專利名稱：小型振蕩瓶培養(yǎng)的制作方法
小型振蕩瓶培養(yǎng)本文報道了小型振蕩瓶培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法，其中振蕩瓶內部培養(yǎng)基的條件通過振蕩瓶的旋轉速度和振蕩瓶的外部氣壓來控制。
背景技術：
在開發(fā)例用哺乳動物細胞來生產(chǎn)重組多肽的生物技術生產(chǎn)工藝的過程中，有多個參數(shù)需要進行調節(jié)和優(yōu)化。由于需要大量的單獨實驗，這種優(yōu)化以小規(guī)模進行，優(yōu)選在振蕩瓶中進行。但由于大型攪拌培養(yǎng)器和小型振蕩瓶在幾何尺寸和反應條件上的差異，得到的小規(guī)模的結果不代表大型工藝的真實結果。這些差異是由化學、生化和加工工程的原因引起的。因此，總體目標是找出小型和大型工藝的條件例如細胞密度、產(chǎn)品濃度或盡可能好的產(chǎn)品質量之間的聯(lián)系。為了使大型工藝和小型工藝盡可能具有可比性，必須評估各種差異對獲得的結果的影響。例如，如果大型工藝是攪拌工藝，那么小型工藝最好也采用攪拌工藝。DE441M44報道了振蕩瓶中攝氧速率在線測定的自動測定系統(tǒng)。Kensy F.等人 (Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 698-708)報道了 48 孔微量滴定板的氧傳遞現(xiàn)象。Nowack G.等人(Am. Physio. Soc. (1996)C2072-C2080)報道了 L-抗壞血酸調節(jié)腎細胞的生長與新陳代謝。Randers-Eichhorn L.等人(Biotechnol. Bioeng. 51 (1996)466-477)報道了在組織培養(yǎng)瓶中的非侵入性氧測量和傳質考慮因素。Micheletti M.等人(Chem.Eng. Sci. 61(2006)2939-2949)報道了振蕩生物反應器中的流體混合對于微量型微生物和哺乳動物細胞培養(yǎng)規(guī)模擴大化預測的意義。因此，需要在小型振蕩瓶基礎上設計大型攪拌哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝，反之亦然。 另一個目標是提供小型振蕩瓶工藝，在其中實現(xiàn)培養(yǎng)基攪動和混合的小型機械攪拌。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個方面是培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法，包括-根據(jù)如下因素調節(jié)培養(yǎng)容器的機械運動速度i)培養(yǎng)基中的活細胞密度，和/或ii)培養(yǎng)基中的氧分壓。在一個實施方式中，該方法包括一個或多個以下步驟a)培養(yǎng)一套培養(yǎng)容器-每一個容器的總容積最高為200μ 1，或-每一個容器的工作容積最高為100μ 1，或-每一個容器的總容積在25ml至3000ml之間，或-每一個容器的工作容積在IOml至1500ml之間，和/或b)通過整個培養(yǎng)容器的機械運動來攪動培養(yǎng)基，c)通過培養(yǎng)容器的外氣相的二氧化碳濃度來調節(jié)培養(yǎng)基的pH值。在一個實施方式中，培養(yǎng)容器包含培養(yǎng)基和培養(yǎng)基上方的內部氣相。在另一個實施方式中，培養(yǎng)容器包含將內部氣相和外部氣相分離的膜或帽或蓋。在本發(fā)明方法的一個實施方式中，機械運動通過整個培養(yǎng)容器的旋轉運動或整個培養(yǎng)容器的俯仰運動或整個培養(yǎng)容器的振蕩來實現(xiàn)。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的方法還包括d)通過非侵入性光化學傳感器確定培養(yǎng)容器內的pH值和p02。在另一個實施方式中，機械運動速度的調節(jié)如下i)根據(jù)起始細胞密度將機械運動速度設置為60rpm至IOOrpm，其中當細胞密度為IxlO5細胞/ml或更小時設置為60rpm，當細胞密度為2. 