生長或細胞存活力。因此，認為包括任何這些序列的雙鏈分子和表達該分子的載體充當用于治療或預防涉及ADAMTS18基因表達細胞增殖的疾病，例如癌癥，特別是肺癌和食管癌的優(yōu)選藥物。如此，依照一個方面，本發(fā)明提供了包括選自SEQ ID NO 11和12的靶序列的雙鏈分子和表達該分子的載體。更具體地，本發(fā)明提供了在導入表達 ADAMTS18基因的細胞中時，抑制該基因表達的雙鏈分子，其中該雙鏈分子包括有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包括選自SEQ ID N0:11和12的核苷酸序列作為靶序列，且該反義鏈包括與該有義鏈的靶序列互補的核苷酸序列，使得該有義和反義鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子。或者，本發(fā)明提供了在導入表達ADAMTS18基因的細胞中時，抑制該基因表達的雙鏈分子，其中該雙鏈分子具有有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈具有與選自SEQ ID N0:11和12的靶序列對應的核苷酸序列，且該反義鏈具有與該有義鏈的靶序列互補的核苷酸序列，使得該有義和反義鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子。有義鏈中所包括的ADAMTS18基因的靶序列可以由SEQ ID NO 1的一部分的序列組成，所述一部分少于約500、400、300、200、100、75、50或25個連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，靶序列可以是來自核苷酸序列SEQ ID NO 1的約19至約25個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明不限于此， 但合適的靶序列包括選自SEQ ID NO 11和12的核苷酸序列。本發(fā)明的雙鏈分子可以由兩個多核苷酸構建體構成，即一個包括有義鏈的多核苷酸和一個包括該反義鏈的多核苷酸?；蛘?，該分子可以由一個多核苷酸構建體構成；即一個包括有義鏈和反義鏈二者的多核苷酸，其中有義和反義鏈經單鏈多核苷酸連接，從而能夠通過形成發(fā)夾結構而導致有義和反義鏈內靶序列的雜交。在本文中，單鏈多核苷酸也可稱作“環(huán)序列”或“單鏈”。連接有義和反義鏈的單鏈多核苷酸可以由3至23個核苷酸組成。 關于本發(fā)明雙鏈分子的更多詳情見“V-2.包括雙鏈分子的藥物組合物”項下。本發(fā)明中所述雙鏈分子可包含一個或更多個修飾核苷酸和/或非磷酸二酯連接。本領域眾所周知的化學修飾具有增加所述雙鏈分子的穩(wěn)定性、可用性和/或細胞攝入的能力。一般技術人員明白本發(fā)明分子可包含的其它類型的化學修飾(W003/070744 ； W02005/045037)。在一個實施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。上述修飾的例子包括硫代磷酸酯聯接、2’ -0-甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉脫氧脫堿基殘基的摻入(US20060122137)。在另一個實施方案中，可以使用修飾來增強雙鏈分子的穩(wěn)定性或增加尋靶效率。 修飾包括雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學交聯、雙鏈分子一條鏈的3’或5’末端的化學修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸 (W02004/029212)。在另一個實施方案中，修飾可以用于增加或減少針對靶mRNA中和/或互補雙鏈分子鏈中互補核苷酸的親和力(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一個實施方案中，當雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15，15 (2) :188-200)。關于進一步的細節(jié)，可以利用公開文獻如US20060234970。本發(fā)明不限于這些實例，可以將任何已知化學修飾應用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得分子保留抑制靶基因表達的能力。此外，本發(fā)明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現出提高的穩(wěn)定性?？梢孕纬蒁NA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸) 組成的雜合型雙鏈分子、或在任一單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，諸如此類，來增強所述雙鏈分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA鏈的雜合體可以是這樣的雜合體，其中有義鏈是DNA而反義鏈是RNA，或者相反，只要它在導入表達靶基因的細胞中后具有抑制該基因表達的活性。