專利名稱：用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最優(yōu)化的宿主細(xì)胞的制作方法
用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最優(yōu)化的宿主細(xì)胞 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2006年11月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/872， 281 的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。該申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用將其全部并入本文。發(fā)明背景[OOOl]選擇生產(chǎn)高水平重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞系是生物技術(shù)中最大的 挑戰(zhàn)之一。用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞宿主群體常常表現(xiàn)為遺傳學(xué)上異質(zhì) 的細(xì)胞，它們具有不同的生長(zhǎng)屬性及其他屬性。甚至當(dāng)這些宿主群體 是來(lái)源于一個(gè)個(gè)體細(xì)胞的群體時(shí)，對(duì)此細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)久而久之會(huì)導(dǎo)致 產(chǎn)生這樣的細(xì)胞群體，其中個(gè)體細(xì)胞以一種或多種累積的遺傳差異為 特征。為了生產(chǎn)蛋白質(zhì)，將編碼目的蛋白質(zhì)的一種或多種遺傳序列引 入細(xì)胞中。引入了遺傳序列的群體中的每個(gè)細(xì)胞可以吸收不同拷貝數(shù) 的遺傳序列，而這些序列中的任何一條又可以整合入此細(xì)胞基因組中 不同位置。結(jié)果產(chǎn)生了細(xì)胞的很大的多樣性，其中每個(gè)細(xì)胞具有生產(chǎn) 目的蛋白質(zhì)的不同潛力。為了生產(chǎn)蛋白質(zhì)，有可能使用全部或部分引 入了遺傳序列的宿主細(xì)胞，或者也有可能測(cè)試細(xì)胞的克隆群體、或由 這個(gè)群體中分離的單個(gè)細(xì)胞衍生而來(lái)的細(xì)胞系，以鑒別具有最佳蛋白 質(zhì)生產(chǎn)及其他特征的細(xì)胞，其他特征如對(duì)蛋白質(zhì)生產(chǎn)有利的某種生長(zhǎng) 或增殖特征。由于細(xì)胞巨大的多樣性，難以從有成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的群 體中鑒定并分離出具有增加的生產(chǎn)目的RNA(例如，編碼目的蛋白的 一個(gè)RNA)能力的單個(gè)細(xì)胞。有限稀釋是鑒定用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞 系的一種普通方法，其中將幾百和如果通過(guò)機(jī)器人技術(shù)自動(dòng)化則數(shù)千 個(gè)單個(gè)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以產(chǎn)生克隆群體，然后評(píng)估克隆群體的 蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力。然而，由于細(xì)胞在蛋白質(zhì)生產(chǎn)和其他特征(如生長(zhǎng) 或增殖速率)二者上的巨大多樣性，測(cè)試如此相對(duì)小數(shù)目的細(xì)胞對(duì)于效(ineffective)的方法。流式細(xì)胞儀或細(xì) 胞分選具有分析及分離單個(gè)細(xì)胞的能力，能對(duì)更巨大數(shù)目的個(gè)體細(xì)胞 進(jìn)行測(cè)試，是另一種有助于選擇這種稀有細(xì)胞的方法。然而，流式細(xì) 胞技術(shù)中用到的很多測(cè)量個(gè)體細(xì)胞中RNA或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法常 常需要?dú)⑺勒粶y(cè)量的細(xì)胞，或者不能在單個(gè)細(xì)胞中測(cè)量蛋白質(zhì)生產(chǎn)。 此外，這些現(xiàn)在應(yīng)用的方法不能夠評(píng)估細(xì)胞的增殖速率。因此，需要 有方法用于鑒定、分離及培養(yǎng)具有增加的RNA或蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率的細(xì) 胞的高通量方法，其中還根據(jù)最優(yōu)化的生長(zhǎng)及增殖屬性選擇細(xì)胞。
現(xiàn)有增加細(xì)胞中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法還聚焦在最優(yōu)化培養(yǎng)基 配方上。例如，增加或減少生長(zhǎng)培養(yǎng)基的多種成分如糖、鹽、氨基酸、 維生素等。例如，參見(jiàn)Chu和RoMnson， Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12(2): 180_7; Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 (1) : 52-7; Dempsey等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 (1) : 175-8;及Sauer等人，Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5; 67 ( 5 ): 585-97。這些努力聚焦在異質(zhì)細(xì)胞群體上。也有可能產(chǎn)生可 靠地生產(chǎn)高水平蛋白質(zhì)的克隆細(xì)胞群體，并為此克隆群體最優(yōu)化培養(yǎng) 基。
此外，表達(dá)高水平目的RM的細(xì)胞可以將其很多能量花費(fèi) 在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中并且因此生長(zhǎng)速率降低(Gu等人，Cytotechnology. 1992: 9 ( 1-3 ): 237-45和Kromenaker等人，Biotechnol Prog. 1994 May-Jun; 10 ( 3 ): 299-307 )。具體而言，當(dāng)使用非克隆細(xì)胞群體時(shí)， 生長(zhǎng)速率降低會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)生產(chǎn)降低的細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。選擇在不同或 最優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下具有最佳生長(zhǎng)譜和增殖譜的細(xì)胞的方法還有助 于建立用于最優(yōu)化的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞群體。發(fā)明概迷
本發(fā)明涉及分離表達(dá)增加水平的目的RNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞 的方法。本發(fā)明還涉及分離具有改變的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞，例如具 有增加或降低的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞的方法。還提供了分離具有改變8的細(xì)胞增殖速率(例如，增加或降低的細(xì)胞增殖速率)的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞還表達(dá)增加水平的目的RNA或蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離具有增加的細(xì)胞增 殖速率的細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與用于監(jiān)測(cè) 細(xì)胞增殖速率的焚光試劑接觸，以及分離顯示出一定水平的熒光試劑 的熒光的細(xì)胞，所述一定水平的熒光試劑的熒光與細(xì)胞增殖的增加有 關(guān)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于分離具有增加的 細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞也表達(dá)高水平的目的RNA。 該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與熒光發(fā)生探針接觸，該熒光發(fā)生 探針在與目的RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；將該群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速 率的熒光試劑接觸；以及分離顯示出增加的熒光發(fā)生探針的熒光和一 定水平的熒光試劑的熒光的細(xì)胞，所述一定水平的熒光試劑的熒光與 細(xì)胞增殖的增加有關(guān)。檢測(cè)熒光發(fā)生探針的熒光可以與檢測(cè)用于監(jiān)測(cè) 細(xì)胞增殖速率的試劑的熒光同時(shí)測(cè)定。備選地，檢測(cè)熒光發(fā)生探針的測(cè)定。用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑可以發(fā)出與熒光發(fā)生探針相 同或不同波長(zhǎng)的熒光。根據(jù)本發(fā)明的方法分離到的細(xì)胞可以進(jìn)一步培 養(yǎng)從而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。在特定實(shí)施方案中，以上方法進(jìn)一 步包括測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物密度的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增加的細(xì)胞 密度的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)增加水平的 目的RNA。該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與熒光發(fā)生探針接觸， 該熒光發(fā)生探針在與目的RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；從顯示出增加的焚光 發(fā)生探針的熒光的群體中分離細(xì)胞；培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞以產(chǎn)生第一 細(xì)胞培養(yǎng)物；重復(fù)上述步驟從而分離第二細(xì)胞培養(yǎng)物；測(cè)量第一和第 二細(xì)胞培養(yǎng)物的密度；以及鑒定具有增加或更高的細(xì)胞密度的細(xì)胞培 養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)增加的高水平目的RNA。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了分離具有二相生長(zhǎng)譜(biphasic growth profile )的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)鐠 第一部分中具有增加的增殖速率，并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部 分中具有降低的增殖速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟 將細(xì)胞群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸，以及分離在生 長(zhǎng)譜第一部分中顯示出改變的熒光試劑的熒光且在生長(zhǎng)譜第二部分中 顯示出未改變或降低的焚光試劑的熒光的細(xì)胞。