5x10s細胞/ml時設置為80rpm，當細胞密度為5x10s細胞/ml時設置為lOOrpm，或在中間細胞密度時設置為線性中間值，ii)活細胞密度每增加一倍，機械運動速度增加20rpm，直至細胞濃度達到20xl05 細胞/ml，iii)活細胞密度每增加20xl05細胞/ml，機械運動速度增加20rpm，直至細胞密度達到80xl05細胞/ml，iv)活細胞密度由80xl05細胞/ml增加至細胞密度ΙΟΟχΙΟ5細胞/ml時，機械運動速度增加lOrpm。在一個實施方式中，機械運動的速度進一步調節(jié)如下ν)維持機械運動速度在200rpm至210rpm之間，逐步降低機械運動速度至 135rpm,并保持該速度不變直到培養(yǎng)完成。在一個實施方式中，步驟ν)中機械運動的速度維持在200rpm至2IOrpm達18小時至30小時。在另一個實施方式中，步驟ν)中機械運動速度維持在200rpm至210rpm達約24小時。根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方式包括根據(jù)培養(yǎng)基中的氧分壓來調節(jié)機械運動速度，以維持培養(yǎng)基中的氧分壓處于或高于下限水平。在一個實施方式中，增加機械運動速度以增加培養(yǎng)基中的氧分壓或降低機械運動速度以降低培養(yǎng)基中的氧分壓。在一個實施方式中，為改變氧分壓而對機械運動速度進行的改變是線性變化，或是多項式變化或是指數(shù)變化。在一個實施方式中，氧分壓的下限水平是25%空氣飽和度。本發(fā)明的第二個方面是重組生產(chǎn)異源多肽的方法，包括以下步驟a)提供含有編碼異源多肽的核酸的哺乳動物細胞，b)用本發(fā)明的方法培養(yǎng)所述哺乳動物細胞，c)從培養(yǎng)基中回收異源多肽。在一個實施方式中，異源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白接合物。在進一步的實施方式中，哺乳動物細胞是CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NSO細胞、 SP2/0細胞或雜交瘤細胞。本發(fā)明的第三方面是非侵入性光化學傳感器在本發(fā)明的方法中用于測定小型培養(yǎng)容器中的PH值和PA的應用。本發(fā)明的第四方面是本發(fā)明的方法用于確定在容積為1000L至25000L的攪拌培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)的培養(yǎng)參數(shù)范圍的應用。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及在振蕩瓶中培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法，其中，用機械運動進行培養(yǎng)基的攪動，并通過運動速度和振蕩瓶外部氣壓來控制pH、pO)2和p02。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的細胞密度、成活力、活細胞密度、細胞生長曲線、體積產(chǎn)量、產(chǎn)品濃度和產(chǎn)品質量與在帶有機械攪拌的總量為1000L至25000L的培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)相當。因此，在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基不通過直接與小型培養(yǎng)容器內的培養(yǎng)基接觸的機械部件如機械攪拌槳或電磁攪拌棒進行攪動或混合。本文所用的術語“機械運動”是指使小型培養(yǎng)容器內的培養(yǎng)基運動、 即使其攪動或混合的方式。在一個實施方式中，機械運動通過使整個培養(yǎng)容器運動來進行， 而不是使用直接與培養(yǎng)容器內的培養(yǎng)基接觸的機械部件。生物技術生產(chǎn)工藝的開始是以獲自冷凍細胞庫的細胞培養(yǎng)作為初始培養(yǎng)。