專利名稱：制備蛋白質(zhì)微粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供制備蛋白質(zhì)微粒的方法，該蛋白質(zhì)微?？捎糜谖⒛野?(micro-encapsulation)、基質(zhì)或支架結(jié)構(gòu)或者形成膜或涂層。
背景技術(shù)：
為了各種應(yīng)用如食品涂層、施藥和殺蟲劑的緩釋、肥料和環(huán)境清潔劑而由蛋白質(zhì)制備微球或微粒的許多方法是公知的。然而，通常使用非酸性有機(jī)溶劑如乙醇或丙酮以溶解該蛋白質(zhì)。這些溶劑通常與食品不相容且難以從食品中去除，因此食品和制藥工業(yè)已不愿使用蛋白質(zhì)膜或微粒體系。此外，使用非酸性有機(jī)溶劑導(dǎo)致蒸汽的散發(fā)、其引發(fā)的火災(zāi)及其可在食品或藥物中留下可能的殘?jiān)陌踩珕栴}。許多方法還要求使用高溫。美國(guó)專利No. 5，736，178教導(dǎo)了可由谷蛋白衍生的蛋白質(zhì)的稀酸水溶液通過使該蛋白質(zhì)作為微粒沉淀而制備形成膜的膠體分散體。然而，該蛋白質(zhì)不得不首先溶解于醇如乙醇中，這導(dǎo)致以上所列的缺點(diǎn)。因此申請(qǐng)人已確定需要在無非酸性有機(jī)溶劑(如乙醇)的情況下制備蛋白質(zhì)微粒的方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供制備蛋白質(zhì)微粒的方法，該方法包括以下步驟(a)通過攪拌作用且在無醇情況下使谷物的谷醇溶蛋白溶于有機(jī)酸中；和(b)用水溶液稀釋包含蛋白質(zhì)的溶液，從而形成具有空泡的蛋白質(zhì)微粒。蛋白質(zhì)可為任意谷物的谷醇溶蛋白，如小麥谷蛋白、大麥醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。有機(jī)酸可為丙酸、乳酸或乙酸，或者任意其它適合的酸?？上虿襟E(a)或者(b)的任一步驟中加入添加劑，例如增塑劑、著色劑、調(diào)味劑、防腐劑、微量礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素、酶、激素、保健品(nutraceutical)益生菌、益生素 (prebiotic)、藥物或其任意結(jié)合。在步驟(a)中，蛋白質(zhì)溶液優(yōu)選地為飽和的或高濃度的。在步驟(a)中，通過攪拌作用進(jìn)行溶解，以確保所形成的蛋白質(zhì)微粒具有空泡。可通過攪拌、搖晃、均化、穿過溶液起泡氣體等提供攪拌作用。在步驟(b)中，優(yōu)選地將包含蛋白質(zhì)的溶液用水稀釋至2重量份的蛋白質(zhì)比2至 30重量份的有機(jī)酸比96至68重量份的水的最終濃度，從而形成蛋白質(zhì)微粒。該方法可在約20°C至40°C的溫度下進(jìn)行，更特別地，在室溫下進(jìn)行?？稍谌芙馇盎蛉芙夂蟾男?物理、化學(xué)或者酶法)蛋白質(zhì)，以提高或改變微?；虍a(chǎn)品(例如由其形成的膜)的功能性質(zhì)。例如，可將該蛋白質(zhì)用鞣酸或酶交聯(lián)和/或加熱。如此制備的蛋白質(zhì)微粒可用于制備膜、涂層或基質(zhì)，如下所述。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供由如上所述制成的蛋白質(zhì)微粒制備完整的膜或涂層的方法，包括以下步驟(i)制備蛋白質(zhì)微粒在有機(jī)酸的水溶液中的懸浮液，達(dá)到2重量份的蛋白質(zhì)比2至 60重量份的有機(jī)酸比96至38重量份的水的最終濃度；和(ii)干燥該懸浮液以形成膜或涂層。該膜或涂層可為清潔的或混濁的，透明的或半透明的。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供由蛋白質(zhì)微粒制備基質(zhì)的方法，包括以下步驟(i)制備蛋白質(zhì)微粒在有機(jī)酸的水溶液中的懸浮液，達(dá)到2重量份的蛋白質(zhì)比2至 60重量份的有機(jī)酸比96至38重量份的水的最終濃度；(ii)洗去有機(jī)酸；和(iii)干燥懸浮液以形成基質(zhì)。形成本發(fā)明的第二和第三方面的方法優(yōu)選地在無任意非酸性有機(jī)溶劑(特別是醇如乙醇)的情況下進(jìn)行。有機(jī)酸可為丙酸或乙酸以制備膜或涂層，或?yàn)楸?、乳酸或乙酸以制備基質(zhì)，或者任意其它適合的酸。懸浮液的最終濃度可為2重量份的蛋白質(zhì)比10至60重量份的有機(jī)酸比88至38 重量份的水。