專利名稱：用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙肼敏感性的方法和試驗片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的方法和試驗片。
背景技術(shù)：
據(jù)報道，目前日本每年有數(shù)千人、全球每年有數(shù)百萬人死于結(jié)核。結(jié)核的治療基本 上采用以化學(xué)療法為中心的內(nèi)科療法，在通過內(nèi)科療法無法達到治療目的的情況下考慮外 科療法。作為內(nèi)科療法中使用的結(jié)核治療的藥物，已知有異煙胼(INH)、利福平(RFP)、鏈 霉素(SM)、乙胺丁醇(EB)、吡嗪酰胺(PZA)等多種藥物。但是，在對患者給藥時，存在著產(chǎn) 生耐藥菌的問題，所述耐藥菌因突然變異而獲得了對所給藥物的耐性。有報道稱耐藥菌由于特定基因發(fā)生突變而獲得耐藥性。因此，人們開發(fā)了通過 檢測特定基因的突變來檢測耐藥菌的檢測方法。例如，有人公開了結(jié)核桿菌診斷試劑盒，該 試劑盒中包含固定有寡核苷酸的基板，所述寡核苷酸是根據(jù)對結(jié)核治療用藥物敏感的野生 型結(jié)核桿菌和對任一種藥物具有耐性的突變型結(jié)核桿菌中的結(jié)核桿菌基因組上的結(jié)核治 療用耐藥性關(guān)聯(lián)基因的核苷酸序列合成的(專利文獻1)?，F(xiàn)在開發(fā)的DNA微列陣試劑盒 "Oligo Array"(日清紡績株式會社)是能夠檢測與對INH、RFP、SM、卡那霉素(KM)和EB 這5種藥物的耐性有關(guān)的基因突變的試劑盒。異煙胼(INH)是結(jié)核治療中最具代表性的藥物。INH耐性菌中的大多數(shù)在katG基 因或inhA基因中存在突變。人們就檢測這些突變的方法進行了各種研究(例如專利文獻2 和3)。但是，INH耐性菌中約80%根據(jù)katG基因或inhA基因的公知的突變而作為耐性菌 被檢出，而余下的約20%的INH耐性菌則無法檢測。因此，對于保有這樣的無法檢測的INH 耐性菌的結(jié)核患者也給予INH?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2001-103981號公報專利文獻2 日本專利第3579049號說明書專利文獻3 日本特表平9-501823號公報非專利文獻非專利文獻1 :Parish 等人，J. Bact.，2007 年，189 卷，10 號，第 3721-37 頁非專利文獻2 =Cohen-Gonsaud 等人，J. Mol. Biol.，2002 年，320 卷，2 號，第 249-261 頁非專利文獻3 =Marrakchi 等人，Microbiology, 2002 年，148 卷(Pt4)，第 951-960 頁非專利文獻4:A. S. Pym等人，Molecular Microbiology，2001 年，40卷，第 879-889 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供用于更準確地檢測結(jié)核桿菌的INH敏感性、即結(jié)核桿菌 是否是INH耐性菌的新方法。解決課題的方法本發(fā)明人等新發(fā)現(xiàn)了 fabGl基因也是異煙胼敏感性基因之一，fabGl基因具有突 變，由于該突變，結(jié)核桿菌可以成為INH耐性菌。本發(fā)明提供檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的方法，該方法包括以下步驟獲得檢體中的結(jié)核桿菌的fabGl基因的步驟；以及對該獲得的fabGl基因檢測與異煙胼耐性有關(guān)的突變的步驟。在一實施方案中，上述突變是指序列表的SEQ ID NO=I記載的核苷酸序列(塩基 配列)的609位的堿基(塩基)G突變成A或T的突變、或其互補序列的突變。本發(fā)明還提供用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的試驗片，該試驗片上固定有 至少一個探針，該至少1個探針由能夠與具有結(jié)核桿菌的fabGl基因突變的核苷酸序列的區(qū)雜交 的寡核苷酸構(gòu)成，或者由在具有該結(jié)核桿菌的fabGl基因突變的核苷酸序列的區(qū)中，雖然 不能與具有該突變的核苷酸序列的區(qū)雜交、但能夠與該區(qū)所對應(yīng)的野生型核苷酸序列構(gòu)成 的區(qū)雜交的寡核苷酸構(gòu)成。