在特定的其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離具有二相生 長(zhǎng)譜的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第一部分中具有增加的增 殖速率，并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部分中具有降低的增殖速率， 并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部分中表達(dá)的目的RM水平等于或高 于在生長(zhǎng)譜第一部分表達(dá)的目的RNA水平。在其他的實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了分離具有二相生長(zhǎng)譜的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng) 譜第一部分中具有增加的增殖速率，并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二 部分有著降低的增殖速率，并且其中細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部分中表達(dá)的 目的RNA水平低于在生長(zhǎng)譜第一部分表達(dá)的目的RNA水平。在一個(gè)實(shí) 施方案中，該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與熒光發(fā)生探針接觸， 該熒光發(fā)生探針在與所述目的RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；將所述群體與用 于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸，其中所述試劑發(fā)出與焚光發(fā)生 探針不同波長(zhǎng)的熒光；以及分離在生長(zhǎng)鐠第一部分中顯示出改變的熒 光試劑的熒光，在生長(zhǎng)語(yǔ)第二部分中顯示出未改變或降低的熒光試劑 的熒光強(qiáng)度變化，而且在生長(zhǎng)譜第二部分中顯示出增加的熒光發(fā)生探 針的熒光的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟將細(xì) 胞群體與熒光發(fā)生探針接觸，該熒光發(fā)生探針在與所述的目的RNA雜 交時(shí)發(fā)出熒光；將所述群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸， 其中所述試劑發(fā)出與熒光發(fā)生探針不同波長(zhǎng)的熒光；以及分離在生長(zhǎng) 謙第一部分中顯示出改變的熒光試劑的熒光，在生長(zhǎng)i普第二部分中顯示出增加的熒光試劑的熒光，而且在生長(zhǎng)譜第二部分中顯示出增加的 熒光發(fā)生探針的熒光的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下 步驟將細(xì)胞群體與熒光發(fā)生探針接觸，該熒光發(fā)生探針在與所述的目的RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；將群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試 劑接觸，其中所述試劑發(fā)出與熒光發(fā)生探針不同波長(zhǎng)的熒光；以及分 離在生長(zhǎng)傳第一部分中顯示出改變的熒光試劑的熒光，在生長(zhǎng)譜第二 部分中顯示出未改變或降低的熒光試劑的熒光，而且在生長(zhǎng)譜第二部 分中顯示出降低的熒光發(fā)生探針的熒光的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中， 檢測(cè)熒光發(fā)生探針的熒光可以與檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)在生長(zhǎng)譜第二部分中細(xì) 胞增殖速率的試劑的熒光同時(shí)測(cè)定。備選地，檢測(cè)熒光發(fā)生探針的熒 光與檢查用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的試劑的熒光在分開(kāi)的步驟中測(cè)定。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑發(fā)出與熒光 發(fā)生探針相同波長(zhǎng)的焚光。根據(jù)本發(fā)明的方法分離的細(xì)胞可以進(jìn)一步 經(jīng)培養(yǎng)從而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。在特定實(shí)施方案中，以上方法 進(jìn)一步包括測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物密度的步驟。
本文描述的任一方法可以進(jìn)一步包括將本發(fā)明的細(xì)胞與監(jiān) 測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的 方法進(jìn)一步包括將具有增加的增殖速率或增加的RNA或蛋白生產(chǎn)的細(xì) 胞與監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接觸的步驟。例如，可以將顯示 出增加的熒光信號(hào)探針的熒光及改變的監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率試劑的熒光 的細(xì)胞與監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接觸。顯示出凋亡或預(yù)凋亡 標(biāo)記物的細(xì)胞會(huì)不被選擇。[OOll]可以使用本發(fā)明的方法檢測(cè)的RNA包括內(nèi)源或異質(zhì)的RNA， 其中包括但不限于編碼蛋白的信使RNA、反義RNA分子、結(jié)構(gòu)RM (structure RNA)、核糖體RNA、 h禮A和snRNA。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于檢測(cè)mRNA， 此mRNA編碼免疫球蛋白重鏈，免疫球蛋白輕鏈，單鏈Fv，抗體的片 斷如Fab、 Fab，或(Fab， ) 2，或免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，熒光的檢測(cè)是通過(guò)熒光顯微 鏡、焚光細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞分選技術(shù)或熒光平板讀取器來(lái)測(cè)定。檢 測(cè)熒光可以在單個(gè)樣本中檢測(cè)，或者一次性在多個(gè)樣本中檢測(cè)，如在 高通量的測(cè)定中檢測(cè)。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光 試劑選自羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯、SNARF-1羧酸、醋酸 琥詢酯、PKH26、 HoechstCPAl、 CyquantGR和NF染料、MTT以及CTT。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于分離和/或培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、；微生物細(xì)胞、藻類細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、Per. C6細(xì)胞。在特定實(shí)施 方案中，CHO細(xì)胞是CH0K1細(xì)胞、CH0K1SV細(xì)胞、CHO-S細(xì)胞或DG44 細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是BL21細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述真菌細(xì)胞選自金孢霉屬(C力7xyo^oWM7)細(xì)胞、曲 霉屬(A/7er^77/M)細(xì)胞、木霉屬(7>/cAof/eivz/a)細(xì)胞、網(wǎng)柄菌屬 (Z /c0^^e7/wz7)細(xì)胞、念珠菌屬(Cs/K/2't/a )細(xì)胞、酵母屬 (5^cc力aro邁/ces)細(xì)胞、裂歹直酵母屬(ScA/zosaccAaro/z^ces)細(xì)月包 和青霉屬(戶e/7/c/77/咖)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞 是SF9細(xì)胞或SF21細(xì)胞。發(fā)明詳述定義
術(shù)語(yǔ)"鄰近的"用于探針的上下文中時(shí)，指一種接近的條 件從而允許相互作用彼此功能性地相互作用。例如，接近的條件允許 熒光基團(tuán)被淬滅劑部分淬滅或部分地淬滅。允許目前所知熒光基團(tuán)和 淬滅劑相互作用的距離為大約20-100A。
術(shù)語(yǔ)"生物質(zhì)"指兩個(gè)或多存活細(xì)胞組成的群體。存活細(xì) 胞可以在任何體積的培養(yǎng)基中。
術(shù)語(yǔ)"凸出區(qū)域"指沒(méi)有配對(duì)的一個(gè)核苷酸或修飾的核苷 酸的單鏈區(qū)域。凸出的核苷酸的鄰側(cè)是相互互補(bǔ)的區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)"啞鈴結(jié)構(gòu)"指具有兩個(gè)通過(guò)每個(gè)莖干區(qū)域伸出的臂 的末端相連的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸或修飾的核酸的鏈。所述連接可能是修 飾或無(wú)修飾的非互補(bǔ)區(qū)域或者磷酸二酯鍵。
術(shù)語(yǔ)"相互作用對(duì)，，指兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)，它們?cè)谙嗷ム徑鼤r(shí)功能性地相作用，而在不相互鄰近時(shí)產(chǎn)生與無(wú)信號(hào)或由相互作用化學(xué) 基團(tuán)產(chǎn)生的背景信號(hào)相比可檢測(cè)的信號(hào)，或者產(chǎn)生與相互作用化學(xué)基團(tuán)產(chǎn)生的信號(hào)不同的信號(hào)。相互作用對(duì)包括但不限于熒光基團(tuán)和淬 滅劑，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和淬滅劑或加合物(adduct ),染料二聚體和FRET 供體及受體，或者它們的組合。信號(hào)探針可以包含一個(gè)以上相互作用 對(duì)。例如，波長(zhǎng)移動(dòng)信號(hào)探針具有都與淬滅劑相互作用的第一熒光基 團(tuán)和第二熒光基團(tuán)，且這兩個(gè)熒光基團(tuán)是FRET供體和受體對(duì)。
術(shù)語(yǔ)"環(huán)區(qū)域，，指一個(gè)以上的未配對(duì)核苷酸或修飾的核苷 酸的單鏈區(qū)域。所述環(huán)還可以處于具有彼此相互互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的一 個(gè)或多個(gè)核苷酸的兩個(gè)區(qū)域之間。例如，環(huán)的上游區(qū)域與環(huán)下游區(qū)域 互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。
術(shù)語(yǔ)"信號(hào)探針"指如下探針，其包含與靶核酸序列互補(bǔ) 的序列和至少相互互補(bǔ)區(qū)域，并進(jìn)一步包含至少一個(gè)相互作用對(duì)。當(dāng) 信號(hào)探針未結(jié)合其靶序列時(shí)，相互作用對(duì)的各部分相互鄰近，以至于 不能產(chǎn)生或產(chǎn)生很少或不同的信號(hào)。當(dāng)信號(hào)探針結(jié)合其靶序列時(shí)，相 互作用對(duì)的各部分不再相互鄰近，并產(chǎn)生了可檢測(cè)的信號(hào)或不同于探 針未結(jié)合狀態(tài)所產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針是熒 光發(fā)生探針，它包含熒光基團(tuán)和淬滅劑部分，當(dāng)與靶序列雜交時(shí)產(chǎn)生 熒光的改變。相互作用對(duì)的各部分可以連接到信號(hào)探針的末端或可以 連接到核酸序列之內(nèi)?？梢员粌?nèi)部地并入到信號(hào)探針序列上的部分的 實(shí)例包括但不局限于淬滅劑dabcyl dT、 BHQ2 dT和BHQ1 dT，以及 熒光基團(tuán)熒光素dT、 Alexa dT和Tamra dT。
術(shù)語(yǔ)"錯(cuò)配區(qū)域"指核酸分子或修飾的核酸分子中的雙鏈 區(qū)域，其中的堿基或修飾的堿基沒(méi)有形成Watson-Crick堿基配對(duì)。錯(cuò) 配區(qū)域的鄰側(cè)是兩個(gè)堿基配對(duì)的區(qū)域。雙鏈區(qū)域可以是非氫鍵合的或 氬鍵的以形成Hoogst 6sn械基對(duì)等,或兩種情況都有。
術(shù)語(yǔ)"相互互補(bǔ)區(qū)域"指核酸分子或修飾的核酸分子中的 Watson—Crick;^l酉己對(duì)區(qū)^。
術(shù)語(yǔ)"非互補(bǔ)區(qū)域"指核酸分子或修飾的核酸分子中的非13Watson-Crick堿基配對(duì)區(qū)域。例如，非互補(bǔ)區(qū)域可以設(shè)計(jì)成具有凸出 的核普酸、單鏈環(huán)、5，或3，末端的突出核苷酸或錯(cuò)配區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)"莖千區(qū)域"指核酸分子或修飾的核酸分子中至少含 有兩個(gè)非Watson-Crick堿基配對(duì)的區(qū)域。例如，莖干區(qū)域可以設(shè)計(jì)成 具有通過(guò)非互補(bǔ)區(qū)域連接的一個(gè)以上相互互補(bǔ)區(qū)域，或形成連續(xù)的相 互互^卜區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)"莖環(huán)結(jié)構(gòu)"指核酸分子或修飾的核酸分子具有單鏈 環(huán)序列，其兩側(cè)是一對(duì)5，和3，寡核苷酸或修飾的寡核苷酸臂。5' 和3，臂形成莖千區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)"三臂交叉結(jié)構(gòu)"指核苷酸或修飾的核苷酸的鏈，其 具有通過(guò)莖千區(qū)域的臂連接的莖千區(qū)域、第一莖環(huán)區(qū)域和第二莖環(huán)區(qū) 域的構(gòu)象。第一莖環(huán)區(qū)域在第二莖環(huán)區(qū)域的5，端。這三個(gè)區(qū)域可以 通過(guò)非互補(bǔ)區(qū)域、磷酸二酯鍵或修飾的磷酸二酯鍵或它們的組合相連。
除非另外定義，否則所有本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ) 的意思都與本領(lǐng)域技術(shù)人員普通理解的意思相同。如果有沖突，以本 說(shuō)明書(shū)包括定義為準(zhǔn)。另外，除非另外有上下文需要，否則單數(shù)的術(shù) 語(yǔ)包括了復(fù)數(shù)形式，復(fù)數(shù)的術(shù)語(yǔ)包括了單數(shù)形式。 一般的，本文描述 的與細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā) 育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)有關(guān)的命名法和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知并普遍使用 的。