當(dāng)所使用的有機(jī)酸為乙酸時(shí)，最終濃度優(yōu)選地為2重量份的蛋白質(zhì)比20至60重量份的乙酸比78至38重量份的水，更優(yōu)選地為2重量份的蛋白質(zhì)比20至30重量份的乙酸比78至68重量份的水，最優(yōu)選地為2重量份的蛋白質(zhì)比21. 6重量份的乙酸比76. 4重量份的水然而，當(dāng)有機(jī)酸為乙酸且蛋白質(zhì)是在已從酒糟(brewers spent grain)或由谷物制備醇的其它聯(lián)產(chǎn)品萃取的溶液中時(shí)，則蛋白質(zhì)比酸比水的比例優(yōu)選地為2份蛋白質(zhì)比2 份乙酸比96份水。當(dāng)所使用的有機(jī)酸為丙酸或乳酸時(shí)，最終濃度優(yōu)選地為2重量份的蛋白質(zhì)比10至 30重量份的丙酸或乳酸比88至68重量份的水，更優(yōu)選地為2重量份的蛋白質(zhì)比10至15 重量份的丙酸或乳酸比88至83重量份的水，最優(yōu)選地為2重量份的蛋白質(zhì)比10. 8重量份的丙酸或乳酸比87. 2重量份的水。在本發(fā)明第二和第三方面的方法中，在步驟(ii)之前，優(yōu)選允許將步驟(i)中制備的懸浮液靜置8至24小時(shí)。進(jìn)一步地，在步驟(ii)之前，優(yōu)選地以0. 2至0. 6重量份的增塑劑比1重量份的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選約0. 4重量份的增塑劑比1重量份的蛋白質(zhì)的量向懸浮液加入增塑劑。增塑劑的例子包括單獨(dú)或結(jié)合使用的甘油、聚乙二醇、聚丙二醇和乳酸、酒石酸二丁酯、單酸甘油酯(如油酸、棕櫚酸或硬脂酸)、三亞乙基甘油和山梨糖醇或任意其它適合的增塑劑或其結(jié)合。優(yōu)選的增塑劑是1 1 1(重量/重量)的甘油聚乙二醇(400)乳酸的混合物。在步驟(ii)或(iii)之前，可加入其它添加劑如著色劑、調(diào)味劑、防腐劑、微量礦
物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素、酶、激素、保健品、藥物、益生菌、益生素、藥品及結(jié)合。為制備膜，步驟(i)的懸浮液可直接在流延表面(casting surface)上流延。其后通過干燥去除液相，其中應(yīng)用或者不應(yīng)用加熱，以提供完整的膜。該膜可為清潔的或混濁的，透明的或半透明的。為在底物上制備涂層，步驟(i)的懸浮液可用于覆蓋底物的表面。其后通過干燥去除液相，其中應(yīng)用或不應(yīng)用加熱，以提供底物上的完整涂層。該涂層可為清潔的或混濁的，透明的或半透明的。為制備結(jié)合化合物或物質(zhì)的基質(zhì)，已向步驟(i)的懸浮液加入該化合物或物質(zhì)。 其后通過干燥去除液相，其中應(yīng)用或不應(yīng)用加熱，以提供包封或結(jié)合該化合物或物質(zhì)的不透明基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，可根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法形成蛋白質(zhì)微粒，以結(jié)合或包封化合物，如營(yíng)養(yǎng)素、維生素、酶、激素、藥物、增塑劑、防腐劑、著色劑、調(diào)味劑、微量礦物質(zhì)、保健品、益生菌或益生素或其結(jié)合。該化合物可以其濃酸溶液或者水溶液在微粒形成之前加入?？蛇x地，可將包含蛋白質(zhì)微粒的溶液或分散體干燥以形成粉末。在此情況下，根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供由經(jīng)干燥的蛋白質(zhì)微粒在底物上制備涂層的方法，包括以下步驟(i)將經(jīng)干燥的蛋白質(zhì)微粒與待涂覆的干燥底物混合；(ii)向步驟(i)的混合物加入一定量的濃有機(jī)酸，以使蛋白質(zhì)微粒涂覆底物；和(iii)去除有機(jī)酸以使蛋白質(zhì)微粒熔融(fuse)于底物以形成涂層。有機(jī)酸可通過蒸發(fā)去除，任選地借助于加熱。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供將化合物結(jié)合入由蛋白質(zhì)微粒形成的基質(zhì)的方法， 包括以下步驟(i)將經(jīng)干燥的蛋白質(zhì)微粒與待結(jié)合的化合物的溶液混合，該經(jīng)干燥的蛋白質(zhì)微?；旧喜蝗苡谠撊芤?；和(ii)去除溶劑，留下結(jié)合入基質(zhì)的化合物。溶劑可通過蒸發(fā)去除，優(yōu)選地借助于加熱。