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可以是這樣的分子，其中有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要在導入表達靶基因的細胞中時，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩(wěn)定性，分子中優(yōu)選包含盡可能多的DNA;而為了誘導靶基因的表達抑制，要求分子在一定范圍內是RNA，以充分地誘導表達抑制。作為嵌合型雙鏈分子的一個優(yōu)選實例，雙鏈分子的上游部分區(qū)域(即位于有義鏈或反義鏈內的靶序列或其互補序列之側翼的區(qū)域)為RNA。所述上游部分區(qū)表示有義鏈的5’側(5’端)和反義鏈的 3’側(3’端)。就是說，在優(yōu)選實施方案中，反義鏈3’末端側翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側翼的區(qū)域和反義鏈3’末端側翼的區(qū)域均由RNA組成。例如，本發(fā)明的嵌合型或雜合型雙鏈分子包含以下組合。有義鏈5，_[—DNA—]_3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，和有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，
3，_(—RNA)_5，反義鏈。上游部分區(qū)優(yōu)選是由9-13個核苷酸組成的域，從雙鏈分子的有義鏈或反義鏈內的靶序列或其互補序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實例包括這樣的實例鏈長為19-21個核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半區(qū)(對于有義鏈為5’側區(qū)域而對于反義鏈為3’側區(qū)域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達的效果比反義鏈整體為RNA時強得多(US20050004064)。在本發(fā)明的背景中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾結構，例如短發(fā)夾RNA(ShRNA)以及由 DNA與RNA組成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成緊密的發(fā)夾轉彎，可以用來通過RNA干擾來沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA 在單一鏈上包含有義靶標序列和反義靶標序列，其中所述序列被環(huán)序列隔開。通常，發(fā)夾結構被細胞機制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進一步與RNA誘導的沉默復合物(RISC)結合。這種復合物結合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶標序列匹配的 mRNA?；蛘?，本發(fā)明提供了包括具有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的每一種的載體，其中所述有義鏈核酸包括SEQ ID NOs: 11或12的核苷酸序列，且所述反義鏈核酸由與有義鏈互補的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導入表達ADAMTS18的細胞中時抑制所述基因表達。優(yōu)選地， 多核苷酸的有義鏈是長度介于約19個和約25個核苷酸之間的寡核苷酸(例如來自SEQ ID NO :1的核苷酸序列的連續(xù)核苷酸)。更優(yōu)選地，多核苷酸組合包括單一核苷酸轉錄物， 其具有經單鏈核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈。更優(yōu)選地，多核苷酸的組合具有通式 5，-[A]-[B]-[A，]-3，或 5，-[A，]-[B]-[A]-3，，其中[A]包含 SEQ ID N0:11 或 12 的核苷酸序列，[B]為由約3至約23個核苷酸組成的核苷酸序列，而[A’]為互補于[A]的核苷酸序列。本發(fā)明的載體可通過下述方法生成例如，將ADAMTS18序列克隆入表達載體中， 使調控序列可操作性地連接于ADAMTS18序列，以允許兩條鏈的表達(通過DNA分子的轉錄)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，與 mRNA 反義的 RNA 分子由第一啟動子(例如位于克隆DNA的3’末端側翼的啟動子序列)轉錄，對mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動子(例如位于克隆DNA的5’末端側翼的啟動子序列)轉錄。 