貫穿于本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方案中的，詞語(yǔ)"包含"或其變體 如"包括，，或"含有"可以理解為表示包括一個(gè)所述的組成體或一 組組成體但不排除任何其他的組成體或一組組成體。
本文提到的所有發(fā)表物和其他參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用將其 全部并入。盡管本文引用了大量文檔，但此引用不構(gòu)成承認(rèn)任一文檔 形成本領(lǐng)域普通一般知識(shí)的一部分。2、 發(fā)明方法
影響細(xì)胞群體中總RNA和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的兩個(gè)培養(yǎng)參數(shù)包括(i)細(xì)胞特定的生產(chǎn)速率，和(n)用于RNA和/或蛋白質(zhì)生產(chǎn) 的細(xì)胞群體的生長(zhǎng)特征。本發(fā)明的方法和組合物最優(yōu)化了這些參數(shù)中 一個(gè)或兩個(gè)。第三個(gè)影響細(xì)胞群體中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的變量是細(xì)胞增殖速 率。例如，具有增加的增殖速率的細(xì)胞比具有降低的增殖速率的細(xì)胞 可能在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞的一定生物量。因此，在 一個(gè)給定時(shí)間段內(nèi)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)量就最大化了。在一些情況下，細(xì)胞 可以降低細(xì)胞增殖以將能量輸出轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)生產(chǎn)上。因此，在另一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離具有降低的增殖速率的細(xì)胞的方法， 其中所述細(xì)胞也表達(dá)增加水平的編碼目的蛋白質(zhì)的RNA。
本發(fā)明的方法基于熒光發(fā)生信號(hào)探針和可以用于增殖標(biāo)記 物的試劑在存活的細(xì)胞中產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)的能力，而無(wú)需固定或裂 解細(xì)胞。在活細(xì)胞中，熒光發(fā)生信號(hào)探針在與靶標(biāo)RM序列雜交時(shí)產(chǎn) 生可檢測(cè)的信號(hào)，且當(dāng)RNA是蛋白質(zhì)編碼RNA時(shí)與細(xì)胞產(chǎn)生的相應(yīng)蛋 白質(zhì)的量相關(guān)。本發(fā)明中所使用的信號(hào)探針和增殖標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào) 檢測(cè)出來(lái)應(yīng)當(dāng)比所測(cè)試細(xì)胞群體中產(chǎn)生的平均水平(例如背景焚光)更高或者不同。因此，平均的細(xì)胞一點(diǎn)都不產(chǎn)生熒光是不必要。在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞系的方法，所述細(xì) 胞或細(xì)胞系具有增加的目的RNA或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。例如，本發(fā)明的方 法可用于分離細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞系，所述細(xì)胞或細(xì)胞系具有相對(duì)于所測(cè) 試細(xì)胞群體中目的RM或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)增加的目的RM或蛋白質(zhì)的生 產(chǎn)。正如本文所使用的，對(duì)照細(xì)胞與本發(fā)明的分離的細(xì)胞相同，但是 它沒(méi)有用本文描述的發(fā)明中任何方法就增加或降低的RNA或蛋白質(zhì)生 產(chǎn)而選擇，或沒(méi)有就改變的細(xì)胞增殖速率而選擇。
如本文所描述，使用可用作增殖標(biāo)記物的信號(hào)探針和試劑 使得能夠鑒定就增加的目的RNA(如編碼蛋白質(zhì)的RNA )的生產(chǎn)最佳化 的細(xì)胞。不像需要固定或裂解細(xì)胞來(lái)分析細(xì)胞內(nèi)成分的試劑，信號(hào)探 針和增殖標(biāo)記物的熒光能用于分析活細(xì)胞中胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)水平。 這個(gè)特征使得能夠分離和繁殖具有增加的目的RNA生產(chǎn)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用包含編碼目的RNA的基因的DNA構(gòu)建體將編碼目 的蛋白質(zhì)的遺傳序列引入細(xì)胞(如，轉(zhuǎn)染)后，將識(shí)別目的RNA的熒 光發(fā)生信號(hào)探針引入細(xì)胞。這個(gè)步驟可以在用選擇標(biāo)記物進(jìn)行任選的 篩選后進(jìn)行，如，若被轉(zhuǎn)染的DNA構(gòu)建體也編碼藥物抗性則可以進(jìn)行 藥物選擇。轉(zhuǎn)錄了所述基因的細(xì)胞發(fā)熒光。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞與增殖標(biāo)記物如CFSE接觸。在 用CFSE染色之后，可以隨時(shí)間監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂，或者可以讓細(xì)胞在定量 增殖標(biāo)記物的信號(hào)之前的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分裂?？梢允辜?xì)胞在定量增 殖標(biāo)記物的信號(hào)之前增殖短于1小時(shí)到1天，1到5天，3到10天，5 到15天，l到2周，1.5到4周或者至多IO周。在一個(gè)實(shí)施方案中， 分離具有增加的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞。分離這些細(xì)胞可以基于，例如， 增殖標(biāo)記物的降低的熒光信號(hào)。具有不同增殖速率的細(xì)胞依據(jù)增殖標(biāo) 記物的不同信號(hào)水平被分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離具有降低的 細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)增加水平的目的RNA或蛋白 質(zhì)。細(xì)胞可以同時(shí)或在不同的時(shí)間暴露于增殖標(biāo)記物和信號(hào)探針。如 果是在不同的時(shí)間，細(xì)胞可以在暴露于信號(hào)探針接觸之前或者之后暴 露于增殖標(biāo)記物。細(xì)胞可以在不同時(shí)間暴露于增殖標(biāo)記物和信號(hào)探針 接觸但同時(shí)進(jìn)行分析，例如細(xì)胞可以在一個(gè)時(shí)間暴露于增殖標(biāo)記物而 在相應(yīng)于幾次細(xì)胞分裂所需要的時(shí)間長(zhǎng)度(基于平均細(xì)胞加倍時(shí)間) 之后的第二個(gè)時(shí)間暴露于信號(hào)探針。
可以用檢測(cè)熒光的任何已知方法分離在CFSE染色或信號(hào) 探針雜交時(shí)產(chǎn)生多種水平的熒光的細(xì)胞。例如，可以用流式細(xì)胞分選 技術(shù)分離在CFSE染色或信號(hào)探針雜交時(shí)產(chǎn)生熒光的細(xì)胞。分離的細(xì)胞 可以隨后用于產(chǎn)生表達(dá)高水平目的RNA以及還具有增加或降低的增殖 速率的細(xì)胞系。
本發(fā)明的方法和組合物還可以用于分離具有一個(gè)以上目的 RNA生產(chǎn)增加的細(xì)胞，甚至不需要在選擇性藥物和試劑存在下維持細(xì) 胞。細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)染或者用另外的方式引入兩種或多種DNA或RNA構(gòu) 建體。所述兩種或多種DNA或RNA構(gòu)建體可以同時(shí)或順序地轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。第一目的RNA的信號(hào)探針可以產(chǎn)生與其他目的RNA的信號(hào)探針相 同或不同的信號(hào)。例如，它們可以具有相同或不同的熒光基團(tuán)。可以 通過(guò)同時(shí)或順序重復(fù)這些步驟來(lái)提供表達(dá)兩種以上RNA的細(xì)胞或細(xì)胞 系。DNA或RNA構(gòu)建體任選地包含一種或多種藥物或選擇性試劑標(biāo)記 物。在轉(zhuǎn)染及任選的藥物選擇后，將針對(duì)每種目的RM的信號(hào)探針引 入細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞隨后由流式細(xì)胞分選技術(shù)分選，于 是分離出表達(dá)所述兩種或多種目的RNA或蛋白質(zhì)的任意組合的細(xì)胞。
在特定實(shí)施方案中，使用多輪次本文描述的方法從而得到 具有兩種或多種目的RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)增加的細(xì)胞。例如，用一種 或多種編碼目的RNA或蛋白質(zhì)的RNA或DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞且根據(jù)本 文描述的方法對(duì)其分離。接著用一種或多種編碼目的RNA或蛋白質(zhì)的 RNA或DNA構(gòu)建體對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步輪次的轉(zhuǎn)染。這個(gè)方法用 于例如產(chǎn)生具有增加的蛋白質(zhì)復(fù)合體、相同或相關(guān)生物學(xué)途徑中的 RNA或蛋白質(zhì)、在彼此的上游或下游作用的RNA或蛋白質(zhì)、對(duì)彼此具 有調(diào)控、激活或抑制功能的RNA或蛋白質(zhì)、在功能或活性上相互依賴 的RNA或蛋白質(zhì)、或共享同源性(例如序列、結(jié)構(gòu)或功能同源性) 的RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)增加的細(xì)胞。例如，這個(gè)方法可以用于產(chǎn)生具 有免疫球蛋白蛋白質(zhì)(如IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM)的重鏈和輕鏈 或其抗原結(jié)合片段的表達(dá)增加的細(xì)胞系。免疫球蛋白蛋白質(zhì)可以是完 全人的、人化的或嵌合的免疫球蛋白蛋白質(zhì)。f為、庠^才炎f時(shí)勿應(yīng)燴崖遽畢#勿^敏#才法
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從具有比群體中細(xì)胞平 均生長(zhǎng)增加的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞群體中分離細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞系的方 法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從具有比群體中細(xì)胞平均生 長(zhǎng)降低的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞群體中分離細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞系的方法。 所述細(xì)胞任選地還表達(dá)增加水平的目的RNA或蛋白質(zhì)。從起始群體中 分離的細(xì)胞的增殖速率與起始群體中細(xì)胞的平均增殖速率相比增加或 降低了至少1.3倍。在其他實(shí)施方案中，來(lái)源于從起始群體中分離的 細(xì)胞的細(xì)胞的增殖速率與起始群體中細(xì)胞的平均增殖速率相比增加或17降低了至少1.5倍、至少2. 0倍、至少2.5倍、至少3. 0倍、至少5 倍或至少10倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)最優(yōu)化培養(yǎng)基配方(如 優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，如糖類、鹽類、氨基酸、維生素等)而改變(如 增加或降低)細(xì)胞增殖速率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)遺傳學(xué)或代 謝工程而改變細(xì)胞增殖速率。例如，可通過(guò)表達(dá)、過(guò)表達(dá)或改變影響 細(xì)胞增殖速率的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)而改變?cè)鲋乘俾省＠缫?jiàn)Mazur 等人，Biotechnol Prog. 1998; 14: 705-713，其全部?jī)?nèi)容并入本文 作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)表達(dá)、過(guò)表達(dá)或改變負(fù)責(zé)細(xì)胞周 期、細(xì)胞分裂或DNA復(fù)制的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)而改變細(xì)胞增殖速率， 所述基因或蛋白質(zhì)例如編碼細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、 細(xì)胞周期依賴性磷酸酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制劑、細(xì)胞周 期轉(zhuǎn)錄因子、DNA聚合酶、組蛋白和參與DNA復(fù)制起始的蛋白質(zhì)的基 因。