通過轉移確定數(shù)量的細胞或確定體積的培養(yǎng)基至新的培養(yǎng)容器中將初始培養(yǎng)擴大，所述新的培養(yǎng)容器比之前使用的容器具有更大的培養(yǎng)體積并且在其中加入了新鮮的另外的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)可以在通過機械運動如振蕩、俯仰運動等攪動或混合培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中進行。在具有一定培養(yǎng)量的情況下，優(yōu)選采用機械攪拌來攪動和混合培養(yǎng)基，以最小化由于培養(yǎng)基的攪動和混合不充分而導致的培養(yǎng)容器內培養(yǎng)基組分的濃度差異。這種濃度差異可導致培養(yǎng)條件的不均勻，從而導致不同培養(yǎng)量下得到的培養(yǎng)結果缺乏可比性。因此，在不進行重大修改以及大量工作的情況下，小規(guī)模下獲得的結果和確定的參數(shù)不能輕易轉移到大規(guī)模培養(yǎng)中。為了能夠從小型向大型轉化，在過去已經(jīng)確定了一些重要的參數(shù)-培養(yǎng)容器的幾何可比性，如高徑比，或內部構件如液體流斷路器(折流板)，-由類似尺寸的攪拌裝置輸入的類似的體積比能量，-類似的質量疏運，-類似的重要工藝參數(shù)控制如培養(yǎng)基中的氧分壓、pH值、溫度等。根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物細胞小型培養(yǎng)尚未見報道。在該方法中，通過整個培養(yǎng)容器的機械運動來攪動和混合培養(yǎng)基。此外，氧氣和二氧化碳分壓以及與之相關的PH值的控制可隨之實現(xiàn)。當根據(jù)本發(fā)明的方法施行時，小型培養(yǎng)所產(chǎn)生的細胞密度和產(chǎn)品濃度與在機械攪拌的培養(yǎng)容器中的哺乳動物細胞的大型培養(yǎng)相似。本發(fā)明使用的術語“機械攪拌”或其語法等價術語是指機械部件如攪拌槳或攪拌棒直接接觸容器中的培養(yǎng)基。使用本文所報道的培養(yǎng)方法，可以通過小型培養(yǎng)來確定大型培養(yǎng)中關于培養(yǎng)基PH值、溫度、混合速度、氣相的二氧化碳飽和度以及氧分壓的時間進程的培養(yǎng)參數(shù)范圍。本申請中所使用的術語“范圍”是指很多小型培養(yǎng)過程中測得的參數(shù)最大值和最小值之間的范圍。因此，通過根據(jù)本發(fā)明方法在容積為25ml至3000ml的培養(yǎng)容器中的小型培養(yǎng)，本發(fā)明的方法可用于確定在容積為1000L至25000L的攪拌培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)的培養(yǎng)參數(shù)范圍。在一個實施方式中，該方法就地使用非侵入性光化學傳感器在線測定pH值和PA 值即氧分壓。在一個實施方式中，傳感器位于振蕩瓶的下部并且包括嵌入組織相容性聚合物中的熒光性分析物敏感染料，其可通過光纖讀出。通過根據(jù)細胞密度調節(jié)機械運動速度可以調節(jié)液體培養(yǎng)基中的氧分壓。機械運動速度可逐步或連續(xù)地調節(jié)。本申請所使用的術語“逐步”是指培養(yǎng)方法中的參數(shù)變化是立即的，即，直接從一個值變到下一個值。在“逐步”調節(jié)中，一個或多個參數(shù)在每次變化后保持改變的參數(shù)值直到方法中的下一個逐步調節(jié)或方法結束。本申請所使用的術語“連續(xù)”是指培養(yǎng)方法中的參數(shù)變化是連續(xù)的，即，參數(shù)值的變化是一系列小步驟，在一個實施方式中，每步的變化不大于參數(shù)值的2%，在另一個實施方式中，不大于參數(shù)值的1%。