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供由上述第一方法形成的蛋白質(zhì)微粒。該微粒必須具有空泡，因而具有大的內(nèi)表面積，并可比使用非酸性有機(jī)溶劑(如乙醇)形成的微粒更柔軟。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供通過上述第一方法制備的微粒的水溶液或分散體。根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供通過上述第一方法制備的蛋白質(zhì)微粒的干燥粉末。根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供由通過上述第二方法制備的微粒分散體流延的膜。根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供具有通過上述第二或第五方法制備的微粒涂層的底物。底物可選自食品、水果、蔬菜、經(jīng)最低限度處理的和經(jīng)處理的水果和蔬菜、種子、堅(jiān)果、動(dòng)物飼料產(chǎn)品、著色劑、調(diào)味劑、微量礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素、酶、激素、藥物保健品、益生菌、益生素、藥品和其它藥物產(chǎn)品、醫(yī)學(xué)裝置等或其結(jié)合。起始蛋白質(zhì)可為可市購(gòu)得到的蛋白質(zhì)，例如商業(yè)玉米醇溶蛋白?？蛇x地，可用有機(jī)酸如冰醋酸、乳酸或丙酸從所有谷物(高粱、玉米、小麥、大麥等或其混合物)或聯(lián)產(chǎn)品(例如面粉、糠、麥糟(spent grain)、干酒糟及其殘液(distiller'sdry grain with solubles)或其它由谷物制備醇的聯(lián)產(chǎn)品)萃取蛋白質(zhì)并去除殘余固體材料而提供蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的混合物(例如在酒糟、干酒糟及其殘液或其它由谷物制備醇的聯(lián)產(chǎn)品中得到的那些)也可用于萃取，其可為例如以各種比例的高粱和玉米或大麥和玉米的混合物(但不排除其它谷物的結(jié)合)。該蛋白質(zhì)溶液可隨后在本發(fā)明第一方面的方法的步驟(b)中直接使用。


圖 1顯示通過卩&1~1^8、(001^和!1化1^(2005)Agric Food Chem 53 :4788_4792 中的現(xiàn)有技術(shù)方法制備的高粱醇溶蛋白微粒的掃描電子顯微照片，其中在微粒形成之前使用乙醇水溶液(aqueous ethanol)以溶解高粱醇溶蛋白。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的方法在不同的酸濃度下制備的高粱醇溶蛋白微粒的顯微照片a-c為分別在5. 4%,21. 6%和40%的乙酸下的光學(xué)顯微照片；d-f為分別在5. 4%, 21. 6 %和40 %的乙酸下的掃描電子顯微照片；g-i為分別在5. 4 %、21. 6 %和40 %的乙酸下的透射電子顯微照片；j_l為分別在5.4%、21.6%和40%的乙酸下的較高放大倍數(shù)的透射電子顯微照片。圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的方法制備的經(jīng)冷凍干燥的高粱醇溶蛋白微粒的掃描電子顯微照片。圖4顯示(a)由21. 6%乙酸流延的2%高粱醇溶蛋白微粒膜，該具有光滑表面的膜約為15微米厚、柔韌、無色、清潔且透明；和(b)由冰醋酸流延的2%高粱醇溶蛋白膜，該具有粗糙表面的膜約為30微米厚、柔韌、幾乎無色、清潔、不完全透明。圖5顯示用不同的有機(jī)酸以逐漸增多的酸濃度制備的高粱醇溶蛋白微粒對(duì)膜的形成的影響，分別是a-c為乙酸(5.4%,10.8%,21.6% )，d_f為丙酸(5.4%U0.8%, 21.6%)。a和b分別顯示，完整、清潔的膜不能在5. 4%或10. 8%的乙酸下形成。該膜為不透明、碎片狀的且表面粗糙。與之相比，在21. 6%的乙酸下形成了完整、無色、清潔、透明并且光滑的膜(c)。d顯示用5. 4%的丙酸不可形成完整的膜。該具有粗糙表面的膜為不透明且碎片狀的，但與分別使用5.4%和10.8%乙酸的a和b中的膜相比程度較輕。e和f 顯示分別在10. 8%和21. 6%的丙酸下形成了完整、無色、清潔、透明且光滑的膜。圖6顯示由高粱啤酒渣的萃取物直接制備的微粒制成的膜和涂層。A為20%乙酸、 B為10%乙酸、C為2%乙酸、D為乙酸；1為2%高粱醇溶蛋白，2為高粱醇溶蛋白， 3為0.5%高粱醇溶蛋白。注意所有的膜都是完整的。