被遺傳學(xué)或代謝方式工程改造的特定基因或蛋白質(zhì)依賴于本發(fā)明 使用的生物體且能由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò) 表達(dá)一種或多種MYC基因如c-MYC而改變細(xì)胞增殖速率。例如見(jiàn) Ifandi等人，Biotechnol Prog. 2005; 21: 671-677，其全部?jī)?nèi)容并 入本文作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與來(lái)自起始細(xì)胞培養(yǎng) 物群體的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的平均細(xì)胞密度相比，增加細(xì)胞培養(yǎng)物中 的細(xì)胞密度的方法。所述細(xì)胞任選地還表達(dá)增加水平的目的RNA或蛋 白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度與來(lái)自起始細(xì)胞培養(yǎng)物群體的細(xì)胞的細(xì) 胞培養(yǎng)物的平均細(xì)胞密度相比增加至少1.2倍。在其他實(shí)施方案中，比增加了至少1.5倍、至少2. 0倍、至少2. 5倍、至少3. 0倍、至少 5倍或至少10倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)最優(yōu)化培養(yǎng)基配方(如最 優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，如糖類、鹽類、氨基酸、維生素等)而增加細(xì) 胞培養(yǎng)物密度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)遺傳學(xué)或代謝工程的手段 而增加細(xì)胞培養(yǎng)物密度。例如，通過(guò)表達(dá)Bcl-2、 Bcl-t或p21,在 細(xì)胞中抑制凋亡。抑制凋亡可以增加細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度也增加蛋白質(zhì)生產(chǎn)。例如見(jiàn)Itoh等人,Biotechnology and Bioengineering 2004; 48: 118-122; Chiang等人，Biotechnology and Bioengineering 2005; 91: 779-792;和Jung等人，Biotechnology and Bioengineering 2002; 79: 180-187;其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。在特定實(shí)施方案中，一 種或多種MYC基因與Bcl-2共表達(dá)以增加細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞密度。 例如見(jiàn)Ifandi等人，Biotechnol. Prog. 2005; 21: 671-677，和 Bissonnette等人，Nature. 1992; 359: 552-554，其全部?jī)?nèi)容并入 本文作為參考。
細(xì)胞增殖速率根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞類型而變 化。例如，細(xì)菌細(xì)胞在30分鐘或更少的時(shí)間內(nèi)可以分裂從而產(chǎn)生兩個(gè) 存活的子細(xì)胞，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞每10-24小時(shí)才分裂一次，甚至每次 細(xì)胞分裂花費(fèi)超過(guò)一天的時(shí)間。例如，真核細(xì)胞每12-30小時(shí)可以分 裂一次?？梢杂杉夹g(shù)工作人員通過(guò)在細(xì)胞生長(zhǎng)周期的增殖期監(jiān)測(cè)群體 中存活細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞的加倍時(shí)間。
細(xì)胞增殖的增加還依賴于營(yíng)養(yǎng)條件。在特定實(shí)施方案中， 通過(guò)最優(yōu)化培養(yǎng)基配方(例如最優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)成分的濃度，如糖類、鹽 類、氨基酸、維生素等)而增加細(xì)胞的增殖速率。例如，見(jiàn)Chu和 Robi畫n， Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12 ( 2 ) : 180-7; Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19(1): 52-7; Dempsey 等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 ( 1 ) : 175-8;和Sauer 等人，Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5; 67 ( 5 ) : 585-97，其全部 內(nèi)容并入本文作為參考。
為提高重組蛋白產(chǎn)量也可以最優(yōu)化環(huán)境條件。例如，將哺 乳動(dòng)物細(xì)胞置于亞生理溫度之下可以導(dǎo)致重組蛋白產(chǎn)量的增加。例如， 見(jiàn)Al-Fageeh等人,Biotechnology and Bioengineering 2006; 93: 829-835和Baik等人,Biotechnology and Bioengineering 2006; 93: 361-371,其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。
細(xì)胞可以用標(biāo)準(zhǔn)方法和儀器來(lái)定量。例如，將細(xì)胞的一部 分涂布于固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以測(cè)量群體中菌落形成細(xì)胞單位的數(shù)量。備選地，可以使用如分光光度計(jì)和血球計(jì)數(shù)器這些儀器。也可以使用用于測(cè)量細(xì)胞密度的自動(dòng)化的技術(shù)和儀器如Guava ViaCount測(cè)定和 Beckman Coulter Vi-CELL自動(dòng)細(xì)胞存活分析儀。
本發(fā)明中任一用于分離細(xì)胞的方法中，可以培養(yǎng)細(xì)胞從而 生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物或產(chǎn)生細(xì)胞系。
本文描述的任一用于分離具有增加的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞 或產(chǎn)生具有增加的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞系的方法還可以包括檢測(cè)細(xì)胞 凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的步驟。凋亡和預(yù)凋亡標(biāo)記物包括，例如，DNA 切割、核破碎、染色體濃縮、壞死、細(xì)胞膜起泡、聚(ADP-核糖)聚 合酶切割、胱天蛋白酶3激活或其它凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。凋亡或預(yù) 凋亡標(biāo)記物還包括對(duì)碘化丙咬或7-AAD的通透性。在一個(gè)實(shí)施方案中， 本文描述的方法進(jìn)一步包括以下步驟將具有增加的增殖速率或增加 的RNA或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞與用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接 觸。例如，顯示出增加的熒光發(fā)生信號(hào)探針的熒光和改變的用于監(jiān)測(cè) 細(xì)胞增殖速率試劑的熒光的細(xì)胞可以與用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物 的試劑接觸。用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑在本領(lǐng)域中熟知。 用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的焚光試劑的實(shí)例包括熒光標(biāo)記的膜聯(lián) 蛋白-V和硤化丙淀。^Z^I，加麥產(chǎn)#勿應(yīng)培#參^才法
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有更大傾向 于增加細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。例如，提高有能力生產(chǎn)蛋白質(zhì) 的存活細(xì)胞數(shù)量或生物量(例如增加細(xì)胞培養(yǎng)物密度)使得提高生 物量生產(chǎn)的蛋白質(zhì)總量。細(xì)胞培養(yǎng)物密度可以提高1到10倍(例如 1.5倍、2倍、3倍、5倍或IO倍)，提高10到100倍(例如15倍、 25倍、50倍或100倍)，提高100到1000倍(例如150倍、250倍、 500倍或1000倍)，或大于1000倍。例如，最終細(xì)胞培養(yǎng)物密度可 以在大約1 x 1(T個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基到1 x 105個(gè)細(xì)胞/1111培養(yǎng)基范圍內(nèi)， 在lxl()5個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基到lxl()6個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基范圍內(nèi)，在1 xl()6個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基到lxlO'個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基范圍內(nèi)，在lx107個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基到lxl()8個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基范圍內(nèi)，或者甚至大于1 x 108個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)物密度的增加依賴于營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條 件，還根據(jù)本發(fā)明中所用的細(xì)胞類型而變化?？梢耘囵B(yǎng)根據(jù)一種或多 種增殖標(biāo)記物的標(biāo)記的不同水平而分離的細(xì)胞，并且可以測(cè)試產(chǎn)生的 群體以鑒定具有更高傾向達(dá)到更高細(xì)胞密度的細(xì)胞。
在特定實(shí)施方案中，通過(guò)最優(yōu)化培養(yǎng)基配方(例如最優(yōu) 化營(yíng)養(yǎng)成分濃度如糖類、鹽類、氨基酸、維生素等)而增加蛋白質(zhì)生 產(chǎn)細(xì)胞的生物量。例如，見(jiàn)Chu和Robi謂n， Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12(2): 180-7; Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 U) : 52-7; Dempsey等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 (1) : 175-8;和Sauer等人，Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5; 67 ( 5 ): 585-97，其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，通過(guò)阻止蛋白質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞的群體中細(xì)胞死亡或凋亡而增加蛋白質(zhì) 生產(chǎn)細(xì)胞的生物量。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有 增加的細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá) 增加水平的目的RNA。例如，提供了用于生產(chǎn)高濃度的存活且具生產(chǎn) 力的細(xì)胞的方法，這些細(xì)胞還能迅速增殖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)遺傳學(xué)或代謝工 程改變細(xì)胞群體的細(xì)胞培養(yǎng)物密度的方法。例如，可以通過(guò)抑制凋亡 細(xì)胞的死亡而增加細(xì)胞密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)了抗凋亡存活 蛋白質(zhì)，如bcl-2或bc1-xL。在其他實(shí)施方案中，使用了抑制胱天蛋 白酶或表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)HSP70來(lái)增加細(xì)胞密度。在其他實(shí)施方案 中使用了代謝工程的方法。使用代謝工程來(lái)增加細(xì)胞密度是通過(guò)抑制 新陳代謝有毒副產(chǎn)物如乳酸和氨的積累或通過(guò)工程性改進(jìn)新陳代謝途 徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。例如，丙酮酸羧化酶的表達(dá)可以增加葡萄糖向三羧酸循 環(huán)中的流動(dòng)。
