專利名稱:在宿主細(xì)胞中制造糖基化蛋白的新方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及真核生物中糖蛋白制造及蛋白糖基化工程的領(lǐng)域,特別是涉及類人復(fù)合物或雜交糖基化蛋白在例如酵母等低級(jí)真核生物中的制造。本發(fā)明進(jìn)一步涉及經(jīng)糖基化修飾的真核宿主細(xì)胞,其能夠制造作為免疫球蛋白及其他治療用蛋白對(duì)人類特別有效的糖基化優(yōu)化蛋白。本發(fā)明還涉及基因工程改造的真核非人細(xì)胞,其能夠制造與人細(xì)胞中制造的糖蛋白類似的具有多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。因此,本發(fā)明進(jìn)一步涉及可由所述細(xì)胞制造的具有類人多糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)及其新組合物。
背景技術(shù):
大多數(shù)基于蛋白質(zhì)的生物藥物會(huì)暴露出一些可以對(duì)與其治療應(yīng)用有關(guān)的蛋白質(zhì)特性產(chǎn)生極大影響的翻譯后修飾的形態(tài)。蛋白質(zhì)糖基化是最普通的修飾(大約50%的人蛋白質(zhì)是糖基化蛋白質(zhì))。糖基化可以通過(guò)在蛋白質(zhì)組合物中的蛋白質(zhì)上產(chǎn)生不同的多糖結(jié)構(gòu)而向該組合物中引入重要的異質(zhì)性。這樣的多糖結(jié)構(gòu)通過(guò)糖基化系統(tǒng)的各種酶的作用來(lái)形成,隨著糖蛋白運(yùn)輸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體(糖基化級(jí)聯(lián))。蛋白質(zhì)多糖結(jié)構(gòu)的性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定、壽命、運(yùn)輸、藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)及免疫原性均產(chǎn)生影響。多糖結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的初級(jí)功能活性有很大影響。糖基化可以影響蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)并可能幫助引導(dǎo)多肽鏈的折疊。一種重要的多糖結(jié)構(gòu)就是所謂的N-多糖。N-多糖通過(guò)寡糖共價(jià)鍵合新生多肽鏈共有序列NXS/T中的天冬酰胺殘基的氨基(N)而產(chǎn)生。N-多糖可能進(jìn)一步參與分選或引導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)其最終靶點(diǎn)抗體的N-多糖,例如,可能與補(bǔ)體成分相互作用。N-多糖還可以穩(wěn)定糖蛋白,例如,可通過(guò)提高其溶解度、在其表面屏蔽疏水位點(diǎn)、防止蛋白水解及引導(dǎo)鏈內(nèi)穩(wěn)定化作用。糖基化可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的半衰期,例如,在人體內(nèi),N-多糖的末端唾液酸的存在可通過(guò)在血流中循環(huán)而增加蛋白質(zhì)的半衰期。寡糖的合成發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的兩側(cè)。糖基化級(jí)聯(lián)起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)面上連接有脂質(zhì)的寡糖(lipid-linked oligosaccharide ;LL0)的生成。首先,合成一個(gè)具有確定結(jié)構(gòu)(Man3GlCNAC2)的與脂質(zhì)連接的核心寡糖,然后添加所述寡糖至胞質(zhì)面上的脂質(zhì)多萜醇連接的Man3GlCNAC2以形成低聚七糖Man5GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)。隨后將該LLO轉(zhuǎn)移(翻轉(zhuǎn))到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔面,進(jìn)一步地,在該處加工所述庚-寡多糖以形成包含3個(gè)葡萄糖、9個(gè)甘露糖和 2個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基(GlC3Man9GlCNAC2)結(jié)構(gòu)的支鏈寡糖單元。所述GlC3Man9GlCNAC2 結(jié)構(gòu)通過(guò)若干糖基轉(zhuǎn)移酶的作用而形成。每個(gè)單獨(dú)的糖基轉(zhuǎn)移酶都對(duì)特定的寡糖底物顯示出很強(qiáng)的優(yōu)先選擇性,這導(dǎo)致可以基本線性、逐步地生物合成該支鏈寡糖。然后所述 Glc3Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)從多萜醇脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至新生多肽。圖1示出了野生型酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的LLO操作過(guò)程。所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖基化途徑的兩個(gè)步驟不與糖基轉(zhuǎn)移酶的作用直接相關(guān)(1) Man5GlCNAC2-LL0從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)面向腔面的翻轉(zhuǎn)和⑵從脂質(zhì)連接物到新生多肽的寡
糖基轉(zhuǎn)移。翻轉(zhuǎn)是在一種不依賴于ATP的雙向翻轉(zhuǎn)酶的催化下完成的。在酵母中,翻轉(zhuǎn)酶活性是由一種包含約10個(gè)橫跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜域的多起源膜蛋白即“Rftl”支持或給予的。 同源蛋白質(zhì)的基因也出現(xiàn)在其他真核生物的基因組中。不希望受理論的束縛,完整的寡糖GlC3Man9GlCNAC2是寡糖基轉(zhuǎn)移酶(0T或 0ST)最佳的底物,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶將全部寡糖從供體LLO轉(zhuǎn)移至新生蛋白質(zhì)或多肽的 Asn-X-Ser/Thr共有序列中選定的天冬酰胺殘基的氨基上。在大部分生物中,寡糖基轉(zhuǎn)移酶是一種包含七或八個(gè)不同蛋白質(zhì)的多聚體復(fù)合物,其中一個(gè)蛋白質(zhì)6tt3p)是催化性亞基。一旦糖蛋白適當(dāng)?shù)赝瓿烧郫B和寡聚體化,就會(huì)移動(dòng)到高爾基復(fù)合體中。然后,進(jìn)一步修剪和修飾N-連接多糖,并且添加新的糖類例如在人細(xì)胞中生成雜交型或復(fù)合型多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶布滿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的內(nèi)(腔)表面,因此在蛋白質(zhì)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基網(wǎng)時(shí)提供了一個(gè)允許糖蛋白序列加工的催化表面。事實(shí)上,順面、中間和反面高爾基體的多區(qū)室結(jié)構(gòu)及反面高爾基網(wǎng)(TGN)提供了可以產(chǎn)生糖基化反應(yīng)的有序序列的不同場(chǎng)所。隨著糖蛋白從在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成到在晚期高爾基體或TGN中完全成熟,其連續(xù)暴露于不同的糖苷酶、甘露糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶,使得可以合成特定的寡糖多糖結(jié)構(gòu)。不同的生物提供不同的糖基化酶(糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶)。因此,蛋白質(zhì)的多糖結(jié)構(gòu)的最終組成可根據(jù)宿主的不同而發(fā)生明顯變化。例如,典型地,例如酵母和絲狀真菌等低級(jí)真核生物在高爾基體中添加大量甘露糖殘基而產(chǎn)生“高甘露糖”型糖蛋白;然而,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,多糖結(jié)構(gòu)可能在高爾基體中經(jīng)過(guò)修剪而去除若干個(gè)九甘露糖殘基,并且可通過(guò)附加的糖殘基進(jìn)一步延長(zhǎng),這在低級(jí)真核生物的N-多糖例如唾液酸或巖藻糖中并不典型。制造重組蛋白的可能性已經(jīng)徹底改變了對(duì)患有多種不同疾病的患者的治療。大部分治療用蛋白需要通過(guò)添加多糖結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行修飾。所述糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊、長(zhǎng)循環(huán)及最佳活性(大多數(shù)情況下)可能是必要的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞如常用的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)可以產(chǎn)生與人多糖結(jié)構(gòu)類似的復(fù)合多糖結(jié)構(gòu),然而,來(lái)源于例如CHO細(xì)胞的多糖結(jié)構(gòu)與人源多糖結(jié)構(gòu)不同,因?yàn)镃HO細(xì)胞a)唾液酸化程度較低,b)額外地使寡糖與普通唾液酸(NeuAc)合并成另一種非人唾液酸(NeuGc),及c)包括人細(xì)胞中不存在的末端結(jié)合的α-1-3半乳糖?,F(xiàn)在使用的用于制造重組蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于(1) 制造率低,( 發(fā)酵程序昂貴,( 菌株設(shè)計(jì)復(fù)雜,及(4)存在病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相反,酵母細(xì)胞是用于工業(yè)發(fā)酵的強(qiáng)健生物體,而且可以在成分明確的培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度培養(yǎng)。雖然糖基化在酵母和真菌中與在哺乳動(dòng)物和人中有很大不同,但一些常見(jiàn)的要素是可以共享的。第一步,LLO在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中向新生蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移在包括酵母、真菌、植物和人類的所有真核生物中是高度保存的。但是,隨后N-多糖在高爾基體中的加工過(guò)程在酵母和哺乳動(dòng)物中有顯著不同。在酵母中,該過(guò)程包括若干甘露糖的添加。 所述甘露糖基化由殘留于高爾基體(例如0Chl,Mrml,Mrm2,等)中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶催化, 連續(xù)向N-多糖添加甘露糖。對(duì)于生物制藥產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō),采用一種具有重現(xiàn)性和一致性的糖式模型來(lái)制造治療用蛋白仍然是一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。特別是,在酵母中制造的治療用糖蛋白可能會(huì)在高級(jí)真核生物尤其是動(dòng)物和人中引起不必要的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致在酵母及其同類中制造的治療用蛋白的治療價(jià)值低。對(duì)于幾種重要的治療劑類別,包括血液因子、抗凝血?jiǎng)?、溶血栓藥、抗體、激素、刺激因子及細(xì)胞因子,例如腫瘤壞死因子(TFN)家族的調(diào)節(jié)蛋白、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、促性腺激素、免疫球蛋白G(IgG)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及干擾素,均已經(jīng)觀察到糖基化對(duì)若干治療用蛋白的分泌、穩(wěn)定性、免疫原性及活性會(huì)產(chǎn)生影響。最近正在開(kāi)發(fā)例如畢赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等許多酵母以發(fā)揮此類系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)而消除其在糖基化方面的缺點(diǎn)。已對(duì)若干菌株進(jìn)行基因組學(xué)研究以在蛋白質(zhì)上產(chǎn)生明確的類人多糖結(jié)構(gòu)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供制造例如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等糖基化分子,特別是重組糖蛋白并且優(yōu)選實(shí)例是免疫球蛋白的手段及方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種可采用所述手段和方法制造的、具有明確的多糖結(jié)構(gòu)例如特別是類人或雜交或復(fù)合多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白及其新組合物。本發(fā)明的一個(gè)特別目的在于提供具有類人多糖結(jié)構(gòu)的N-糖基化蛋白特別是免疫球蛋白,其可用于治療人類疾病,療效高并且不會(huì)弓I起不必要的副作用。本發(fā)明所基于的技術(shù)問(wèn)題是主要通過(guò)提供一種新的與脂質(zhì)連接的寡糖(以下有時(shí)簡(jiǎn)稱為脂質(zhì)連接寡糖,縮寫為L(zhǎng)L0)翻轉(zhuǎn)酶活性物(LL0翻轉(zhuǎn)酶活性)而得到解決的。所述新的翻轉(zhuǎn)酶活性物主要特征在于,其能夠高效地翻轉(zhuǎn)含有包含一個(gè)甘露糖殘基的多糖結(jié)構(gòu)特別是ManlGlCNAC2的LLO ;能夠高效地翻轉(zhuǎn)含有包含兩個(gè)甘露糖殘基的多糖結(jié)構(gòu)特別是Man2GlCNAC2的脂質(zhì)連接寡糖;還能夠高效地并且尤其高活性地翻轉(zhuǎn)含有包含三個(gè)甘露糖殘基的多糖結(jié)構(gòu)特別是Man3GlCNAC2的脂質(zhì)連接寡糖。本發(fā)明提供了一種與已知的翻轉(zhuǎn)酶活性物特別是Rft-I型活性物相反的新型 “LL0翻轉(zhuǎn)酶活性物”,其對(duì)于所要被翻轉(zhuǎn)的寡糖基結(jié)構(gòu)顯示出“松弛”的特異性。不希望受理論的束縛,已知的翻轉(zhuǎn)酶,例如低級(jí)真核生物的之前已經(jīng)被表征的翻轉(zhuǎn)酶活性物,對(duì)于要被翻轉(zhuǎn)的脂質(zhì)連接寡糖的特定多糖結(jié)構(gòu)顯示出很高的特異性。更特別地,Rft-I型活性物 (同義詞YBL020W ;Man5GlcNAc2-PP-Dol翻轉(zhuǎn)酶)主要能夠翻轉(zhuǎn)包含五個(gè)甘露糖殘基特別是Man5GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,但基本不能翻轉(zhuǎn)包含ManlGlcNAd多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。本文中所述術(shù)語(yǔ)“高效”主要是指酶活性或轉(zhuǎn)移活性以足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的范圍和目標(biāo)內(nèi)的宿主細(xì)胞的技術(shù)目的的數(shù)量或比例呈現(xiàn)。例如,據(jù)認(rèn)為,“高效”的轉(zhuǎn)移或合成不是類似于或反映為了制造本發(fā)明所述的糖蛋白而在宿主細(xì)胞中進(jìn)行的酶合成級(jí)步驟中的化合物流動(dòng)中的主要限速步驟。本發(fā)明還通過(guò)提供一種修飾或基因工程細(xì)胞或宿主細(xì)胞,特別是一種包含和表達(dá)所述新型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的真核細(xì)胞,解決了其潛在的技術(shù)問(wèn)題。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn),有可能提供所述對(duì)于要被翻轉(zhuǎn)的脂質(zhì)連接寡糖的多糖結(jié)構(gòu)具有松弛的特異性的新型“LL0翻轉(zhuǎn)酶”。該新型LLO翻轉(zhuǎn)酶有利地使得能夠在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器官膜特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上進(jìn)行糖基化加工的基因工程。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面,提供了一種具有松弛的特異性的新型LLO翻轉(zhuǎn)酶,其可用作一種在宿主細(xì)胞中修飾和控制糖基化的有價(jià)值的手段。在優(yōu)選實(shí)施方案中,將所述宿主細(xì)胞的修飾與在膜的胞質(zhì)面和/或細(xì)胞器的腔面構(gòu)建LLO結(jié)構(gòu)的過(guò)程中的至少一種或多種遺傳修飾相結(jié)合(見(jiàn)圖1)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,在所述構(gòu)建過(guò)程末期,由細(xì)胞器介導(dǎo)的向新生多肽進(jìn)行寡糖基轉(zhuǎn)移時(shí),這些修飾進(jìn)一步與寡糖基轉(zhuǎn)移酶的遺傳修飾相結(jié)合。這些修飾的復(fù)合體系有利地使得能夠提供新修飾的宿主細(xì)胞,其尤其能夠在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器更特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,具體地合成包含1、2或3個(gè)甘露糖殘基的多糖結(jié)構(gòu),特別是ManlGlcNAC2,Man2GlCNAC2 或 Man3GlcNAc2。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面,所述細(xì)胞被進(jìn)一步修飾來(lái)使其缺乏或具有被抑制、減少或耗盡的一個(gè)或多個(gè)定位于細(xì)胞器或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性物,特別是甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性物,并且更特別是來(lái)替換表達(dá)異源糖基轉(zhuǎn)移酶活性物及其他為蛋白質(zhì)的雜交或復(fù)合 N-糖基化所必需的酶。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面,提供了一種細(xì)胞,該細(xì)胞被替代性地或附加性地修飾以包含或表達(dá)一個(gè)或多個(gè)定位于細(xì)胞器或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修飾、特別是異源的寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OT) 活性物,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OT)活性物對(duì)于被從LLO轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的多糖結(jié)構(gòu)具有松弛的特異性。特別地,此類寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移活性高。在本文中,術(shù)語(yǔ)“高”意味著ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2 將被轉(zhuǎn)移至新生蛋白質(zhì)中的至少20%,至少40%,至少60%,優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少90%。所述細(xì)胞的特征可以進(jìn)一步在于所述細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的核酸分子,特征在于所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物不優(yōu)先轉(zhuǎn)移GlC3Man9GlCNAC2到蛋白質(zhì),但能夠轉(zhuǎn)移除GlC3Man9GlCNAC2之外的寡糖到蛋白質(zhì),優(yōu)選帶有1到9個(gè)甘露糖殘基的寡糖,最優(yōu)選為ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2。更特別地,所述細(xì)胞的特征在于,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物不僅轉(zhuǎn)移GlC3Man9GlCNAC2到蛋白質(zhì),還能夠高效地轉(zhuǎn)移除GlC3Man9GlCNAC2之外的寡糖到蛋白質(zhì),優(yōu)選帶有1到9個(gè)甘露糖殘基的寡糖(ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2, Man3GlcNAc2, Man4GlcNAc2 Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2 Man9GlcNAc2),最優(yōu)選為 ManlGlcNAc2, Man2GlcNAc2 和 / 或 Man3GlcNAc2。更特別地,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OT)活性物是一個(gè)單獨(dú)的單位或原生型寡糖基轉(zhuǎn)移酶,其以一個(gè)單獨(dú)蛋白質(zhì)單位的形式產(chǎn)生寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在一個(gè)更特別的實(shí)施方案中,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OT)活性物來(lái)源于原生動(dòng)物體,即原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)。 這一方案的所述細(xì)胞優(yōu)選的特征進(jìn)一步在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物來(lái)源于弓形蟲(chóng) CToxoplasma gondii (Tg)),碩大利什曼蟲(chóng)(Leishmania major (Lm));嬰兒利什曼蟲(chóng)(Leishmania infantum (Li)), EiH^1JffMii (Leishmania braziliensis (Lb)), SHr]1 禾1J7I十曼蟲(chóng)(Leishmania Mexicana (Lmx)),杜氏禾Ij什曼蟲(chóng)(Leishmania donovani (Ld)),利什曼蟲(chóng)圭亞那亞禾中(Leishmania guyanensis (Lg)),熱帶禾Ij什曼蟲(chóng)(Leishmania tropica (Lt)),克氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi (Tc)),及布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei(Tb))。本發(fā)明還涉及與所述POT有關(guān)或來(lái)源于所述POT的同源或人造結(jié)構(gòu),其功能是在細(xì)胞中產(chǎn)生 POT活性。在本發(fā)明的一個(gè)特別方面,所述細(xì)胞被進(jìn)一步修飾而使其缺乏或具有被抑制、減少或耗盡的一個(gè)或多個(gè)定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。本發(fā)明所述的細(xì)胞優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)核酸分子,所述核酸分子編碼一個(gè)或多個(gè)糖蛋白,特別是異源和重組糖蛋白,并且能制造所述糖蛋白或由一個(gè)或多個(gè)所述糖蛋白構(gòu)成的組合物。本發(fā)明還提供了制造所述糖蛋白或糖蛋白組合物的方法或工藝,其中所述方法的主要特征在于,提供并使用本發(fā)明所述的細(xì)胞來(lái)制造所述糖蛋白。本發(fā)明還提供了可利用本發(fā)明所述細(xì)胞制造的或利用本發(fā)明所述細(xì)胞制造的糖蛋白,特別是新的糖蛋白組合物。根據(jù)本發(fā)明所述的細(xì)胞,與該宿主細(xì)胞未經(jīng)修飾的野生型菌株相比,Manl至 Man3型脂質(zhì)連接寡糖的腔內(nèi)濃度更高。特別地,腔內(nèi)濃度增加至少5 %,10 %,15 %,20 %, 25 %,30 %,40 %,50 %,70 %,或 90 %,更特別地,增加至少 100 %,200 %,500 %,700 %, 1000 %,1500 %,2000 %或更多。因此,與該宿主細(xì)胞未經(jīng)修飾的野生型菌株相比,所述細(xì)胞表現(xiàn)出糖基化效率提高。特別地,尤其是對(duì)于基于Man3的結(jié)構(gòu),糖基化率提高至少5%, 10%,15%,20%,25%,30%,40%,50%,70%,或 90%,更特別地,提高至少 100%,200%, 500%,700%,1000%,1500%,2000% 或更多。關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)敲除突變株,即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有被修飾的糖基化特別是采用alg修飾途徑的菌株,與未經(jīng)修飾的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)敲除突變株相比,根據(jù)本發(fā)明方法修飾的此類突變株表現(xiàn)出了生長(zhǎng)率增加和/或溫度敏感性降低。特別地,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)敲除突變株中的生長(zhǎng)率增加至少 5%,10%,15%,20%,25%,30%,40%,50%,70%,或 90%,更特別地,增加至少 100%, 200%,500%,700%,1000%,1500% ,2000% 或更多。本發(fā)明的一個(gè)特別方面涉及一種分離的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶及編碼所述翻轉(zhuǎn)酶的分離的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明所述的翻轉(zhuǎn)酶是一種包含至少一個(gè)跨膜域及至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)膜的定位序列的蛋白質(zhì),并且是膜結(jié)合的。所述翻轉(zhuǎn)酶的進(jìn)一步特征在于能跨膜翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)連接寡糖的 ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2,或Man3GlcNAc2 結(jié)構(gòu),例如將所述ManlGlcNAc2, Man2GlCNAC2,或Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)從所述細(xì)胞器的胞質(zhì)面翻轉(zhuǎn)至腔面。根據(jù)下文進(jìn)一步描述的方法可分離出所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在細(xì)胞中表達(dá)所述翻轉(zhuǎn)酶活性物的表達(dá)盒及表達(dá)載體。本發(fā)明更特別的方面涉及所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的用途,優(yōu)選將其與對(duì)多糖結(jié)構(gòu)具有松弛特異性的寡糖基轉(zhuǎn)移酶,例如特別是原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)結(jié)合使用, 或者涉及本發(fā)明所述的任意一種細(xì)胞在制造糖蛋白或包含這種糖蛋白的組合物方面的用途。本發(fā)明的其他方面涉及由包含本發(fā)明所述細(xì)胞的試劑盒制造的糖蛋白及該試劑盒,和它們?cè)谥圃焖鎏堑鞍字械膽?yīng)用。更特別地,在第一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種細(xì)胞或宿主細(xì)胞,所述細(xì)胞或宿主細(xì)胞被修飾以表達(dá)脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,所述翻轉(zhuǎn)酶活性物能高效地將包含1至3個(gè)甘露糖殘基的所有脂質(zhì)連接寡糖從胞內(nèi)細(xì)胞器的胞質(zhì)面翻轉(zhuǎn)至腔面。