圖7顯示在4°C下貯藏5天的經(jīng)最低限度處理的鱷梨。A 未涂覆的鱷梨，B 用根據(jù)本發(fā)明的高粱醇溶蛋白微粒涂層制劑涂覆的鱷梨。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的第一方面涉及在稀有機(jī)酸溶液中制備蛋白質(zhì)微粒分散體的方法。通過將蛋白質(zhì)溶于濃有機(jī)酸溶液中并隨后用水相稀釋該溶液而形成該微粒。微粒的形成取決于蛋白質(zhì)在有機(jī)酸溶液中的相對(duì)溶解度。由于有機(jī)酸濃度通過加入水相而降低，蛋白質(zhì)不再可溶并因此從溶液析出形成微粒。在微粒的形成之前可向溶液加入化合物以使其結(jié)合入微?；虮晃⒘０?。在稀有機(jī)酸中的該微粒的分散體在無微生物污染的環(huán)境貯藏條件下是穩(wěn)定且均質(zhì)的?？蓪⒃撐⒘南∮袡C(jī)酸中分離，洗滌并干燥以形成粉末，或者可用于形成連續(xù)的膜或涂覆底物。如本文中使用的，濃酸通常被視作具有80%或更高濃度的酸，而稀酸通常被視作具有小于80%濃度的酸。本方法不使用醇如乙醇，并且所有組分可為食品相容的，使得該微粒適于被人類或動(dòng)物消費(fèi)。不同于形成微粒的公知方法，本方法不需要高溫，并可在20°C至40°C的溫度 (如室溫)下進(jìn)行。也不需要有毒的化學(xué)品。顆粒尺寸和定義如本文所用，“微”指具有納米至微米直徑的顆粒。微球通常被視作球形顆粒，而微粒通常稍大且在形狀上是不規(guī)則或非球形的。在本發(fā)明中，微?？蔀榍蛐位蛘卟灰?guī)則形狀， 但兩者都將被稱作微粒。因此術(shù)語(yǔ)“微?！币庵赴ㄎ⑶?。微粒的尺寸可從納米尺度(納米)至微米，但對(duì)于球形顆粒更特別地為1-10微米，而對(duì)于不規(guī)則形狀的顆?；蛘呶⒘＞奂w可略大，其可至數(shù)毫米。然而，取決于制備方法(例如改變稀釋的速率或在制備過程中應(yīng)用剪切)，可控制該尺寸以制備較大或較小的顆粒。具有一定尺寸范圍的微粒的形成允許多種應(yīng)用。這包括食品用途如用于食品包裝的膜的形成、用于延長(zhǎng)食品產(chǎn)品的保質(zhì)期的可食用涂層以及包封例如食品、動(dòng)物飼料產(chǎn)品、 食品成分、酶、激素、著色劑、調(diào)味劑、微量礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素、藥物、保健品、益生菌和益生素。 其它非食品用途可包括施藥、其它醫(yī)學(xué)用途(如組織工程、組織基質(zhì)或者用于心血管的支架和涂層以及其它生物醫(yī)學(xué)裝置)、生物半導(dǎo)體以及殺蟲劑和肥料的緩釋。如通過掃描電子顯微鏡(外表面)和透射電子顯微鏡(內(nèi)表面)所示(圖2)，通過本發(fā)明的方法制備的微粒具有粗糙多孔的表面和大量?jī)?nèi)部孔洞或空泡。因此本制備方法造成具有非常大表面積的微粒的形成。通過本發(fā)明制備的微粒具有粗糙的具洼點(diǎn)(pitted)的外表面，顯得柔軟但可通過交聯(lián)而硬化，并將形成連續(xù)的膜，而通過現(xiàn)有技術(shù)使用乙醇水溶液制備的微粒具有幾乎光滑的外表面，顯得較堅(jiān)硬且不形成連續(xù)的膜。形成微粒的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)為谷物的谷醇溶蛋白，且更特別地(但不排他地)為高粱醇溶蛋白、谷蛋白、大麥醇溶蛋白或玉米醇溶蛋白或其混合物。通常，該蛋白質(zhì)為高粱醇溶蛋白。使用蛋白質(zhì)制備微粒是因?yàn)樗鼈兪翘烊坏?，具有不同的性質(zhì)，其可被改性并可在體外和體內(nèi)降解為氨基酸和小肽。因此它們適于人類和動(dòng)物消費(fèi)以及藥品的給藥。疏水蛋白質(zhì)在水中具有有限的溶解度，但在有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑的水混合物、二元溶劑和具有極端PH的溶劑(如酸和堿)中是可溶的。高粱醇溶蛋白是優(yōu)選的谷醇溶蛋白，因?yàn)樗绕渌却既艿鞍兹缧←湸既艿鞍缀陀衩状既艿鞍赘杷?，并且比玉米醇溶蛋白更交?lián)，造成更好的功能性質(zhì)。蛋白質(zhì)可為蛋白質(zhì)離析物，或可從聯(lián)產(chǎn)品材料如酒糟、干酒糟及其殘液或其它由谷物制備醇的聯(lián)產(chǎn)品萃取。用于制備微粒的酸將蛋白質(zhì)溶于適合的有機(jī)酸。如果在環(huán)境溫度Q0-25°C )下0. 5% (重量/體積)的蛋白質(zhì)溶于溶劑形成澄清溶液，該蛋白質(zhì)通常被視作可溶的(Shukla，R.