在進一步的實施方式中，調節(jié)是連續(xù)和線性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從切105細胞/ml的接種細胞密度、IOOrpm的機械運動速度開始是很有利的，活細胞密度每加倍一次機械運動速度就增加20rpm，直到細胞密度達到20xl05細胞/ ml ；之后，活細胞密度每增加20xl05細胞/ml，機械運動速度就增加20rpm，直到最終細胞密度達到SOxlO5細胞/ml ；之后，將機械運動速度增加lOrpm，以使活細胞密度由SOxlO5細胞 /ml增加至ΙΟΟχΙΟ5細胞/ml。當細胞密度達到IOOxIO5細胞/ml之后，活細胞密度增加， 但機械運動速度保持不變。在一個實施方式中，機械運動速度在最大值保持不變持續(xù)16至 72小時。在另一個實施方式中，機械運動速度在最大值保持不變持續(xù)18至30小時，在一個實施方式中，持續(xù)約M小時。機械運動速度保持不變后，將其逐步降低至135rpm并保持不變，直到培養(yǎng)完成。更詳細地，為5xl05細胞/ml時，機械運動速度設定到IOOrpm(rpm =每分鐘的轉數(shù))。達到IOxlO5細胞/ml時，機械運動速度增加到120rpm ；達到20xl05細胞/ml時，機械運動速度增加到140rpm ；達到40xl05細胞/ml時，機械運動速度增加到160rpm ；達到60xl05 細胞/ml時，機械運動速度增加到180rpm ；達到80xl05細胞/ml時，機械運動速度增加到 200rpm ；達到100x10s細胞/ml時，機械運動速度增加到210rpm。之后，機械運動速度保持在200rpm士20rpm持續(xù)大約對小時。以后，機械運動速度降低至135rpm。在一個實施方式中是逐步降低，在一個不同的實施方式中是連續(xù)降低。在另一個實施方式中，機械運動速度的降低是連續(xù)和漸進的。達到135rpm的最終機械運動速度之后，機械運動速度保持不變直到培養(yǎng)完成，然后收獲重組生產(chǎn)的多肽。改變機械運動速度允許增加或降低液相中的氧分壓，其一方面取決于培養(yǎng)基中的活細胞密度，另一方面取決于培養(yǎng)階段，即取決于培養(yǎng)是在指數(shù)增長階段、穩(wěn)定階段還是生產(chǎn)階段。本發(fā)明所使用的術語“線性”是指可表達為線性方程的兩個參數(shù)的相互關系，如y =a ^ x+b，其中y和χ表示兩個參數(shù)，a和b表示常數(shù)值。本發(fā)明所使用的術語“多項式” 是指可表達為多項式方程的兩個參數(shù)的相互關系，如y = a * x+b * x2+c * x3+d * x4+···， 其中y和x表示兩個參數(shù)，a、b、c和d等表示常數(shù)值。本發(fā)明所使用的術語“指數(shù)”是指可表達為指數(shù)方程的兩個參數(shù)的相互關系，如y = a * ex+b，其中y和χ表示兩個參數(shù)，a和 b表示常數(shù)值，e為歐拉指數(shù)，為2. 71828182845904523536o在一個實施方式中，通過調節(jié)培養(yǎng)容器外部的二氧化碳分壓來調節(jié)培養(yǎng)基的ρΗ 值。由于氣相壓力和液相分壓的關系，氣態(tài)二氧化碳可以強制進入液相(氣相中的壓力上升)或者它可以從液相中(氣相中的壓力降低)去除。由于二氧化碳在液體培養(yǎng)基中水化， 它是碳酸氫根的來源，因此，提供了液相中的碳酸鹽緩沖劑以調節(jié)液體培養(yǎng)基的PH值。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方式中，通過小型培養(yǎng)容器外的二氧化碳氣壓來調節(jié)液體培養(yǎng)基的ΡΗ，因此外部pC02的降低導致培養(yǎng)基的ρΗ上升，反之亦然。在一個實施方式中，培養(yǎng)是分批補料培養(yǎng)的方式。“蛋白質”是大分子，包括一個或多個多肽鏈或超過100個氨基酸殘基的多肽鏈。蛋白質還可包括如碳水化合物基團的非肽類組分。碳水化合物和其他非肽類取代基可通過產(chǎn)生蛋白質的細胞加成到蛋白質上，并隨細胞類型而變化。本文所定義的蛋白質是根據(jù)其氨基酸骨架結構來定義的；取代基如碳水化合物基團一般不明確指出，不過仍然可能存在。