有義和反義鏈在體內雜交，產生用于沉默該基因的雙鏈分子構建體?；蛘?，使用分別編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個載體構建體來分別表達有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構建體。而且，克隆的序列可編碼具有二級結構(例如發(fā)夾)的構建體，即，載體的單一轉錄物同時包含靶基因的有義序列和互補反義序列二者。也可以配置本發(fā)明的載體使得其實現在靶細胞的基因組中的穩(wěn)定插入(關于同源重組盒載體的說明，參見Thomas KR&Capecchi MR, Cell 1987，51 :503-12)?？梢詤⒖祭?Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ；美國專利第 5，580，859 號、第 5，589，466 號、第 5，804，566 號、第 5，739，118 號、第 5，736，524 號、第 5，679，647 號和 WO 98/04720?；?DNA的輸送技術的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導型) 輸送、陽離子脂質復合體、和粒子介導型投遞(“基因槍”)或壓力介導型輸送(例如參照美國專利第5，922，687號)。本發(fā)明的載體包括，例如，病毒載體或細菌載體。表達載體的例子包括牛痘或雞痘等減毒病毒宿主(參照美國專利第4，722，848號)。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來表達編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導入表達靶基因的細胞時即表達該分子并由此抑制細胞的增殖。可使用的載體的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG載體在 Mover等，Nature 1991，351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈分子的治療性施用與生產，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等?？梢詤⒄绽鏢iata等，Mol Med Today 2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。下面，本發(fā)明將參考實施例進行更加詳細的說明。然而，下面的材料、方法和實施例僅僅是舉例說明本發(fā)明的多個方面，并不意圖對本發(fā)明的范圍進行限制。因此，與這里所述相似或等同的方法和材料也可以用于實施或測試本發(fā)明。
實施例材料和方法細胞系和組織樣品。此項研究中使用的15種人肺癌細胞系包括5種腺癌(ADC ；NCI-H1781, NCI-H1373，LC319，A549 和 PC-14)，5 種鱗狀細胞癌(SCC ；SK-MES-1，NCI-H520，NCI-H1703， NCI-H2170 和 LU61)，1 種大細胞癌(LCC ；LXl)，和 4 種小細胞肺癌(SCLC ；SBC-3，SBC-5， DMS 114和DMS273)。此項研究中使用的10種人食管癌細胞系如下9種SCC細胞系(TE1， TE2，TE3，TE4，TE5，TE6，TE8，TE9JPTE10)和 1 種 ADC 細胞系(TE7) (Nishihira T，et al. J Cancer Res Clin Oncol 1993 ；119 :441-9.) 所有細胞在補充有 10%胎牛血清(FCS)的適宜培養(yǎng)基中以單層培養(yǎng)并在含5% CO2的增濕空氣中于37°C維持。用作正常對照的人小氣道上皮細胞(SAEC)在經過優(yōu)化的培養(yǎng)基(Cambrex Bioscience, Inc)中培養(yǎng)。原發(fā)性肺癌和 ESCC 樣品早前在知情同意下獲得(Kikuchi T5Daigo Y，Katagiri T，et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Taniwaki Μ, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006 ；29 567-75, Yamabuki Τ, Daigo Y, Kato Τ,et al. Int J Oncol 2006 ;28 :1375—84)。半定量RT-PCR。使用隨機弓I物(Roche Diagnostics)禾口 Superscript II (Invitrogen) 來自每份樣品的總共3微克mRNA等份試樣逆轉錄成單鏈cDNA。