和Cheryan，M. (2001)Zein :The Industrial Protein From Corn, Industrial Crops and Products 13 :171-192)?？捎糜谌芙獾鞍踪|(zhì)的有機(jī)酸的例子為乙酸、乳酸和丙酸。這些酸的使用為微粒賦予食品相容性的優(yōu)點(diǎn)。另外，以該方式形成的微粒是微生物穩(wěn)定的，且不需要額外的防腐劑。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選的酸為乙酸。粉末形成可將微粒從形成微粒的稀有機(jī)酸溶液中分離并用水溶液清洗。隨后去除水溶液并將微粒干燥成粉末。分離方法可為例如過濾或離心過濾。干燥方法可包括冷凍干燥、急驟干燥、噴霧干燥、流化床干燥或任意其它適合的干燥方法。分離和干燥的方法通常將取決于所使用的蛋白質(zhì)。可將該粉末貯藏并無須冷凍或其它特別的處理技術(shù)而處理?？蓪⒎勰┩ㄟ^足以使顆粒再懸浮的攪拌作用加入稀有機(jī)酸溶液而實(shí)現(xiàn)再水合(re-hydration)。用于再生的稀有機(jī)酸溶液的量取決于所需要的最終產(chǎn)品的濃度以及所需要的用途。已干燥的微粒保持其結(jié)構(gòu)。它們?cè)谛螤钌鲜乔蛐位虿灰?guī)則的，具有粗糙的具洼點(diǎn)的表面，如通過掃描電子顯微鏡所示(圖3)。膜和涂層的形成當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)微粒用于形成自立式(free-standing)膜時(shí)，該微粒的稀有機(jī)酸懸浮液可直接在流延表面上流延。隨后通過干燥去除液相，其中應(yīng)用或者不應(yīng)用加熱。取決于用于制備微粒的蛋白質(zhì)的濃度，制備了厚度可變的完整的(而不是碎片狀的、破碎的或有孔的) 膜(圖4a)。該膜通常具有10-30微米的厚度。該膜可用作包裝材料，例如用于食品、食品成分和為了獸醫(yī)或人類用途的藥物。該膜還可用作隔離(interleaving)材料，例如用于分離同一食品產(chǎn)品的一部分，例如匹薩餅，或用于同一食品產(chǎn)品中的不同組分之間，例如在餡餅中的水果餡和餡餅皮之間以阻止水分傳遞。該膜可為清潔的或渾濁的。當(dāng)?shù)孜锷闲枰繉訒r(shí)，該微粒的水分散體用于覆蓋底物的表面，隨后允許水相蒸發(fā)，在底物表面上形成涂層。該底物可為可食用的食品或食品成分的底物，其對(duì)氧化或失水敏感，例如水果、堅(jiān)果、調(diào)味品或蔬菜(完整的或經(jīng)最低限度處理的或經(jīng)處理的)或者動(dòng)物或魚類飼料產(chǎn)品。其它適合的產(chǎn)品也可被涂覆，例如花、藥物化合物、酶、激素、片劑組合物或其它藥物、生物或醫(yī)學(xué)產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)素、保健品、益生菌、益生素等或其結(jié)合。關(guān)于本發(fā)明的第二和第三方法，如所述地將蛋白質(zhì)微粒的分散體稀釋是重要的， 以制備完整的膜和涂層。這使該膜和涂層區(qū)別于通過使用乙醇或者不同的蛋白質(zhì)溶劑 水的比例的現(xiàn)有技術(shù)方法制備的那些(可為不完整的)。根據(jù)本發(fā)明制備的膜也可為清潔的或渾濁的、透明的或半透明的。蛋白質(zhì)微粒的分散體可與各種添加劑(例如增塑劑，其改進(jìn)由微粒分散體制備的膜和涂層的功能性質(zhì))共調(diào)配。由蛋白質(zhì)微粒制備的膜是完整的并可比其它膜制備得更薄，如10微米至30微米，且優(yōu)選地約15微米。該膜還可具有一些比用蛋白質(zhì)的乙醇溶液制備的膜更好的功能性質(zhì)，例如水阻擋性能及其為清潔的、透明的或半透明的(其它流延膜通常為碎片狀且不透明)。在基質(zhì)內(nèi)包封當(dāng)待形成的蛋白質(zhì)微粒用于包封化合物時(shí)，在該微粒形成之前，該化合物可結(jié)合入水溶液、有機(jī)酸或蛋白質(zhì)溶液或其結(jié)合中。當(dāng)通過攪拌作用混合所得溶液時(shí)，形成包含待包封的化合物的微粒。