在一實施方案中，上述fabGl基因的突變是指序列表的SEQ IDNO :1記載的核苷酸 序列的609位的堿基G突變成A或T的突變、或其互補序列的突變。在另一實施方案中，能夠與上述野生型核苷酸序列的區(qū)雜交的寡核苷酸由序列表 的SEQ ID NO :3記載的核苷酸序列或其互補序列構(gòu)成。在一實施方案中，上述試驗片上進一步固定有探針，該探針由能夠與具有結(jié)核桿 菌的furA基因突變的核苷酸序列的區(qū)雜交的寡核苷酸構(gòu)成，或者由在具有該結(jié)核桿菌的 furA基因突變的核苷酸序列的區(qū)中，雖然不能與具有該突變的核苷酸序列的區(qū)雜交、但能 夠與該furA基因的區(qū)所對應(yīng)的野生型核苷酸序列構(gòu)成的區(qū)雜交的寡核苷酸構(gòu)成。在一實施方案中，上述furA基因的突變是指序列表的SEQ ID NO :8記載的核苷酸 序列的41位的堿基C突變成T的突變、或其互補序列的突變。在又一實施方案中，能夠與上述furA基因的野生型核苷酸序列的區(qū)雜交的寡核 苷酸由序列表的SEQ ID NO :10記載的核苷酸序列或其互補序列構(gòu)成。本發(fā)明還提供結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的檢測用試劑盒，該試劑盒包含上述任 一項的試驗片。本發(fā)明還提供檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的方法，該方法包括以下步驟獲得檢體中的結(jié)核桿菌的fabGl基因的步驟；使該獲得的fabGl基因與上述任一項的試驗片接觸，以使該fabGl基因與固定在 該試驗片上的探針結(jié)合的步驟；以及使與該探針結(jié)合的fabGl基因顯色的步驟。在一實施方案中，上述方法進一步包括以下步驟獲得上述檢體中的結(jié)核桿菌的furA基因的步驟；
使該獲得的furA基因與上述任一項的試驗片接觸，以使該furA基因與固定在該 試驗片上的探針結(jié)合的步驟；以及使與該探針結(jié)合的furA基因顯色的步驟。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，對于迄今為止尚未鑒定為INH耐性菌的一部分INH耐性菌，也可以正 確地鑒定為INH耐性菌。因此，通過與現(xiàn)有的檢測katG基因或inhA基因中的突變的方法 組合，對于INH耐性菌中的約90%可以鑒定為INH耐性菌。這樣，可以更準確地檢測INH敏 感性。其結(jié)果，可以對保有異煙胼耐性結(jié)核桿菌的結(jié)核患者提供適當?shù)闹委煛?br> 具體實施例方式(fabGl基因和furA基因的突變)本發(fā)明中，結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的異煙胼(INH)敏感性基因 是指與結(jié)核治療用藥物異煙胼(INH)的作用有關(guān)的基因。在INH耐性菌中，該野生型INH 敏感性基因中發(fā)生突變，獲得對INH的作用的耐藥性。具體而言，在由具有突變的INH敏感 性基因表達的酶中，由于構(gòu)成的氨基酸序列中發(fā)生取代、插入和/或缺失，所以酶活性降低 或藥物結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此INH的效果被抑制。如上所述，結(jié)核桿菌的INH耐性通過katG基因、inhA基因等的與INH的作用相關(guān) 的各種基因的突變而得以產(chǎn)生。這樣的突變例如公開在專利文獻1 3中。這些突變中， 只要存在任一種突變，就能夠成為INH耐性結(jié)核桿菌。在本發(fā)明中新發(fā)現(xiàn)了 除上述基因外，fabGl基因也存在突變，由于該突變，結(jié)核 桿菌能夠成為INH耐性菌。fabGl基因是fabGl-inhA操縱子的起始基因(先頭遺伝子)、 是編碼分枝菌酸合成酶的基因(非專利文獻1 3)。具體而言，fabGl基因的突變是指序列表的SEQ ID NO :1記載的核苷酸序列的609 位的堿基G突變成A或T的突變、以及其互補序列中的堿基C突變成T或A的突變。在本 發(fā)明中，匯總該突變，描述為“由核苷酸序列的609位的堿基G突變成A或T的突變、或其互 補序列的突變”。