本文描述的任一用于生產(chǎn)具有增加的細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng) 物的方法還可以包括監(jiān)測(cè)細(xì)胞的凋亡性細(xì)胞死亡的步驟。在一個(gè)實(shí)施 方案中，本文描述的方法進(jìn)一步包括了將細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞與用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接觸這一步驟。用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋 亡標(biāo)記物的試劑是本領(lǐng)域熟知的。用于監(jiān)測(cè)凋亡的熒光試劑包括熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-v和碘化丙啶。在特定實(shí)施方案中，凋亡細(xì)胞或傾向凋亡的細(xì)胞不被選擇。為、岸^才二畝i長(zhǎng)-w敘敏的才法
本發(fā)明提供了用于分離具有二相生長(zhǎng)譜的細(xì)胞的方法。二 相生長(zhǎng)譜的特征是在生長(zhǎng)譜第 一部分迅速增殖。這種迅速增殖使得在 一段短的時(shí)間段內(nèi)積累蛋白產(chǎn)生細(xì)胞的群體。這個(gè)迅速生長(zhǎng)階段隨后 是由迅速向慢速增殖甚至不增殖的轉(zhuǎn)變。這個(gè)增殖降低或較低的階段 以蛋白質(zhì)生產(chǎn)的增加為特征。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法分離的細(xì)胞在 其生長(zhǎng)鐠第一部分具有增加的增殖速率。生長(zhǎng)譜的這個(gè)部分的特征還 在于增加或降低的蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率。在生長(zhǎng)譜第二部分，細(xì)胞或多個(gè) 細(xì)胞具有降低或較低的增殖速率，其中細(xì)胞表達(dá)與生長(zhǎng)譜第一部分的 表達(dá)水平相比增加的目的RNA水平。在特定實(shí)施方案中，還可以監(jiān)測(cè) 細(xì)胞的細(xì)胞死亡和凋亡來(lái)選擇具有最小凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物存在的細(xì) 胞。檢測(cè)熒光的方法記物一并使用，以鑒別和/或分開(kāi)在一種或多種波長(zhǎng)下顯示出 一定水平 或多個(gè)水平熒光的細(xì)胞。例如，信號(hào)探針和增殖標(biāo)記物的熒光可以用 熒光顯微鏡、熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞分選技術(shù)或熒光酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè) 和/或定量。流式細(xì)胞分選技術(shù)目前允許每秒分選至多70, OOG個(gè)細(xì)胞。 可以在不到2分鐘內(nèi)分選5， 000， OOO個(gè)細(xì)胞。
本文描述的方法還可以與利用熒光報(bào)告子檢測(cè)胞內(nèi)事件、 狀態(tài)或組成(如，凋亡、壞死，Ca"離子流動(dòng)、pH流動(dòng)、細(xì)胞粘附、 細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)或DNA含量)的測(cè)定法同時(shí)使用。檢測(cè)胞內(nèi)事件的熒 光測(cè)定法的實(shí)例包括，例如熒光染色(如核酸、蛋白質(zhì)和/或膜的染 色)和用來(lái)檢測(cè)蛋白間相互作用或蛋白與核酸相互作用的測(cè)定法?？?以被熒光標(biāo)記而用于這些測(cè)定法的試劑包括但不限于蛋白質(zhì)(用熒光分子或自發(fā)熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記)；熒光代謝指示劑(如C12刃天青)； 熒光底物或副產(chǎn)物；熒光標(biāo)記的凝集素；熒光化學(xué)制品；籠形熒光化 合物；熒光核酸染料；及熒光多聚體、脂類、氨基酸殘基和核苷酸/ 側(cè)(side)類4以物。
本發(fā)明的方法可以用適于與本文描述的信號(hào)探針和增殖標(biāo) 記物一起使用的任何細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì) 胞、細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞、藻類細(xì)胞和真菌細(xì)胞。在一 些實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人、小鼠、大鼠、山羊、 馬、兔、倉(cāng)鼠或牛細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以來(lái)自任何已建立的細(xì)胞系， 包括但不限于HeLa、 NSO、 SP2/0、 HEK293T、 Vero、 Caco、 Caco-2、 MDCK、 COS-1、 C0S-7、 K562、 Jurkat、 CH0-K1、 DG44、 C駆1SV、 CHO-S、 Huvec、 CV-1、 HuH-7、 NIH3T3、 HEK293、 293、 A549、 HepG2、 IMR-90、 MCF-7、 U-2 0S、 Per.C6、 SF9、 SF21或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。 在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞為真菌細(xì)胞，例如選自如下的細(xì)胞金孢霉 屬細(xì)胞、曲霉屬細(xì)胞、木霉屬細(xì)胞、網(wǎng)柄菌屬細(xì)胞、念珠菌屬細(xì)胞、 酵母屬細(xì)胞、裂殖酵母屬細(xì)胞和青霉屬細(xì)胞。在特定的其他實(shí)施方案 中，細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或BL21細(xì)胞。重遂細(xì)種建伴
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于分離具有 增加的目的RNA (如編碼目的蛋白的RNA)生產(chǎn)的細(xì)胞。目的RNA可以 從DNA構(gòu)建體上的基因表達(dá)。例如，將被轉(zhuǎn)錄為目的RNA的DNA構(gòu)建 體引入細(xì)胞?？梢詫NA構(gòu)建體整合到細(xì)胞基因組的不同位置或者可 以留在細(xì)胞胞質(zhì)中。也可以整合到一個(gè)或多個(gè)特定的基因座。然后， 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與信號(hào)探針和/或增殖標(biāo)記物接觸?？梢詫⑿盘?hào)探針和增 殖標(biāo)記物同時(shí)、在一個(gè)之后立即加另一個(gè)、在完全不同的時(shí)間，且以 任何順序暴露于細(xì)胞。在將細(xì)胞暴露于信號(hào)探針和/或增殖標(biāo)記物之 后，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)并分離目的細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域的任何方法分 離和培養(yǎng)細(xì)胞，例如，單個(gè)或批量分離并涂布細(xì)胞。可以通過(guò)培養(yǎng)分離的細(xì)胞而產(chǎn)生細(xì)胞系。
本發(fā)明任一方法可以使用選擇標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行。盡管藥物選 擇(或使用任何其他合適的選擇標(biāo)記物的選擇)不是必需的步驟，但 只要轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體設(shè)計(jì)成賦予藥物抗性，它可以用來(lái)就穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了編 碼目的蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞富集細(xì)胞群體。如果使用信號(hào)探針 的選擇在轉(zhuǎn)染后太早進(jìn)行， 一些陽(yáng)性細(xì)胞可以只是瞬時(shí)而非穩(wěn)定地轉(zhuǎn) 染。然而，這種情況可以由以下方法減至最小進(jìn)行足夠多的細(xì)胞傳 代使得從不穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中稀釋或丟失轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒；或根據(jù)本文描 述的方法進(jìn)行多輪次選擇。^辦'^《^ 和蛋^ j
轉(zhuǎn)染入本發(fā)明的細(xì)胞的DNA構(gòu)建體可以包含轉(zhuǎn)錄成編碼目 的蛋白質(zhì)的RNA的序列，該序列有下列不同功能中的一種或多種編 碼蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、融合到蛋白質(zhì)上的肽、輸出信號(hào)、輸入信號(hào)、 胞內(nèi)定位信號(hào)或其它信號(hào)的信使RNA，這些可以融合到蛋白質(zhì)或肽上。 可以根據(jù)本文所描述的方法生產(chǎn)任何蛋白質(zhì)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于肽激素(如胰島素)、糖蛋白激 素(如促紅細(xì)胞生成素)、抗生素、細(xì)胞因子、酶、疫苗(如HIV疫 苗、HPV疫苗、HBV疫苗)、抗癌治療劑(如Mucl)和治療性抗體。 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，RNA編碼免疫球蛋白蛋白質(zhì)或其抗原結(jié)合 片斷，如免疫球蛋白重鏈，免疫球蛋白輕鏈，單鏈Fv，抗體片斷如Fab、 Fab'或(Fab' ) 2，或免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段。在一個(gè)特別的實(shí) 施方案中，RNA編碼促紅細(xì)胞生成素。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中， RNA編碼一種或多種免疫球蛋白蛋白質(zhì)或其片斷，其結(jié)合到表皮生 長(zhǎng)因子受體(EGFR) 、 HER1或c-ErbB - 1如Erbitux ( cetuximab)。 由本發(fā)明的方法及組合物生產(chǎn)的RNA還可以具有一種或多種以下功 能反義RNA、 siRNA、結(jié)構(gòu)RNA、細(xì)胞RNA，其中包括但不限于如核 糖體RNA、 tRNA、 hnRNA、 snRNA;隨才幾R(shí)NA、對(duì)應(yīng)于cDNA或EST的RNA; 來(lái)自多樣性物種的RNA、對(duì)應(yīng)于寡核苷酸的RNA、對(duì)應(yīng)于整個(gè)細(xì)胞、組 織或生物體cDNA制備物的RNA;對(duì)其他核酸、蛋白質(zhì)、其他細(xì)胞成分或藥物分子具有一定結(jié)合活性的RNA;可以被并入多種大分子復(fù)合體 的RNA;影響一定細(xì)胞功能的RNA;或者不具有前述功能或活性但仍然 可以被細(xì)胞表達(dá)的RNA;對(duì)應(yīng)于病毒或外源RNA、連接子RNA或連接一 種或多種RNA的序列的RNA;或，作為標(biāo)簽或以上任何一種或多種未 修飾的誘變的、隨機(jī)的、換位的序列的組合或重組的RNA。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以包含編碼目的RNA、可操作地連 接至結(jié)構(gòu)性或條件性啟動(dòng)子的DNA，所述啟動(dòng)子包括但不限于可誘導(dǎo) 的、可抑制的、組織特異的、熱休克的、發(fā)育的、細(xì)胞系特異的、或 暫時(shí)的啟動(dòng)子或者以上任何一種或多種未修飾的或誘變的、隨機(jī)的、 換位的序列的組合或重組。3、信號(hào)探針
識(shí)別和報(bào)告特定核酸序列存在的核酸探針已經(jīng)用子檢測(cè)特 定的核酸。例如見(jiàn)美國(guó)專利5， 925， 517，其全部?jī)?nèi)容并入本文作為 參考。 一種類型的探針被設(shè)計(jì)成具有發(fā)卡或莖環(huán)形狀的結(jié)構(gòu)，具有與 靶序列互補(bǔ)的核苷酸的中央節(jié)段，和包含短的相互互補(bǔ)序列的末端。 例如見(jiàn)Tyagi和Kramer, Nature Biotechnology, 14, 303-308( 1996 )， 其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。該探針的 一個(gè)末端共價(jià)結(jié)合到熒光基 團(tuán)上，另一端結(jié)合到淬滅部分。在其原始狀態(tài)，具有雜交的末端，熒 光基團(tuán)和淬滅劑如此接近以至于相對(duì)極少或幾乎沒(méi)有熒光產(chǎn)生。當(dāng)與 其靶核酸雜交時(shí)，所述探針發(fā)生構(gòu)象改變致使熒光基團(tuán)的熒光產(chǎn)生發(fā) 生可檢測(cè)的變化。這種探針已經(jīng)用于觀察活細(xì)胞中的信使RNA (Matsuo， 1998， Biochim.Biophys.Actal379: 178—184 )。類似的探4十 已經(jīng)用于根據(jù)RNA序列的表達(dá)來(lái)分離活細(xì)胞。例如，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6， 692， 965，其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。