實(shí)現(xiàn)將化合物包封至微粒中的另一方式是通過將預(yù)先干燥的本發(fā)明的微粒在該微粒不溶的溶液或懸浮液中與物質(zhì)混合。當(dāng)該溶劑蒸發(fā)時(shí)，該化合物保持包封在該微粒中。微粒改性微粒的性質(zhì)可為特定應(yīng)用而改性，例如在形成微粒之前或在形成微粒的過程中， 或在形成微粒、基質(zhì)之后，或在由微粒形成膜或涂層之后或在形成膜或涂層的過程中，通過使用化學(xué)、酶法或物理方法以改變初始蛋白質(zhì)。此改性可制備具有改進(jìn)性質(zhì)的微粒、基質(zhì)、 支架、膜或涂層，如改變的熱穩(wěn)定性、剪切穩(wěn)定性或耐蛋白酶性。通過此改性制備的膜或涂層還將具有改進(jìn)的功能性質(zhì)，包括改變的拉伸和阻擋性能，改進(jìn)的耐蛋白酶性和延遲的生物降解。蛋白質(zhì)改性的特別的例子為用鞣酸交聯(lián)、使用反式谷氨酰胺酶以及加熱。本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述。然而，這些實(shí)施例將不視作以任何方式限制本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或者范圍。實(shí)施例實(shí)施例1 形成高粱醇溶蛋白微粒通過混合以下各項(xiàng)制備根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案的組合物(所有百分比按重量基準(zhǔn)給出)增塑劑(10%)、冰醋酸(66%)和高粱醇溶蛋白(對(duì)％)，并將高粱醇溶蛋白溶于酸中。隨后加入蒸餾水并攪拌，形成微粒。蛋白質(zhì)的濃度為2%，增塑劑相對(duì)于蛋白質(zhì)含量為40 %，而酸濃度為5.4%。通過在125毫升錐形燒瓶(Erlenmeyer flask)中稱重高粱醇溶蛋白(1.8 克-88. 63%蛋白質(zhì))而制備微粒。在加入高粱醇溶蛋白之前，通過溫和的攪拌使增塑劑 (0.66克1 1 1的乳酸、聚乙二醇000)、甘油-相對(duì)于蛋白質(zhì)為40%)與冰醋酸(4. 34 克)混合。將溫度緩慢升高至30°C以確保完全溶解。隨后將該蛋白質(zhì)溶液在室溫下靜置一夜(16小時(shí))以松弛蛋白質(zhì)。在此期限之后，在5分鐘的期限內(nèi)緩慢加入蒸餾水并攪拌至總重量為80克。微粒在加入水時(shí)形成，呈穩(wěn)定、白色的膠體懸浮液。該顆粒尺寸為1至10 微米，其中大多數(shù)微粒經(jīng)測(cè)量為3-4微米。在8°C下貯藏6個(gè)月的期限后，顆粒尺寸無顯著增加。在此期間，不加入任何抗微生物劑而無微生物生長(zhǎng)。當(dāng)用掃描電子顯微鏡觀察時(shí)，微粒呈具有大量洼點(diǎn)表面的球體(圖2)。用透射電子顯微鏡確定的內(nèi)部結(jié)構(gòu)顯示不同尺寸的具有光滑壁的內(nèi)部空泡。這些結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的微粒具有非常大的內(nèi)表面積。實(shí)施例2 使用乙酸、乳酸或者丙酸形成玉米醇溶蛋白微粒通過混合以下各項(xiàng)制備組合物(所有百分比以重量基準(zhǔn)給出)增塑劑(9.5%)、 冰醋酸(62%)(或乳酸或丙酸)和商業(yè)玉米醇溶蛋白(ZPP Gold,Zein Protein Products, Marina, CA) 6% )，并將玉米醇溶蛋白溶于酸中。隨后加入蒸餾水并攪拌，形成微粒。蛋白質(zhì)的濃度為10%，增塑劑相對(duì)于蛋白質(zhì)含量為40%，酸濃度為21.6%。為了進(jìn)一步使蛋白質(zhì)含量降低至2%，加入21. 6%的乙酸。通過在125毫升錐形燒瓶中稱重玉米醇溶蛋白G克-100%蛋白質(zhì))而制備微粒。 在加入玉米醇溶蛋白之前，通過溫和攪拌使增塑劑(1.32克1 1 1的乳酸、聚乙二醇 (400)、甘油-相對(duì)于蛋白質(zhì)為40% )與冰醋酸(8. 64克)混合。將溫度緩慢升高至30°C 以確保完全溶解。隨后將該蛋白質(zhì)溶液在室溫下靜置一夜(16小時(shí))以松弛蛋白質(zhì)。在此期限之后，在5分鐘的期限內(nèi)緩慢加入蒸餾水并攪拌至總重量為40克、玉米醇溶蛋白為10%、乙酸為21.6%。微粒在加入水時(shí)形成，呈穩(wěn)定、白色的膠體懸浮液。為了進(jìn)一步降低蛋白質(zhì)濃度，使用21. 6%乙酸以稀釋。實(shí)施例3 形成用高粱醇溶蛋白微粒制備并通過加熱交聯(lián)的涂層，以便在復(fù)胃動(dòng)物的瘤胃中的條件下保護(hù)被涂覆的材料，例如甲硫氨酸(一種限定的氨基酸)將本發(fā)明的微粒用于制備干燥的粉末。如本節(jié)中前述地制備此粉末，將“粉末形成物(powder formation)”與干底物混合，在本例中，氨基酸、甲硫氨酸以1 1的比例。為了使微粒在底物(如甲硫氨酸)周圍相互熔融并形成連續(xù)涂層的目的，隨后將該粉末混合物與冰醋酸(1 2)混合以形成糊。隨后將該糊直接在平坦表面上干燥或者首先經(jīng)過不曝露于加熱或超壓下的簡(jiǎn)單擠出過程。