在本發(fā)明的一個(gè)特別方面,所述細(xì)胞的特征還在于,所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶具有高效翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)連接寡糖的活性,所述脂質(zhì)連接寡糖選自由ManlGlCNAC2,Man2GlcNAc2和 Man3GlcNAc2組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面,所述細(xì)胞的特征還在于,所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物由一個(gè)或多個(gè)核酸分子的表達(dá)來(lái)賦予,所述核酸分子選自a)包含下述一個(gè)或多個(gè)序列或者由下述一個(gè)或多個(gè)序列組成的核酸分子SEQ ID NO :1, SEQ ID N0:3,SEQ ID N0:5,SEQ ID N0:7,SEQ ID N0:9,SEQ ID NO :11, SEQ ID NO: 13,SEQ ID N0:15,及SEQ ID NO 17 ;SEQ ID NO :21,SEQ ID NO :23,SEQ ID NO :25,SEQ IDNO :27,及 SEQ ID NO 29 ;b)包含下述一個(gè)或多個(gè)序列的編碼聚氨基酸的核酸分子SEQ ID NO :2,SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6,SEQ ID NO :8,SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :12,SEQ ID NO 14 ;SEQ ID NO 16 及 SEQ ID NO 18 ;SEQ ID NO :22,SEQ ID NO :24,SEQ ID NO :26,SEQ ID NO :28,及 SEQ ID NO 30 ;及c) a)或b)所述的核酸分子的片段、變體、類似物或衍生物。如以上任一方面中所述的細(xì)胞,其特征還可以在于,所述細(xì)胞器為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。如以上任一方面中所述的細(xì)胞,其特征還可以在于,所述細(xì)胞包含至少一種編碼異源(糖)蛋白的核酸,并且優(yōu)先表達(dá)所述(糖)蛋白。所述細(xì)胞的特征還在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Rft-I型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物。優(yōu)選地,此方面的所述細(xì)胞的特征還在于,所述Rft-I型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的特征在于,其對(duì)帶有少于5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性小于其對(duì)帶有5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性。更特別地,所述Rft-I型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的特征在于,其對(duì)帶有少于5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性低于其對(duì)帶有5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性,其中,“小于”是指,與帶有5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的數(shù)量相比,小于其10 %,20%,50%,80 %的帶有少于5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖被翻轉(zhuǎn)。該特別方案中所述的細(xì)胞進(jìn)一步優(yōu)選的特征在于,所述細(xì)胞為rftl基因或rftl 同源基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征還可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一個(gè)或多個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征還可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一個(gè)或多個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征還可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Alg-Il型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征還可以在于,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 Alg-Il型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)連接單糖 (LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為algll基因或algll 同源基因及一個(gè)或多個(gè)編碼脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物的基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Alg3型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因及alg3基因或alg3同源基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的β -D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或 DPMI型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因及dpml基因或dpml同源基因的敲除突變株。
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進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 Alg2型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為alg2基因或alg2同源基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞包含一種或多種編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的核酸分子,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的特征在于,不優(yōu)先轉(zhuǎn)移GlC3Man9GlCNAC2 至蛋白質(zhì),而是還能夠轉(zhuǎn)移除GlC3Man9GlCNAC2之外的寡糖至蛋白質(zhì),優(yōu)選具有1_9個(gè)甘露糖殘基的寡糖,最優(yōu)選ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2,和/或Man3GlcNAc2。更特別地, 所述細(xì)胞的特征在于,所述酶活性物不僅轉(zhuǎn)移GlC3Man9GlCNAC2至蛋白質(zhì),還能夠高效地轉(zhuǎn)移除GlC3Man9GlCNAC2之外的寡糖至蛋白質(zhì),優(yōu)選所述寡糖具有1_9個(gè)甘露糖殘基 (ManlGlcNAc2, Man2GlcNAc2, Man3GlcNAc2, Man4GlcNAc2 Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2),最優(yōu)選 ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2,禾口 / 或 Man3GlcNAc2。進(jìn)一步優(yōu)選地,前述方面中所述的細(xì)胞的特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物選自H^tt3Bp型活性物,TbStt3Cp型活性物,Ln^tt3Ap型活性物,Ln^tt3Bp型活性物,及Ln^tt3Dp型活性物。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一種或多種定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。前述方面中任一或多項(xiàng)所述的細(xì)胞,特別地,其特征在于,所述定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶選自O(shè)chl型活性物及Mrm甘露糖基轉(zhuǎn)移酶家族,尤其是Mrml型活性物、 Mnn2型活性物、Mnn4型活性物、Mnn5型活性物、Mnn9型活性物、MnnlO型活性物及Mnnll 型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為選自oChl,mrml,mrm2,mnn4, mnn5, mnn9, mnnlO, mnnll和/或它們的同源基因中的至少一種基因的敲除突變株。前述方面中任一或多項(xiàng)所述的細(xì)胞,特別地,其特征在于,所述定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶選自Ktr甘露糖基轉(zhuǎn)移酶家族,尤其是Ktrl型活性物、Ktr2型活性物、Ktr3 型活性物、Ktr5型活性物、Ktr6型活性物及Ktr7型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為選自ktrl,ktr2,ktr3,ktr4,ktr5,ktr6,ktr7和/或它們的同源基因中的至少一種基因的敲除突變株。前述方面中任一或多項(xiàng)所述的細(xì)胞,特別地,其特征在于,所述定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶選自Van甘露糖基轉(zhuǎn)移酶家族,尤其是Vanl型活性物及Vrg4型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為選自vanl,vrg4和/或它們的同源基因中的至少一種基因的敲除突變株。進(jìn)一步優(yōu)選地,前述方面中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Mrm2型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Mrm5 型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為mrm2基因或mrm2同源基因及 mnn5基因或mrm5同源基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 Ochl型活性物。進(jìn)一步優(yōu)選地,所述細(xì)胞的特征在于,所述細(xì)胞為ochl基因或ochl同源基因的敲除突變株。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種定位于高爾基體
16的異源酶或其催化域,優(yōu)選地,所述定位于高爾基體的異源酶或其催化域選自甘露糖基(0-1,3-)_糖蛋白0-1,2-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&ιΤΙ);甘露糖基(α-1,6-)_糖蛋白β _1,2_Ν_乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&ιΤΙΙ);β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&1ΤΙΙΙ);甘露糖基(0-1,3-)_糖蛋白0-1,4-Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&iTIV);甘露糖基(0-1,6_)-糖蛋白0-1,6-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&iTV);
甘露糖基(0-1,6-)_糖蛋白0-1,4-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&iTVI);β -N-乙酰葡糖氨基糖肽β -1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT);α (1,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FucT);β -半乳糖苷α -2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST);UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶(NeuC);唾液酸合酶(NeuB);CMP-Neu5Ac 合酶;N-?;窠?jīng)氨酸-9-磷酸合酶;N-?;窠?jīng)氨酸-9-磷酸酶;UDP-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)體;UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體;⑶P-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體;CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體;核苷酸二磷酸酶;⑶P-D-甘露糖4,6-脫水酶;及⑶P-4-酮-去氧-D-甘露糖_3,5-差向異構(gòu)酶_4_還原酶。進(jìn)一步地,所述細(xì)胞的特征可以在于,所述細(xì)胞選自包括真菌細(xì)胞在內(nèi)的低級(jí)真核細(xì)胞及包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞在內(nèi)的高級(jí)真核細(xì)胞。第三方面,本發(fā)明提供了一種或多種分離的核酸分子,其能夠編碼或提供本發(fā)明第一方面中所述的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物。在一個(gè)優(yōu)選方面,所述核酸分子的特征在于,所述分子選自本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的核酸分子的一種或多種。第四方面,本發(fā)明提供了一種用于在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒,包含本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的任一種核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝,所述一個(gè)或多個(gè)拷貝與編碼啟動(dòng)子的核酸分子和編碼終止子的核酸分子中的至少一種核酸分子結(jié)合在一起。在其一個(gè)優(yōu)選方面,所述表達(dá)盒還包含編碼本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝。第五方面,本發(fā)明提供了一種用于真核宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體,所述載體包含選自以下拷貝中的一種或多種本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的任一種核酸分子的拷貝和本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒的一個(gè)或多個(gè)拷貝。第六方面,本發(fā)明提供了一種用于制造細(xì)胞的方法,所述細(xì)胞能夠在其細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中特別合成具有ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,所述方法至少包括下述步驟用至少一種編碼脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的構(gòu)造或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞,所述構(gòu)造或結(jié)構(gòu)選自本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的核酸分子;本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒;及本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的載體;以使得所述細(xì)胞能夠表達(dá)由所述構(gòu)造或結(jié)構(gòu)編碼的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物。在其一個(gè)優(yōu)選方面,所述構(gòu)造還編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物,以使得所述細(xì)胞能夠表達(dá)由所述結(jié)構(gòu)編碼的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物和寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。在一個(gè)或多個(gè)前述方面的優(yōu)選方面,所述方法還包括在細(xì)胞內(nèi)減少或耗盡以下的至少一種酶活性物的步驟,所述酶活性物選自Alg2型活性物;Algll型活性物;Alg3型活性物;DPMI型活性物;以及脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶型活性物。第七方面,本發(fā)明提供了一種或多種分離的細(xì)胞,所述細(xì)胞能夠在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器中特別合成具有ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2和/或Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并且能夠?qū)⑺龆嗵墙Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至在所述細(xì)胞中表達(dá)的新生蛋白質(zhì),其特征在于,所述細(xì)胞可以由或?qū)嶋H上由本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)制造。第八方面,本發(fā)明提供了一種用于制造糖蛋白或糖蛋白組合物的方法,包括如下步驟提供本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞;在使所述細(xì)胞內(nèi)允許制造所述糖蛋白或糖蛋白組合物的條件下,于培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞;及必要時(shí),從所述細(xì)胞和/或所述培養(yǎng)基中分離所述糖蛋白或糖蛋白組合物。第九方面,本發(fā)明提供了一種用于制造糖蛋白或糖蛋白組合物的試劑盒,包括本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞;及培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)所述細(xì)胞以制造所述糖蛋白。第十方面,本發(fā)明提供了一種糖蛋白或糖蛋白組合物,其特征在于,所述糖蛋白或糖蛋白組合物的多糖結(jié)構(gòu)選自GlcNAcMan3-5GlcNAc2,GlcNAc2Man3GlcNAc2,GlcNAc3Man3GlcNAc2_ 平分型Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc,Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型,Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型,NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc,NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型,
NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型,GlcNAc3Man3GlcNAc2,Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2,Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc,NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2,及NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc第十一方面,本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞,能夠特別制造本發(fā)明第九方面所述的一種或多種糖蛋白或糖蛋白組合物。第十二方面,本發(fā)明提供了一種糖蛋白,選自可由本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞制造的糖蛋白;可利用本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的方法制造的糖蛋白;及本發(fā)明第十方面所述的糖蛋白。一個(gè)優(yōu)選方面為一種糖蛋白組合物,包含兩種或多種第十方面所述的糖蛋白。一個(gè)優(yōu)選方面為一種或多種重組蛋白。一個(gè)優(yōu)選方面為一種或多種治療活性蛋白。一個(gè)優(yōu)選方面為一種或多種免疫球蛋白。第十三方面,本發(fā)明提供了一種藥物組合物,包含本發(fā)明前述方面中任一項(xiàng)所述的糖蛋白中的一種或多種糖蛋白,并且優(yōu)選地,包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體或輔藥 (佐劑)。第十四方面,本發(fā)明提供了一種治療失調(diào)的方法,所述失調(diào)可通過(guò)施用本發(fā)明前述方面中任一或多項(xiàng)所述的糖蛋白或其組合物中的一種或多種來(lái)治療,所述方法包括下述步驟給對(duì)象施用如上所述的糖蛋白或其組合物,其中,所述對(duì)象患有或疑似患有可通過(guò)施用所述糖蛋白或其組合物治療的疾病。
圖1顯示了酵母中生物合成脂質(zhì)連接寡糖(LLO)途徑的圖示。脂質(zhì)連接寡糖合成起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外膜,當(dāng)生成Man5GlCNAC2(M5)結(jié)構(gòu)時(shí),所述脂質(zhì)連接寡糖被翻轉(zhuǎn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔并完成所述脂質(zhì)連接寡糖合成。所述寡糖由OT(OST)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)。圖2顯示了來(lái)源于Aalgll突變菌株(YG1365)(圖2A)及Δ alg3 Δ algll突變菌株(YG1363)(圖2B)的[3H]-甘露糖標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖的HPLC圖,示出Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)(M3)在YG1363中的產(chǎn)生。圖3顯示了來(lái)源于Aalglll突變菌株(YG1365)(圖3A)及Aalg3Aalgll突變菌株(YG1363)(圖;3B)的[3H]-甘露糖標(biāo)記的蛋白連接寡糖的HPLC圖。所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的Man3GlcNAc2 LLO結(jié)構(gòu)(M3)在高爾基體區(qū)室中被進(jìn)一步延伸成Man4GlcNAc2 (M4)及 Man5GlcNAc2(M5)。圖4顯示了從來(lái)源于野生型菌株(WT)(圖4A)、Aalgll突變菌株(YG1365)(圖 4B)及Aalg3Aalgll突變菌株(YG1363)(圖4C)的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)中分離的2-AB-標(biāo)記 N-多糖的MALDI-TOF MS譜。每個(gè)N-多糖峰在各峰下方已有注釋,代表Man3GlcNAc2至Manl2GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)(M3至M12)。每個(gè)標(biāo)記的結(jié)構(gòu)都由2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) 殘基和各自指定數(shù)目的甘露糖組成;在m/z 1053處的峰代表M3,在m/z 1215處的峰代表 M4,在m/z 1377處的峰代表M5。所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的M3 LLO結(jié)構(gòu)在高爾基體區(qū)室中被進(jìn)一步延伸成M4及M5。圖5A-K列舉了編碼Flc2’或其片段的核苷酸序列或其轉(zhuǎn)錄物的氨基酸序列。(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)以^MM印出,跨膜域以加粗字體印出)圖5A表示編碼Flc2,的核苷酸序列(SEQ ID N0:1);圖5B表示Flc2,轉(zhuǎn)錄物的氨基酸序列(SEQ ID NO 2);圖5C表示編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)及編碼flc2’的編碼區(qū)的跨膜域(TM)I至 3(ΤΜ1-3)的核苷酸序列(SEQ ID NO 3);圖5D表示圖5C的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物的氨基酸序列(SEQ ID NO 4);圖5E表示編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)及編碼flc2’的編碼區(qū)的跨膜域(TM)I至 2(ΤΜ1-2)的核苷酸序列(SEQ ID NO 5);圖5F表示圖5E的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物的氨基酸序列(SEQ ID NO 6);圖5G表示編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)及編碼flc2’的編碼區(qū)的跨膜域(TM)2至 4(TM2-4)的核苷酸序列(SEQ ID NO 7);圖5H表示圖5G的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物的氨基酸序列(SEQ ID NO 8);圖51表示編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)及編碼flc2’的編碼區(qū)的跨膜域(TM)3至 4(TM3-4)的核苷酸序列(SEQ ID NO 9);圖漲表示圖51的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物的氨基酸序列(SEQ ID NO 10);圖5L表示代表flc2,的內(nèi)源性啟動(dòng)子的核苷酸序列(SEQ ID NO 61)下劃線部分標(biāo)識(shí)了起始密碼子。圖6A顯示了將野生型菌株與攜帶空載體、Rftl (oe RFT1)或Flc2,表達(dá)質(zhì)粒(oe Flc2')的Arftl突變菌株相比較的斑點(diǎn)分析。每排由指定菌株的一系列稀釋物組成。質(zhì)粒運(yùn)載的Flc2’可以補(bǔ)足Rftl缺失;圖6B顯示了將野生型菌株與Aalgll突變菌株相比較的各自的斑點(diǎn)分析;圖6C顯示了將野生型菌株與Aalg2_l突變菌株相比較的各自的斑點(diǎn)分析。圖7々及8顯示了攜帶空載體、1 代1、?1(32’、包含跨膜域3 0¥ 3)、跨膜域1和 3 (TM1-3)或跨膜域3和4(TM 3-4)的Flc2,片段或Flc2表達(dá)質(zhì)粒的Arftl突變菌株的斑點(diǎn)分析。每排由指定菌株的一系列稀釋物組成。質(zhì)粒運(yùn)載的Flc2’可以補(bǔ)足Rftl缺失。 相反,全長(zhǎng)Flc2的超表達(dá)(oe Flc2)不能補(bǔ)足生長(zhǎng)缺陷,因此引起對(duì)內(nèi)源性翻轉(zhuǎn)酶活性物缺乏的補(bǔ)償。圖7C顯示了羧肽酶Y在野生型酵母菌株或攜帶空質(zhì)粒(YEp35》或用于Rftl的超表達(dá)的質(zhì)粒中任一種及Flc2’翻轉(zhuǎn)酶的Arftl突變菌株中的N-糖基化。代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶以-1,-2,-3及-4顯示。YEp26. 2代表在HCSS中鑒定的初始克隆。圖8顯示了來(lái)源于Arftl突變菌株的[3H]-甘露糖標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖的HPLC 圖。圖8A:攜帶空載體YEp352的Δ rftl突變菌株;圖8B 攜帶Rftl表達(dá)構(gòu)造的Arftl突變菌株;圖8C 攜帶Flc2’表達(dá)構(gòu)造的Arftl突變菌株。
