一種降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群的糖基化滸苔寡糖制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群的糖基化滸苔寡糖制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人民生活的提高，高血糖人群的日益擴(kuò)大，由高血糖引起的糖尿病，血液循環(huán)系統(tǒng)疾病對(duì)人類健康危害越來越大。近年來的研究數(shù)據(jù)顯示，腸道菌群與2型糖尿病密切相關(guān)。雙歧桿菌是人體腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬，是人類健康的重要標(biāo)志之一。雙歧桿菌數(shù)量的減少可導(dǎo)致整個(gè)腸道菌群失調(diào)和腸道微生態(tài)失衡，從而導(dǎo)致眾多代謝性疾病的發(fā)生。雙歧桿菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖誘發(fā)的胰島素分泌功能，降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠內(nèi)毒素血癥和血漿脂肪組織的促炎癥因子水平，從而改善糖尿病代謝紊亂的狀態(tài)。寡糖的巖藻糖基化是通過巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到寡糖上完成的。巖藻糖基化寡糖在真核生物的多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。滸苔隸屬綠藻門石莼目石莼科滸苔屬植物，具有取材方便、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，是開發(fā)海洋藥物的極好資源。目前，功能性滸苔寡糖研究相關(guān)報(bào)道極少，尚未見糖基化滸苔寡糖降血糖和促進(jìn)腸道益生菌增殖功能研究的相關(guān)報(bào)道或?qū)＠?。本發(fā)明制備的糖基化滸苔寡糖對(duì)P葡萄糖苷酶具有強(qiáng)抑制活性，能顯著促進(jìn)腸道益生菌增殖，在制備治療和預(yù)防糖尿病腸道疾病藥物及保健品上的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群的糖基化滸苔寡糖制備方法。制備工藝路線簡(jiǎn)單有效，增強(qiáng)了功能性寡糖的活性，是一種綠色高效制備糖基化功能性寡糖的有效方法，極大提升了綠藻滸苔資源的經(jīng)濟(jì)附加值。制備的糖基化滸苔寡糖對(duì)葡萄糖苷酶具有強(qiáng)抑制活性，能顯著促進(jìn)腸道益生菌增殖，并且具有改善腸道菌群的功效，對(duì)腸道益生菌雙歧桿菌增殖有明顯促進(jìn)作用。本發(fā)明糖基化滸苔寡糖可應(yīng)用于降糖益生菌制劑藥物或保健品的制備，所要解決的技術(shù)問題是提供一種療效好且利用度高的防治糖尿病改善腸道菌群的糖基化寡糖。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
(1)取干燥、超微粉碎、過80-100目篩的滸苔粉末，按重量體積比(g/mL)1:20-30加入質(zhì)量濃度為60%-80%的乙醇溶液，60-90 0C下200-400W超聲提取1-1.5小時(shí)，提取結(jié)束后，進(jìn)行過濾，將濾渣重復(fù)上述步驟進(jìn)行2-3次提取，合并提取液，將獲得的濾液混合后進(jìn)行減壓濃縮至原體積的3-8%，真空冷凍干燥后粉碎，過50-80目篩；
(2)向步驟(I)所得粉末中加入蒸餾水，其中粉末質(zhì)量與蒸餾水體積比為(g/mL)l:10-20，進(jìn)行攬摔復(fù)溶，用Sevag法、二氣二氯乙燒法、二氯乙酸法中一種或幾種除蛋白3_5次；
(3)將步驟(2)所得到的溶液，通過HPD-826大孔吸附樹脂填充柱，洗脫液進(jìn)一步過非極性吸附劑活性炭，活性炭使用量與洗脫液按重量體積比(g/mL)l:30-50去除色素，于搖床中60-80 !?/111；[11振蕩1-211，4000-6000印1]1離心15-20 min，收集上清液；
(4)將步驟(3)得到的上清液旋蒸濃縮至原體積的3-8%，然后按體積比1:3-4加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，攪拌后放入4-10°C條件下靜置24 h，6000-8000rpm離心15-20min，取上清液減壓濃縮、冷凍干燥得滸苔功能性寡糖的固體，粉末后過50-80目篩；
(5)將步驟(4)中滸苔寡糖粗品粉末加蒸餾水溶解，粉末質(zhì)量與水體積比(g/mL)為1:20-50，溶液用截留分子量2000D透析袋處理，收集透析液，在37-40°C及轉(zhuǎn)速為60-80 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/10-1/5;濃縮液采用截留分子量500D透析袋處理，將截留液冷凍干燥，制備得到未糖基化滸苔寡糖精制品；
(6)步驟(5)得到的滸苔寡糖精制品按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l:1-2溶解于蒸餾水中，將商品化巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行生物反應(yīng)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用量與反應(yīng)體系按質(zhì)量與體積比(mg/mL) 1:3-5，反應(yīng)體系中消1笞寡糖與二磷酸鳥苷-巖藻糖濃度比(mM) 1:1.0-1.5 ,MgCl2終濃度為 15-20 mM，pH6.5-8.0，置于35-40°C溫度，80-100 r/min搖床條件下反應(yīng)24 -36 ho