隨后將該被涂覆的材料在強(qiáng)制通風(fēng)爐中在60-70°C下加熱處理一夜。被微粒涂覆的甲硫氨酸制劑隨后經(jīng)溶解和模擬胃蛋白酶消化檢定以確定甲硫氨酸釋放特征。溶解試驗(yàn)的誘導(dǎo)(incubation)條件以39°C下約5. 5的pH模擬牛的瘤胃中的條件。被高粱醇溶蛋白微粒涂覆的甲硫氨酸無脈沖釋放。與未涂覆的甲硫氨酸在這些條件下在1小時(shí)以內(nèi)完全溶解相比，約80%的甲硫氨酸而是在8小時(shí)后從被冰醋酸熔融的微粒涂層釋放。甲硫氨酸顯得是通過穿過該高粱醇溶蛋白微粒涂層中的孔的擴(kuò)散而釋放的。因此，通過用微粒涂層涂覆甲硫氨酸或任意其它適合的化合物，實(shí)現(xiàn)了該化合物的緩釋。這允許該化合物避開瘤胃而按要求地在該動(dòng)物的腸內(nèi)吸收。實(shí)施例4 形成用高粱醇溶蛋白微粒制備的自立式膜在另一具體實(shí)施方案中，將本發(fā)明的微粒用于制備自立式膜。將如以上實(shí)施例1 中所述制備的微粒懸浮液(每張膜4克-2%蛋白質(zhì)、5.4%乙酸)在塑料離心管中稱重。該懸浮液在4000克下離心5分鐘。潷析出上層清液，并用相等重量的21. 6%乙酸替換。隨后將該蛋白質(zhì)懸浮液在室溫下靜置一夜。將增塑劑(每張膜32毫克，1 1 1混合的乳酸、聚乙二醇(400)、甘油-相對(duì)于蛋白質(zhì)為40%)加入蛋白質(zhì)懸浮液。隨后將該懸浮液在清潔、干燥的平坦塑料容器中流延。將該容器置于50°C下的爐(非強(qiáng)制通風(fēng))中的水平表面上，并干燥4小時(shí)。輕輕地從流延容器剝下膜。隨后確定該自立式膜的拉伸和防水性能。與使用常規(guī)的膜流延技術(shù)用相同百分比的高粱醇溶蛋白制成的膜相比，由通過本文描述的方法制備的高粱醇溶蛋白微粒制成的自立式膜具有顯著更低的水蒸氣滲透性。高粱醇溶蛋白微粒膜的拉伸性能與使用常規(guī)膜流延技術(shù)流延的那些相似。與使用常規(guī)膜流延技術(shù)流延的相同蛋白質(zhì)濃度的高粱醇溶蛋白膜(30微米)(圖 4b)相比，高粱醇溶蛋白微粒膜薄得多(約15微米)(圖4a)。應(yīng)注意到，可改變自立式微粒膜的厚度以得到不同的性質(zhì)。類似地，可改變膜的精確組成，以賦予所得的膜以不同的性質(zhì)。另外，該膜是清潔、無色且透明的。實(shí)施例5 形成用高粱醇溶蛋白微粒、酸-丙酸制備的自立式膜將本發(fā)明的微粒用于使用可選的有機(jī)酸(如丙酸)制備自立式膜。將如以上實(shí)施例1中所述制備的微粒懸浮液(每張膜4克-2%蛋白質(zhì)、5. 4%丙酸)在塑料離心管中稱重。該懸浮液在4000克下離心5分鐘。潷析出上層清液，并同等重的10. 8%丙酸替換。隨后將該蛋白質(zhì)懸浮液在室溫下靜置一夜。將增塑劑(每張膜32毫克，1 1 1混合的乳酸、聚乙二醇(400)、甘油-相對(duì)于蛋白質(zhì)為40%)加入蛋白質(zhì)懸浮液。隨后將該懸浮液在清潔、干燥的平坦塑料容器中流延。將該容器置于50°C下的爐(非強(qiáng)制通風(fēng))中的水平表面上，并干燥4小時(shí)。輕輕地從流延容器剝下膜(圖k)。隨后確定該自立式膜的拉伸、防水性能和蛋白質(zhì)的可消化性(表1)。由丙酸流延的高粱醇溶蛋白微粒膜在厚度(約15微米)(圖5e)和外觀(清潔、 無色且透明)上與由乙酸流延的高粱醇溶蛋白微粒膜(圖5c)相似，且與使用常規(guī)膜流延技術(shù)流延的相同蛋白質(zhì)濃度的高粱醇溶蛋白膜(30微米)(圖4b)相比更薄。表1 自立式高粱醇溶蛋白膜的功能性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種制備蛋白質(zhì)微粒的方法，該方法包括以下步驟(a)通過攪拌作用且在無醇情況下使谷物的谷醇溶蛋白溶于有機(jī)酸中；和(b)用水溶液稀釋包含該蛋白質(zhì)的溶液，從而形成具有空泡的蛋白質(zhì)微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述谷物的谷醇溶蛋白選自谷蛋白、大麥醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)酸選自丙酸、乳酸或乙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，該方法在無乙醇的情況下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)中，所述蛋白質(zhì)溶液為飽和的或高度濃縮的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過攪拌、搖晃、均化或穿過所述溶液