圖9描述了羧肽酶Y在攜帶空質(zhì)粒(YEp352)、用于Flc2,的超表達(dá)的質(zhì)?;騌ftl 翻轉(zhuǎn)酶的野生型酵母或Δ alg3 Δ algll突變菌株中的N-糖基化結(jié)果。圖10描述了羧肽酶Y(CPY)和β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(feislp)在野生型酵母 (YG1509)或表達(dá)Flc2,翻轉(zhuǎn)酶、Ln^tt3D、或由Flc2,翻轉(zhuǎn)酶和Ln^tt3D組成的組合的突變酵母株 YG1365 (Aalgll)及 YG1363 ( Δ alg3 Δ algll)中 N-糖基化的蛋白免疫印跡(Western blot)結(jié)果。指出了代表CPY及(iaslp的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶。圖11描述了羧肽酶Y在攜帶空載體(例如,YEp352)或用于Flc2,、POT或Flc2, 和POT的超表達(dá)的質(zhì)粒的Δ algll突變菌株中的N-糖基化。代表CPY的全部糖基化(mCPY) 及低糖基化形式的帶以-1,-2,-3及-4顯示。圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明所述的用于在以酵母為例的低級(jí)真核生物中的N-連接糖基化的優(yōu)選復(fù)合系統(tǒng)的圖示。更詳細(xì)地,脂質(zhì)連接寡糖的合成發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)面;所述合成通過(guò)由%c59p將磷酸殘基向多萜醇轉(zhuǎn)移而發(fā)起,并且通過(guò)數(shù)個(gè)單糖轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)面和腔面的連續(xù)動(dòng)作來(lái)延伸寡糖供體,最終形成脂質(zhì)連接的GlC3Man9GlCNAC2。脂質(zhì)連接的GlC3Man9GlCNAC2作為內(nèi)源性多亞基酵母寡糖基復(fù)合物(Ost復(fù)合物)的底物;在復(fù)合系統(tǒng)中,alg3及algll基因缺失(Aalgll, Aalg3)導(dǎo)致脂質(zhì)連接Man3GlCNAC2的產(chǎn)生。 剩余的轉(zhuǎn)移酶仍然存在于細(xì)胞中,但是,對(duì)脂質(zhì)連接GlcNAc2Man3底物是無(wú)活性的。添加了本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶(Flc2’ )及原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT碩大利什曼蟲(chóng)Mt3D)。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中,脂質(zhì)連接Man3GlCNAC2的產(chǎn)生是由dpml基因的缺失而賦予的,所述基因產(chǎn)物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)面制造脂質(zhì)連接甘露糖(DPMI)。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中,脂質(zhì)連接Man3GlCNAC2是由單糖翻轉(zhuǎn)酶的缺失而產(chǎn)生的,所述翻轉(zhuǎn)酶將多萜醇連接的甘露糖翻轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(星號(hào))。脂質(zhì)連接甘露糖為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的寡糖基轉(zhuǎn)移酶提供供體。通過(guò)與algll突變結(jié)合,這種細(xì)胞還能制造脂質(zhì)連接Man3GlCNAC2。 多余未用的轉(zhuǎn)移酶、翻轉(zhuǎn)酶(Rftl)、酵母Ost復(fù)合物的組分及未合成的結(jié)構(gòu)以灰體示出。圖13描述了一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案Flc2,表達(dá)質(zhì)粒YEp352Flc2,的核苷酸序列(SEQ ID NO 31)。圖14描述了另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案Ln^tt3D和Flc2,共表達(dá)質(zhì)粒pAX306f的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)。圖15A顯示了酵母Flc2蛋白的截短譯本Flc2,(跨膜域1-4)的圖示。圖15B描述了 Arftl突變菌株的斑點(diǎn)分析,所述突變菌株或攜帶空載體(v. c.),或攜帶用于Flc2’ (oe Flc2*)或截短部分(TMD1-2,TMD1-3,TMD3-4)的超表達(dá)的載體、或Flc2,的單個(gè)跨膜域1, 3或4(TMD1,TMD3,TMD4)。帶有跨膜域3和4(TMD3_4)及跨膜域4(TMD4)的截短部分被露出以補(bǔ)足Rftl的缺失至與全長(zhǎng)Flc2’(=跨膜域1至4)相似的水平。圖15C描述了羧肽酶Y(CPY)在Arftl突變酵母菌株中的N-糖基化結(jié)果,所述突變菌株或攜帶空載體 (^),或攜帶質(zhì)粒,所述質(zhì)粒用于?1(2’的超表達(dá)(oe Flc2*)或僅包含F(xiàn)lc2’跨膜域 4(Flc2*-TMD4)的Flc2’的截短譯本的超表達(dá)。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶??缒び?(Flc2*-TMD4)的超表達(dá)能單獨(dú)補(bǔ)足Δrftl突變酵母菌株中的糖基化缺陷。圖16A描述了羧肽酶Y(CPY)在Δ rftl突變酵母菌株中的N-糖基化結(jié)果,所述突變菌株或攜帶空載體(v. c.),或攜帶用于Rftl(oe Rftl),F(xiàn)lc2’ (oe Flc2*)或內(nèi)源性Flc2(oe Flc2)的超表達(dá)的質(zhì)粒。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶。Flc2的超表達(dá)不能補(bǔ)足Rftl缺失時(shí)被觀察到的低糖基化表型。圖16B描述了攜帶空載體(v. c.)、用于 Rftl(oe Rftl),F(xiàn)lc2*(oe Flc2*)或 Flc2 的超表達(dá)的質(zhì)粒的 Arftl 細(xì)胞的生長(zhǎng)分析。該生長(zhǎng)分析證實(shí)了 Flc2*能補(bǔ)足Rftl缺陷,及全長(zhǎng)Flc2不能補(bǔ)足Rftl缺陷。圖17ABC顯示了 [3H]-甘露糖標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖的HPLC圖,該脂質(zhì)連接寡糖是從攜帶空載體(v.c.)(圖17A)的Aalgll突變菌株(YG1365)、攜帶用于Rftl (oe Rftl) (圖17B)或Flc2,(oe Flc2*)(圖17C)的超表達(dá)的質(zhì)粒的Aalgll突變菌株(YG1365)中分離的。檢測(cè)到的脂質(zhì)連接寡糖物種為Man2GlcNac2 (Man2, M2),Man3GlcNac2 (Man3, M3), Man5GlcNac2 (Man5, M5),Man6GlcNac2 (Man6, M6),及 Man7GlcNac2 (Man7, M7)。M2 及 M3 寡糖定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)面(cytopl.),M5至M7寡糖定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的腔面(lumenal)。 細(xì)胞質(zhì)的脂質(zhì)連接寡糖物種之于內(nèi)腔的脂質(zhì)連接寡糖物種的相對(duì)量可用于表示被表達(dá)蛋白質(zhì)的翻轉(zhuǎn)酶活性物。圖18A描述了攜帶空載體(v. c.)、攜帶用于Rftl (oe Rftl)或Flc2,(oe Flc2*)的超表達(dá)的質(zhì)粒的Aalgll Δ alg3突變酵母菌株的生長(zhǎng)分析。圖18B描述了各自細(xì)胞的斑點(diǎn)分析。所述生長(zhǎng)分析及斑點(diǎn)分析顯示出Flc2’或Rftl的超表達(dá)能夠改善AalgllAalg3突變酵母菌株的生長(zhǎng)。圖18C描述了羧肽酶Y(CPY)在Aalgll Aalg3突變酵母菌株中的N-糖基化結(jié)果,所述突變菌株或攜帶空載體(v. c.),或攜帶用于Rftl(oe Rftl)或Flc2’ (oe Flc2*)的超表達(dá)的質(zhì)粒。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶。Rftl 或Flc2,的超表達(dá)改善了 CPY的N-糖基化。圖19A 描述了攜帶空載體(v. c.)、攜帶用于 Rftl (oe Rftl)或 Flc2,(oe Flc2*) 的超表達(dá)的質(zhì)粒的Aalgll突變酵母菌株的生長(zhǎng)分析。圖19B描述了各細(xì)胞的斑點(diǎn)分析。 所述生長(zhǎng)分析及斑點(diǎn)分析顯示出Flc2’或Rftl的超表達(dá)能夠改善Aalgll突變酵母菌株的生長(zhǎng)。圖19C描述了羧肽酶Y(CPY)在Aalgll突變酵母菌株中的N-糖基化結(jié)果,所述突變菌株或攜帶空載體(v. c.),或攜帶用于Rftl(oe Rftl)或Flc2,(oe Flc2*)的超表達(dá)的質(zhì)粒。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶。Rftl或Flc2’的超表達(dá)改善了 CPY的N-糖基化。圖20A顯示了具有溫度敏感性Alg2蛋白的alg2_l菌株中的脂質(zhì)連接寡糖合成的圖示。Alg2催化甘露糖向ManlGlcNAc2(Ml)結(jié)構(gòu)的兩步連續(xù)添加而產(chǎn)生Man2GlcNAc2 (M2) 及Man3GlCNAC2(M;3)。該突變降低Alg2活性,所述Alg2反過(guò)來(lái)減少大于Ml的脂質(zhì)連接寡糖種類的合成。但是,Alg2的剩余活性足以維持常規(guī)的脂質(zhì)連接寡糖合成,從而導(dǎo)致Glc3Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。Ml和M2結(jié)構(gòu)的翻轉(zhuǎn)與由Alg2催化的延伸反應(yīng)互相競(jìng)爭(zhēng)。如果Ml和M2結(jié)構(gòu)被翻轉(zhuǎn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),這些結(jié)構(gòu)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中將不作為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的底物,并且不被進(jìn)一步延長(zhǎng)。最終,來(lái)源于不同脂質(zhì)連接寡糖供體的寡糖被轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的N-糖基化共有序列的Asn殘基上。圖20B顯示了 MALDI-T0F質(zhì)譜的圖示,具有預(yù)期的峰ManlGlcNAc2(Ml),Man2GlcNAc2 (M2)和高甘露糖結(jié)構(gòu)Man8GlcNAc2至 Manl2GlcNAc2(M8-M12)0根據(jù)NLO種類的峰強(qiáng)度,可以計(jì)算出每個(gè)結(jié)構(gòu)的相對(duì)豐度。Ml類的相對(duì)增加表明Ml的翻轉(zhuǎn)在由Alg2催化的ManlGlCNAC2 (Ml)的延伸反應(yīng)中占優(yōu)勢(shì)地位。圖2IA描述了羧肽酶Y(CPY)在Δ algll突變酵母細(xì)胞中的N-糖基化結(jié)果,所述突變細(xì)胞攜帶用于Flc2’(oe Flc2*)或原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶POT (oe POT)及由Flc2’和 POT組成的組合(oe Flc2* & POT)的超表達(dá)的載體。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY) 及低糖基化形式的帶。圖21B顯示了羧肽酶Y(CPY)在Aalgll Aalg3突變酵母細(xì)胞中的 N-糖基化結(jié)果,所述突變細(xì)胞攜帶用于Flc2,(oe Flc2*)、P0T(oe POT)及由Flc2,和POT 組成的組合(oe Flc2* & POT)的超表達(dá)的載體。指出了代表CPY的全部糖基化(mCPY)及低糖基化形式的帶。POT和Flc2’的共表達(dá)在Aalgll及Δ algll Δ alg3這兩種酵母菌株中均抑制低糖基化表型向更高程度變化。圖22AB描述了從來(lái)源于Aalg3Aalgll酵母突變菌株(圖22A)及 Aalgll Δ alg3 Amrml酵母突變菌株(圖22B)的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)中分離的2-AB-標(biāo)記N-多糖的MALDI-T0F MS譜。每個(gè)N-多糖峰在各自峰上面進(jìn)行了注釋,代表Man3GlcNAc2(M3)至 Man6GlcNAc2(M6)0除甘露糖之外,每個(gè)指明的結(jié)構(gòu)包含2個(gè)附加的Gn殘基。在m/z 1053 處的峰代表M3,在m/z 1215處的峰代表M4,在m/z 1377處的峰代表M5,在m/z 1539處的峰代表M6。所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的Man3GlCNAC2 LLO結(jié)構(gòu)在高爾基體區(qū)室中被進(jìn)一步延伸成 Man4GlcNAc2、Man5GlcNAc2及非常少量的Man6GlcNAc2。正如Man5峰大幅降低所顯示的, mnnl的缺失部分地破壞了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)在高爾基體區(qū)室中的加工。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明主要涉及具有被修飾的脂質(zhì)連接寡糖的宿主細(xì)胞,其可以通過(guò)一組糖基轉(zhuǎn)移酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)體及甘露糖苷酶的異源表達(dá)被進(jìn)一步修飾,而成為制造哺乳動(dòng)物例如人的治療糖蛋白的宿主株。所述方法提供了一種基因工程的宿主細(xì)胞,其能被用于表達(dá)及靶向參與糖基化的任何所需基因。創(chuàng)造或挑選出具有被修飾的脂質(zhì)連接寡糖的宿主細(xì)胞。在所述基因工程宿主細(xì)胞中形成的N-多糖具有ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2,和/或Man3GlcNAc2 核心結(jié)構(gòu),然后所述核心結(jié)構(gòu)可以通過(guò)一種或多種酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)體及甘露糖苷酶的異源表達(dá)被進(jìn)一步修飾,來(lái)制造類人糖蛋白。對(duì)于治療用蛋白的制造,該方法可以適用于以基因工程形成細(xì)胞系,在所述細(xì)胞系中可以獲得任何期望的糖基化結(jié)構(gòu)。除非另有定義,本發(fā)明中所使用的科技術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍理解的含義。此外,除非上下文另有要求,單數(shù)詞應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù),且復(fù)數(shù)詞應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。本發(fā)明所述的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō),本發(fā)明所使用的命名法及所述的生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)和雜交中的技術(shù)均為本領(lǐng)域公知和常用的。除非另有指明,本發(fā)明所述的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的及本說(shuō)明書(shū)中引用和討論的各種概括的和具體的參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn),例如,Sambrook等的《Molecular Cloning :A Laboratory Manual》 (第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約州冷泉港(1989)) ;Ausubel 等的 ((Current Protocols in Molecular Biology)) (Greene Publishing Associates (1992年及 2002年的添力口本));《Harlow and Lane Antibodies :A Laboratory Manual》(Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約州冷泉港(1990));《Introduction to Glycobiology》 (Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003));《Worthington Enzyme Manual》 (Worthington Biochemical Corp.,新澤西州弗里霍爾德);《Handbook of Biochemistry :Section A Proteins》(第 I 卷,1976 年,CRC Press);《Handbook ofBiochemistry :Section A Proteins》(第 II 卷,1976 年,CRC Press);《Essentials of Glycobiology》(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999))。)(寸中MM 的I名法及所述的生物化學(xué)與分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和技術(shù),均為本領(lǐng)域公知和常用的。提供新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶在本發(fā)明正文中,“脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物”或“翻轉(zhuǎn)酶”被定義為將脂質(zhì)連接寡糖(LLO)尤其是多萜醇連接寡糖從胞質(zhì)面穿過(guò)膜向細(xì)胞器腔面移位的功能,所述脂質(zhì)連接寡糖被結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器的膜上,主要是被結(jié)合在該膜的胞質(zhì)面。具體而言,所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。該脂質(zhì)連接寡糖的移位過(guò)程的特征在于“翻轉(zhuǎn)”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述翻轉(zhuǎn)酶活性物以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為靶點(diǎn)。不希望受理論的束縛,術(shù)語(yǔ)“翻轉(zhuǎn)酶”和 “翻轉(zhuǎn)”還指用于支持另一種潛在翻轉(zhuǎn)酶蛋白以產(chǎn)生翻轉(zhuǎn)酶活性的支持作用。已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn),所述新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶是可以分離并在細(xì)胞的糖基化級(jí)聯(lián)中具有功能的,并且它們能夠補(bǔ)償內(nèi)源性脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物例如Rftl型活性物的減少或缺乏。此外,還驚奇地發(fā)現(xiàn),本發(fā)明所述的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物能夠在改變的糖基化級(jí)聯(lián)中起作用。所述改變包括產(chǎn)生具有較少量寡糖的脂質(zhì)連接寡糖,例如, 包含少于5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖,并將其跨過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜翻轉(zhuǎn)。在野生型細(xì)胞中制造或翻轉(zhuǎn)這樣的脂質(zhì)連接寡糖結(jié)構(gòu)通常是不占優(yōu)勢(shì)的。已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn),所述新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶在跨過(guò)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器膜翻轉(zhuǎn)包含少于5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖尤其是 ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2, Man3GlcNAc2,或 Man4GlcNAc2 的脂質(zhì)連接寡糖方面具有高效的活性。所述新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶在翻轉(zhuǎn)包含Man5GlCNAC2的脂質(zhì)連接寡糖中顯示出高活性,在翻轉(zhuǎn)包含Man4GlCNAC2的脂質(zhì)連接寡糖中顯示出高活性,在翻轉(zhuǎn)包含 Man3GlcNAc2的脂質(zhì)連接寡糖中顯示出高活性,在翻轉(zhuǎn)包含Man3GlCNAC2的脂質(zhì)連接寡糖中仍顯示出高活性,在翻轉(zhuǎn)包含Man2GlCNAC2的脂質(zhì)連接寡糖中顯示出高活性,并且在翻轉(zhuǎn)包含ManlGlcNAd的脂質(zhì)連接寡糖中仍顯示出高活性。發(fā)現(xiàn)所述新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶對(duì)于要被翻轉(zhuǎn)的寡糖基結(jié)構(gòu)顯示出松弛的特異性。不希望受理論的束縛,本文所用的術(shù)語(yǔ)“活性”,特別是對(duì)于脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶而言,涉及具體對(duì)要被轉(zhuǎn)運(yùn)或合成的特定化合物或分子進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)移或合成的比率。對(duì)于分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),通過(guò)估算要被轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)生物屏障,尤其是被翻轉(zhuǎn)通過(guò)或透過(guò)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器膜的具體分子或結(jié)構(gòu)的凈通量來(lái)估算以轉(zhuǎn)運(yùn)率表示的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。所述凈通量具體通過(guò)流入率和流出率來(lái)計(jì)算。據(jù)發(fā)現(xiàn),所述凈通量在很大程度上可以取決于被轉(zhuǎn)運(yùn)分子的分子結(jié)構(gòu)。凈通量及相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性對(duì)于每個(gè)被轉(zhuǎn)運(yùn)或翻轉(zhuǎn)的單獨(dú)結(jié)構(gòu)可以是特定的。不希望受理論的束縛,可以通過(guò)確定混入存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)面的脂質(zhì)連接寡糖的帶標(biāo)記甘露糖的數(shù)量,并以該數(shù)量除以混入脂質(zhì)連接寡糖的帶標(biāo)記甘露糖(優(yōu)選[3H]-甘露糖)的總數(shù)來(lái)計(jì)算所述翻轉(zhuǎn)酶活性??商娲兀鲋|(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性可以使用“人工”囊泡來(lái)確定。例如,Rftl型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶對(duì)具有Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性很高,但發(fā)現(xiàn)其對(duì)于具有ManlGlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性即使有的話也很低。因此,Rftl型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶對(duì)翻轉(zhuǎn)Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)顯示出很高的特異性。相反,本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶對(duì)具有ManlGlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性很高,并且對(duì)具有Man2GlCNAC2或Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性也很高。本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶顯示出對(duì)特定多糖結(jié)構(gòu)特異性較低,因此顯示出松弛的或低特異性的翻轉(zhuǎn)酶活性??梢酝ㄟ^(guò)采用附加的實(shí)施例中詳細(xì)描述的高拷貝抑制基因篩選(HCSS)方式分離出(在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中,是從酵母細(xì)胞中分離出)編碼本發(fā)明所述的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的基因或“人工”基因。簡(jiǎn)而言之,在高拷貝抑制基因篩選中可以使用其內(nèi)源性脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶已被失活的細(xì)胞,例如,攜帶rftl基因缺失的酵母細(xì)胞。然后,所述細(xì)胞可以用基因組DNA文庫(kù),例如基因組酵母DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化,從高拷貝質(zhì)粒例如也攜帶可選擇的標(biāo)記的 Yep352中被表達(dá)。在糖基化級(jí)聯(lián)中有缺陷的細(xì)胞將產(chǎn)生低糖基化蛋白,并且溫度和滲透敏感性較高。因此,檢測(cè)高拷貝抑制基因篩選中獲得的選定細(xì)胞在不存在滲透穩(wěn)定劑例如山梨醇時(shí)的生長(zhǎng)能力。然后進(jìn)一步分析陽(yáng)性菌落的溫度敏感性及使所表達(dá)的蛋白糖基化的能力。本發(fā)明還涉及一種或多種分離的核酸,該核酸編碼具有新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶多肽的;包括所述分離的核酸的載體及包含所述載體的細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種“人工”的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,其為flc2’的轉(zhuǎn)錄物。所述“人工”基因flc2’來(lái)源于flc2基因(同義名YAL053W ; 定位于酵母1號(hào)染色體上;堿基45900-48251)。所述Flc2轉(zhuǎn)錄物是推定的FAD轉(zhuǎn)運(yùn)體,其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜并且具有使FAD進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的功能。內(nèi)源性Flc2蛋白質(zhì)不作為翻轉(zhuǎn)酶起作用并且不轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)連接寡糖。所述“人工”基因flc2’主要是flc2的3’端的截短譯本。flc2’的全部序列列于SEQ ID NO :1(圖5A)中,并代表酵母1號(hào)染色體,堿基45900-47222。所述flc2,的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生由452個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),其包含4個(gè)完整的跨膜域和1個(gè)截去五分之一的跨膜域(SEQ ID NO 2;圖5B)。C末端的從氨基酸442至452的11個(gè)氨基酸從克隆過(guò)程中產(chǎn)生。意想不到的是,F(xiàn)lc2’即Flc2的N末端片段,能夠在Δ rftl突變菌株中補(bǔ)償缺乏的翻轉(zhuǎn)酶活性,盡管全長(zhǎng)Flc2本身根本不顯示翻轉(zhuǎn)酶活性。更特別的是,據(jù)發(fā)現(xiàn),所述Flc2’ 翻轉(zhuǎn)酶對(duì)Manl結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很大的親和力,并以高比例(速率)翻轉(zhuǎn)所述Manl結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的數(shù)個(gè)“人工”基因或基因構(gòu)造。這些“人工”基因或基因構(gòu)造全部來(lái)源于flc2基因。具體地說(shuō),提供了“人工” flc2’的片段及這些片段的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)造物。本發(fā)明不限于這些序列。本發(fā)明特別地涉及顯示出本文所表征和描述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶型功能的“人工”基因或基因構(gòu)造。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn),定位于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器膜的并且翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)連接寡糖進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)腔的“人工”跨膜蛋白能被翻譯或是可獲得的。這些蛋白顯示出所述新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性,其主要特征在于對(duì)本文所述的脂質(zhì)連接寡糖的多糖結(jié)構(gòu)具有松弛特異性。 經(jīng)過(guò)本文所提出的開(kāi)創(chuàng)性“原理證明”之后,主要是以來(lái)源于f lc2的“人工”基因或基因構(gòu)造的形式,本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)簡(jiǎn)單地繼續(xù)采取如下所述的篩選方法,可以很容易地提供編碼脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶類似功能的“人工”基因或基因構(gòu)造??商娲鼗蚋郊拥?,本發(fā)明提供了基于并且尤其包括rftl基因或多核苷酸的基因構(gòu)造,所述多核苷酸編碼Rftl或Rftl型活性物以在細(xì)胞中產(chǎn)生脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性,尤其是在通過(guò)超表達(dá)rftl的方式Rftl以高濃度存在的經(jīng)過(guò)基因修飾的細(xì)胞中;本發(fā)明還提供了制造所述細(xì)胞的手段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性體現(xiàn)在一種或多種蛋白或