免疫球蛋白的重組生產(chǎn)在現(xiàn)有技術中是眾所周知的，并描述在例如Makrides， S. C. ， Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S. φ 人·，Protein Expr. Purif. 8(1996) 271—282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151 — 161 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜述文章中。術語“免疫球蛋白”是指由一個或多個大量被免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質。已經(jīng)確定的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以各種形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)或雙抗體(例如 Huston，J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. Ε.等人，Science 242(1988)423-426 ；通常，Hood 等人，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版(1984)；禾口 Hunkapiller, T.和 Hood, L.，Nature 323(1986) 15-16)。一般情況下，免疫球蛋白包括兩條所謂的輕鏈多肽(輕鏈)和兩條所謂的重鏈多肽(重鏈)。每個重鏈和輕鏈多肽都包含可變結構域(可變區(qū))(一般為多肽鏈的氨基末端部分)，其包括能與抗原相互作用的結合區(qū)。每個重鏈和輕鏈多肽都包含恒定區(qū)(一般為羧基末端部分)。重鏈的恒定區(qū)調節(jié)抗體與如下細胞的結合i)帶有Fc γ受體(FcyR)的細胞，如吞噬細胞，或ii)帶有新生Fc受體(Fcfoi)(也被稱為Brambell受體)的細胞。它還調節(jié)與某些因子、包括經(jīng)典補體系統(tǒng)的因子如免疫成分(Clq)的結合。免疫球蛋白的輕或重鏈可變區(qū)本身又包括不同的片段，即四個框架區(qū)(FR)和三個高變區(qū)(⑶R)。術語“免疫球蛋白接合物”是指包含至少一個通過肽鍵與另外的多肽結合的免疫球蛋白重鏈或輕鏈結構域的多肽。另外的多肽是非免疫球蛋白肽，如激素，或生長受體，或抗融合肽或補充因子等。術語“異源免疫球蛋白”是指不是由哺乳動物細胞自然生產(chǎn)的免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的免疫球蛋白是通過重組方式生產(chǎn)的。這種方法在現(xiàn)有技術中是眾所周知的，包括蛋白質在真核細胞中的表達以及隨后回收和分離異源免疫球蛋白，并且通常純化得到藥學上可接受的純度。為了生產(chǎn)，即表達免疫球蛋白，編碼輕鏈的核酸和編碼重鏈的核酸均通過標準的方法被插入到表達框中。編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核酸很容易用常規(guī)程序分離和測序。雜交瘤細胞或B-細胞可作為這種核酸的來源。表達框可被插入到表達質體中，然后將表達質粒轉染到在未轉染的情況下無法生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細胞中。在合適的原核或真核宿主細胞中進行表達，并且從溶胞后的細胞或從培養(yǎng)上清液中回收免疫球蛋白。術語“重組哺乳動物細胞”是指這樣的細胞，核酸、例如編碼異源多肽的核酸可被或者被引入或轉染進入該細胞。術語“細胞”包括用于表達核酸的細胞。在一個實施方式中，哺乳動物細胞是CHO細胞(如CHO K1、CH0DG44)、或BHK細胞、或NSO細胞、或SP2/0細胞、或HEK 293細胞、或HEK 293 EBNA細胞、或PER. C6 細胞、或COS細胞。特別優(yōu)選CHO 細胞、或BHK細胞、或PER. C6 細胞。本文所使用的術語“細胞”包括母細胞及其后代細胞。 