半定量RT-PCR實驗用下述各組對人上皮細胞轉化序列2(ADAMTS18)特異性的合成引物或用作為內部對照的β-肌動蛋白(ACTB)特異性引物進行ADAMTS18，5，-GGATTAGCCAGCTCAGCATA-3，(SEQ ID NO 3)禾口 5，-CTGTTTTTCAGAAGGCAACG-3，(SEQ ID NO 4) ；ACTB，5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ ID NO 5)和 5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQ ID NO :6)。對 PCR 反應優(yōu)化循環(huán)數以確保產物強度在擴增的線性期內。Northern 印跡分析。將涵蓋23種組織的人多組織印跡(BD Bioscience)與ADAMTS18的[α -32P] -dCTP 標記的 226-bp PCR 產物(其使用引物 5' -TAGGGCAACATGGACTGTTTAAG-3 ‘ (SEQ ID N0:
517)和 5' -GCTGTGTTTTGTCATTTAGCTCC-3‘ (SEQ ID NO:8)制備成探針)雜交。預雜交、雜交、和清洗遵循制造商的說明書實施。將印跡于-80°C用增強屏放射自顯影7天。RNA干擾測定。為了評價ADAMTS18在癌細胞中的生物學功能，使用針對靶基因的短發(fā)夾RNA。用于RNAi的合成寡核苷酸的靶序列如下對照1 (增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)，維多利亞水母(Aequorea victoria) GFP的突變體)， 5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQ ID NO :9)；對照 2(螢光素酶(LUC)螢火蟲 (Photinus pyralis)螢光素酶基因)，5，-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3，(SEQ ID NO: 10)； si-ADAMTS 18-#1,5' -GCCAGUAUCUCAAGAAAUU-3‘ (SEQ ID NO :11) ;si_ADAMTS18-#2，和 5' -GGGCACAACUUUGGUAUGA-3‘ (SEQ ID 而1幻。將 DMS114 和 TE4 細胞涂布到 ΙΟ-cm 盤上(每個盤1. 5xl06個細胞)，并使用24微升Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商的指令用siRNA寡核苷酸(IOOnM)轉染。溫育7天后，這些細胞通過吉姆薩溶液染色以評估集落形成，并通過溴化3- ，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑(MTT)測定評估細胞數。ADAMTS18表達質粒的制備。為了調查ADAMTS18的生物學功能，制備了表達ADAMTS18全長片段的帶p3XFLAG 標簽(C端)的質粒。Western 印跡。將細胞在裂解緩沖液中裂解；50mmol/LTris-HCl (pH 8. 0), 150mmol/LNaCl, 0. 5% NP40,0. 5%脫氧膽酸鈉，和蛋白酶抑制劑混合物組III(Calbiochem)。通過Bio-fcid 蛋白質測定系統(Bio-Rad)來測定每份裂解物的蛋白質含量，以牛血清白蛋白(BSA)作為標準品。每份裂解物取10微克在5-15%變性聚丙烯酰胺凝膠(帶4%聚丙烯酰胺積層凝膠)上解析并電泳轉移至硝酸纖維素膜(GE Healthcare Bio-sciences)。用TBST中的 5%無脂奶粉封閉后，膜與家兔中生成的抗FLAG抗體(SIGMA) —起于室溫溫育1小時。將免疫反應性蛋白質與綴合有辣根過氧化物酶的二抗(GE Healthcare Bio-sciences) 一起于室溫溫育1小時。用TBST清洗后，反應物使用增強型化學發(fā)光試劑盒(GE Healthcare Bio-sciences)顯色。將細胞培養(yǎng)液應用于^festern印跡時，在以1，OOOXg，4°C離心10-15 分鐘后收集上清液。然后，使用Amicon Ultra_15離心過濾裝置(MILLIP0RE)依照制造商的指令濃縮上清液。細胞生長測定。將用表達ADAMTS18的帶p3XFLAG標簽(C端)的質?；蛴媚M質粒轉染的C0S-7 和A549細胞接種到6孔微量滴度板上(IxlO4個細胞/孔)。溫育7天后，使用細胞計數試劑盒依照供應商(Wako)的指導評估這些細胞。N-糖苷酶測定。如上所述收獲用表達ADAMTS18的帶p3XFLAG標簽(C端)的質?；蛴媚M質粒轉染的C0S-7細胞，并將每份樣品與N-糖苷酶F(CALBIOCHEM)混合。于37°C溫育16小時后， 實施Western印跡分析。免疫細胞化學分析。將細胞涂布到玻璃蓋玻片(Becton Dickinson Labware)上，用4%低聚甲醛固定，并通過用含0.1 ^Triton X-100的PBS于室溫處理3分鐘使得可透。通過用 CASBLOCK(ZYMED)于室溫處理10分鐘來阻斷非特異性結合。然后將細胞與含1 % BSA的 PBS中稀釋的家兔中生成的抗FLAG抗體(SIGMA) —起于室溫溫育60分鐘。