25類蛋白結(jié)構(gòu)上,例如多單元轉(zhuǎn)運(yùn)體上。根據(jù)本發(fā)明,提供了一種分離的或“基本上純的”核酸分子或其功能性類似物,其能夠編碼或提供如上文所述的翻轉(zhuǎn)酶活性物。在優(yōu)選實(shí)施方案中,所述核酸分子選自如下所述的核酸分子中的一種或多種。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸分子”是指在長(zhǎng)度上至少有10個(gè)堿基的核苷酸的聚合物形式。所述術(shù)語(yǔ)包括DNA分子(例如,cDNA或基因組DNA或合成DNA)和RNA分子(例如, mRNA或合成RNA),以及含有非天然核苷酸類似物、非原有核苷酸間的鍵或同時(shí)含有兩者的 DNA或RNA的類似物。所述核酸可以處于任何一種拓?fù)錁?gòu)象。例如,核酸可以是單鏈的、雙鏈的、三鏈的、四鏈的、部分雙鏈的、分支的、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的、環(huán)狀的或是處于掛鎖構(gòu)象。所述術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA。分離的或“基本上純的”核酸或多核苷酸(例如,RNA,DAN或混合聚合體)是一種基本上與在其天然宿主細(xì)胞中自然伴隨原有多核苷酸存在的其他細(xì)胞成分例如,核糖體、 聚合酶,及其自然結(jié)合的基因組序列分離開(kāi)的核酸或多核苷酸。所述術(shù)語(yǔ)包含(1)已從其天然存在環(huán)境中脫離的核酸或多核苷酸,( 不與多核苷酸的全部或一部分結(jié)合的核酸或多核苷酸,其中,所述“分離的多核苷酸”是在自然界中發(fā)現(xiàn)的,⑶可操作地連接至在自然狀態(tài)下未連接的多核苷酸的核酸或多核苷酸,或(4)在自然狀態(tài)下不存在的核酸或多核苷酸。所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”也可以指重組或克隆DNA分離體、化學(xué)合成的多核苷酸類似物或利用異源系統(tǒng)生物合成的多核苷酸類似物。但是,“分離的”不一定要求所述核酸或多核苷酸實(shí)體上從其原來(lái)環(huán)境中脫離。例如,生物體基因組中的以下內(nèi)源性核酸序列被視為 “分離的”如果異源序列(即,與該內(nèi)源性核酸序列不是自然相鄰的序列)被置于鄰近所述內(nèi)源性核酸序列的位置而導(dǎo)致該內(nèi)源性核酸序列的表達(dá)改變。舉例來(lái)說(shuō),非原有啟動(dòng)子序列可以被替換(例如,通過(guò)同源重組)成為人細(xì)胞基因組中基因的原有啟動(dòng)子,從而導(dǎo)致該基因具有被修改的表達(dá)模式。因?yàn)樗龌蚩梢耘c天然位于其側(cè)面的至少一些序列中分開(kāi),因而成為“分離的”。如果核酸包含任何對(duì)基因組中的相應(yīng)核酸不自然發(fā)生的修飾,其也被認(rèn)為是“分離的”。例如,如果一種內(nèi)源性編碼序列包括插入序列、缺失序列或通過(guò)“人工方式”例如通過(guò)人為干預(yù)誘導(dǎo)的點(diǎn)突變,則該內(nèi)源性編碼序列被認(rèn)為是“分離的”?!胺蛛x的核酸”還包括在異源部位整合入宿主細(xì)胞染色體的核酸,以游離基因存在的核酸構(gòu)造。此外,“分離的核酸”可以基本上不含其他細(xì)胞材料,或當(dāng)采用重組技術(shù)制造時(shí)可以基本不含培養(yǎng)基,或當(dāng)采用化學(xué)合成時(shí)可以基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。本發(fā)明的一個(gè)主要方面涉及來(lái)源于flc2且編碼所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子。在此方面的優(yōu)選實(shí)施方案中,所述核酸分子至少攜帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的序列和一種或多種跨膜區(qū)的序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞中的所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物通過(guò)一種或多種核酸分子的表達(dá)來(lái)提供,所述核酸分子選自包含下述一種或多種序列的或者由下述一種或多種序列組成的核酸分子SEQ ID NO :1, SEQ ID N0:3,SEQ ID N0:5,SEQ ID N0:7,SEQ ID N0:9,SEQ ID NO :11, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO :15,及 SEQ ID NO :17 ;包含下述一種或多種序列的或者由下述一種或多種序列組成的編碼聚氨基酸的
26核酸分子SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:4,SEQ ID N0:6,SEQ ID N0:8,SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :14 ;SEQ ID NO 16 及 SEQ ID NO :18 ;包含下述一種或多種序列的或者由下述一種或多種序列組成的核酸分子SEQ ID NO :21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID N0:27,及 SEQ ID NO :29,特別地,當(dāng)被融合于編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的一種或多種核酸分子時(shí),優(yōu)選選自SEQ ID N0:19及編碼包含HDEL 基序和/或KKxx基序的聚氨基酸序列的核苷酸序列中的一種。包含下述一種或多種序列的或者由下述一種或多種序列組成的編碼聚氨基酸的核酸分子SEQ ID NO 22, SEQ ID NO :24,SEQ ID NO :26,SEQ ID NO :28,和 SEQ ID NO 30,特別是還包含一種或多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的核酸分子,優(yōu)選選自SEQ ID N0:20及包含 HDEL基序和/或KKxx基序的聚氨基酸序列中的一種;及上述核酸分子的提供本發(fā)明脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性的片段、變體、類似物或衍生物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“片段”是指多核苷酸的一個(gè)節(jié)段。片段可具有末端(5'-或 3'-端)和/或內(nèi)部缺失。一般來(lái)說(shuō),多核苷酸的片段在長(zhǎng)度上具有至少4個(gè)核苷酸,具體而言,至少5個(gè),至少6個(gè),至少7個(gè),至少8個(gè),至少9個(gè),至少10個(gè),至少12個(gè),至少15 個(gè),至少18個(gè),至少25個(gè),至少30個(gè),至少35個(gè),至少40個(gè),至少50個(gè),至少60個(gè),至少 65個(gè),至少70個(gè),至少75個(gè),至少80個(gè),至少85個(gè),至少90個(gè),至少100個(gè)或更多個(gè)核苷酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“缺失”是指核苷酸序列的以下變體所述變體中,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20個(gè)多核苷酸段(由兩個(gè)或多個(gè)核苷酸組成
的多核苷酸段)從該核苷酸序列中失去或被除去。本文所用的術(shù)語(yǔ)“添加”是指核苷酸序列的以下變體所述變體中,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20個(gè)多核苷酸段(由兩個(gè)或多個(gè)核苷酸組成的多核苷酸段)被加入或融合至該核苷酸序列內(nèi)。添加變體也包括融合分子。應(yīng)當(dāng)理解的是,在上述修飾的優(yōu)選變體尤其是通過(guò)添加或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而進(jìn)行修飾的優(yōu)選變體中,通過(guò)添加或缺失3個(gè)或3的整數(shù)倍個(gè)核苷酸來(lái)避免移碼。本文所用的術(shù)語(yǔ)“類似物”或“相似物”主要是指結(jié)構(gòu)上與天然存在的RNA及DNA 類似(相似)的化合物。核酸是核苷酸的鏈狀物,由以下三部分組成磷酸主鏈、折疊形戊糖(核糖或脫氧核糖)及四種核酸堿基之一。類似物可以具有這些改變中的任意一種,其中,典型地,核酸堿基類似物提供不同的堿基配對(duì)和堿基堆積性質(zhì),例如能與全部四種標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)的通用堿基,而磷酸糖主鏈類似物影響鏈的性質(zhì),例如PNA (Petersson B et al., Crystal structure of a partly self—complementary peptide nucleic acid(PNA) oligomer showing a duplex-triplex network. J Am Chem Soc.2005 Feb 9 ; 127 (5) 14M-30),其二級(jí)結(jié)構(gòu)與DNA顯著不同,并且可以形成三重結(jié)構(gòu)(三鏈螺旋)。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為一種或多種分離的核酸分子,選自(a)具有如上特征的核酸分子和(b)在高嚴(yán)格條件下雜交成(a)核酸分子的補(bǔ)體的核酸分子。高嚴(yán)格條件通常被定義為等同于在45°C于6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交,隨后于65°C在0. 2XSSC、0. 1% SDS中清洗。所述實(shí)施方案的優(yōu)選變型為分離的核酸分子,其包含與本文所述的任一核酸序列至少有80%相同的序列或由所述序列組成。“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)”是指一種肽序列,其引導(dǎo)具有該肽序列的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至并被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列通常見(jiàn)于駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并起作用的蛋白質(zhì)中。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位或“保留”信號(hào)是可以獲得的,例如,S. cerevisiae內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白 MNSl 的最初 21 個(gè)氨基酸殘基(Martinet et al. Biotechnology Letters 20: 1171-1177,1998)。本發(fā)明使用的優(yōu)選內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)為肽HDEL(SEQ ID NO :31)。所述發(fā)現(xiàn)于許多酵母蛋白的C-末端的HDEL肽序列,作為保留/回收信號(hào)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Pelham EMBO J.7 :913-918,1988)。具有HDEL序列的蛋白質(zhì)被膜結(jié)合受體(Erd2p)結(jié)合,然后進(jìn)入逆向轉(zhuǎn)運(yùn)途徑從高爾基體返回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)??商娲兀琄Kxx序列可以提供內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位(Jackson J. Cell Biol. 121 :317)。該基序存在于若干內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白上。所述序列可以存在于所述蛋白的N末端或者C末端,并且從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后區(qū)室中被回收。本發(fā)明的主要方面是提供適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(見(jiàn)下文)的修飾或基因工程的方法和手段,并在所述細(xì)胞中提供改變的和更合適的N-糖基化。因此,本發(fā)明還提供一種表達(dá)盒或其功能性類似物,用于在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)如上所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,其包含任一種如上所述的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝。所述載體中的核酸序列可以被操作性地連接到表達(dá)調(diào)控序列上。優(yōu)選地,所述核酸分子的一種或多種與編碼啟動(dòng)子的核酸分子和編碼終止子的核酸分子中的至少一種結(jié)合存在。本文所用的“啟動(dòng)子”是指一種能使基因被轉(zhuǎn)錄的DNA序列。所述啟動(dòng)子被RNA 聚合酶識(shí)別,然后開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子包含被RNA聚合酶直接結(jié)合的DNA序列或者參與募集 RNA聚合酶的DNA序列。啟動(dòng)子序列還可以包含“增強(qiáng)子區(qū)”,所述“增強(qiáng)子區(qū)”為一個(gè)或多個(gè)DNA區(qū)域,可以在基因簇中與蛋白質(zhì)(即,反式作用因子,更類似于一組轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合來(lái)增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄水平(因此得名)。典型地,當(dāng)位于編碼區(qū)的5'端時(shí),增強(qiáng)子還可以是與啟動(dòng)子序列分離的,并且可以是例如基因的固有區(qū)域或該基因的3'端至編碼區(qū)。根據(jù)本發(fā)明,所述啟動(dòng)子優(yōu)選為基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述基因位于高拷貝數(shù)質(zhì)粒上,優(yōu)選為引起超表達(dá)的高拷貝數(shù)質(zhì)粒上。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述基因位于低拷貝數(shù)質(zhì)粒上。所述啟動(dòng)子可以為異源啟動(dòng)子。在一個(gè)具體的變型中,所述啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體的變型中,所述啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明所述的一種具體的啟動(dòng)子可進(jìn)行所述核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝的超表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中,與從內(nèi)源性啟動(dòng)子的表達(dá)相比,所述分子被超表達(dá)2倍,更優(yōu)選為5倍、10 倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍,最優(yōu)選為2000或更多倍。例如,當(dāng)宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)時(shí),適合的啟動(dòng)子包括但不限于,aoxl、a0X2、daS、 gap、pex8> yptl、 fldl R p40 ;當(dāng) 酉良(Saccharomyces cerevisiae) 0^, 適合的啟動(dòng)子包括但不限于,gall、交配因子a、cyc-1、pgkl、adh2、adh、tef、gpd、met25、 galL、galS、ctrU ctr3及cupl ;當(dāng)宿主細(xì)胞例如是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí),適合的啟動(dòng)子包括但不限于,CMV、SV40、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、rps21、勞氏肉瘤病毒基因組大基因組長(zhǎng)端重復(fù)序列 (RSV)、金屬硫蛋白、胸苷激酶或干擾素基因啟動(dòng)子?!敖K止子”或3'末端序列是結(jié)構(gòu)基因的終止密碼子,其功能為穩(wěn)定基因的mRNA
28轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,在所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上例如誘發(fā)聚腺苷酸化的序列等可被操作性地連接??梢詮?Pichia或其他甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母或其他酵母或高級(jí)真菌或其他真核生物中獲得3'末端序列??捎糜诒景l(fā)明實(shí)際應(yīng)用的Pichia pastoris 3'末端序列的實(shí)例包括選自aoxl基因、 p40基因、his4基因和fldl基因的末端序列。根據(jù)本發(fā)明,還提供了一種用于真核宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體,包含任一種如上所述的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝或如上所述的表達(dá)盒的一個(gè)或多個(gè)拷貝。本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”意指能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一種核酸的核酸分子。載體的一種類型為質(zhì)粒,其是指附加的DNA片段可以接入其內(nèi)部的一種環(huán)狀雙鏈DNA。其他載體包括粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)及酵母人工染色體(YAC)。載體的另一種類型為病毒載體, 其中,附加的DNA片段可以被接入病毒基因組(下文將詳細(xì)討論)。某些載體能在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如,具有在宿主細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的載體)。其他載體可以在被引入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組,從而隨著宿主細(xì)胞被復(fù)制。此外,特定的優(yōu)選載體能引導(dǎo)與其操作性連接的基因的表達(dá)。這種載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱為“表達(dá)載體”)。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的載體包括選擇性標(biāo)記基因。此類系統(tǒng)的實(shí)例包括可用于補(bǔ) his4 Pichia 1 ' Saccharomyces cerevisiae 5 Pichia pastoris his4 SI3, bJM 于補(bǔ)足 Pichia pastoris arg 突變菌株的 S. cerevisiae 或 Pichia pastoris arg4 基因, 或分別可用于補(bǔ)足Pichia pastoris ura3或adel突變菌株的Pichia pastoris ura3和 adel基因。其他作用于Pichia pastoris的選擇性標(biāo)記基因包括zee/基因、g418K基因、殺稻瘟菌素抗性基因及其類似基因。本發(fā)明所述的載體還包括自主復(fù)制序列(ARS)。所述載體還包括作用于細(xì)菌的選擇性標(biāo)記基因及負(fù)責(zé)在細(xì)菌中復(fù)制和染色體外保持的序列。在替代的實(shí)施方案中,營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記提供所述選擇。細(xì)菌選擇性標(biāo)記基因的實(shí)例包括氨芐西林抗性(amf)、四環(huán)素抗性 (tef)、新霉素抗性、潮霉素抗性及博來(lái)霉素抗性(zeoK)基因。本發(fā)明還提供了用于直接基因整合的各種手段。本發(fā)明所述的編碼在細(xì)胞中被表達(dá)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列,可以被置于整合載體或者置于復(fù)制型載體(例如復(fù)制型環(huán)狀質(zhì)粒)中。通常,整合載體包括至少第一插入DNA片段、選擇性標(biāo)記基因和第二插入DNA片段的連續(xù)排布序列。所述第一和第二插入DNA片段每個(gè)在長(zhǎng)度上各為大約200個(gè)核苷酸,并且具有與被轉(zhuǎn)化物種的部分基因組DNA同源的核苷酸序列。在所述載體的第一和第二插入 DNA片段之間而不限于所述標(biāo)記基因之前或之后,插入有包含表達(dá)所涉及的結(jié)構(gòu)基因的核酸序列。整合載體能在酵母轉(zhuǎn)化之前被線性化,以促進(jìn)有關(guān)的核酸序列向宿主細(xì)胞基因組的整合。本發(fā)明還提供了一種聚氨基酸分子,具體地說(shuō),提供了一種或多種蛋白質(zhì),其能翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)連接的、截短的或完整的前體寡糖(LLO),特別是ManlGlcNAC2,Man2GlCNAC2和/或 Man3GlCNAC2。術(shù)語(yǔ)“聚氨基酸分子” “多肽” “蛋白質(zhì)”可替換使用,并且不考慮其長(zhǎng)度或是否翻譯后修飾,均意味著氨基酸的任何肽連接鏈。在本發(fā)明的一個(gè)具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域 4(TM4)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在本發(fā)明一個(gè)具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域3-4(TM3-4)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。所述分子可以包含編碼Flc2’的跨膜域I(TMl)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。所述分子還可以包含編碼Flc2’的跨膜域2(TM;3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在一個(gè)具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域1-2(ΤΜ1-2)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中, 所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域2-4(TM2-4)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。所述分子可以包含編碼Flc2’的跨膜域3(TM3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域1-3(ΤΜ1-3) 的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述分子包含編碼 Flc2'的跨膜域2-3(TM2-3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在一個(gè)主要方面,所述聚氨基酸為上述來(lái)源于flc2’并包括flc2,的“人工”構(gòu)造中的一種或多種“人工”構(gòu)造的轉(zhuǎn)錄物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述轉(zhuǎn)錄物包含下述一種或多種序列或由下述一種或多種序列組成SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4,SEQ ID NO :6,SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :12,SEQ ID NO 14 ;SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO :18。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述轉(zhuǎn)錄物包含下述一種或多種序列或由下述一種或多種序列組成SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO :28 JPSEQ ID NO: 30,其被融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào),優(yōu)選地,選自SEQ ID NO 20及包含HDEL基序和KKxx基序的聚氨基酸序列中的一種。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述聚氨基酸分子為上述轉(zhuǎn)錄物中的一種或多種轉(zhuǎn)錄物的片段、類似物及衍生物。本文所用的轉(zhuǎn)錄物的“片段”、“類似物”及“衍生物”是指具有生物活性的變體,其可以包含添加、缺失或置換。優(yōu)選地,帶有置換的變體具有不多于50個(gè)的保守氨基酸置換,具體而言,不多于 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,15,20,25,30,35,40 或 45 個(gè)保守氨基酸置換?!氨J刂脫Q”應(yīng)