該突變是由fabGl基因編碼的FabGl (序列表的SEQID NO 2)的203位的 亮氨酸(Leu)的沉默突變。在本發(fā)明中，還新發(fā)現(xiàn)了 由于furA基因的突變，結(jié)核桿菌也能夠成為INH耐性 菌。編碼過氧化氫酶-過氧化物酶的上述katG基因構(gòu)成以furA為起始基因的furA_katG 操縱子，而furA基因是該操縱子的負轉(zhuǎn)錄基因(負O転寫遺伝子)(非專利文獻4)。furA 基因由于調(diào)節(jié)katG表達，所以與INH耐性有關(guān)。在非專利文獻1中，只記載了 furA基因的 功能通過缺失全體furA基因而得到確認，關(guān)于furA基因的突變則沒有任何記載。具體而言，furA基因的突變是指序列表的SEQ ID NO 8記載的核苷酸序列的41 位的堿基C突變成T的突變、以及其互補序列中的堿基G突變成A的突變。在本發(fā)明中，匯 總該突變，描述為“由核苷酸序列的41位的堿基C突變成T的突變、或其互補序列的突變”。 由于該突變，由furA基因編碼的FurA (序列表的SEQ ID NO 9)的14位的丙氨酸(Ala)突 變成纈氨酸(Val)。作為檢測fabGl基因和furA基因上的上述突變的方法，可以采用=Nollau等人， Clin. Chem.，43，1114-1120(1997)、“突然變異検出乃亡的O研究室口卜^ ^ (用于檢測突然變異的研究室操作規(guī)程)” (Landegren, U.等人，Oxford University Press (1996))； 以及"PCR” 第 2 版(Newton 等人，BIOS Scientific Publishers Limited (1997))等 中記載的通常使用的方法。具體而言，例如可以從PCR片段測序法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性法 (SSCP 法0rita，Μ.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，86 (8)，2766-2770 (1989))、異源 雙鏈變性濃度梯度凝膠電泳法(DGGE法Sheffield，V. C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，86(1) ,232-236(1989))、侵入法(Invader method) (Griffin, Τ. J.等人，Trend Biotech, 18,77(2000)) > SniPerTM ^ (Amersham pharmacia biotech) > TaqMan PCR ^ (Livak, K. J.，Genel. Anal.，14，143 (1999) ；Morris, Τ.等人，J. Clin. Microbiol.，34， 2933 (1996)), MALDI-T0F/MS 法(Griffin, Τ. J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，96 (11)， 6301-6(1999))、限制酶長多態(tài)性分析法(RFLP =Murray, J. C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，80 (19) ,5951-5955(1983))、DNA 芯片雜交法(Kokoris, K.等人，J. Med. Genet.，36， 730(1999))、MasscodeTM法^liagen Genomics)等中例示的公知的方法中選擇，但并不限于 這些方法。只要是檢測基因突變的方法，可以采用任何方法。例如，還可以采用PCR-序列特 異性寡核苷酸探針(SS0P :sequence-specific oligonucleotide probes)法。PCR-SSOP法 是指，制作包含突變位點的約10 約30堿基、且與一方的對立基因序列完全互補的探針， 通過PCR法擴增包含突變位點的DNA，之后進行雜交，根據(jù)是否形成雜化物來判別基因多態(tài) 性的方法。(探針)作為本發(fā)明的用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的探針，可以列舉能夠與具 有結(jié)核桿菌的fabGl基因突變的區(qū)結(jié)合(雜交)的寡核苷酸探針(以下，有時稱作“fabGl 突變探針”)；以及在具有該fabGl基因突變的區(qū)中，雖然不能與具有突變的核苷酸序列的 區(qū)雜交、但能夠與由該區(qū)所對應(yīng)的野生型核苷酸序列構(gòu)成的區(qū)雜交的寡核苷酸探針(以 下，有時稱作“fabGl野生型探針”)。