用PBS清洗后， 將細胞用FITC綴合的二抗(SantaCruz)于室溫染色60分鐘。再次用PBS清洗后，每份標本用 Vectashield (Vector Laboratories)含有 4'，6_ 二脈 _2_ 苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI) 封固并用 Spectral 共焦掃描系統(TSC SP2A0BS, Leica Microsystems)顯現。Matrigel 侵襲測定。將用表達ADAMTS18的帶p3XFLAG標簽(C端)的質粒或用模擬質粒轉染的C0S-7 細胞在含有10% FCS的DMEM中培養(yǎng)至接近匯合。通過胰蛋白酶消化來收獲細胞，在不添加血清或蛋白酶抑制劑的DMEM中清洗，并以IxlO5個細胞/ml的濃度在DMEM中懸浮。在制備細胞懸浮液之前，將干的Matrigel基質層(Becton Dickinson Labware)用DMEM于室溫復水2小時。向24孔Matrigel侵襲室的每個下室中加入含有10% FCS的DMEM(0. 75ml)， 并向上室的每個插片中加入0.5ml (切104個細胞)細胞懸浮液。將插片的板于37°C溫育 M小時。溫育后，處理小室；將侵襲穿過Matrigel的細胞固定并用遵循供應商(Becton Dickinson Labware)的指導進行吉姆薩染色。在相同的時間點檢查細胞生長測定。接著， 將用si-ADMTS18-#l或對照(EGFP)轉染的DMSl 14細胞在轉染M小時后接種在Matrigel 侵襲室中，并如上所述檢查細胞侵襲?；|金屬蛋白酶測定。制備兩類細胞；將用表達ADAMTS18的帶p3XFLAG標簽(C端)的質?；蛴媚M質粒轉染的C0S-7細胞在含有10% FCS的DMEM中培養(yǎng)至接近匯合，而將用si-ADAMTS 18_#1 或用對照I(EGFP)轉染的DMS114細胞溫育48小時。然后，收集細胞培養(yǎng)液的上清液，并于4°C以1，OOOXg離心10-15分鐘。收集上清液并使用knsoLyte 570通用測定試劑盒 (AnaSpec)依照制造商的指導檢查基質金屬蛋白酶(MMP)活性。將含有MMP的樣品與ImM 4-氨基苯基乙酸汞一起溫育2小時以活化MMP?；旌蠘悠泛屯ㄓ肕MP底物(含有MMP_1，2， 7，8，9，10，13和14的底物)并啟動酶促反應，于室溫溫育30分鐘。用酶標儀(Microplate Reader)測量熒光強度。結果肺癌和食管癌和正常組織中的ADAMTS18表達。使用由27，648種基因或表達序列標簽組成的cDNA微陣列對101例肺癌(86例 NSCLC和15例小細胞肺癌)和19例ESCC，以及30種正常器官進行了基因組范圍表達譜 ^ff (Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, et al. Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N,et al. Hum Mol Genet 2004 ； 13 :3029-43,Kikuchi Τ,Daigo Y,Ishikawa N,et al.Int J Oncol 2006 ；28 :799-805,Taniwaki Μ,Daigo Y,Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75, Yamabuki Τ, Daigo Y, Kato Τ, et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84)。 鑒定出ADAMTS18轉錄物在絕大多數檢查的肺癌和食管癌樣品的癌細胞中表達升高(> =3 倍)。此外，在除睪丸外的四種正常組織中均沒有觀察到ADAMTS18表達(數據未顯示)。 因此，認為ADAMTS18是用于進一步分析的較好分子候選。通過半定量RT-PCR實驗在檢查的7/15份肺癌組織、2/15份肺癌細胞系、5/10份ESCC組織、和1/10種ESCC細胞系中確認了它的過表達(圖IA和1B)。在5名ESCC患者中，還比較了 ESCC組織及其正常食管組織之間的ADAMTS18表達(

圖1C)。在所檢查的23種正常人組織中使用ADAMTS18cDNA作為探針進行Northern印跡分析，僅在胎盤中鑒定出6. Ο-kb轉錄物(圖1D)。ADAMTS18的小干擾RNA對癌細胞生長的抑制。為了評估ADAMTS18是否對肺癌和食管癌細胞的生長或存活至關重要，使用針對 ADAMTS18的siRNA的合成寡核苷酸，將其轉染入內源表達高水平的ADAMTS18的DMSl 14 和TE4細胞。用si-ADAMTS 18-#1或-#2轉染的細胞中ADAMTS 18_mRNA水平與用對照 siRNA轉染的細胞相比顯著降低(圖2，頂部小圖)。MTT測定和集落形成測定揭示了用 si-ADAMTS18-#l或-#2轉染的細胞的數目的顯著降低(圖2，中部和底部小圖)。外源ADAMTS18對細胞生長的影響。