理解為一種氨基酸置換為具有相似特征的另一種氨基酸。保守置換包括在下述組內(nèi)的置換纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸;亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸;賴氨酸和精氨酸;及,苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸。 極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。相反的,非保守置換是一種氨基酸置換為具有相似特征的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的聚氨基酸分子顯示出或提供了本文中所述的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性。具體地說(shuō),其特征在于能翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)連接的、截短的或完整的前體寡糖(LLO),尤其是 ManlGlcNAc2, Man2GlcNAc2 和 / 或 Man3GlcNAc2。不希望受理論的束縛,可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)測(cè)定脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶或其片段、變體、類似物或衍生物的活性或特異性。不希望受理論的束縛,一種估算本發(fā)明所述的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性的優(yōu)選方法可以包括下述步驟生長(zhǎng)和培養(yǎng)正在表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞,所述蛋白質(zhì)為推定的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶;在特定溫度下暴露所述細(xì)胞于標(biāo)記的甘露糖底物中一定時(shí)間,所述甘露糖底物具體為放射性標(biāo)記的[3H]_甘露糖(標(biāo)記);及分離甘露糖標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖;及分析[3H]_甘露糖標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖中的寡糖含量??梢园凑毡景l(fā)明實(shí)施例中詳細(xì)描述的方法分離[3H]_標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖??梢圆捎眠m當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法例如質(zhì)譜法(例如,MALDI-TOF-MQ或高效液相色譜法(HPLC)來(lái)分析[3H]-甘露糖標(biāo)記的脂質(zhì)連接寡糖中的寡糖含量。然后,可以通過(guò)確定混入存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)面的脂質(zhì)連接寡糖的[3H]-甘露糖的數(shù)量,并將所述數(shù)量除以混入脂質(zhì)連接寡糖的 [3H]-甘露糖的總數(shù)來(lái)計(jì)算所述翻轉(zhuǎn)酶活性。不能翻轉(zhuǎn)具有特定多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖的細(xì)胞將積聚胞質(zhì)脂質(zhì)連接寡糖。例如,當(dāng)具有Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖被翻轉(zhuǎn)并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中被甘露糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步修飾時(shí),可檢測(cè)到本發(fā)明所述的推定的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶。在野生型細(xì)胞中,具有Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖是脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶例如Rftl翻轉(zhuǎn)酶的底物。表達(dá)功能性翻轉(zhuǎn)酶的野生型細(xì)胞會(huì)主要產(chǎn)生腔脂質(zhì)連接寡糖, 其被進(jìn)一步加工為具有GlC3Man9GlCNAC2結(jié)構(gòu)的最終脂質(zhì)連接寡糖。然而,缺失脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶或具有脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶缺陷的細(xì)胞,例如rftl敲除細(xì)胞會(huì)主要產(chǎn)生存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)面并且可測(cè)量的具有Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,表明阻礙所述脂質(zhì)連接寡糖移位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔,換言之,阻礙所述脂質(zhì)連接寡糖進(jìn)一步加工形成最終的具有 Glc3Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔脂質(zhì)連接寡糖??商娲兀梢允褂谩叭斯ぁ蹦遗輥?lái)確定所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的活性或特異性??梢酝ㄟ^(guò)從細(xì)胞中提取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜來(lái)生成此類囊泡。從這種被耗竭的膜中重組內(nèi)源性脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶例如Rftl,并用新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶組裝所述囊泡以允許確定所述新蛋白質(zhì)的翻轉(zhuǎn)酶活性。添加[3H]-甘露糖進(jìn)行標(biāo)記,胞質(zhì)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性使所述 [3H]-甘露糖合并入胞質(zhì)面的脂質(zhì)連接寡糖。然后,所述脂質(zhì)連接寡糖可借助一種活性脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶翻轉(zhuǎn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。通過(guò)用一種Endo H酶處理所述囊泡,修剪暴露于囊泡表面的脂質(zhì)連接寡糖,僅在多萜醇脂質(zhì)上留下末端GIcNAC殘基并且從而從囊泡表面去除放射性標(biāo)記。通過(guò)定量測(cè)定囊泡腔中出現(xiàn)在Endo H酶處理的[3H]-甘露糖及未經(jīng)Endo H 酶處理的囊泡中的放射性活度,能夠計(jì)算翻轉(zhuǎn)數(shù)量;其中,所測(cè)得的放射性越小,脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶對(duì)特定脂質(zhì)連接寡糖的活性或特異性越小??梢酝ㄟ^(guò)使用至少一種細(xì)胞質(zhì)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏或具有缺陷的細(xì)胞來(lái)確定脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶對(duì)特定類型脂質(zhì)連接寡糖的特異性或活性,其根據(jù)寡糖結(jié)構(gòu)的不同而不同。例如,Alg2型活性具有缺陷的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有ManlGlcNAc2或Man2GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖;然而,Algll型活性和可選地,Alg3型活性缺乏或具有缺陷的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有 Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。此類突變細(xì)胞或其重組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜囊泡可以被用于測(cè)定和確定新分離的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的活性及特異性。本文中進(jìn)一步詳細(xì)描述的翻轉(zhuǎn)酶被測(cè)定具有翻轉(zhuǎn)酶活性,其對(duì)于翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)連接的低甘露糖寡糖,即具有Manl-3G1CNAC2結(jié)構(gòu)的寡糖具有很小的特異性,或基本無(wú)特異性,其中,所述 Manl-3GlcNAc2 結(jié)構(gòu)為 ManlGlcNAc2、Man2GlcNAc2 或 Man3GlcNAc2 結(jié)構(gòu)。相反,內(nèi)源性脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶尤其是Rftl,對(duì)具有Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖具有最高的翻轉(zhuǎn)酶活性或特異性,其次是對(duì)具有Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。更特別地,本發(fā)明所述的翻轉(zhuǎn)酶對(duì)脂質(zhì)連接寡糖顯示出相對(duì)于內(nèi)源性Rftl反向的特異性,對(duì)小的脂質(zhì)連接寡糖例如ManlGlCNAC2具有最高的特異性,對(duì)Man5GlCNAC2具有最低的特異性。合適的宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脂質(zhì)連接寡糖向新生蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移在包括酵母、真菌、植物、動(dòng)物和人類的所有真核生物中都是高度保守的。因此,如上文詳細(xì)描述的本發(fā)明的細(xì)胞在原則上可以是任意一種真核細(xì)胞,包括低級(jí)真核細(xì)胞、真菌細(xì)胞,還包括植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明所述的“宿主細(xì)胞”旨在涉及一種已經(jīng)導(dǎo)入重組載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是,該術(shù)語(yǔ)意為不僅是指特殊的主體細(xì)胞,還指這種細(xì)胞的子代。由于突變或環(huán)境影響,特定的修飾可能發(fā)生在隨后的幾代中,因此,雖然實(shí)際上這樣的子代可能與其親代細(xì)胞不相同,但是仍然包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì)胞可以為生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的分離的細(xì)胞或細(xì)胞系,或者可以為存在于活組織或生物體的細(xì)胞。用于制造異源糖蛋白的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”是指能導(dǎo)入/轉(zhuǎn)染或者導(dǎo)入/轉(zhuǎn)染核酸,例如編碼異源糖蛋白的核酸的細(xì)胞。這種細(xì)胞不僅包括用于載體或質(zhì)粒增殖的原核細(xì)胞,還包括真核細(xì)胞。 在優(yōu)選實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自并優(yōu)選為無(wú)限增殖化的,雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或人細(xì)胞的細(xì)胞系,骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選為大鼠骨髓瘤細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。在其更多優(yōu)選的變型中,所述細(xì)胞選自但不限于,CHO細(xì)胞尤其是CHO K-I和CHO DG44、BHK 細(xì)胞、NSO 細(xì)胞、SP2/0 細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞、ΗΕΚ293^ΝΑ 細(xì)胞、PER. C6 細(xì)胞、COS 細(xì)胞、3T3細(xì)胞、TO2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和Vero細(xì)胞。在優(yōu)選變型中,所述細(xì)胞選自DHFR缺陷 CHO 細(xì)胞,例如 dhfrXHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77,p. 4216-4220,1980)和 CHO K-I (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 60,p. 1275,1968)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為兩棲動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自但不限于,Xenopus Iaevis 卵母細(xì)胞(Nature, Vol. 291, p. 358-360,1981)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞。優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自但不限于,Sf9、Sf21 和 Tn5。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。優(yōu)選地,所述細(xì)胞選自但不限于,來(lái)源于煙草(Nicotiana tabacum)、水生植物浮萍(Lemna minor)或苔蘚 Physcomitrella patens (球蒴蘚)的細(xì)胞。這些細(xì)胞作為制造多肽的體系是公知的,并且還可以作為愈傷組織培養(yǎng)。在目前最優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為低級(jí)真核細(xì)胞。本發(fā)明所述的低級(jí)真核細(xì)胞包括但不限于,單細(xì)胞、多細(xì)胞和絲狀真菌,優(yōu)選選自=Pichia sp. Candida sp. Saccharomyces sp.、Saccharomycodes sp.、Saccharomycopsis sp.、 Schizosaccharomyces sp.、Zygosaccharomyces sp. Yarrowia sp.、Hansenula sp.、 Kluyveromyces sp.、Trichoderma sp.、Aspergillus sp.禾口 Fusarium sp.及菌物界,優(yōu)選選自子囊菌尤其是Chysosporium lucknowense,禾口擔(dān)子菌尤其是Coniphora sp.禾口 Arxula sp。在更優(yōu)選的變型中,所述細(xì)胞選自但不限于,P. pastoris, P. stiptis, P.methanolica, P.bovis, P.canadensis, P.fermentans, P.membranaefaciens,
32P. ρseudopolymorpha, P. quercuum, P.robertsii, P. saitoi, P. silvestrisi, P. strasburgensis ;P.finlandica, P.trehalophila, P.koclamae, P.opuntiae, P. thermotolerans, P. salictaria, P. guercuum, P. pijperi ;C. albicans, C. amphixiae, C. atlantica,C. corydalis,C. dosseyi,C. fructus,C. glabrata,C. fermentati, C. krusei, C. lusitaniae, C. maltosa, C. membranifaciens, C. utilis ;S. bayanus, S. cerevisiae, S. b i sporus, S. de lbruecki i , S. fermentati , S. frag i 1 i s, S.mellis, S. rosei ; Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycopsis capsularis ;Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Zygosaccharomyces b i sporus , Zygosaccharomyces mellis, Zygosaccharomyces rouxii ;Yarrowia 1ipolytica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp. , Trichoderma reseei. , A. nidulans, A. candidus, A. carneus, A. clavatus, A. fumigatus, A. niger, A. oryzae, A. versicolor, Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, 及 Neurospora crassa 禾口 Arxula adeninivorans。Rftl翻轉(zhuǎn)酶缺乏的宿主細(xì)胞本文所述的及表1和2中所指的所有酶及基因均根據(jù)它們各自在酵母 S. cerevisiae中的基因座位來(lái)命名。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠提供它們各自存在于其他生物體包括原核生物中的相應(yīng)活性物??晒┻x擇的來(lái)源的實(shí)例為釀酒酵母,畢赤酵母,曲霉菌 (Aspergillus),假絲酵母(Candida),及類似菌株。在已知的酶的同源物的基礎(chǔ)上,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)PCR引物或者可以用編碼此類酶的基因或基因片段來(lái)作為探針在靶標(biāo)生物體的DNA文庫(kù)中識(shí)別出同源物??商娲?,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在有關(guān)生物體中補(bǔ)足特別的表型??商娲?,如果一種特別相關(guān)的真菌的全部基因組序列是已知的,本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)檢索公眾可獲得的DNA數(shù)據(jù)文庫(kù)可以簡(jiǎn)單地鑒定該基因,所述DNA數(shù)據(jù)文庫(kù)可從例如NCBI,Swissprot等一些來(lái)源獲得。例如,通過(guò)用來(lái)源于S. cerevisiae的已知基因檢索給定的基因組序列或數(shù)據(jù)文庫(kù),本領(lǐng)域技術(shù)人員能在這樣一個(gè)基因組中識(shí)別出具有高同源性的基因,其以高度確定性編碼具有相似或相同活性的基因。例如,使用這些方法中的任意一種方法已經(jīng)在P. pastoris中識(shí)別出來(lái)源于S. cerevisiae的已知甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的同源物;這些基因與S. cerevisiae中的蛋白質(zhì)的甘露糖基化涉及的基因具有相似的功能,因此,可以應(yīng)用它們的缺失以在P. pastoris或具有相似糖基化途徑的任何其他真菌中操縱糖基化模式。在上述實(shí)施方案的優(yōu)選變型中,通過(guò)例如敲除rftl和/或rftl同源基因的方式, 進(jìn)一步修飾或以基因工程改造所述宿主細(xì)胞,使其缺乏或減少或耗竭(內(nèi)源性)脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶,尤其是Rftl。更特別地,所述細(xì)胞為rftl基因的敲除突變株。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。因此,本發(fā)明涉及基因工程細(xì)胞,其中,通過(guò)采用一種或多種方式,使其中至少一種內(nèi)源性酶活性缺乏或失活,所述方法選自倒位引起的抑制、反義結(jié)構(gòu)引起的抑制、缺失引起的抑制、轉(zhuǎn)錄水平上的抑制、翻譯水平上的抑制及其他方法。這些對(duì)于分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是公知的。在本發(fā)明正文中,術(shù)語(yǔ)“敲除”或“敲除突變株”是指該基因或轉(zhuǎn)錄物根本不存在的全部敲除系統(tǒng),及該基因或轉(zhuǎn)錄物仍然存在但是沉默的或低濃度的部分敲除突變株,均導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)揮充分影響。一旦確定給定的靶基因序列,基因敲除的建立在酵母和真菌分子生物學(xué)界是一種完善的技術(shù),并且任何一個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都能實(shí)施(例如,見(jiàn)R. Rothsteins, (1991) Methods in Enzymology,vol. 194,p. 281)。事實(shí)上,對(duì)于這類宿主,良性轉(zhuǎn)化的利用性及基因中斷技術(shù)都可能影響宿主生物體的選擇。如果一些轉(zhuǎn)移酶必須被敲除,已經(jīng)開(kāi)發(fā)了允許重復(fù)使用標(biāo)記物例如URA3標(biāo)記物來(lái)連續(xù)去除所有不期望的內(nèi)源性轉(zhuǎn)移酶或本文所引用的其他酶的方法。該技術(shù)已經(jīng)被其他人完善,但基本上包括使用攻擊反選擇性標(biāo)記物側(cè)面的兩種重復(fù)DNA序列。所述標(biāo)記物的存在在轉(zhuǎn)化株的后續(xù)選擇中是有用的;例如,可以應(yīng)用在酵母ura3,his4,suc2,g418,bla,或shble基因中。例如,可以使用ura3作為標(biāo)記物來(lái)確保選擇一種已經(jīng)整合了構(gòu)造的轉(zhuǎn)化株。通過(guò)用直接重復(fù)序列攻擊ura3標(biāo)記物,技術(shù)人員可以首先對(duì)已經(jīng)整合了所述構(gòu)造并因此中斷靶基因的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行選擇。分離所述轉(zhuǎn)化株及它們的表型之后,技術(shù)人員可以在第二輪中對(duì)具有5' FOA抗性的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行反選擇。能在包含5' FOA的平板上生存的菌落已經(jīng)通過(guò)涉及上述重復(fù)序列的交叉事件重新失去ura3 標(biāo)記物。因此,該方法允許重復(fù)使用相同的標(biāo)記物,并且不需要額外標(biāo)記物的情況下促進(jìn)多基因的中斷。本文所用的適用于核酸或多肽的術(shù)語(yǔ)“野生型”是指存在于生物有機(jī)體(自然界中存在的生物有機(jī)體)中的核酸或由所述生物有機(jī)體產(chǎn)生的多肽。本文中適用于宿主細(xì)胞中的核酸或由宿主細(xì)胞制造的多肽的術(shù)語(yǔ)“異源”是指不是來(lái)源于與宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞的任何核酸或多肽(例如,基因N-糖基化的蛋白質(zhì))。因此,本文所用的“同源”核酸或蛋白質(zhì),是存在于與宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞中或由所述細(xì)胞制造的核酸或蛋白質(zhì)。更特別地,本文所用的與核酸及具體的宿主細(xì)胞有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“異源”是指不存在于 (并且不能從其獲得)自然界中發(fā)現(xiàn)的具體細(xì)胞中的任何核酸。因此,非天然存在的核酸一旦被導(dǎo)入宿主細(xì)胞,就被認(rèn)為對(duì)于該宿主細(xì)胞是異源的。值得注意的是,非天然存在的核酸可以包含自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸序列或核酸序列片段,假如所述核酸作為一個(gè)整體在自然界中不存在。例如,在表達(dá)載體內(nèi)包含基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸,因此一旦被導(dǎo)入宿主細(xì)胞,就被認(rèn)為對(duì)于該宿主細(xì)胞是異源的,因?yàn)樗龊怂岱肿幼鳛橐粋€(gè)整體(基因組DNA加上載體DNA)在自然界中不存在。因此,任何一種作為整體在自然界中不存在的載體、自主復(fù)制質(zhì)?;虿《?例如,逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰疹病毒)均被認(rèn)為是非天然存在的核酸。由此可見(jiàn),通過(guò)PCR或限制性核酸內(nèi)切酶處理制造的基因組DNA片段,及 cDNAs均被認(rèn)為是非天然存在的核酸,因?yàn)槲窗l(fā)現(xiàn)它們?cè)谧匀唤缰幸苑蛛x的分子存在。由此還可以得知,任何一種在自然界中未發(fā)現(xiàn)的在一種排列中包含啟動(dòng)子序列和多肽編碼序列(例如,cDNA或基因組DNA)的核酸是非天然存在的核酸。一種非天然存在的核酸對(duì)于具體的細(xì)胞來(lái)說(shuō)可以是異源的。例如,從酵母χ的細(xì)胞中分離的完整染色體一旦被導(dǎo)入酵母y的細(xì)胞,對(duì)于酵母y的細(xì)胞來(lái)說(shuō)就是一種異源核酸。^-^^w.^mm^mm^um^^Mm,本發(fā)明所述的翻轉(zhuǎn)酶在突變細(xì)胞中被表達(dá)時(shí)支持生長(zhǎng)和穩(wěn)定,所述突變細(xì)胞缺乏定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多糖的合成途徑(例如通過(guò)基因工程)的一種或多種酶活性物,尤其是缺乏具有甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的一種或多種酶,所述甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性轉(zhuǎn)移甘露糖殘基至多糖結(jié)構(gòu)例如具有Manl-3G1CNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞經(jīng)特別設(shè)計(jì)或選擇用來(lái)合成新生糖蛋白,所述糖蛋白具有適合進(jìn)一步在高爾基體中進(jìn)行糖基化加工的ManlGlCNAC2結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞經(jīng)特別設(shè)計(jì)或選擇用來(lái)合成新生糖蛋白,所述糖蛋白具有適合進(jìn)一步在高爾基體中進(jìn)行糖基化加工的Man2GlCNAC2結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞經(jīng)特別設(shè)計(jì)或選擇用來(lái)合成新生糖蛋白,所述糖蛋白具有適合進(jìn)一步在高爾基體中進(jìn)行糖基化加工的Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選方面,本發(fā)明所述的被修飾后表達(dá)上述新脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶的宿主細(xì)胞被進(jìn)一步修飾或基因工程改造,以缺乏一種或多種定位于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器的糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。這些優(yōu)選實(shí)施方案的基本構(gòu)思是減少和控制脂質(zhì)連接寡糖在細(xì)胞器表面和/或細(xì)胞器內(nèi)的糖基化,尤其是甘露糖基化。提供本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞能有選擇地控制糖基化并且有可能特備提供下述改進(jìn)的實(shí)施方案,所述宿主細(xì)胞被修飾后表達(dá)上述具有松弛特異性的新脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物并因此能翻轉(zhuǎn)低甘露糖尤其是Manl-3多糖結(jié)構(gòu)至內(nèi)腔。優(yōu)選地,在所述宿主細(xì)胞中被敲除、減少或耗竭的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(見(jiàn)表1)。在所述宿主細(xì)胞的優(yōu)選方案中,Alg2、Alg3和Algll型活性物中的一種或多種被敲除、減少或耗竭。在更優(yōu)選的變型中,這些實(shí)施方案進(jìn)一步缺乏或被減少或耗竭β-D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(Dpml)和脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物中的一種或多種。表1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性物