因此，術語“重組細胞”包括初級轉染細胞和包含由其衍生的后代細胞(不考慮傳代次數(shù))的培養(yǎng)物?？梢岳斫獾氖?，由于故意或無意的突變，所有的后代細胞的DNA內容可能不完全相同。與初始轉化細胞具有相同的功能或生物活性的變種后代也包括在內。為了純化重組生產(chǎn)的異源免疫球蛋白，通常采用不同柱色譜步驟的組合。一般來說，在蛋白A親和色譜之后進行一個或兩個附加的分離步驟。最后的純化步驟是所謂的 “精煉步驟”，用來去除痕量雜質和污染物如聚集的免疫球蛋白、殘余HCP(宿主細胞蛋白)、 DNA(宿主細胞核酸)、病毒或內毒素。對于精煉步驟，通常在流通模式下使用陰離子交換材料。很好地建立了不同的方法并普遍用于回收和純化蛋白質，如微生物蛋白質親和色譜法(如蛋白A或蛋白G親和色譜法)、離子交換色譜法(如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換)、嗜硫吸附色譜法(例如采用巰基乙醇和其他SH配體)、疏水作用或芳香吸附色譜法(如采用苯基瓊脂糖、氮雜嗜沙 (aza-arenophilic)樹脂，或間氨基苯硼酸)、金屬螯合親和色譜法(如采用Ni (II)-和銅 (II)-親和材料)、體積排阻色譜法和電泳法(如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi， Μ. Α.，App1. Biochem. Biotech. 75(1998)93—102)。提供下面的實施例和附圖來幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍由所附的權利要求確定?？梢岳斫獾氖?，可以對提出的方法進行修改而不偏離本發(fā)明的實質。


附圖1 培養(yǎng)基(原位)中在線測定的培養(yǎng)過程中pH值和p02 (氧分壓)值時程圖。附圖2 在線測定和離線測定之間的pH值和p02值的比較。附圖3 :p02值(離線和在線)的時程圖、活細胞密度和機械運動速度的進程圖。附圖4 離線和在線測定之間PH值的比較。此外，給出了恒溫箱中P(X)2的時程圖。附圖5 取決于培養(yǎng)基中活細胞密度(X軸)的機械運動速度(y軸)的示例性變化。實施例1
材料和方法細胞密度通過臺盼藍染色法測定細胞密度。由于其完整的細胞膜，活細胞能夠排出帶有負電荷的染料臺盼藍，由此可以區(qū)分活細胞與非活細胞(參見例如Freshney，R. (1987) Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique,第117頁，Alan R. Liss,Inc., 紐約)。該方法在細胞培養(yǎng)分析儀CEDEXHiRes (Irmovatis AG，比勒費爾德，德國)中自動進行。然后通過活細胞與細胞總數(shù)的比率來計算存活率。底物及代謝產(chǎn)物葡萄糖、乳酸鹽、氨、谷氨酰胺和谷氨酸濃度通過酶和離子選擇性傳感器測定。所使用的儀器是NOVA BioProfile loo (nova生物醫(yī)學，Riidermark，德國)。免疫球蛋白濃度免疫球蛋白濃度通過親和色譜用蛋白A作為特異性免疫球蛋白結合劑(PorosA 柱，應用生物系統(tǒng)公司)進行測量。在波長為^Onm下通過吸收測量來測定免疫球蛋白的洗脫曲線。pH、pC02、p02:血氣分析儀(pHOx，NOVA生物醫(yī)學，RSdermark，德國)用于測定pH以及氧分壓(p02)和二氧化碳分壓(PCO2)。滲透壓通過測量可與溶質含量相關的樣品凝固點的降低來測定滲透壓(Osmomate 030， Gonotec，柏林，德國)。實施例2小型振蕩瓶培養(yǎng)-一般程序在裝有通風帽以及綜合pH和氧氣傳感器(Precision Sensing GmbH，雷根斯堡，德國，Cat. -Nr. 200000919)的250ml無菌錐形瓶(康寧，Cat. -Nr. 431144)中，在無菌條件下采用潔凈工作臺裝入120ml培養(yǎng)基。將含有培養(yǎng)基的振蕩瓶在已被證實能夠提供足夠精確的溫度調節(jié)的帶有溫度控制的恒溫箱中進行調節(jié)。