本發(fā)明中使用的信號(hào)探針被設(shè)計(jì)成或者與目的RNA的部分 互補(bǔ)或者與其5，或3，非翻譯區(qū)互補(bǔ)。編碼目的RNA的基因可以用標(biāo) 簽序列加標(biāo)簽且探針信號(hào)可以被設(shè)計(jì)成使其識(shí)別所述標(biāo)簽序列。標(biāo)簽 序列可以與基因信息的蛋白質(zhì)編碼部分在同框或者與其不同框，這根據(jù)是否希望給所生產(chǎn)的蛋白加標(biāo)簽。標(biāo)簽序列可以是與信號(hào)探針的序 列全部或部分互補(bǔ)的任何核苷酸序列。蛋白質(zhì)標(biāo)簽的實(shí)例包括但不限
于c-myc、血凝素及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。信號(hào)探針包含一個(gè)或多個(gè)的相互作用對(duì)，且可以有不同的 相互作用對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針是熒光發(fā)生探針。例如， 見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6， 692， 965和國(guó)際公布WO 2005/079462，其全部?jī)?nèi)容 并入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光發(fā)生探針在其未雜交狀 態(tài)下不發(fā)射熒光或發(fā)射出背景水平的熒光，但是結(jié)合其靶標(biāo)時(shí)就發(fā)出 背景水平之上的熒光或發(fā)出高于背景水平的熒光?？梢允褂枚嘀?zé)晒?基團(tuán)來(lái)增加信號(hào)或提供不同顏色范圍的熒光?？梢允褂枚嘀卮銣鐒┰?缺少靶序列時(shí)降低或消除信號(hào)。淬滅劑的實(shí)例包括但不限于DABCYL、 EDAC、銫、溴化二吡啶對(duì)二曱苯、鉈和金納米顆粒。熒光基團(tuán)的實(shí)例 包括但不限于磺酰羅丹明101、吖啶、5- (2，-氨乙基)氨基萘-l-磺 酸(EDANS)，德克薩斯紅、伊紅和Bodipy和Alexa Fluor350、 Alexa Fl雨405、 AlexaFl雨430、 AlexaFl雨488、 Alexa Fl雨500、 Alexa Fluor514、 AlexaFl雨532、 AlexaFl窗546、 Alexa Fluor555、 Alexa Fluor568、 Alexa Fl雨594、 Alexa Fluor610、 Alexa Fluor633、 Alexa Fluor635、 Alexa Fluor647、 Alexa Fluor660、 Alexa Fluor680、 Alexa Fluor700、 Alexa Fluor705、別藻藍(lán)蛋白、氨基香豆素、Bodipy-FL、 Cy2、 Cy3、 Cy3. 5、 Cy5、 Cy5. 5、羧基焚光素(FAM) 、 Cascade Blue、 APC-Cy5、 APC-Cy5. 5、 APC-Cy7、香豆素、ECD( Red613 )、熒光黃(FITC )、 六氯熒光素(HEX)、羥基香豆素、Lissamine羅丹明B、螢光黃、甲 氧基香豆素、俄勒岡綠488、俄勒岡綠514、 Pacific Blue、 PE-Cy7 綴合物、PerC、 PerCP-Cy5.5、 R-藻紅蛋白(PE)、羅丹明、羅丹明綠、 羅丹明紅-X、四氯熒光素(TET) 、 TRITC、四曱基羅丹明、德克薩斯 紅-X、 TRITC、 XRITC和量子點(diǎn)。例如，見(jiàn)Tyagi等人Nature Biotechnology 16:49-53， (1998)及 Dubertret 等人，Nature Biotechnology, 19: 365-370 ( 2001 ),其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。本發(fā)明還提供了波長(zhǎng)移動(dòng)的信號(hào)探針。在一個(gè)實(shí)施方案中， 探針的一個(gè)末端具有至少一個(gè)收獲熒光基團(tuán)及一個(gè)發(fā)射熒光基團(tuán)，該 探針的鄰近末端具有至少一個(gè)淬滅劑部分。例如，見(jiàn)Tyagi等人， Nature Biotechnology, 18， 1191-1196 ( 2000 )，其全部?jī)?nèi)容并入 本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，收獲熒光基團(tuán)及發(fā)射熒光基團(tuán)在 相同的末端，其中發(fā)射熒光基團(tuán)在遠(yuǎn)端而淬滅劑部分在與收獲熒光基 團(tuán)相對(duì)的一端。發(fā)射熒光基團(tuán)可以通過(guò)幾個(gè)核苷酸的間隔子臂與收獲 熒光基團(tuán)隔開(kāi)。收獲熒光基團(tuán)在單色光源的波長(zhǎng)范圍內(nèi)強(qiáng)烈吸收。在 沒(méi)有靶標(biāo)時(shí)，探針發(fā)出在發(fā)射熒光基團(tuán)的發(fā)射范圍內(nèi)的熒光。發(fā)射光 譜的移動(dòng)是由于來(lái)自收獲熒光基團(tuán)的吸收的能量通過(guò)熒光能量共轉(zhuǎn)移 而轉(zhuǎn)移到發(fā)射熒光基團(tuán)上。這些類型的信號(hào)探針可以提供比含有不能 有效從單色光源吸收能量的熒光基團(tuán)的信號(hào)探針更強(qiáng)的信號(hào)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，收獲熒光基團(tuán)是熒光黃，且發(fā)射熒光基團(tuán)是6-羧基羅丹 明6G、四甲基羅丹明或德克薩斯紅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，探針的一端具有至少一個(gè)熒光基團(tuán) Fl，且另一個(gè)相鄰末端具有至少另一個(gè)熒光基團(tuán)F2。選擇這兩個(gè)熒光 基團(tuán)使得當(dāng)它們?cè)诤芙咏鼤r(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。當(dāng)探針 未結(jié)合其靶序列時(shí)，在Fl的吸收波段的激發(fā)時(shí)，F(xiàn)l的熒光會(huì)被F2淬 滅，并且觀察到F2的熒光。當(dāng)探針結(jié)合其靶序列時(shí)，F(xiàn)RET減少或消 除，且F1的熒光升高而F2的熒光減少或消失。能監(jiān)測(cè)這個(gè)熒光強(qiáng)度 的差異，并可以計(jì)算Fl和F2的熒光之間的比值。由于有時(shí)候會(huì)在熒 光基團(tuán)-淬滅劑系統(tǒng)中觀察到殘存的熒光，因此這個(gè)系統(tǒng)在定量檢測(cè)耙 序列時(shí)更有優(yōu)勢(shì)。見(jiàn)Zhang等人，Angrew. Chem. Int. Ed. 40， 2， pp. 402-405 (2001)，其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。FRET供體-受體對(duì)的實(shí)例包括但不限于分別為香豆素組及6-羧基焚光素組。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針包含發(fā)光標(biāo)記及加合物對(duì)。 加合物與發(fā)光標(biāo)記的相互作用減少了從標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)。見(jiàn)Becker 和Nelson,美國(guó)專利5, 731， 148，其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針包含至少一個(gè)染料二聚體。 當(dāng)探針結(jié)合靶序列時(shí)，來(lái)自染料的信號(hào)與來(lái)自二聚體構(gòu)象中染料的信 號(hào)不同。
^#豕封-戈^他探封^^#
雙鏈結(jié)構(gòu)本發(fā)明提供了包含至少兩條分開(kāi)的核酸鏈的信號(hào)探針或其 他探針，所述核酸鏈設(shè)計(jì)成相互退火或形成至少一個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)域。 一條鏈的至少一個(gè)末端與另一條鏈的一個(gè)末端是想鄰近的。所述核酸 可以是DNA、 RNA或修飾的DNA或RNA。這兩條鏈可以是形成自我二聚 體的相同的鏈。所述鏈也可以是序列上不相同的。
非互補(bǔ)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩條分開(kāi)的鏈設(shè)計(jì)成與彼此完 全互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩條鏈形成在每個(gè)末端形成4-9、 5-6、 2-10、 10-40、或40 - 400個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的相互互補(bǔ)區(qū)域。所 述鏈可以含有5-7、 8-10、 11-15、 16-22、超過(guò)30、 3-10、 11-80、 811-200或超過(guò)200個(gè)核苷酸或修飾的核苷酸。所述兩條鏈可以具有 相同或不同數(shù)目的核苷酸。例如， 一條鏈比另一條更長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施 方案中， 一條鏈的5，末端從另一條鏈偏移(offset)，或者其3，末 端從另一條鏈偏移，或者兩個(gè)末端都偏移，其中抵消的部分可以多至 10個(gè)、多至20個(gè)或多至30個(gè)堿基或修飾的堿基。與靶序列雜交的區(qū)域可以在一條或兩條鏈的互補(bǔ)區(qū)域、非 互補(bǔ)區(qū)域或其組合中。多于一 條靶核酸序列可以被相同的信號(hào)探針耙 向。所述一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)可以在相同或不同的序列上，且它們可以與 被設(shè)計(jì)與靶標(biāo)結(jié)合的探針的部分準(zhǔn)確互補(bǔ)或至少足夠的互補(bǔ)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述兩條鏈在各自末端形成相互互補(bǔ)區(qū)域且乾標(biāo)補(bǔ)充序 列處于末端相互互補(bǔ)區(qū)域以外的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有至少兩條分開(kāi)的鏈的信號(hào)探針是 熒光發(fā)生探針。在一個(gè)實(shí)施方案中， 一條鏈在一端具有至少一個(gè)淬滅 劑部分，且在另一條鏈鄰近的一端具有熒光基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，
28一條鏈5，和3，末端中每個(gè)都具有彼此相同或不同的熒光基團(tuán)，而且 另一條鏈5，和3，末端中每個(gè)都具有彼此相同或不同的淬滅劑部分。 在一個(gè)實(shí)施方案中， 一條鏈的5，末端具有熒光基團(tuán)而3，末端具有淬 滅劑部分，且另一條鏈的3，末端具有相同或不同的淬滅劑部分，5， 末端具有相同或不同的熒光基團(tuán)。 莖環(huán)結(jié)構(gòu)在另一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針是核酸或修飾的核酸的鏈， 其包含至少一個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)域和至少一個(gè)非互補(bǔ)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方 案中，探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖干區(qū)域可以是相互互補(bǔ)的或包含相互互 補(bǔ)區(qū)域和非互補(bǔ)區(qū)域。例如，莖干區(qū)域可以有未形成堿基配對(duì)的凸出 的核苷酸。莖干區(qū)域也可以含有不發(fā)生堿基配對(duì)的、在5，和3，末端 的突出的核苷酸。當(dāng)莖千區(qū)域完全互補(bǔ)時(shí)，莖干區(qū)域可以包括3-4、 5-6、 7-8、 9-10、 2-6、 7-10或11-30個(gè)堿基對(duì)。環(huán)區(qū)域可以包括10-16、 17-26、 27-36、 37-45、 3-10、 11-25或25-60個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中 莖環(huán)區(qū)域形成了 4-10、 4或5個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)擁有兩個(gè)化學(xué)