名稱功能EC號(hào)同義詞DPMI多萜醇磷酸β -D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶2. 4. 1. 83多萜醇磷酸甘露糖基合酵 多萜醇磷酸甘露糖基轉(zhuǎn)移酶甘露糖基磷酸多辟醇合酶 甘露糖基磷?;噍拼己厦窤lg2α-1,3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酵2. 4. 1. -YGL065CAlgllα-1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酵2.4.1.-YNL048LAlg3多萜醇磷酸-甘露糖-糖脂α-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶2. 4. 1. 13 0AlgC
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在一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為缺乏Alg2型活性物的突變菌株。更特別地,所述細(xì)胞為alg2基因和/或alg2同源基因的敲除突變株。特別地,所述宿主細(xì)胞能合成具有ManlGlCNAC2和Man2GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為缺乏Algll型活性物的突變菌株。更特別地,所述細(xì)胞為algll基因和/或algll同源基因的敲除突變株。特別地,所述細(xì)胞能合成具有Man3GlcNAc2、Man6GlcNAc2和Man7GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。在其一個(gè)優(yōu)選的變型中,所述宿主細(xì)胞為同時(shí)缺乏Algll型活性物和脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物的突變菌株。更特別地,所述細(xì)胞為algll基因和/或algll同源基因及一個(gè)或多個(gè)編碼脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物的基因的敲除突變株。特別地,所述細(xì)胞能主要合成具有Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在其另一個(gè)優(yōu)選的變型中,所述宿主細(xì)胞為同時(shí)缺乏Algll型活性物和β-D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(DPMI)型活性物的突變菌株。更特別地,所述細(xì)胞為algll基因或algll 同源基因及dpml基因或dpml同源基因的敲除突變株。特別地,所述細(xì)胞能主要合成具有 Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞為缺乏Alg3型活性物的突變菌株。更特別地,所述細(xì)胞為alg3基因和/或alg3同源基因的敲除突變株。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為同時(shí)缺乏Alg3型活性物和Algll型活性物的突變菌株。更特別地,所述細(xì)胞為alg3基因和algll基因和/或其任何同源基因的敲除突變株。特別地,所述細(xì)胞能合成具有Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在上述實(shí)施方案的優(yōu)選變型中,所述宿主細(xì)胞被進(jìn)一步修飾或基因工程改造,以缺乏或被減少或耗竭至少一種定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。表達(dá)POT-復(fù)合系統(tǒng)的宿主細(xì)胞本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及一種寡糖基轉(zhuǎn)移酶(0ST或0T)和/或修飾的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),優(yōu)選為異源的寡糖基轉(zhuǎn)移酶。所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶是一種膜蛋白或蛋白復(fù)合物,轉(zhuǎn)移脂質(zhì)連接寡糖中的寡糖至新生蛋白質(zhì)。 在野生型細(xì)胞中,脂質(zhì)連接寡糖的GlC3Man9GlCNAC2結(jié)構(gòu)會(huì)被轉(zhuǎn)移并被附加到將被糖基化的蛋白質(zhì)的天冬酰胺(Asn)殘基上。所述被寡糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)在N-連接糖基化途徑中是重要的步驟。酵母和脊椎動(dòng)物的寡糖基轉(zhuǎn)移酶是由7或8個(gè)亞單位(酵母中為Ostlp,0st2p, 0st3p/0st6p, 0st4p, 0st5p, Stt3p, Wbplp,和Swplp ;在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中為核糖體結(jié)合蛋白I,DAD1, N33/IAP, 0ST4, Stt3A/Stt3B, 0st48,和核糖體結(jié)合蛋白II)組成的復(fù)合異源寡聚蛋白。與酵母或脊椎動(dòng)物的多蛋白復(fù)合物相反,除了僅包含催化^5 3亞單位的 Trypanosoma sp.和Leishmania sp之外,原生動(dòng)物體的基因組具有2_4個(gè)亞單位,編碼3 或4種完整的旁系同源基因。原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)與酵母和脊椎動(dòng)物的寡糖基轉(zhuǎn)移酶在它們對(duì)不同脂質(zhì)連接寡糖結(jié)構(gòu)的特異性上是有區(qū)別的。不希望受理論的束縛,內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)轉(zhuǎn)移具有高甘露糖多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖可以是高度特異的,所述高甘露糖多糖結(jié)構(gòu)是野生型細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中典型具有的。因此,內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)轉(zhuǎn)移具有GlC3Man9GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖可以是高度特異的。在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的甘露糖基化被抑制,并且被修飾的細(xì)胞主要制造具有Manl-3G1CNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖。內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶例如酵母多萜基二磷酸寡糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(亞單位:ffbpl, Ostl, 0st2, 0st3, 0st4, 0st5, 0st6, Swp 1, Stt3p)對(duì)此類低甘露糖脂質(zhì)連接寡糖的活性可能很低。例如,預(yù)期酵母寡糖基轉(zhuǎn)移酶(見(jiàn)圖 1)對(duì)具有 ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2, Man3GlcNAc2, Man4GlcNAc2 或 Man5GlcNAc2 結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖的活性可能很低。不希望受理論的束縛,內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶的存在可能影響限速步驟,并可能在糖基化級(jí)聯(lián)中引起“瓶頸”,因?yàn)榈透事短嵌嗵窍蛐律鞍踪|(zhì)的轉(zhuǎn)移以非常受限的速率發(fā)生,如果真發(fā)生的話。因此,在另一個(gè)方面,本方面還提供了一種或多種被修飾的或優(yōu)選的異源的寡糖基轉(zhuǎn)移酶,及特別是表達(dá)或超表達(dá)這些被修飾的或優(yōu)選的異源的寡糖基轉(zhuǎn)移酶中的一種或多種寡糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞??商娲鼗蚋郊拥?,根據(jù)本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞被修飾或基因工程改造,來(lái)表達(dá)或包含一種或多種被修飾的或優(yōu)選的異源的寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物,其特征在于,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物不優(yōu)先轉(zhuǎn)移GlC3Man9GlCNAC2至蛋白質(zhì),而是還能夠轉(zhuǎn)移除GlC3Man9GlCNAC2之外的寡糖至蛋白質(zhì),所述寡糖優(yōu)選是具有1_9個(gè)甘露糖殘基的寡糖,最優(yōu)選ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2,和/或Man3GlcNAc2。換言之,本發(fā)明提供了具有至少一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的宿主細(xì)胞,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物對(duì)不同類型的將被轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)的多糖結(jié)構(gòu)顯示出松弛特異性。具體地說(shuō),這種活性物在本文中被稱作“類POT活性物”或“POT活性物”。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,提供一種在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中使用的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT),其對(duì)轉(zhuǎn)移低甘露糖結(jié)構(gòu),尤其是ManlGlcNAc2,Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2, 顯示出相當(dāng)大的活性。在更優(yōu)選的變型中,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為一種原生動(dòng)物的酵母寡糖基轉(zhuǎn)移酶的亞單位的同源物,具體的所述原生動(dòng)物選自但不限于,Toxoplasma sp.,Leishmania sp.,和Trypanosoma sp.。優(yōu)選地,所述原生動(dòng)物選自但不限于, Toxoplasma gondii (Tg),Leishmania major (Lm) ;Leishmania infantum(Li),Leishmania braziliensis(Lb), Leishmania mexicana(Lmx), Leishmania donovani(Ld), Leishmania guyanensis (Lg), Leishmania tropica (Lt), Trypanosoma cruzi (Tc), 禾口 Trypanosoma bruceiCTb)。在具體實(shí)施方案中,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶選自下述旁系同源基因中的一種或多種 Trypanosoma brucei 的 TbStt3Bp 禾口 TbStt3Cp ;Leishmania infantum 的 LiStt3-l, LiStt3-2, ^P LiStt3-3 ;Leishmania braziliensis 的 LbStt3-l, LbStt3-2,^P LbStt3-3 ;和 Leishmania major 及其同源結(jié)構(gòu)的 Ln^tt3A,LmStt3B, Ln^tt3C,和 Ln^tt3D。 在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶選自下述一種或多種Trypanosoma brucei 的 TbStt3Bp 和 TbStt3Cp ;及 Leishmania major 的 LmStt3Ap, LmStt3Bp,和 LmStt3Dp。因此,本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞,其包含一種或多種編碼一種或多種原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。表達(dá)所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶或類原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的啟動(dòng)子可以是一種內(nèi)源性啟動(dòng)子,內(nèi)源性是針對(duì)所述活性物被表達(dá)時(shí)所在的細(xì)胞而言。啟動(dòng)子可以進(jìn)行所述核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝的超表達(dá)。可以使用例如ADH,Tef或GPD的啟動(dòng)子在酵母中表達(dá)所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物或類原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,編碼所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物或類原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的基因位于一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒上,所述質(zhì)粒優(yōu)選引起超表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中,與從低拷貝數(shù)質(zhì)粒或從單拷貝染色體整合的表達(dá)相比,所述分子被超表達(dá)2倍,更優(yōu)選為5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍,最優(yōu)選為2000或更多倍。表達(dá)所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物或類原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的啟動(dòng)子可以為adh,Tef或gpd,例如在一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒上。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。_連接· (LLM) Ir^佘-(POT)筲合系統(tǒng)本發(fā)明提供了一種被修飾的或基因工程改造的宿主細(xì)胞,在下文中被稱為“復(fù)合系統(tǒng)”。本發(fā)明所述的復(fù)合系統(tǒng)是指一種宿主細(xì)胞,其特別能合成具有低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并轉(zhuǎn)移所述低甘露糖多糖至一種或多種在所述細(xì)胞中表達(dá)的新生蛋白質(zhì); 所述細(xì)胞(i)被修飾以在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器中合成具有低甘露糖多糖結(jié)構(gòu),尤其是 ManlGlcNAc2, Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖;尤其是通過(guò)敲除至少一種定位于細(xì)胞器的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶,并且根據(jù)情況敲除脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶的方式來(lái)完成所述修飾,如本文中所詳細(xì)描述的;及(ii)進(jìn)一步被修飾后表達(dá)外源性/異源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶,其對(duì)將被轉(zhuǎn)移至新生蛋白質(zhì)的低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)顯示出松弛的底物特異性,尤其是與內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性相比,其中,所述外源性/異源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶為原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,對(duì)將被轉(zhuǎn)移至新生蛋白質(zhì)的低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)顯示出松弛的底物特異性的寡糖基轉(zhuǎn)移酶為原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania major的旁系同源基因(Paralogue)Ln^ttiBB或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中, 將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania major的旁系同源基因Ln^tt3C或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3_l或其同源結(jié)構(gòu)。在所述宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶還可以為L(zhǎng)eishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3_2或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3_3或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania infantum的旁系同源基因LKtt3_l或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為L(zhǎng)eishmania infantum的旁系同源基因LKtt3_2或其同源結(jié)構(gòu)。在所述宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶還可以為L(zhǎng)eishmania infantum的旁系同源基因LKtt3_3或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為Trypanosoma brucei (布氏錐蟲(chóng))的旁系同源基因TbMt3A或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbMtIBB或其同源結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,將在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶為Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbMt3C或其同源結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,提供了一種表達(dá)盒或其功能性類似物,用于表達(dá)一種或多種對(duì)低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)具有松弛的底物特異性的原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶,例如尤其是上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶中的一種或多種。所述表達(dá)盒包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的任一種核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)具有松弛的底物特異性,選自上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶。在其一個(gè)具體的變型中,還提供了一種用于轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的載體,包含編碼上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶中的一種或多種的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝。所述載體中的核酸序列能被操作性地連接到表達(dá)調(diào)控序列。優(yōu)選地,所述核酸分子中的一種或多種與編碼啟動(dòng)子的核酸分子及編碼終止子的核酸分子中的至少一種核酸分子結(jié)合存在。表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子可以為ADH,Tef或GPD,例如在一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒上。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因突變細(xì)胞,其表達(dá)Leishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D或其同源結(jié)構(gòu)。在其一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D在一種低拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在其另一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D在一種高拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所提供的細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3-3或其同源結(jié)構(gòu)。在其一個(gè)具體的變型中,LbMt3-3在一種低拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在其另一個(gè)具體的變型中,Ll^tt3-3在一種高拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所提供的細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3-l或其同源結(jié)構(gòu)。在其一個(gè)具體的變型中,LbMt3-l在一種高拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所提供的細(xì)胞表達(dá)Leishmania infantum的旁系同源基因LKtt3-2或其同源結(jié)構(gòu)。在其一個(gè)具體的變型中,LKtt3-2在一種低拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所提供的細(xì)胞表達(dá)Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbMtIBB或其同源結(jié)構(gòu)。在其一個(gè)具體的變型中,TbStUB在一種高拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所提供的細(xì)胞表達(dá)Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbMt3C或其同源結(jié)構(gòu)。在其一個(gè)具體的變型中,TbStt3C在一種高拷貝載體的所述細(xì)胞中被表達(dá)。在所述復(fù)合系統(tǒng)的一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Alg2型活性物,及(ii)表達(dá)或超表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為alg2基因和/或alg2同源基因的敲除突變株,及(ii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在所述復(fù)合系統(tǒng)的一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Algll型活性物,及(ii)表達(dá)或超表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。更特別地, 所述細(xì)胞(i)為algll基因和/或algll同源基因的敲除突變株,及(ii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種表達(dá) Leishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D的algll基因和/或algll同源基因的敲除突變株。在本發(fā)明一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源LbMt3_3。在一個(gè)具體的變型中,LbMt3-3在一種低拷貝載體中被表達(dá)。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。在所述復(fù)合系統(tǒng)的另一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Alg3型活性物和Algll型活性物,及(ii)表達(dá)或超表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為alg3基因和algll基因和/或其任一種同源基因的敲除突變株,及(ii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了一種表達(dá)Leishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D的alg3基因和algll基因和/或其任一種同源基因的敲除突變株。在其一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D 在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3_3。在其一個(gè)具體的變型中,LbMt3_3在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Trypanosoma brucei的旁系同源基因H^tUB或TbMt3C。在一個(gè)具體的變型中,TbStUB或TbMt3C在一種高拷貝載體中被表達(dá)。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。在所述復(fù)合系統(tǒng)的另一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Algll型活性物和脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶型活性物,及(ii)表達(dá)或超表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為algll基因和/或algll同源基因及一個(gè)或多個(gè)編碼脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶型活性物的基因的敲除突變株,及(ii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。在所述復(fù)合系統(tǒng)的另一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Algll型活性物和β-D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(DPMI)型活性物,及(ii)表達(dá)或超表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為algll基因和/或dpml基因和/或其同源基因的敲除突變株,及(ii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶型活性物。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。不希望受理論的束縛,在優(yōu)選變型中,要求對(duì)內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶無(wú)敲除突變。然而,在一個(gè)優(yōu)選變型中,內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞中是不存在或是被抑制的。因此,提供了一種細(xì)胞,其中一種或多種編碼內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞單位的基因被敲除。在包括酵母細(xì)胞的優(yōu)選變型中,所述內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶的至少一種亞單位選自ffbplp,Ostlp,0st2p, 0st3p,0st4p,0st5p,0st6p,Swplp,和Mt3p。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為wbpl基因和stt3基因的敲除突變株。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為ostl基因和ost2基因的敲除突變株。