為了評估ADAMTS18在腫瘤發(fā)生中的潛在作用，制備了設計成表達ADAMTS18的質粒(pCAGGSn3FC-ADAMTS18)并轉染入 C0S-7 細胞。通過 1Western 印跡確認了 ADAMTS18 表達(圖3A，左邊小圖)后，進行了 MTT測定，發(fā)現C0S-7-ADAMTS18細胞的生長與用模擬載體轉染的C0S-7細胞相比得到了顯著程度的促進(圖3A，右邊小圖)。接著，與C0S-7細胞一樣轉染A549細胞，顯示外源ADAMTS18促進了 A549的細胞生長(圖。ADAMTS18的翻譯后修飾。為了檢查外源ADAMTS18的翻譯后修飾，實施了 N-糖苷酶測定。與N-糖苷酶一起溫育后，Western印跡分析揭示了外源ADAMTS18蛋白的條帶向下移動(圖4A)。結果提示 ADAMTS18可能在翻譯后發(fā)生N-糖基化。外源ADAMTS18蛋白的亞細胞定位。為了檢查外源ADAMTS18蛋白的亞細胞定位，使用抗FLAG實施了免疫細胞化學分析。轉染后72小時，外源ADAMTS18蛋白位于C0S-7細胞的細胞質(圖4B)。ADAMTS18蛋白的定位看上去像顆粒狀圖樣。它可能是分泌囊泡。外源ADAMTS18蛋白向培養(yǎng)基中的分泌。ADAMTS18被推測是分泌型蛋白質，所以使用不表達或很低地表達ADAMTS18的 C0S-7細胞來過表達ADAMTS18，以評估ADAMTS18蛋白向培養(yǎng)基中的分泌(圖4C)。ADAMTS18 轉染后48小時，更換培養(yǎng)基。然后，在轉染后72小時時，收獲培養(yǎng)基。離心后，濃縮培養(yǎng)基并應用于Wfestern印跡分析。外源ADAMTS18蛋白表現為分泌入培養(yǎng)基(圖4D)。ADAMTS18對哺乳動物細胞侵襲的激活。因為ADAMTS18含有金屬蛋白酶域，它消化ECM(細胞外基質)，所以使用哺乳動物細胞(C0S-7)通過Matrigel測定檢查ADAMTS18在細胞侵襲中的可能作用。與模擬載體用轉染的細胞相比，將ADAMTSlScDNA轉染入細胞中顯著增強了它們穿過Matrigel的侵襲活性(圖5A)。而且，在與Matrigel測定同一時間點實施的細胞生長測定沒有揭示它們之間的顯著差異(圖5B)。這個結果獨立地提示ADAMTS18可能有助于癌細胞高度惡性的表型。ADAMTS18 的 MMP 活性。由于ADAMTS18含有金屬蛋白酶域且具有細胞侵襲效應，通過MMP測定評估了 ADAMTS18的MMP活性。與用模擬載體轉染的細胞相比，用ADAMTS18表達質粒轉染的C0S-7 細胞顯著增強了 MMP活性(圖5C)。相反，與用對照SiRNA(EGFP)轉染的細胞相比，用 si-ADAMTS 18-#1轉染的肺癌細胞(DMS114)顯著顯示降低的MMP活性(圖5D)。這些結果提示ADAMTS18可能擁有MMP活性且有助于癌細胞侵襲。碰通過激光顯微解剖富集癌細胞后，使用含有27，648種基因的cDNA微陣列對101 例肺癌和19例ESCC實施了基因組范圍表達譜分析。作為該分析的結果，鑒定出一些基因， 它們可能是用于開發(fā)新的診斷標志物、治療性藥物、和/或免疫療法的潛在較好候選者，而且發(fā)現ADAMTS18在大多數肺癌和食管癌樣品中頻繁反式激活，而且它的基因產物在癌細胞的生長和進展中發(fā)揮不可缺少的作用。ADAM蛋白質家族，一種MMP相關金屬蛋白酶家族，是涉及其它跨膜蛋白的蛋白水解加工、細胞粘附和細胞信號傳導事件的多功能蛋白質(Mochizuki S and Okada Y. Cancer Sci 2007;98:621-8)。許多跨膜蛋白通過一個或多個蛋白水解步驟被加工成生物學活性構造。例子包括生長因子(諸如EGF,HB-EGF和TGF- α )和細胞因子(諸如TNF- α )，它們都是作為前體合成的。另外，有一些細胞表面受體在跨膜域附近被切割，該過程稱作胞外域脫落(ectodomain shedding)。這些包括 TNF-α 受體-I、TNF-α 受體-II、CD44，L-選擇蛋白和Erb4/HER4。這些受體的可溶性的、被釋放的胞外域可以是響應于配體活化而發(fā)生的下調的一部分，或者它們可以具有它們自己的功能。在過去幾年里已探明ADAM在這些過程中發(fā)揮主要作用。惡性腫瘤的關鍵特征是它們侵襲周圍組織、到達血管和淋巴系統、和通過轉移性傳播而播撒至遠端器官的能力。越來越多的證據證明蛋白水解酶諸如基質金屬蛋白酶 (MMP)和密切相關的ADAM(解聯蛋白和金屬蛋白酶)和ADAMTS(具有血小板反應蛋白基序的解聯蛋白和金屬蛋白酶)在癌癥發(fā)生和進展中的至關重要的作用。雖然關于ADAM和 ADAMTS在癌癥中的功能的信息仍然有限，最近的研究提供了不同類型的癌癥中各種ADAM 和ADAMTS失調的證據。因此，這些蛋白質引起了許多研究組的注意，而且以近來其中某些蛋白質的缺陷小鼠的產生為基礎，人們正在進行ADAM和ADAMTS的功能分析。在本發(fā)明中，ADAMTS18被表征為涉及肺癌和食管癌的新的癌蛋白。評估了 ADAMTS18對癌細胞生長和/或存活的重要性。用阻抑ADAMTS18表達的特異性siRNA處理兩種癌細胞導致了癌細胞生長的抑制。還獲得了其他支持ADAMTS18在癌發(fā)生中的意義的證據。