培養(yǎng)基的調節(jié)包括在用于培養(yǎng)的起始階段的溫度、氣壓條件和機械運動條件下對含有尚未接種細胞的培養(yǎng)基的燒瓶進行保溫。調節(jié)后，在無菌條件下使用潔凈工作臺，用表達重組免疫球蛋白的CHO細胞對培養(yǎng)基接種。培養(yǎng)以分批補料培養(yǎng)方式進行。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的PH值和PA值通過光化學熒光傳感器原位測定。通過恒溫箱的設置來控制pC02。除了連續(xù)測定pH值、PA值和p(X)2值外， 每培養(yǎng)M小時后，還要測定以下參數(shù)-細胞密度，-底物(葡萄糖)和代謝物(谷氨酰胺、氨、谷氨酸、乳酸、乳酸脫氫酶活性)的濃度，-上清液中免疫球蛋白濃度，-滲透壓?；谏鲜鏊袇?shù)的測定值，沒有、有一個或多個下列參數(shù)每M小時改變一次-通過改變機械運動速度改變p02，-通過改變恒溫箱中的外界(X)2氣壓(酸控制)或加入堿(堿控制)來改變pH，-添加營養(yǎng)液。實施例3使用恒定的機械運動和恒溫箱中恒定的P(X)2進行小型振蕩瓶培養(yǎng)可根據(jù)本發(fā)明進行小型培養(yǎng)的抗體(優(yōu)選單克隆)的例子為抗淀粉樣蛋白β -Α4 肽的抗體(抗Αβ抗體)。在例如WO 2003/070760或US 2005/0169925中報道了這種抗體和相應的核酸序列。用以下參數(shù)在KUhner恒溫箱(Kilhner AG,比爾斯費爾登，瑞士，B08型)中小型培養(yǎng)表達抗-A β抗體的CHO細胞。
參數(shù)數(shù)值振蕩瓶偏心距5cm接種細胞密度5xl05 細胞 /ml起始體積120ml機械運動160rpm外界CO2氣體量5%飽和度pH約為7PO2> 25%空氣飽和度樣品體積4. 5ml測定的p02值和pH值示于附圖1中。從附圖1可以看出，溶液中的氧分壓(PO2) 非常高(高于70%空氣飽和度)，并且培養(yǎng)基的氧含量和pH值在每次取樣后均會上升。原位測定值(在線)和取樣(離線)的測定值的比較示于附圖2中?？梢缘贸鼋Y論-離線測定的p02值低于在線測定值；-144小時后離線測定的PA值低于25%空氣飽和度的閾值，其顯示了實際上并不存在的氧氣極限值；-離線測定的PH值低于在線測定值；-PH值的在線值和離線值之間的差異顯示其并不依賴于細胞密度。實施例4使用可變的機械運動和恒溫箱中可變的P(X)2進行小型振蕩瓶培養(yǎng)用以下參數(shù)在KUhner恒溫箱(Kilhner AG,比爾斯費爾登，瑞士，B08型)中小型培養(yǎng)表達抗-A β抗體的CHO細胞。
參數(shù)數(shù)值振蕩瓶偏心距5cm接種細胞密度SxlO5 細胞/ml起始體積120ml機械運動根據(jù)在線測定的PO2而變化外界CO2氣體量根據(jù)在線測定的PH而變化PH約為7PO2> 25%空氣飽和度樣品體積4. 5ml
根據(jù)下表對機械運動速度進行調節(jié)
權利要求
1.培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法，包括根據(jù)i)培養(yǎng)基中的活細胞密度改變培養(yǎng)容器的機械運動速度的步驟。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于所述改變進一步取決于ii)培養(yǎng)基中的氧分壓。
3.根據(jù)權利要求1或2任一項的方法，進一步包括一個或多個如下步驟a)培養(yǎng)一套培養(yǎng)容器-每一個容器的總容積最高為200 μ 1，或 -每一個容器的工作容積最高為100 μ 1，或 -每一個容器的總容積在25ml至3000ml之間，或 -每一個容器的工作容積在IOml至1500ml之間，b)通過整個培養(yǎng)容器的機械運動來攪動培養(yǎng)基，c)通過培養(yǎng)容器的外氣相的二氧化碳濃度來調節(jié)培養(yǎng)基的PH值。
4.根據(jù)前述任一項權利要求的方法，其特征在于通過整個培養(yǎng)容器的旋轉運動或整個培養(yǎng)容器的俯仰運動或整個培養(yǎng)容器的振蕩進行機械運動。