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在一個(gè)具體的變型中,所述宿主細(xì)胞為Stt3p的突變菌株,更特別地,所述宿主細(xì)胞為酵母菌株YGM3,其具有stt3-7等位基因的溫度敏感性表現(xiàn)型(Spirig et al. Mol. Gen. Genet. 256,p.628—637,1997)。_連挪編祁佘-_連機(jī)麵_ -原、柄會(huì)充根據(jù)另一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞,其特別能合成具有低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并轉(zhuǎn)移所述低甘露糖多糖至一種或多種在所述細(xì)胞中表達(dá)的新生蛋白質(zhì);所述細(xì)胞(i)被修飾以在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器中合成具有低甘露糖多糖結(jié)構(gòu),尤其是 ManlGlcNAc2, Man2GlcNAc2或Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖;尤其是通過(guò)敲除至少一種定位于細(xì)胞器的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶,并且根據(jù)情況敲除脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶的方式來(lái)形成,如本文中所詳細(xì)描述的;(ii)被修飾以表達(dá)新的對(duì)低甘露糖脂質(zhì)連接寡糖具有松弛特異性的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶,如本文中所詳細(xì)描述的;及(iii)進(jìn)一步被修飾以表達(dá)寡糖基轉(zhuǎn)移酶,其對(duì)將被轉(zhuǎn)移至新生蛋白質(zhì)的低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)顯示出松弛的底物特異性,優(yōu)選地,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶為原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT),更特別選自上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒或其功能性類似物,用于表達(dá)上述新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,及對(duì)低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)具有松弛的底物特異性的寡糖基轉(zhuǎn)移酶例如原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶。所述表達(dá)盒包含編碼上述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的任一種核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝,及編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶例如上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶的任一種核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)具有松弛的底物特異性。在其一個(gè)具體的變型中,還提供了一種用于轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的載體,包含編碼上述核酸分子中的任一種的一個(gè)或多個(gè)拷貝,或包含上述表達(dá)盒的一個(gè)或多個(gè)拷貝。所述載體中的核酸序列能被操作性地連接到表達(dá)調(diào)控序列。優(yōu)選地,所述核酸分子中的一種或多種與編碼啟動(dòng)子的核酸分子及編碼終止子的核酸分子中的至少一種核酸分子結(jié)合存在。 表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子可以為ADH,Tef或GPD,例如在一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒上。一個(gè)關(guān)于為宿主細(xì)胞提供新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物和原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的載體的優(yōu)選實(shí)施方案示于圖14中。所述核酸序列提供于SEQ ID NO 32中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于flc2’ ”還包括包含flc2’ (SEQ ID NO 1)的完整序列的分子,并且在更優(yōu)選的變型中,包括包含flc2’的一個(gè)或多個(gè)片段的分子,所述一個(gè)或多個(gè)片段編碼一個(gè)或多個(gè)Flc2分子的跨膜域。在本發(fā)明一個(gè)具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域4(TM4)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在本發(fā)明一個(gè)具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域3-4(TM3-4)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。所述分子可以包含編碼Flc2’的跨膜域I(TMl)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。所述分子還可以包含編碼Flc2’的跨膜域2(TM;3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在本發(fā)明一個(gè)具體并優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’ 的跨膜域1-2(ΤΜ1-2)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc 2’的跨膜域2-4(TM2-4)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。所述分子可以包含編碼Flc2’的跨膜域3(TM3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域 1-3(ΤΜ1-3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述分子包含編碼Flc2’的跨膜域2-3(TM2-;3)的片段或其同源功能性結(jié)構(gòu),或基本上由其組成。在所述復(fù)合系統(tǒng)的一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Alg2型活性物;(ii)表達(dá)本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物;及(iii)表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為alg2基因和/或alg2同源基因的敲除突變株;(ii)表達(dá)一種或多種提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子;及 (iii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中, 所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于flc2’的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所詳細(xì)描述的。在另一個(gè)變型中,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于rftl的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所描述的。特別地,所述細(xì)胞能合成具有 ManlGlCNAC2和Man2GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并能轉(zhuǎn)移所述結(jié)構(gòu)至新生蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Algll型活性物,(ii)表達(dá)本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,及(iii)表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為algll基因和/或algll同源基因的敲除突變株,(ii)表達(dá)一種或多種提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,及(iii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于flc2’的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所詳細(xì)描述的。在另一個(gè)變型中,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于rftl的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所描述的。特別地,所述細(xì)胞能合成具有Man3GlCNAC, Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2和/或Man8GlcNAc2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并能轉(zhuǎn)移所述結(jié)構(gòu)至新生蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Alg3型活性物和Algll型活性物,(ii)表達(dá)本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,及 (iii)表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為alg3基因和algll基因或其任一種同源基因的敲除突變株,( )表達(dá)一種或多種提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,及(iii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于flc2’的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所詳細(xì)描述的。在另一個(gè)變型中,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于 rftl的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所描述的。特別地,所述細(xì)胞能合成具有Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并能轉(zhuǎn)移所述結(jié)構(gòu)至新生蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D。在一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3_3。在一個(gè)具體的變型中,LbMt3_3 在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Trypanosomabrucei的旁系同源基因TbMtIBB或TbMt3C。在一個(gè)具體的變型中,TbStUB或TbMt3C在一種高拷貝載體中被表達(dá)。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Algll型活性物和脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物,(ii)表達(dá)本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,及(iii)表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i) Salgll 基因和/或algll同源基因及一個(gè)或多個(gè)編碼脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物的基因的敲除突變株,(ii)表達(dá)一種或多種提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,及(iii) 表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于flc2’的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所詳細(xì)描述的。可替代地或附加地,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于rftl的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所描述的。本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選突變細(xì)胞表達(dá) Leishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D。在一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3-3。在一個(gè)具體的變型中,LbMt3-3在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbMt3B 或TbMt3C。在一個(gè)具體的變型中,TbStUB或TbMt3C在一種高拷貝載體中被表達(dá)。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。特別地,所述細(xì)胞能合成具有Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并能轉(zhuǎn)移所述結(jié)構(gòu)至新生蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為一種突變菌株,其(i)至少缺乏Algll型活性物和β-D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(DPMI)型活性物,(ii)表達(dá)本發(fā)明所述的新的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,及(iii)表達(dá)原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。更特別地,所述細(xì)胞(i)為 algll基因和/或algll同源基因及dpml基因和/或dpml同源基因的敲除突變株,(ii) 表達(dá)一種或多種提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,及(iii)表達(dá)一種或多種上述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于flc2’的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所詳細(xì)描述的??商娲鼗蚋郊拥?,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種來(lái)源于rftl的提供脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的核酸分子,如上文中所描述的。本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania major的旁系同源基因Ln^tt3D。在一個(gè)具體的變型中,Ln^tt3D在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá)Leishmania braziliensis的旁系同源基因LbMt3_3。在一個(gè)具體的變型中,Ll^tt3-3在一種低拷貝載體中被表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述突變細(xì)胞表達(dá) Trypanosoma brucei的旁系同源基因TbMtIBB或TbMt3C。在一個(gè)具體的變型中,TbSttiBB 或TbMt3C在一種高拷貝載體中被表達(dá)。本發(fā)明還涉及制造這些細(xì)胞的方法。特別地,所述細(xì)胞能合成具有Man3GlCNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并能轉(zhuǎn)移所述結(jié)構(gòu)至新生蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及制造所述細(xì)胞的方法。具體地講,提供了一種細(xì)胞,其中一種或多種編碼內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞單位的基因被敲除。在包括酵母細(xì)胞的優(yōu)選變型中,內(nèi)源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶的至少一種亞單位選自 ffbplp, Ostlp, 0st2p, 0st3p, 0st4p, 0st5p, 0st6p, Swplp,禾口 Stt3p。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為wbpl基因和stt3基因的敲除突變株。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述細(xì)胞為ostl基因和ost2基因的敲除突變株。
43
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中,任何一種如上所述的細(xì)胞可以還包含至少一種編碼異源糖蛋白的核酸。表達(dá)異源糖蛋白的啟動(dòng)子可以為內(nèi)源性啟動(dòng)子,內(nèi)源性是針對(duì)所述酶被表達(dá)時(shí)所在的細(xì)胞而言的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,啟動(dòng)子為一種異源啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型或構(gòu)建型啟動(dòng)子,其超表達(dá)核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝。特別地,這些細(xì)胞能主要合成具有Manl-3G1CNAC2結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并能轉(zhuǎn)移所述結(jié)構(gòu)至所述異源蛋白質(zhì)。不希望受理論的束縛,上述指定的敲除缺失菌株僅能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中制造低甘露糖脂質(zhì)連接寡糖,尤其是Man3GlCNAC2,其然后被附加到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)上。在一些情況下可以發(fā)現(xiàn),隨后在高爾基體中甘露糖基轉(zhuǎn)移酶作用下添加附加的甘露糖殘基, 可能在蛋白質(zhì)上形成Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。為了減少不期望的Man4GlcNAc2 和Man5GlCNAC2結(jié)構(gòu)的數(shù)量,本發(fā)明提供了避免其發(fā)生的措施。一個(gè)優(yōu)選的措施為在如上所述的本發(fā)明任何一種細(xì)胞中缺失一種或多種編碼定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的在先教導(dǎo)明確相反,其中,通過(guò)使用同源或異源甘露糖苷酶修剪或分裂高甘露糖(例如,Man8GlCNAC2或Man 9GlcNAc2)或高甘露糖基化糖形,得到期望的低甘露糖基化多糖。因此,在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及不表現(xiàn)出有效的甘露糖苷酶活性或根本無(wú)甘露糖苷酶活性的細(xì)胞。具有修飾的高爾基體-糖基化的宿主細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由寡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的主要糖蛋白可以在高爾基體中進(jìn)一步糖基化,如下文詳細(xì)描述的。本發(fā)明更主要的方面在于提供用于在本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞中修飾基于高爾基體的糖基化的手段和方法。上文中詳細(xì)描述的基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基化的修飾及下文中詳細(xì)描述的基于高爾基體的糖基化的修飾是密不可分的。本發(fā)明有利地提供了具有低甘露糖多糖結(jié)構(gòu)的主要糖蛋白,為隨后在高爾基體中的修飾糖基化形成理想的底物^-^^w.^M^mm^mm^um^^Mm,在優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞被進(jìn)一步修飾或基因工程改造,以缺乏或被抑制或耗竭一種或多種,至少兩種,優(yōu)選至少三種、至少四種或至少五種定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地,所述甘露糖基轉(zhuǎn)移酶選自0chlp,Mrmlp,Mrm2p,Mrm4p, Mnn5p,Mnn9p,Mnnl0p,及Mnnllp,及其同源物(見(jiàn)表2)。優(yōu)選地,所述細(xì)胞為至少一種基因的敲除突變株,所述基因選自:ochl,mnnl,mnn2, mnn4, mnn5, mnn9, mnnlO,禾口 mnnll基因及其同源基因。同源基因還包括相同或相關(guān)基因家族的其他成員。表2定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶
4權(quán)利要求
1.一種被修飾以表達(dá)脂質(zhì)連接寡糖(LLO)翻轉(zhuǎn)酶活性物的細(xì)胞,所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物能夠從細(xì)胞器的胞質(zhì)面向其腔面高效地翻轉(zhuǎn)包含1個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖,能夠高效地翻轉(zhuǎn)包含2個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖,并且能夠高效地翻轉(zhuǎn)包含3個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞,其特征在于,所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶具有翻轉(zhuǎn)選自 ManlGlcNAc2, Man2GlcNAc2 和 Man3GlcNAc2 的脂質(zhì)連接寡糖的活性。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其中,所述脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物通過(guò)一種或多種核酸分子的表達(dá)來(lái)提供,所述核酸分子選自a)包含下述一個(gè)或多個(gè)序列的核酸分子SEQID NO 1, SEQ ID NO :3,SEQ ID NO :5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :9,SEQ ID NO :11,SEQ ID NO :13,SEQ ID NO :15,和 SEQ ID NO 17 ;SEQ ID NO :21,SEQ ID NO :23,SEQ ID NO :25,SEQ ID NO :27,和 SEQ ID NO 29 ;b)包含下述一個(gè)或多個(gè)序列的編碼聚氨基酸的核酸分子SEQID NO 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :8,SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :12,SEQ ID NO 14 ;SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO 18 ;SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO :28 JPSEQ ID NO 30 ;及c)a)或b)所述的核酸分子的片段、變體、類似物或衍生物。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其中,所述的細(xì)胞器為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞包含至少一種編碼異源(糖)蛋白的核酸,并表達(dá)所述(糖)蛋白。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Rftl型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物,其中,所述Rftl型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的特征在于,對(duì)帶有1至3個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性小于對(duì)帶有5個(gè)甘露糖殘基的脂質(zhì)連接寡糖的翻轉(zhuǎn)活性。
7.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為rftl基因或rftl同源基因的敲除突變株。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一種或多種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞,其特征在于,所述定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的一種或多種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的Algll型活性物。
12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因的敲除突變株。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一種或多種脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶型活性物。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algl1基因或algl 1同源基因及一種或多種編碼脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物的基因的敲除突變株。