基團(tuán)的相互作用對(duì)，且一個(gè)化學(xué)基團(tuán)是在這條鏈的每個(gè)末端之上的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)探針在這條鏈的每個(gè)末端有至少一個(gè)熒光基 團(tuán)和一個(gè)淬滅劑部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，莖干區(qū)域包含通過(guò)非互補(bǔ)區(qū)域相連的 兩個(gè)相互互補(bǔ)區(qū)域，與相互作用對(duì)鄰近的相互互補(bǔ)區(qū)域形成5 - 9個(gè)堿 基對(duì)，且與環(huán)區(qū)域鄰近的相互互補(bǔ)區(qū)域形成4 - 5個(gè)堿基對(duì)。在一個(gè)實(shí) 施方案中，非互補(bǔ)區(qū)域是單鏈環(huán)區(qū)域、錯(cuò)配區(qū)域或者二者。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，莖干區(qū)域包含通過(guò)兩個(gè)非互補(bǔ)區(qū)域相連的三個(gè)相互互補(bǔ) 區(qū)域，與相互作用對(duì)鄰近的第一相互互補(bǔ)區(qū)域形成4-5個(gè)堿基對(duì)，第 二相互互補(bǔ)區(qū)域形成2 - 3個(gè)堿基對(duì)，而與環(huán)區(qū)域鄰近的第三相互互補(bǔ) 區(qū)域形成2-3個(gè)堿基對(duì)。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，與靼序列互補(bǔ)的區(qū)域可以在一個(gè)或多個(gè)莖干區(qū)域或環(huán)區(qū)域中，或在二者中。莖干中與靶標(biāo)雜交的區(qū)域可以在相 互互補(bǔ)區(qū)域、非互補(bǔ)區(qū)域或二者中。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)補(bǔ)充序 列在單鏈環(huán)區(qū)域當(dāng)中的。在一個(gè)實(shí)施方案中，與相互作用對(duì)鄰近的莖 干區(qū)域之外的區(qū)域是靶標(biāo)補(bǔ)充序列。多于 一種靶核酸序列可以被相同 的探針耙向。所述一種或多種靶標(biāo)可以在相同或不同序列上，且它們 可以與被設(shè)計(jì)與靶標(biāo)結(jié)合的探針的部分準(zhǔn)確互補(bǔ)或至少足夠的互補(bǔ)。莖干長(zhǎng)度的增加可以提高信號(hào)探針在其關(guān)閉構(gòu)象中的穩(wěn)定 性，并且因此可以提高可檢測(cè)信號(hào)的信噪比。可以在對(duì)細(xì)胞仍然安全 的略微提高的溫度下將這些探針信號(hào)暴露于細(xì)胞，之后回到正常溫度。 在更高的溫度下，信號(hào)探針會(huì)打開(kāi)并且如果其靶標(biāo)存在時(shí)結(jié)合到其靶 標(biāo)上。 一旦冷卻，未結(jié)合到靼標(biāo)上的信號(hào)探針會(huì)回復(fù)到關(guān)閉狀態(tài)，莖 干穩(wěn)定性的提高有助于這一點(diǎn)。類似的，其他力量可以用來(lái)達(dá)到相同 的結(jié)果，例如考慮用DMSO使堿基對(duì)松散。
^"f探封W^夢(mèng)夢(mèng)謬本發(fā)明還提供了化學(xué)修飾的信號(hào)探針或其他探針?？梢孕?飾一種或多種糖-磷酸二酯類型的骨架，2， 0H，堿基。磷酸二酯鍵的 替換物包括但不限于 一OP (OH) (0) 0—， —OP ((TM+) (0) 0—， 一0P (SH) (0) 0—， --OP (SM+) (0) O--， 一NHP (0) 20— —OC (0) 20--， 一OCH2C (0) 2冊(cè)一，一0CH2C (0) 20—， 一OP (CH3) (0) 0--， —OP (CH2C6H5) (0)0—， —P(S) (O)O--和--0C(0)2NH—。 M+是無(wú)機(jī)或有機(jī) 陽(yáng)離子。該骨架還可以是肽核酸，其中脫氧核糖磷酸骨架被假肽骨架 替換。肽核酸在 Hyrup 和 Nielsen, A/0orga"2.c 《#e￡/2'c2'72 s7 C力e/z7/s"/ 4:5-23， 1996， 及Hydig-Hielsen和Godskesen， WO 夕J/"MJ中有描述，其中每篇文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容都并入本文作為參考。糖結(jié)構(gòu)的2'位包括但不限于H、 0H、 d-G烷氧基 OCH2-CH=CH2、 OCH2-CH=CH-CH3、 0CH2-CH=CH-(CH2) nCH3 (n-0， 1 ... 30)、 閨族元素(F、 Cl、 Br、 1)、 d-C6烷基及0CH3。 d-C4烷氧基及d-G
烷基可以是或可以包括直鏈、支鏈或環(huán)狀的基團(tuán)。核苷酸的堿基可以是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤或修飾的這些堿基中的任何一個(gè)。修飾的堿基包括
但不限于N4-甲基脫氧鳥(niǎo)嘌呤、脫氮雜或氮雜嘌呤和嘧啶。環(huán)上的 氮如腺嘌呤的N1、鳥(niǎo)嘌呤的N7、胞嘧啶的N3可以被烷基化。嘧啶堿 基能在5或6位被取代，而噪呤堿基可以在2、 6或8位被取代。例如， 見(jiàn)Cook, W0 93/13121; Sanger, iV/z^/p/es o尸^c7eic Jc/d 5Y藩&re, Springer-Verlag， New York (1984)，其全部?jī)?nèi)容并入本 文作為參考。常規(guī)核苷酸的衍生物是本領(lǐng)域熟知的，并且包括例如具有 不同類型糖的分子。糖的04，位置可以被S或CH2所取代。例如，核 苷酸堿基識(shí)別序列可以具有由連接部分連接的環(huán)丁基部分，其中環(huán)丁 基部分具有與其連接的雜環(huán)堿基。例如，見(jiàn)Cook et al.，國(guó)際公布 W0 94/19023 (這里其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)。
但不限于膽固醇、轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(如TAT、滲透素等)。 4、增殖標(biāo)記物在特定實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用細(xì)胞分裂的熒 光標(biāo)記物。標(biāo)記細(xì)胞的熒光標(biāo)記物用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂，因?yàn)闃?biāo)記的細(xì) 胞熒光的改變表示細(xì)胞已經(jīng)分裂?？梢噪S時(shí)間監(jiān)測(cè)熒光以得到細(xì)胞增 殖速率。細(xì)胞增殖的增加會(huì)關(guān)聯(lián)著用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞的熒光標(biāo)記物的增加 或減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞分裂的熒光標(biāo)記物的熒光減少關(guān)聯(lián) 著細(xì)胞增殖的增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞分裂的熒光標(biāo)記物的 熒光增加關(guān)聯(lián)著細(xì)胞增殖的增加。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用羧基焚光素二乙酸琥珀酰亞胺 酯(CFSE)標(biāo)記細(xì)胞，此熒光染料可以自發(fā)并不可逆地通過(guò)與賴氨酸 側(cè)鏈及其他可及氨基基團(tuán)的反應(yīng)結(jié)合到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。將CFSE染料體 外加到細(xì)胞上，并隨時(shí)間監(jiān)測(cè)熒光；在分析細(xì)胞群體的CSFE標(biāo)記之前 讓細(xì)胞分裂一段時(shí)間。在分裂時(shí)，CFSE在子細(xì)胞中等量分離使得細(xì)胞 中的熒光強(qiáng)度隨著每一次連續(xù)的繼代而減半。CFSE的這個(gè)屬性使得能 夠精確追蹤給定細(xì)胞的經(jīng)歷的分裂次數(shù)(Weston和Parish, JI隱畫l Methods. 1990 Oct 4; 133 (1): 87-97; Lyons and Parish, J Immunol Methods. 1994 May 2; 171(1): 131-7; Parish, Immunol Cell Biol. 1999 Dec; 77 (6):499-508; Lyons, J Immunol Methods. 2000 Sep 21; 243 (1-2): 147-54)。用CFSE標(biāo)記的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度可以通過(guò) 任何適于監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的設(shè)備檢測(cè)，例如流式細(xì)胞分選儀、熒光細(xì)胞 計(jì)數(shù)儀、熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀?？捎糜诒景l(fā)明的其他細(xì)胞分裂的熒光標(biāo)記包括但不限于 CFSE衍生物、羧酸二乙酸琥珀酰亞胺酯染料和它們的衍生物，如俄勒 岡綠488羧酸二乙酸酯的琥珀酰亞胺酯(carboxy-DFFDA SE ) 、 5-(和 -6)-羧基伊紅二乙酸琥珀酰亞胺酯(CEDA SE) 、 PKH26、 Hoechst CPA1、 Cyquant GR和NF染料、MTT、 CTT和SNARF-1羧酸，醋酸 鹽琥珀酸亞胺基酯。
實(shí)施例
實(shí)施例1
生產(chǎn)增加水平目的RNA的、具有二相生長(zhǎng)傳的細(xì)胞 用重組DNA質(zhì)粒(例如編碼結(jié)合到表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈Fv 免疫球蛋白片斷的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法是已知的。 可以使用市場(chǎng)上有售的試劑或試劑盒(Qiagen， Proraega， Invitrogen， Stratagene )并且遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。 如果需要，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)及成功建立的方法，例如通過(guò)均質(zhì)化和進(jìn)一 步化學(xué)處理來(lái)分開(kāi)所述細(xì)胞。細(xì)胞接著暴露于選擇性抗生素以富集將 重組目的基因整合入細(xì)胞基因組的細(xì)胞，由相同(或不同)的質(zhì)粒賦 予所述選擇性抗生素的抗性。隨后細(xì)胞用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞 胺酯(CSFE)染色并在低密度下生長(zhǎng)一段規(guī)定的時(shí)間。隨后將細(xì)胞暴 露于與目的RNA(例如編碼了結(jié)合到表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈Fv免疫 球蛋白片斷的RM)雜交的熒光發(fā)生探針。
選擇熒光發(fā)生探針，使所述探針與目的RNA雜交時(shí)其熒光增加。 基于其CFSE熒光丟失得更快以及其熒光發(fā)生探針的熒光水平很高(即在低密度下生長(zhǎng)迅速卻能維持高水平目的基因的RNA表達(dá)的細(xì)胞)選 擇細(xì)胞。使分離的細(xì)胞生長(zhǎng)至充足的數(shù)量。
分離的細(xì)胞再次用CFSE染色并在高密度下生長(zhǎng)。在幾天的時(shí)間里 周期性進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)?；谝韵聝蓚€(gè)標(biāo)準(zhǔn)分離細(xì)胞l)在高密度 細(xì)胞培養(yǎng)物中CFSE熒光的丟失速率降低，和2)熒光發(fā)生探針的熒光增 加。還用碘化丙啶或膜聯(lián)蛋白-V對(duì)細(xì)胞染色以消除凋亡的細(xì)胞。最高 密度的細(xì)胞培養(yǎng)物依賴于維持熒光發(fā)生探針的熒光增加和凋亡的低水 平。在所得細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)以分離具有二相生長(zhǎng)譜、 能夠生產(chǎn)高水平目的RNA且能夠生長(zhǎng)至高密度而凋亡水平低的細(xì)胞克 隆。
權(quán)利要求
1.分離具有增加的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞的方法，其包括以下步驟將細(xì)胞群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸；以及分離顯示出一定水平的熒光試劑的熒光的細(xì)胞，所述一定水平的熒光試劑的熒光與細(xì)胞增殖的增加有關(guān)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中使用流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行熒光的檢測(cè)。
3. 分離具有增加的細(xì)胞增殖速率的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞還 表達(dá)高水平目的RNA，該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與熒光發(fā)生探針接觸，該熒光發(fā)生探針在與所述目的 RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；將所述群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的焚光試劑接觸，其中所述試 劑發(fā)出與所述熒光發(fā)生探針不同波長(zhǎng)的熒光；以及分離顯示出增加的熒光發(fā)生探針的熒光和一定水平的焚光試劑的 熒光的細(xì)胞，所述一定水平的熒光試劑的熒光與細(xì)胞增殖的增加有關(guān)。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中檢測(cè)熒光發(fā)生探針的熒光與檢測(cè)熒光 試劑的熒光同時(shí)測(cè)定。