5.根據(jù)前述任一項權利要求的方法，進一步包括d)通過非侵入性光化學傳感器確定培養(yǎng)容器內的pH值和p02。
6.根據(jù)前述任一項權利要求的方法，其特征在于機械運動速度的調節(jié)如下 i)根據(jù)起始細胞密度將機械運動速度設置為60rpm至IOOrpm，其中當細胞密度為IxlO5細胞/ml或更小時設置為60rpm，當細胞密度為2. 5x10s細胞/ml時設置為80rpm， 當細胞密度為5xl05細胞/ml時設置為lOOrpm， 或在中間細胞密度時設置為線性中間值， )活細胞密度每增加一倍，機械運動速度增加20rpm，直至細胞濃度達到20xl05細胞/ml,iii)活細胞密度每增加20xl05細胞/ml，機械運動速度增加20rpm，直至細胞密度達到 80xl05 細胞/ml，iv)活細胞密度由80xl05細胞/ml增加至細胞密度IOOxIO5細胞/ml時，機械運動速度增加lOrpm。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其特征在于機械運動的速度進一步調節(jié)如下ν)維持機械運動速度在200rpm至210rpm之間，逐步降低機械運動速度至135rpm，并保持該速度不變直到培養(yǎng)完成。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其特征在于步驟ν)中機械運動的速度維持在200rpm至 2IOrpm達18小時至30小時。
9.根據(jù)前述任一項權利要求的方法，進一步包括，e)增加機械運動速度來增加培養(yǎng)基中的氧分壓或降低機械運動速度來降低培養(yǎng)基中的氧分壓。
10.生產(chǎn)異源多肽的方法，包括以下步驟a)提供含有編碼所述異源多肽的核酸的哺乳動物細胞，b)用根據(jù)權利要求1-9任一項的方法培養(yǎng)所述哺乳動物細胞，c)從培養(yǎng)基中回收異源多肽。
11.根據(jù)權利要求10的方法，其特征在于異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白接合物。
12.根據(jù)權利要求10或11任一項的方法，其特征在于哺乳動物細胞是CHO細胞、HEK 細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞或雜交瘤細胞。
13.非侵入性光化學傳感器在權利要求1-9任一項的方法中用于測定小型培養(yǎng)容器中的PH值和p02的應用。
14.根據(jù)權利要求1-9任一項的方法用于確定在容積為10001至250001的攪拌培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)的培養(yǎng)參數(shù)范圍的應用。
全文摘要
本發(fā)明報道了表達異源多肽的哺乳動物細胞的培養(yǎng)方法，其中a)培養(yǎng)是在總體積為25ml至3000ml的培養(yǎng)容器中進行的，b)培養(yǎng)容器包含培養(yǎng)基和培養(yǎng)基上方的內部氣相，c)培養(yǎng)容器包含將內部氣相和外部氣相分離的膜或帽或蓋，d)培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基通過整個培養(yǎng)容器的機械運動進行攪拌，e)培養(yǎng)過程中，機械運動速度的改變取決于培養(yǎng)基中的活細胞密度或者取決于培養(yǎng)基中的氧分壓，f)培養(yǎng)基的pH值通過培養(yǎng)容器外部氣相的二氧化碳濃度進行調節(jié)，從而活細胞密度的時程圖或哺乳動物細胞表達的異源多肽的體積得率與總體積為1000l至25000l的機械攪拌培養(yǎng)容器得到的結果相似。
文檔編號C12M1/36GK102171360SQ200980139382
公開日2011年8月31日 申請日期2009年10月2日 優(yōu)先權日2008年10月6日
發(fā)明者C·舒斯特, J·克魯茲曼, R·普斯凱勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司