作為探針，還可以列舉能夠與具有結(jié)核桿菌的furA基因突變的區(qū)結(jié)合(雜交) 的寡核苷酸探針(以下，有時稱作“furA突變探針”)；以及在具有該furA基因突變的區(qū)中， 雖然不能與具有突變的核苷酸序列的區(qū)雜交、但能夠與由該區(qū)所對應(yīng)的野生型核苷酸序列 構(gòu)成的區(qū)雜交的寡核苷酸探針(以下，有時稱作“furA野生型探針”)。各探針的長度還取決于結(jié)合(雜交)時的溫度，但通常為10 30核苷酸長，優(yōu)選 為12 沈核苷酸長。本發(fā)明中，突變探針能夠與具有furA基因或fabGl基因的上述各突變的區(qū)結(jié)合 (雜交)。具有這樣的突變的區(qū)，突變以外的堿基序列為野生型。當該區(qū)為野生型時，突變 探針無法與該區(qū)結(jié)合。為了準確地檢測突變，優(yōu)選設(shè)計成在構(gòu)成突變探針的寡核苷酸的中 間部位存在突變的位置。本發(fā)明中，野生型探針在野生型的furA基因或fabGl基因中能夠與具有上述突變 的區(qū)所對應(yīng)的任意區(qū)結(jié)合(雜交)。上述各探針可以通過使用標準程序和引物分析軟件、例如I^rimerExpress (Perkin Elmer社)而得到，可以采用自動化寡核苷酸合成儀等標準方法進行合成。并且，為了將各探針固定在試驗片上，例如可以對各探針的5’末端或3’末端的任 一方進行修飾。
各探針只要能夠檢測即可，可以以任何形式提供，可以是溶液形式、或者可以被固 定在載體上。為了易于檢測，優(yōu)選固定在試驗片上。(試驗片)在本發(fā)明的用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的試驗片上固定有至少一個探 針。所固定的至少一個探針為上述fabGl突變探針或fabGl野生型探針。fabGl突變探針 和fabGl野生型探針更優(yōu)選被固定在試驗片的各不相同的位置上。當fabGl基因具有突變 時，fabGl基因與fabGl突變探針結(jié)合，而不與furA野生型探針結(jié)合。而當fabGl基因不 具有突變時，fabGl基因與fabGl野生型探針結(jié)合。因此，當結(jié)核桿菌為INH敏感性時，只與 fabGl野生型探針結(jié)合；當結(jié)核桿菌為INH耐性時，不與fabGl野生型探針結(jié)合，而與fabGl 突變型探針結(jié)合。本發(fā)明的試驗片上可以進一步固定用于確認顯色的對照或標志物。在本發(fā)明的用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的試驗片上可以進一步固定上 述furA突變探針或furA野生型探針。furA突變探針和furA野生型探針優(yōu)選被固定在試 驗片的各不相同的位置上。當furA基因具有突變時，furA基因與furA突變探針結(jié)合，而 不與furA野生型探針結(jié)合。而當furA基因不具有突變時，furA基因與furA野生型探針 結(jié)合。因此，當結(jié)核桿菌為INH敏感性時，只與furA野生型探針結(jié)合；當結(jié)核桿菌為INH耐 性時，不與furA野生型探針結(jié)合，而與furA突變探針結(jié)合。在本發(fā)明的試驗片上，可以進一步固定能夠檢測除fabGl基因和furA基因以外 的、INH敏感性或INH耐性的公知的探針。本發(fā)明的試驗片，可以通過將上述探針按照物理或化學(xué)方法固定在載體表面上來 制作。作為載體，可以列舉乙烯基系聚合物、尼龍、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯 二甲酸乙二酯、硝基纖維素等有機材料；玻璃、二氧化硅等無機材料；金、銀等金屬材料等， 沒有特別限定。從成形加工性容易的角度考慮，優(yōu)選有機材料，更優(yōu)選聚對苯二甲酸乙二酯 等聚酯類。為了在顯色法的檢驗中容易直觀確認載體的顯色，這些載體優(yōu)選為白色。上述探針優(yōu)選每一種以一定間隔配置在上述載體上。作為在這些載體表面按物 理方法固定探針的方法，可以采用公知的各種方法。例如有用聚賴氨酸等聚陽離子性高 分子包被載體表面的方法。