5. 權(quán)利要求3的方法，其中使用流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行熒光的檢測(cè)。
6. 權(quán)利要求3的方法，其中所述用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試 劑選自羧基熒光素二乙酸琥珀酸亞胺酯、SNARF-1羧酸或醋酸琥珀酸亞胺酯。
7. 權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、 昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞、藻類細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢(CH0)細(xì)胞、NS0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和Per. C6細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是BL21細(xì)胞。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述真菌細(xì)胞選自金孢霉屬細(xì)胞、 曲霉屬細(xì)胞、木霉屬細(xì)胞、網(wǎng)柄菌屬細(xì)胞、念珠菌屬細(xì)胞、酵母屬細(xì)胞、 裂殖酵母屬細(xì)胞和青霉屬細(xì)胞。
11. 權(quán)利要求7的方法，其中所述昆蟲(chóng)細(xì)胞是SF9細(xì)胞或SF21細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括以下步驟將顯示出增加的熒預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接觸。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述試劑是膜聯(lián)蛋白-V或碘化丙啶。
14. 權(quán)利要求3的方法，其中所述目的RNA選自編碼蛋白的信使 RNA、反義RNA分子、結(jié)構(gòu)RNA、核糖體RNA、 hnRNA和snRNA。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述信使RM編碼免疫球蛋白重鏈， 免疫球蛋白輕鏈，單鏈Fv, Fab、 Fab，或(Fab， ) 2抗體片斷，或免 疫球蛋白的抗原結(jié)合片斷。
16. 權(quán)利要求3的方法，其中所述目的RNA是內(nèi)源性RNA。
17. 權(quán)利要求3的方法，其中所述目的RNA是外源性RNA。
18. 權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì) 胞培養(yǎng)物的步驟。
19. 權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量所述細(xì)胞培養(yǎng)物的密度 的步驟。
20. 產(chǎn)生具有增加的細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其中所述細(xì)胞 培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)高水平的目的RNA，該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與焚光發(fā)生探針接觸，該焚光發(fā)生探針在與所述目的 RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；從顯示出增加的熒光發(fā)生探針的熒光的群體中分離細(xì)胞； 培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞以產(chǎn)生第一細(xì)胞培養(yǎng)物； 重復(fù)上述步驟以分離第二細(xì)胞培養(yǎng)物； 比較第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)物的最大達(dá)到密度；以及 鑒定具有增加的細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)高水平的目的RNA。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中使用流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行熒光的 檢測(cè)。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì) 胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞、藻類細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢(CH0)細(xì)胞、NS0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和Per.C6細(xì)胞。
24. 權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是BL21細(xì)胞。
25. 權(quán)利要求22的方法，其中所述真菌細(xì)胞選自金孢霉屬細(xì)胞、 曲霉屬細(xì)胞、木霉屬細(xì)胞、網(wǎng)柄菌屬細(xì)胞、念珠菌屬細(xì)胞、酵母屬細(xì)胞、 裂殖酵母屬細(xì)胞和青霉屬細(xì)胞。
26. 權(quán)利要求22的方法，其中所述昆蟲(chóng)細(xì)胞是SF9細(xì)胞或SF21細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括以下步驟將顯示出增加的 熒光發(fā)生探針的熒光的細(xì)胞與用于監(jiān)測(cè)凋亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接 觸。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述試劑是膜聯(lián)蛋白-V或碘化丙啶。
29. 權(quán)利要求20的方法，其中所述目的RNA選自編碼蛋白的信 使RNA、反義RNA分子、結(jié)構(gòu)RNA、核糖體RM、 hnRNA和snRNA。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述信使RNA編碼免疫球蛋白重鏈， 免疫球蛋白輕鏈，單鏈Fv， Fab、 Fab，或(Fab， ) 2抗體片斷，或免 疫球蛋白的抗原結(jié)合片斷。
31. 權(quán)利要求20的方法，其中所述目的RNA是內(nèi)源性RNA。
32. 權(quán)利要求20的方法，其中所述目的RNA是外源性RNA。
33. 分離具有二相生長(zhǎng)譜的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第 一部分中具有增加的增殖速率，而在生長(zhǎng)譜第二部分中具有降低的增殖 速率，該方法包括以下步驟將第一細(xì)胞群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸； 在低細(xì)胞密度下培養(yǎng)所述的細(xì)胞群體；從在生長(zhǎng)語(yǔ)第一部分中顯示出改變的熒光試劑的熒光的所迷細(xì)胞群體中分離細(xì)胞；培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞以產(chǎn)生第二細(xì)胞群體；將所述第二細(xì)胞群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸；在高細(xì)胞密度下培養(yǎng)所述第二細(xì)胞群體；以及分離與在生長(zhǎng)鐠第一部分中改變的熒光試劑的熒光相比在生長(zhǎng)譜 第二部分中顯示出未改變或更低速率變化的熒光試劑的熒光的細(xì)胞，從而分離具有二相生長(zhǎng)i普的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第一部分中具有 增加的增殖速率，并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部分中具有降低的增 殖速率。
34. 分離具有二相生長(zhǎng)譜的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第 一部分中具有增加的增殖速率，并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部分中 具有降低的增殖速率，并且其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第二部分中表達(dá)高水 平的目的RNA，該方法包括以下步驟將細(xì)胞群體與熒光發(fā)生探針接觸，該熒光發(fā)生探針在與所述目的 RNA雜交時(shí)發(fā)出熒光；將所述群體與用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光試劑接觸，其中所述試 劑發(fā)出與所述熒光發(fā)生探針不同波長(zhǎng)的熒光；及分離在生長(zhǎng)鐠第一部分中顯示出改變的熒光試劑的熒光，在生長(zhǎng)讒 第二部分中顯示出未改變或降低變化的熒光試劑的熒光，而且在生長(zhǎng)鐠 第二部分中顯示出增加的熒光發(fā)生探針的熒光的細(xì)胞。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述細(xì)胞在生長(zhǎng)譜第一部分中生長(zhǎng) 到增加的密度。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中在生長(zhǎng)鐠第二部分期間，檢測(cè)熒光 發(fā)生探針的熒光與檢測(cè)熒光試劑的焚光同時(shí)測(cè)定。
37. 權(quán)利要求34的方法，其中使用流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行熒光的 檢測(cè)。
38. 權(quán)利要求34的方法，其中所述用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率的熒光 試劑選自羧基熒光素二乙酸琥珀酸亞胺酯、SNARF-1羧酸或醋酸琥珀酸亞胺酯
39. 權(quán)利要求34的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì) 胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞、藻類細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢(CH0)細(xì)胞、NS0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和Per. C6細(xì)胞。
41. 權(quán)利要求39的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是BL21細(xì)胞。
42. 權(quán)利要求39的方法，其中所述真菌細(xì)胞選自金孢霉屬細(xì)胞、 曲霉屬細(xì)胞、木霉屬細(xì)胞、網(wǎng)柄菌屬細(xì)胞、念珠菌屬細(xì)胞、酵母屬細(xì)胞、 裂殖酵母屬細(xì)胞和青霉屬細(xì)胞。
43. 權(quán)利要求39的方法，其中所述昆蟲(chóng)細(xì)胞是SF9細(xì)胞或SF21細(xì)胞。
44. 權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括以下步驟將顯示出增加的亡或預(yù)凋亡標(biāo)記物的試劑接觸。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中所述試劑是膜聯(lián)蛋白-V或碘化丙啶。
46. 權(quán)利要求34的方法，其中所述目的RNA選自編碼蛋白的信 使RNA、反義RNA分子、結(jié)構(gòu)RNA、核糖體RNA、 hnRNA和snRNA。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中所述信使RNA編碼免疫球蛋白重鏈， 免疫球蛋白輕鏈，單鏈Fv, Fab、 Fab'或(Fab， ) 2抗體片斷，或免 疫球蛋白的抗原結(jié)合片斷。
48. 權(quán)利要求34的方法，其中所述目的RNA是內(nèi)源性RNA。
49. 權(quán)利要求34的方法，其中所述目的RNA是外源性RNA。
50. 權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞以產(chǎn)生 細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。
51. 權(quán)利要求50的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量所述細(xì)胞培養(yǎng)物的密度的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離表達(dá)增加水平的目的RNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞顯示出改變的生長(zhǎng)譜，例如具有增加或減少的增殖速率、增加或減少的調(diào)亡速率的細(xì)胞，或者具有二相生長(zhǎng)譜的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101611137SQ200780048293
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者D·索庫(kù)克, K·謝克達(dá) 申請(qǐng)人:克羅莫塞爾公司