將外源ADAMTS18導入哺乳動物C0S-7細胞和A549肺癌細胞中導致對細胞生長的顯著促進。另外，將外源ADAMTS18導入C0S-7細胞中激活了細胞侵襲。正如預期的，ADAMTS18 被分泌到培養(yǎng)基中，并且可能具有MMP活性。這些結果強烈提示ADAMTS18有可能對癌細胞生長和侵襲發(fā)揮重要作用，且可能導致腫瘤發(fā)生和轉移。因為特定ADAM表現出促進癌癥啟動和進展，所以可合理預測阻斷它們的作用會減緩或阻止腫瘤進展。在最近幾年，針對少數 ADAM 的一些選擇性合成抑制劑已有記載(Duffy MJ, McKiernan E，0&apos ；Donovan N, and McGowan PM. Clin Cancer Res 2009;15:1140-4)。因為 ADAMTS18 被正確歸類為典型的癌癥-胎盤抗原之一，所以用小分子化合物選擇性抑制ADAMTS18酶活性是一種有希望的治療策略，預期具有強有力的抗癌癥生物學活性且不利事件的風險最低?？傊?，本文中的數據有助于設計特異性靶向ADAMTS18致瘤活性的新抗癌藥物，用于治療癌癥患者。ADAMTS18被鑒定為新穎潛在治療靶，用于具有肺癌和食管癌的患者。工業(yè)應用性本文中描述的使用基因組范圍cDNA微陣列的癌癥的基因表達分析鑒定出特定基因作為癌癥預防和治療的靶?；贏DAMTS18基因的差異表達，本發(fā)明提供用于診斷或檢測癌癥，特別是肺癌和食管癌的分子診斷標志物。本文中提供的數據增加對癌癥的綜合理解，便于開發(fā)新穎診斷策略，并為鑒定治療藥和預防劑的分子靶提供線索。此類信息有助于更加深刻地理解腫瘤發(fā)生，并為開發(fā)用于診斷、治療、和最終預防癌癥的新策略提供指標。如本文中證明的，細胞生長受到特異性靶向ADAMTS18基因的雙鏈分子阻抑。因此，這些新雙鏈分子可實際用作抗癌藥物。ADAMTS18基因的表達在癌癥，特別是肺癌和食管癌中與正常器官相比顯著升高。 因而，此基因可方便地實際用作癌癥，特別是肺癌和食管癌的診斷標志物，而且由其編碼的蛋白可用于癌癥的診斷測定。另外，本文中描述的方法可用于診斷癌癥，包括肺癌和食管癌。此外，本發(fā)明提供用于治療癌癥，包括肺癌和食管癌的新治療辦法。ADAMTS18基因可實際用作用于開發(fā)抗癌藥物的有用的靶。通過述及完整收錄本文中引用的所有專利、專利申請、和出版物。另外，雖然已經詳細地且參照其具體實施方案描述本發(fā)明，要理解的是，前面的描述在性質上是例示性的和解釋性的，而且意圖例示本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案。通過常規(guī)實驗，本領域技術人員會容易地認識到可以在其中進行各種改變和修改，不偏離本發(fā)明的精神和范圍。如此，本發(fā)明意圖不受上文描述限定，而是由所附權利要求及其等同方案限定。
權利要求
1.一種用于在受試者中檢測或診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法，包括測定源自受試者的生物樣品中ADAMTS18基因的表達水平的步驟，其中所述表達水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示所述受試者罹患或有風險發(fā)生癌癥，其中所述表達水平是通過任何選自下組的方法測定的(a)檢測ADAMTS18 基因的 mRNA ；(b)檢測由ADAMTS18基因編碼的蛋白質；和(c)檢測由ADAMTS18基因編碼的蛋白質的生物學活性。
2.權利要求I的方法，其中所述表達水平比該正常對照水平高至少10%。
3.權利要求I或2的方法，其中該生物學活性為細胞增殖活性、N-糖基化活性、侵襲活性或基質金屬蛋白酶(MMP)活性。
4.一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；(b)檢測該多肽或片段和該測試物質之間的結合；并(c)選擇結合該多肽或片段的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。
5.一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與ADAMTS18多肽或其片段接觸；(b)檢測該多肽或片段的生物學活性；(c)將該多肽或片段的生物學活性與在該物質不存在時檢測到的生物學活性比較；和(d)選擇阻抑該多肽的生物學活性的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。
6.權利要求5的方法，其中該生物學活性為細胞增殖活性、N-糖基化活性、侵襲活性或基質金屬蛋白酶(MMP)活性。
7.一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其包括下述步驟(a)使測試物質與表達ADAMTS18基因的細胞接觸；(b)檢測ADAMTS18基因的表達水平；(c)將該表達水平與在該測試物質不存在時檢測到的表達水平比較；并(d)選擇降低該表達水平的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。