根據(jù)該方法，利用載體表面與作為聚陰離子的探針的靜電相互 作用，可以提高固定化的效率。還有以下方法在探針末端添加無關(guān)的核苷酸序列(poly T(polythymine chain)鏈等)，增加所固定的探針自身的分子量，從而提高固定化效率的方 法。例如，將包含添加有poly T的寡核苷酸探針的溶液由分液器吐出到硝基纖維素膜上， 然后照射紫外線，從而可以比較容易地將各種探針固定。具體而言，將各探針分別放入具備 對-6針04飛3呢6 needle)的分液器中，邊以0. 5 1. 0 μ L/分鐘的量吐出，邊以2. 5 8. 5mm/秒的涂布速度、分別以一定間隔涂布在硝基纖維素膜上，則各探針以按照一定間隔 排列的約1 2mm寬的條紋形式被涂布。通過對涂布有該探針的條紋的載體照射紫外線， 探針被固定在載體上。并且，根據(jù)需要，按照橫斷這些條紋的方式進行細切，則可一次得到 各探針按順序配置的多個試驗片。當載體表面為金等金屬材料時，還已知通過用2-氨基乙硫醇等具有氨基的硫醇 或二硫醚化合物等處理載體表面，經(jīng)由載體表面與作為聚陰離子的探針的靜電相互作用， 固定化的效率提高。
作為向探針中導(dǎo)入官能團以進行化學(xué)固定的方法，可以采用公知的各種方法。例 如，當載體的材料為玻璃、二氧化硅等無機材料時，有使用三甲氧基甲硅烷基、三乙氧基甲 硅烷基等可進行硅烷耦聯(lián)反應(yīng)的官能團修飾探針末端的方法，將載體在含有如此修飾的探 針的溶液中浸漬對 48小時，取出后進行清洗，從而得到試驗片?；蛘?，還有以下方法通 過用氨基乙氧基硅烷等具有氨基的硅烷耦聯(lián)劑處理玻璃、二氧化硅等無機材料載體，將載 體表面氨基化，然后使之與末端導(dǎo)入有羧酸的探針進行氨基耦聯(lián)反應(yīng)，從而將探針固定化。 并且，當載體的材料為金、銀等金屬材料時，用巰基、二硫基等可與金屬結(jié)合的官能團修飾 探針末端，將載體在含有該修飾探針的溶液中浸漬M 48小時，取出后進行清洗，從而可 以將探針固定化。還已知并非固定所合成的探針而是利用平版印刷技術(shù)在載體表面上直接合成具 有所期望的序列的探針的方法。(使用試驗片的INH敏感性檢測方法)1.檢體在本發(fā)明中，“檢體”只要是通常檢查結(jié)核桿菌所必需的檢體即可。例如有痰、咽拭 子(咽頭& C 0液)、胃液、支氣管肺泡清洗液、氣管內(nèi)吸引物、喉拭子和/或組織活檢物等 體液、以及由培養(yǎng)這些檢體得到的培養(yǎng)物。2.檢體的前處理(DNA的提取)從上述檢體中提取DNA可以按照公知的方法進行。例如有酚提取法、硫氰酸胍提 取法、氧釩核糖核苷復(fù)合提取法等。3.核酸的擴增由得到的DNA獲得目標基因。通過PCR法擴增目標基因時，例如按照以下步驟進 行(1)變性步驟，在約92 95°C、約30秒 1分鐘的反應(yīng)條件下對雙鏈基因組DNA進行 熱處理使之轉(zhuǎn)變成單鏈DNA ； (2)退火步驟，通過在約50 65°C、約20秒 1分鐘的反應(yīng) 條件下使至少兩種擴增引物與各該單鏈DNA分別結(jié)合，制作成為PCR的反應(yīng)起點的雙鏈部 分；(3)鏈延伸步驟，在約70 75°C、約20秒 5分鐘的反應(yīng)條件下使用DNA聚合酶進行 反應(yīng)；以及利用常規(guī)方法重復(fù)進行步驟(1) (3)20 40次的步驟。作為用于通過PCR擴增fabGl基因的引物對，可以列舉包含含有突變位點的 序列位點上游的序列和該位點下游的序列使能夠擴增包含該突變位點的fabGl基因、具 有相同或互補的核苷酸序列的寡核苷酸。優(yōu)選的引物對的例子有序列表的SEQ ID NO 6 (ggctacatcgacaccgatat gacc)和 SEQ ID NO 7 (gcgtccttgt gttgtgtcag tgg)的寡核 苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸。另一方面，作為用于通過PCR擴增furA基因的引物 對，可以列舉包含含有突變位點的序列位點上游的序列和該位點下游的序列使能夠擴增 包含該突變位點的furA基因、具有相同或互補的核苷酸序列的寡核苷酸。優(yōu)選的引物對的 例子有序列表的 SEQ ID NO :13(gccatcccac gatccagcgg)禾口 SEQ ID NO 14 (gtcgggcagc gcaaaacgca c)的寡核苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸。為了提高測定的靈敏度，例如由檢體直接擴增DNA時，可以在上述PCR反應(yīng)之前進 一步通過Nested PCR法(日本特公平6-81600號公報)等擴增核酸。Nested PCR法中的 引物可以選擇上述PCR反應(yīng)中使用的引物外側(cè)的序列。例如，當為fabGl基因時，引物的例 子有序列表的 SEQ ID NO :4(gtcgaaggca aacgtgaccg eg)禾口 SEQ ID NO 5 (gtccagcagtcctgtcatgt g)的寡核苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸。當為furA基因時，引物的例子 有序列表的 SEQ ID NO 11 (ggctcatcggaacatacgaa ggctg)禾口 SEQ ID NO 12 (gtcgtacacg gcttgccgg)的寡核苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸。上述探針和引物的序列可以通過使用標準程序和引物分析軟件、例如I^rimer Express (Perkin Elmer社制)而得到，可以采用自動化寡核苷酸合成儀等標準方法進行合 成。4.結(jié)核桿菌的INH敏感性檢測方法本發(fā)明中，結(jié)核桿菌的INH敏感性可以按照PCR-SSOP法進行檢測。還可以更簡便 地通過比較所固定的探針的位置和在PCR-SSOP法中檢測到的點(spot)的位置來進行檢 測。例如，當使用固定有上述探針的試驗片時，從不易發(fā)生非特異性結(jié)合反應(yīng)的角度考慮， PCR-SSOP法中的雜交優(yōu)選在約60 65°C的溫度下進行。當檢測到的點的位置為fabGl 野生型探針的位置時，可以判斷結(jié)核桿菌沒有發(fā)生突變、即為INH敏感性；而當檢測到的點 的位置為fabGl突變探針的位置時，可以判斷結(jié)核桿菌為INH耐性。當檢測到的點的位置 為furA野生型探針的位置時，可以判斷結(jié)核桿菌為INH敏感性；而當檢測到的點的位置為 furA突變探針的位置時，可以判斷結(jié)核桿菌為INH耐性。為了易于檢測在PCR-SSOP法中檢測到的點，優(yōu)選使用修飾放射性同位素、熒光物 質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標記物質(zhì)而得到的引物對來擴增基因。在使用上述標記物質(zhì)的檢測方 法中，從比較廉價且容易實施的角度考慮，優(yōu)選氮藍四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸 酶對甲苯胺鹽(BCIP)顯色法。具體可以如下進行。首先，使用對上述引物的3’末端或5’ 末端進行了生物素修飾的引物對擴增末端具有生物素的基因。然后，通過已擴增的基因與 固定在試驗片上的探針的雜交使該基因與探針結(jié)合，再使該基因與堿性磷酸酶標記鏈霉親 和素接觸，使其與存在于與探針結(jié)合的基因的末端的生物素結(jié)合。再加入NBT/BCIP，使之與 堿性磷酸酶反應(yīng)，從而在與探針結(jié)合的堿性磷酸酶所存在的位置顯色。該顯色可以直觀確 認。(含有試驗片的檢測用試劑盒)本發(fā)明的檢測用試劑盒包含上述試驗片。優(yōu)選可以包含適于檢測結(jié)核桿菌的異煙 胼敏感性的任意的試劑類?？梢粤信e例如用于提取上述DNA的試劑、基因擴增用試劑、用 于檢測基因與探針結(jié)合的試劑等。作為具體的試劑盒，例示用于實施上述PCR-SSOP法的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒中所能包含的、用于DNA提取的試劑為上述任意方法中使用的試 劑。本發(fā)明的試劑盒中還可以包含用于通過PCR擴增fabGl基因的引物對。引物對為 包含含有突變位點的序列位點上游的序列和該位點下游的序列使能夠擴增包含任意突變 位點的fabGl基因、具有相同或互補的核苷酸序列的寡核苷酸。為了檢測INH敏感性，fabGl 基因擴增用的優(yōu)選的引物對的例子有上述序列表的SEQ ID NO :6和SEQ IDNO :7的寡核苷 酸或具有其互補序列的寡核苷酸。而對于furA基因，可以列舉上述序列表的SEQ ID NO 13和SEQ ID NO :14的寡核苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸。作為用于提高測定靈敏度 的NestedPCR法中的引物對，例如，對于fabGl基因，可以列舉上述序列表的SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5的寡核苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸；而對于furA基因，可以列舉上述序列表的SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12的寡核苷酸或具有其互補序列的寡核苷酸。并且，為了在PCR-SSOP法中容易進行檢測，優(yōu)選使用放射性同位素、熒光物質(zhì)、化 學(xué)發(fā)光物質(zhì)等修飾上述引物對?；虻臄U增除了采用PCR法以外，還可采用LAMP法、ICAN法等公知的技術(shù)。在本 發(fā)明中，可以采用上述任一種方法，本發(fā)明還包含在這些方法中使用的含有任意試劑的試劑盒。并且，本發(fā)明的試劑盒可以含有用于檢測的試劑類。例如，當采用NBT/BCIP顯色 法時，所用試劑例如有鏈霉親和素修飾堿性磷酸酶、NBT和BCIP。
實施例(實施例1:INH耐性結(jié)核桿菌的結(jié)核桿菌基因分析)在本實施例中獲取92個檢體，這92個檢體通過確認它們在含有INH的溶液(MGIT 960 日本Becton Dickinson株式會社制)或含有INH的瓊脂培養(yǎng)基(小川培養(yǎng)基、7H10) 中生長而判定為INH耐性結(jié)核桿菌，利用酚提取法從這92個檢體中提取基因組DNA并進行純化。LfabGl基因的分析使用以下所示的引物對擴增fabGl基因。PCR反應(yīng)條件如下變性過程94°C 30秒、 退火過程55°C 20秒、鏈延伸過程72°C 20秒，循環(huán)進行該步驟30次，擴增fabGl基因。fabG 1 弓丨物 1 ggctacatcg acaccgatat gacc (SEQ ID NO 6)fabG 1 弓丨物 2 gcgtccttgt gttgtgtcag tgg(SEQ ID NO 7)利用測序儀研究所擴增的92例檢體的fabGl基因的核苷酸序列。其結(jié)果，在92 例中的15例中發(fā)現(xiàn)了新的突變LeU203LeU[ctG — ctA/T]。該突變是沉默突變，盡管其中 的堿基被取代，但所編碼的氨基酸未變。2.furA基因的分析使用以下所示的引物對擴增furA基因。PCR反應(yīng)條件為變性過程94°C 30秒、退 火過程55°C 20秒、鏈延伸過程72°C 20秒，循環(huán)進行該步驟30次，擴增furA基因。furA 弓丨物 1 gccatcccac gatccagcgg(SEQ ID NO 13)furA 弓L 2 gtcgggcagc gcaaaacgca c (SEQ ID NO 14)利用測序儀研究所擴增的92例檢體的fur基因的核苷酸序列。其結(jié)果，在92例 中的14例中發(fā)現(xiàn)了新的突變Alal4Val[gCc — gTc]。3.已知突變的檢測對于上述92個檢體，分別擴增具有已知突變的katG基因和inhA基因，檢測是否 存在已知的突變。關(guān)于katG，使用以furA起始密碼子為基點、與其上游1 堿基結(jié)合的引物 (gctcatcgga acatacgaag =SEQ ID NO 15)和以katG終止密碼子為基點、與其下游50堿基 結(jié)合的引物(gtgctgcggc gggttgtggttgatcggcgg =SEQ ID NO :16)，對 furA-katG操縱子進 行PCR，利用DNA測序法鑒定總核苷酸序列。以現(xiàn)有論文中未報道的突變作為新的突變。關(guān)于inhA，使用以fabGl起始密碼子為基點、與其上游200堿基結(jié)合的引物 (ttcgtagggc gtcaatacac =SEQ ID NO 17)和以inhA終止密碼子為基點、與其下游40堿基結(jié)合的引物(ccgaacgaca gcagcaggac =SEQID NO :18)，對fabGl-inhA操縱子進行PCR，利用 DNA測序法鑒定總核苷酸序列。以現(xiàn)有論文中未報道的突變作為新的突變。上述1 3的分析結(jié)果匯總在下面的表1中。[表1]
權(quán)利要求