[0005](7)將步驟(6)反應(yīng)體系按體積比1:1添加95%乙醇，終止反應(yīng)并沉淀蛋白，8000_10000 r/min離心15-20min去除沉淀，收集上清濃縮，真空冷凍干燥后得到糖基化滸苔活性寡糖粗品。
[0006](8)將步驟(7)所得粗品溶解后過B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝膠，蒸餾水洗脫，經(jīng)3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定收集寡糖組分，濃縮后真空冷凍干燥得到糖基化滸苔活性寡糖。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明利用巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶生物反應(yīng)制備出具有防治2型糖尿病改善腸道菌群的糖基化滸苔寡糖，尚未見到巖藻糖基化滸苔寡糖促進(jìn)腸道益生菌增殖的報(bào)道。本發(fā)明簡(jiǎn)單易操作，提高了功能性寡糖的原有活性，減少了巖藻糖基化寡糖制備的生產(chǎn)成本。同時(shí)，本發(fā)明能有效合理的綜合利用滸苔資源，提高其商品價(jià)值與經(jīng)濟(jì)附加值。
【附圖說明】
[0008]圖1滸苔寡糖對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。
[0009]圖2糖基化寡糖對(duì)嬰兒雙歧桿菌Bifidobacterium infantis增殖影響。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1
(I)取干燥、超微粉碎、過80目篩的滸苔粉末，按重量體積比(g/mL)1: 20加入質(zhì)量濃度為60%的乙醇溶液，60°C下200W超聲提取I小時(shí)，提取結(jié)束后，進(jìn)行過濾，將濾渣重復(fù)上述步驟進(jìn)行2次提取，合并提取液，將獲得的濾液混合后進(jìn)行減壓濃縮至原體積的3%，真空冷凍干燥后粉碎，過50目篩；
(2 )向步驟(I)所得粉末中加入蒸餾水，其中粉末質(zhì)量與蒸餾水體積比為(g/mL ) 1:1O，進(jìn)行攪拌復(fù)溶，用三氟三氯乙烷法除蛋白3次；
(3)將步驟(2)所得到的溶液，通過HPD-826大孔吸附樹脂填充柱，洗脫液進(jìn)一步過非極性吸附劑活性炭，活性炭使用量與洗脫液按重量體積比(g/mL)l: 30去除色素，速度為60 r/min振蕩I 11，4000印1]1離心15 min，收集上清液；
(4)將步驟(3)得到的上清液旋蒸濃縮至原體積的3%，然后按體積比1:3加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，攪拌后放入4°C條件下靜置24 h，6000rpm離心15min，取上清液減壓濃縮、冷凍干燥得滸苔功能性寡糖的固體，粉末后過50目篩；
(5)將步驟(4)中滸苔寡糖粗品粉末加蒸餾水溶解，粉末質(zhì)量與水體積比(g/mL)為1:20，溶液用截留分子量2000D透析袋處理，收集透析液，在37°(:及轉(zhuǎn)速為60 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/10;濃縮液采用截留分子量500D透析袋處理，將截留液冷凍干燥，制備得到未糖基化滸苔寡糖精制品；
(6)步驟(5)得到的滸苔寡糖精制品按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l:1溶解于蒸餾水中，將商品化巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行生物反應(yīng)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用量與反應(yīng)體系按質(zhì)量與體積比(mg/mL)l:3，反應(yīng)體系中消1笞寡糖與二磷酸鳥苷-巖藻糖濃度比(mM)l: 1.0，MgCl2終濃度為15禮，？!16.5，置于35°(:溫度，80 r/min搖床條件下反應(yīng)24 h。
[0011](7)將步驟(6)反應(yīng)體系按體積比1:1添加95%乙醇，終止反應(yīng)并沉淀蛋白，10000r/min離心20min去除沉淀，收集上清濃縮，真空冷凍干燥后得到糖基化滸苔活性寡糖粗品。
[0012](8)將步驟(7)所得粗品溶解后過B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝膠，蒸餾水洗脫，經(jīng)3，
5-二硝基水楊酸法測(cè)定收集寡糖組分，濃縮后真空冷凍干燥得到糖基化滸苔活性寡糖。
[0013]
實(shí)施例2
(1)取干燥、超微粉碎、過100目篩的滸苔粉末，按重量體積比(g/mL)1:30加入質(zhì)量濃度為80%的乙醇溶液，900C下400W超聲提取1.5小時(shí)，提取結(jié)束后，進(jìn)行過濾，將濾渣重復(fù)上述步驟進(jìn)行3次提取，合并提取液，將獲得的濾液混合后進(jìn)行減壓濃縮至原體積的8%，真空冷凍干燥后粉碎，過80目篩；
(2)向步驟(I)所得粉末中加入蒸餾水，其中粉末質(zhì)量與蒸餾水體積比為(g/mL)1:20，進(jìn)行攪拌復(fù)溶，用Sevag法除蛋白5次；
(3)將步驟(2)所得到的溶液，通過HPD-826大孔吸附樹脂填充柱，洗脫液進(jìn)一步過非極性吸附劑活性炭，活性炭使用量與洗脫液按重量體積比(g/mL)l: 50去除色素，于搖床中80r/min振蕩2 11，5000印1]1離心17 min，收集上清液；
(4)將步驟