8.一種篩選用于治療或預防癌癥的候選物質的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)使測試物質與其中導入有載體的細胞接觸，該載體包含ADAMTS18基因的轉錄調節(jié)區(qū)和在該轉錄調節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；(b)測量所述報告基因的表達水平或活性；(c)將該表達水平或活性與在該測試物質不存在時檢測到的表達水平或活性比較；并(d)選擇降低該表達水平或活性的測試物質作為用于治療或預防癌癥的候選物質。
9.一種雙鏈分子，其在導入表達ADAMTS18基因的細胞中時抑制該基因的表達，其中該雙鏈分子包含有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包含與選自SEQ ID NO : 11和12的靶序列對應的核苷酸序列，且該反義鏈包含與該有義鏈的靶序列互補的核苷酸序列，使得該有義和反義鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子。
10.權利要求9的雙鏈分子，其中該有義鏈與反義鏈在該靶序列處雜交以形成長度為 19-25個核苷酸對的所述雙鏈分子。
11.權利要求9或10的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為單一多核苷酸構建體，該單一多核苷酸構建體包含經由單鏈連接的所述有義鏈和所述反義鏈。
12.權利要求11的雙鏈分子，其具有通式5’_[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A]為有義鏈， 其包含與選自SEQ ID NO 11和12的靶序列對應的核苷酸序列，[B]為單鏈且由3至23個核苷酸組成，且[A’]為反義鏈，其包含與選自SEQ ID NO 11和12的靶序列互補的核苷酸序列。
13.—種載體，其編碼權利要求9至12任一項的雙鏈分子。
14.載體，它們包含包括有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中的每一種，其中所述有義鏈核酸包含與SEQ ID NO : 11或12對應的核苷酸序列，且所述反義鏈核酸由與該有義鏈互補的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉錄物彼此雜交以形成雙鏈分子， 且其中所述載體在導入表達ADAMTS18基因的細胞中時抑制細胞增殖。
15.一種在受試者中治療或預防癌癥的方法，包括對所述受試者施用藥學有效量的針對ADAMTS18基因的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子抑制ADAMTS18 基因的表達。
16.權利要求15的方法，其中該雙鏈分子為權利要求9至12中任一項的雙鏈分子。
17.權利要求15的方法，其中該載體為權利要求13或14的載體。
18.權利要求I至8和15至17中任一項的方法，其中該癌癥選自肺癌和食管癌。
19.一種用于治療或預防癌癥的組合物，該組合物包含藥學有效量的針對ADAMTS18基因的雙鏈分子或包含所述雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子抑制ADAMTS18基因的表達，和可藥用的擔載體。
20.權利要求19的組合物，其中該雙鏈分子為權利要求9至12中任一項的雙鏈分子。
21.權利要求19的組合物，其中該載體為權利要求13或14的載體。
22.權利要求19至21中任一項的組合物，其中該癌癥選自肺癌和食管癌。
23.一種用于診斷或檢測癌癥的試劑盒，其包含用于檢測ADAMTS18基因的轉錄或翻譯產物的試劑。
24.權利要求23的試劑盒，其中該試劑包含結合ADAMTS18基因的轉錄產物的核酸或結合ADAMTS18基因的翻譯產物的抗體。
25.用于診斷或檢測癌癥的試劑，其包含結合ADAMTS18基因的轉錄產物的核酸或結合 ADAMTS18基因的翻譯產物的抗體。
26.權利要求23或24的試劑盒或權利要求25的試劑，其中該癌癥選自肺癌和食管癌。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測和診斷癌癥的方法，此方法涉及測定ADAMTS18基因的表達水平。發(fā)現此基因可區(qū)分癌細胞與正常細胞。另外，本發(fā)明提供篩選可用于治療癌癥的治療劑的方法和用于治療癌癥的方法。此外，本發(fā)明提供靶向ADAMTS18的雙鏈分子，其均有望可用于治療癌癥。
文檔編號A61K38/00GK102597235SQ20108004803
公開日2012年7月18日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權日2009年8月24日
發(fā)明者中村佑輔, 角田卓也, 醍醐彌太郎 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司