1.檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的方法，該方法包括以下步驟獲得檢體中的結(jié)核桿菌的fabGl基因的步驟；以及對該獲得的fabGl基因檢測與異煙胼耐性有關(guān)的突變的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述突變是指序列表的SEQIDNO :1記載的核苷酸序 列的609位的堿基G突變成A或T的突變、或其互補序列的突變。
3.試驗片，該試驗片用于檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性，該試驗片上固定有至少1個探針，該至少1個探針由能夠與具有結(jié)核桿菌的fabGl基因突變的核苷酸序列的區(qū)雜交的寡 核苷酸構(gòu)成，或者由在具有該結(jié)核桿菌的fabGl基因突變的核苷酸序列的區(qū)中，雖然不能 與具有該突變的核苷酸序列的區(qū)雜交、但能夠與該區(qū)所對應(yīng)的野生型核苷酸序列構(gòu)成的區(qū) 雜交的寡核苷酸構(gòu)成。
4.權(quán)利要求3所述的試驗片，其中，上述fabGl基因的突變是指序列表的SEQID NO 1記載的核苷酸序列的609位的堿基G突變成A或T的突變、或其互補序列的突變。
5.權(quán)利要求4所述的試驗片，其中，能夠與上述野生型核苷酸序列的區(qū)雜交的寡核苷 酸由序列表的SEQ ID NO :3記載的核苷酸序列或其互補序列構(gòu)成。
6.權(quán)利要求3 5中任一項所述的試驗片，其中該試驗片上進一步固定有探針，所述探 針由能夠與具有結(jié)核桿菌的furA基因突變的核苷酸序列的區(qū)雜交的寡核苷酸構(gòu)成，或者 由在具有該結(jié)核桿菌的furA基因突變的核苷酸序列的區(qū)中，雖然不能與具有該突變的核 苷酸序列的區(qū)雜交、但能夠與由該furA基因的區(qū)所對應(yīng)的野生型核苷酸序列構(gòu)成的區(qū)雜 交的寡核苷酸構(gòu)成。
7.權(quán)利要求6所述的試驗片，其中，上述furA基因的突變是指序列表的SEQID NO 8 記載的核苷酸序列的41位的堿基C突變成T的突變、或其互補序列的突變。
8.權(quán)利要求7所述的試驗片，其中，能夠與上述furA基因的野生型核苷酸序列的區(qū)雜 交的寡核苷酸由序列表的SEQ ID NO :10記載的核苷酸序列或其互補序列構(gòu)成。
9.結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的檢測用試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求3 8中任一 項所述的試驗片。
10.檢測結(jié)核桿菌中的異煙胼敏感性的方法，該方法包括以下步驟獲得檢體中的結(jié)核桿菌的fabGl基因的步驟；使該獲得的fabGl基因與權(quán)利要求3 8中任一項所述的試驗片接觸，以使該fabGl 基因與固定在該試驗片上的探針結(jié)合的步驟；以及使與該探針結(jié)合的fabGl基因顯色的步驟。
11.權(quán)利要求10所述的方法，該方法進一步包括以下步驟獲得上述檢體中的結(jié)核桿菌的furA基因的步驟；使該獲得的furA基因與權(quán)利要求6 8中任一項所述的試驗片接觸，以使該furA基 因與固定在該試驗片上的探針結(jié)合的步驟；以及使與該探針結(jié)合的furA基因顯色的步驟。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，提供用于更準確地檢測結(jié)核桿菌的INH敏感性、即結(jié)核桿菌是否是INH耐性菌的新方法。本發(fā)明的檢測結(jié)核桿菌中的異煙肼敏感性的方法包括以下步驟獲得檢體中的結(jié)核桿菌的fabG1基因的步驟、以及對該獲得的fabG1基因檢測與異煙肼耐性有關(guān)的突變的步驟。根據(jù)需要，本發(fā)明的方法還可以包括檢測結(jié)核桿菌的furA基因突變的步驟，優(yōu)選可以與其他公知的異煙肼敏感性檢測方法組合。
文檔編號C12Q1/68GK102084006SQ20098012591
公開日2011年6月1日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者中村友彥, 切替照雄, 安藤弘樹, 末竹壽紀 申請人:尼普洛株式會社, 獨立行政法人國立國際醫(yī)療研究中心