15.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Alg3型活性物。
16.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因及alg3 基因或alg3同源基因的敲除突變株。
17.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的Algl 1型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的β-D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或DPMI型活性物。
18.如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因及dpml 基因或dpml同源基因的敲除突變株。
19.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的Alg2型活性物。
20.如權(quán)利要求19所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為alg2基因或alg2同源基因的敲除突變株。
21.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞包含一種或多種編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的核酸分子,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的特征在于,其能夠轉(zhuǎn)移除 Glc3Man9GlcNAc2之外的寡糖至蛋白質(zhì)。
22.如權(quán)利要求21所述的細(xì)胞,其特征在于,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物為原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)活性物。
23.如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞,其特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物來(lái)源于弓形蟲(chóng) CToxoplasma gondii (Tg)),碩大利什曼蟲(chóng)(Leishmania major (Lm));嬰兒利什員蟲(chóng)(Leishmania infantum (Li)), EiH^1JffMii (Leishmania braziliensis (Lb)), SM 哥禾Ij什曼蟲(chóng)(Leishmania Mexicana (Lmx)),杜氏禾Ij什曼蟲(chóng)(Leishmania donovani (Ld)), 利什曼蟲(chóng)圭亞那亞種(Leishmania guyanensis (Lg)),熱帶禾丨J什曼蟲(chóng)(Leishmania tropica (Lt)),胃氏 Ifl 蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi (Tc)), 5 ^ 1 HI Ji, (Trypanosoma brucei(Tb))。
24.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞,其特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物選自TbMt3Bp型活性物,TbStt3Cp型活性物,LmStt3Ap型活性物,LmStt3Bp型活性物,及 LmStt3Dp型活性物。
25.如權(quán)利要求23所述的細(xì)胞,其特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物選自 TbStt3B型活性物,TbStt3C型活性物;LmStt3A型活性物,LmSttIBB型活性物,LmStt3C型活性物,及Ln^tt3D型活性物;LKtt3-l型活性物,LiStt3-2型活性物,及LKtt3_3型活性物;LbMt3-l型活性物,LbStt3-2型活性物,及LbMt3-3型活性物。
26.一種被修飾以表達(dá)寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的細(xì)胞,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物能夠高效地轉(zhuǎn)移包含3個(gè)甘露糖殘基、4個(gè)甘露糖殘基和/或5個(gè)甘露糖殘基的寡糖至蛋白質(zhì)。
27.如權(quán)利要求沈所述的細(xì)胞,其特征在于,所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物為單單元原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶(POT)。
28.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞,其特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物來(lái)源于弓形蟲(chóng) CToxoplasma gondii (Tg)),碩大利什曼蟲(chóng)(Leishmania major (Lm));嬰兒利什員蟲(chóng)(Leishmania infantum (Li)), EiH^1JffMii (Leishmania braziliensis (Lb)), SM 哥禾Ij什曼蟲(chóng)(Leishmania Mexicana (Lmx)),杜氏禾Ij什曼蟲(chóng)(Leishmania donovani (Ld)), 利什曼蟲(chóng)圭亞那亞種(Leishmania guyanensis (Lg)),熱帶禾丨J什曼蟲(chóng)(Leishmania tropica (Lt)),胃氏 Ifl 蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi (Tc)), 5 ^ 1 HI Ji, (Trypanosoma brucei(Tb))。
29.如權(quán)利要求觀所述的細(xì)胞,其特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物選自TbMt3Bp型活性物,TbStt3Cp型活性物,LmStt3Ap型活性物,LmStt3Bp型活性物,及 LmStt3Dp型活性物。
30.如權(quán)利要求觀所述的細(xì)胞,其特征在于,所述原生動(dòng)物寡糖基轉(zhuǎn)移酶選自Tl^tt3B 型活性物,TbStt3C型活性物;Ln^tt3A型活性物,Ln^tUB型活性物,Ln^tt3C型活性物, 及Ln^tt3D型活性物;LKtt3-l型活性物,LiStt3-2型活性物,及LKtt3_3型活性物; LbStt3-l型活性物,LbStt3-2型活性物,及LbMt3-3型活性物。
31.如權(quán)利要求沈-30中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征還在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一種或多種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。
32.如權(quán)利要求31所述的細(xì)胞,其特征在于,所述定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶為甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。
33.如權(quán)利要求沈-32中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征還在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一種或多種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物。
34.如權(quán)利要求沈-33中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征還在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Algll型活性物。
35.如權(quán)利要求34所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因的敲除突變株。
36.如權(quán)利要求沈-35中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征還在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的一種或多種脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶型活性物。
37.如權(quán)利要求36所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algl1基因或algl 1同源基因及一個(gè)或多個(gè)編碼脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶活性物的基因的敲除突變株。
38.如權(quán)利要求沈-37中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征還在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 Alg3型活性物。
39.如權(quán)利要求38所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因及alg3 基因或alg3同源基因的敲除突變株。
40.如權(quán)利要求沈-39中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Algll型活性物,并且進(jìn)一步缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的 β -D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或DPM型活性物1。
41.如權(quán)利要求40所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為algll基因或algll同源基因及dpml 基因或dpml同源基因的敲除突變株。
42.如權(quán)利要求沈-41中任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞,其特征還在于,所述細(xì)胞顯示出Rftl型脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物。
43.如權(quán)利要求42所述的細(xì)胞,所述細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比,超表達(dá)Rftl型活性物。
44.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、 減少或耗竭的一種或多種定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。
45.如權(quán)利要求44所述的細(xì)胞,其特征在于,所述定位于高爾基體的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性物選自O(shè)chl型活性物,Mnnl型活性物,Mnn2型活性物,Mnn4型活性物,Mnn5型活性物, Mnn9型活性物,MnnlO型活性物,及Mnnll型活性物。
46.如權(quán)利要求45所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為選自ochl,mnnl,mnn2, mnn4, mnn5, mnn9, mnnlO, mrmll,及它們的同源基因中的至少一種基因的敲除突變株。
47.如權(quán)利要求44所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Mrml型活性物。
48.如權(quán)利要求47所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為mrml基因和/或mrml同源基因的敲除突變株。
49.如權(quán)利要求44所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞缺乏或具有被抑制、減少或耗竭的Ochl型活性物。
50.如權(quán)利要求49所述的細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞為ochl基因或ochl同源基因的敲除突變株。
51.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種定位于高爾基體的異源酶或其催化域,所述定位于高爾基體的異源酶或其催化域選自甘露糖基(α-1,3-)_糖蛋白β-1,2_Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&ιΤΙ);甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,2_Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&1ΤΙΙ);β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&1ΤΙΙΙ);甘露糖基(α-1,3-)_糖蛋白β-1,4_Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&1TIV);甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,6_Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&iTV);甘露糖基(α-1,6-)-糖蛋白β-1,4_Ν-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(&1TVI);β-N-乙酰葡糖氨基糖肽β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT);α (1,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FucT);β -半乳糖苷α -2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST);UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶(NeuC);唾液酸合酶(NeuB);CMP-Neu5Ac 合酶;N-酰基神經(jīng)氨酸-9-磷酸合酶;N-酰基神經(jīng)氨酸-9-磷酸酶;UDP-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)體;UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體;GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體;CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體;核苷酸二磷酸酶;⑶P-D-甘露糖4,6-脫水酶;及⑶P-4-酮-去氧-D-甘露糖-3,5-差向異構(gòu)酶-4-還原酶。
52.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其特征在于,所述細(xì)胞選自包括真菌細(xì)胞的低級(jí)真核細(xì)胞及包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞的高級(jí)真核細(xì)胞。
53.一種或多種分離的核酸分子,其能夠編碼或提供權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物。
54.如權(quán)利要求53所述的核酸分子,其特征在于,所述分子選自權(quán)利要求3所述的核酸分子中的一種或多種。
55.一種用于在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒,包含權(quán)利要求53或M所述的任一種核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝,所述一個(gè)或多個(gè)拷貝與編碼啟動(dòng)子的核酸分子和編碼終止子的核酸分子中的至少一種核酸分子結(jié)合。
56.如權(quán)利要求55所述的表達(dá)盒,還包含編碼權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
57.一種用于真核宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體,包含權(quán)利要求53或M所述的任一種核酸分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝和/或權(quán)利要求陽(yáng)或56所述的表達(dá)盒的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
58.一種用于制造細(xì)胞的方法,所述細(xì)胞具體能夠在所述細(xì)胞的細(xì)胞器中合成具有 Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,所述方法包括下述步驟用至少一種編碼脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物的構(gòu)造或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞,所述構(gòu)造或結(jié)構(gòu)選自權(quán)利要求53或M所述的核酸分子; 權(quán)利要求55或56所述的表達(dá)盒;及權(quán)利要求57所述的載體;以使得所述細(xì)胞能夠表達(dá)由所述構(gòu)造或結(jié)構(gòu)編碼的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物。
59.如權(quán)利要求58所述的方法,其中,所述構(gòu)造或結(jié)構(gòu)還編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物,并選自權(quán)利要求56所述的表達(dá)盒,及包含權(quán)利要求57所述的表達(dá)盒的一個(gè)或多個(gè)拷貝的載體,以使得所述細(xì)胞能夠表達(dá)由所述構(gòu)造或結(jié)構(gòu)編碼的脂質(zhì)連接寡糖翻轉(zhuǎn)酶活性物和寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性物。
60.如權(quán)利要求58或59所述的方法,還包括步驟在所述細(xì)胞內(nèi)減少或耗竭至少一種酶活性物,所述酶活性物選自Alg2型活性物;Algll型活性物;Alg3型活性物;DPMI型活性物;脂質(zhì)連接單糖(LLM)翻轉(zhuǎn)酶型活性物。
61.一種或多種分離的細(xì)胞,所述細(xì)胞能夠在細(xì)胞器中合成具有ManlGlCNAC2, Man2GlCNAC2和/或Man3GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)連接寡糖,并且能夠轉(zhuǎn)移所述多糖結(jié)構(gòu)至在所述細(xì)胞中表達(dá)的新生蛋白質(zhì),其特征在于,所述細(xì)胞根據(jù)權(quán)利要求58-60中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)制造。
62.一種用于制造糖蛋白或糖蛋白組合物的方法,包括如下步驟 提供權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞;在所述細(xì)胞內(nèi)允許制造所述糖蛋白或糖蛋白組合物的條件下,于培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞;及必要時(shí),從所述細(xì)胞和/或所述培養(yǎng)基中分離所述糖蛋白或糖蛋白組合物。
63.一種用于制造糖蛋白或糖蛋白組合物的試劑盒,包括 權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞;及培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)所述細(xì)胞以制造所述糖蛋白。
64.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 GlcNAcMan3-5GlcNAc2 結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
65.一種具有GlCNACMan3-5GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求45所述的細(xì)胞制造。
66.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 GlcNAc2Man3GlcNAc2 結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
67.一種具有GlCNAC2Man3GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求66所述的細(xì)胞制造。
68.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
69.一種具有GlCNAC3Man3GlCNAC2-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求68所述的細(xì)胞制造。
70.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
71.一種具有feil2GlCNAC2Man3GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求70所述的細(xì)胞制造。
72.一種具有 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 或 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白組合物,由權(quán)利要求70所述的一種或多種細(xì)胞制造。
73.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc 多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
74.一種具有feil2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求73所述的細(xì)胞制造。
75.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
76.一種具有feil2GlCNAC3Man3GlCNAC2-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求75所述的細(xì)胞制造。
77.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
78.一種具有feil2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求77 所述的細(xì)胞制造。
79.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
80.一種具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求79所述的細(xì)胞制造。
81.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc 多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
82.一種具有NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求81 所述的細(xì)胞制造。
83.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
84.一種具有NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求83所述的細(xì)胞制造。
85.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
86.一種具有NeuAc2Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc-平分型多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求85所述的細(xì)胞制造。
87.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
88.一種具有GlCNAC3Man3GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求87所述的細(xì)胞制造。
89.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
90.一種具有feil3GlCNAC3Man3GlCNAC2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求89所述的細(xì)胞制造。
91.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2 多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
92.一種具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求91所述的細(xì)胞制造。
93.如權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞,其具體經(jīng)設(shè)計(jì)用來(lái)制造具有 NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc 多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。
94.一種具有NeuAc3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2Fuc多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白,由權(quán)利要求93 所述的細(xì)胞制造。
95.一種或多種分離的糖蛋白,選自下述一種或多種由權(quán)利要求1-52或權(quán)利要求61中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞制造的糖蛋白; 可利用權(quán)利要求62所述的方法制造的糖蛋白;及權(quán)利要求 63,67,69,71,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,及 94 中任一項(xiàng)所述的糖蛋白。
96.一種糖蛋白組合物,包含兩種或多種不同的如權(quán)利要求95所述的糖蛋白。
97.一種或多種重組的治療用蛋白,其如權(quán)利要求95或96所述。
98.一種或多種免疫球蛋白,其如權(quán)利要求96或97所述。
99.一種藥物組合物,包含權(quán)利要求95-98中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的糖蛋白或糖蛋白組合物中的一種或多種,并且包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體或輔藥。
100.如權(quán)利要求95-99中任一權(quán)利要求所述的糖蛋白或糖蛋白組合物,應(yīng)用在可通過(guò)施用所述糖蛋白或糖蛋白組合物來(lái)治療的疾病的治療方法中。
101.一種治療失調(diào)的方法,所述失調(diào)可通過(guò)施用權(quán)利要求95-99中任一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的糖蛋白或糖蛋白組合物中的一種或多種來(lái)治療,所述方法包括下述步驟給對(duì)象施用如上所述的糖蛋白或糖蛋白組合物,其中,所述對(duì)象患有或疑似患有可通過(guò)施用所述糖蛋白或糖蛋白組合物治療的疾病。
全文摘要
本發(fā)明改善了真核生物中的糖蛋白制造及蛋白糖基化工程,特別是類人復(fù)合物或雜交糖蛋白在例如酵母等低級(jí)真核生物中的制造。本發(fā)明提供了經(jīng)糖基化修飾的真核宿主細(xì)胞,其能夠制造可用作免疫球蛋白及其他治療用蛋白的糖基化優(yōu)化蛋白,并提供了能夠制造具有與人細(xì)胞中制造的糖蛋白類似的多糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可由所述細(xì)胞制造的具有類人多糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)及其新組合物。
文檔編號(hào)C12N9/10GK102203123SQ200980143919
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者喬尼·赫勒紐斯, 亞歷山大·丹尼爾·弗雷, 克里斯廷·紐珀特, 法勞西·帕爾賽-納賽比, 馬庫(kù)斯·艾比 申請(qǐng)人:隆薩股份公司