起泡氣體而提供所述攪拌作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)之前或之后，將所述蛋白質(zhì)用鞣酸或酶交聯(lián)和/或加熱處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，該方法進(jìn)一步包括從所述經(jīng)稀釋的溶液去除有機(jī)酸的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，該方法進(jìn)一步包括干燥步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，該方法進(jìn)一步包括由所述經(jīng)稀釋的溶液形成粉末、膜、涂層、基質(zhì)或支架的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中允許將步驟(a)中的所述溶液靜置8至24小時(shí)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(b)中，將包含所述蛋白質(zhì)的所述溶液用水稀釋至約2重量份的所述蛋白質(zhì)比約2至約30重量份的所述有機(jī)酸比約 96至約68重量份的水的最終濃度。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中將選自增塑劑、著色劑、調(diào)味劑、防腐劑、微量礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素、酶、激素、保健品、益生菌、益生素或藥物或其任意結(jié)合的所述添加劑加入步驟(a)或(b)的溶液，并使該添加劑結(jié)合入蛋白質(zhì)微?；虮坏鞍踪|(zhì)微粒包封。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述添加劑為選自甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、 乳酸、酒石酸二丁酯、單酸甘油酯、棕櫚酸、硬脂酸、三亞乙基甘油或山梨糖醇或其結(jié)合的增塑劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述增塑劑的存在量相對(duì)于約1重量份的蛋白質(zhì)為約0. 2至約0. 6重量份。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法制備的蛋白質(zhì)微粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)微粒，該蛋白質(zhì)微粒具有空泡。
18.—種包含根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)微粒的粉末。
19.一種包含根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)微粒的水懸浮液。
20.一種由根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)微粒形成的膜。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的膜，該膜是完整的。
22.一種由根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)微粒形成的涂層。
23.一種由根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)微粒形成的基質(zhì)。
24.一種由根據(jù)權(quán)利要求17所述的蛋白質(zhì)微粒形成的支架。
25.一種包含根據(jù)權(quán)利要求22所述的涂層的底物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在稀有機(jī)酸溶液中且在無醇(如乙醇)的情況下制備蛋白質(zhì)微粒的方法。通過攪拌作用使谷物的谷醇溶蛋白溶于濃有機(jī)酸溶液中并隨后用水溶液稀釋該溶液而形成微粒。由此形成具有空泡的蛋白質(zhì)微粒。該蛋白質(zhì)微?？捎糜谛纬煞勰?、膜、涂層、基質(zhì)、支架等。可由本發(fā)明的蛋白質(zhì)微粒形成完整的膜。
文檔編號(hào)A23L1/00GK102170790SQ200980139690
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者J·R·N·泰勒, J·泰勒 申請(qǐng)人:比勒陀利亞大學(xué)