專利名稱：用于生產(chǎn)纖維素酶的宿主和發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法。更具體地，本發(fā)明涉及包括使用經(jīng)遺傳修飾之絲狀真菌宿主來生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
植物細胞壁主要由大的生物聚合物纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠組成。纖維素和半纖維素是生產(chǎn)可發(fā)酵糖的重要的可再生和低成本碳源。纖維素由通過β_1，4糖苷鍵以線性鏈相連的D-葡萄糖單元組成。半纖維素主要由線性木聚糖主鏈組成，其包含通過 β _1，4糖苷鍵相連的D-木糖單元以及通過β-1，2或β-1，3糖苷鍵或酯鍵與木糖單元相連的多個側(cè)鏈(如L-阿拉伯糖、醋酸、阿魏酸等)。子囊菌門(Ascomycota)的絲狀真菌(包括多種青霉菌屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、傘菌屬(Agaricus)、脈孢菌屬(Neurospora)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、 鐮刀菌屬(Fusarium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、禾酉癌菌(Magnaporthe)、曲霉菌屬 (Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma)物種)在降解自然界中發(fā)現(xiàn)的豐度最高之聚合物(纖維素和半纖維素)方面起關(guān)鍵作用。里氏木霉(Trichoderma reesei，紅褐肉座菌 (Hypocrea jecorina)的無性型)是纖維素酶和半纖維素酶的重要工業(yè)來源。術(shù)語“纖維素酶”廣義上指催化那些連接纖維素聚合物中各葡萄糖單元之β_1，4糖苷鍵水解的酶。催化機理涉及內(nèi)切葡聚糖酶(Ε. C. 3. 2. 1. 4)、纖維二糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 91)和β -葡糖苷酶(Ε. C. 3. 2. 1.21)的協(xié)同作用。術(shù)語“半纖維素酶”廣義上指催化那些連接半纖維素聚合物中各種木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和其它部分之糖苷鍵水解的酶。半纖維素酶包括例如內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2. 1.8)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2. 1. 28)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3. 2. 1. 55)、1，4- β -木糖苷酶(EC 3.2.1. 27)和α -葡糖醛酸酶(EC 3. 2. 1. 139)。里氏木霉是工業(yè)上用于生產(chǎn)生物質(zhì)降解酶(如纖維素酶和半纖維素酶)的常用絲狀真菌菌種。對里氏木霉菌株RutC30之分泌蛋白質(zhì)組的分析顯示當(dāng)培養(yǎng)在添加了經(jīng)預(yù)處理之玉米秸稈的培養(yǎng)基中時，存在31種分泌型糖基水解酶(Nagendran等，2009)。對培養(yǎng)在啤酒花細胞壁上的禾谷鐮刀菌(F. graminearum)的研究發(fā)現(xiàn)至少45%的分泌型蛋白質(zhì)參與植物細胞壁降解，分別有25、19和11種不同的蛋白質(zhì)參與半纖維素、果膠和纖維素的降解(Phalip 等，2005)。對里氏木霉基因組的測序及分析顯示，存在10種編碼纖維素酶的基因以及16種編碼半纖維素酶的基因(Martinez等，2008)。這些包括兩種纖維二糖水解酶、八種內(nèi)切葡聚糖酶、四種木聚糖酶、兩種α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和一種β-甘露聚糖酶。里氏木霉還產(chǎn)生多種輔助酶(其協(xié)助從纖維素和半纖維素產(chǎn)生單糖)，包括乙酰木聚糖酯酶、木糖苷酶和幾種β-葡糖苷酶(de Vries和Visser，2001 ；Aro等，2005，及其參考文獻)。然而，當(dāng)與其它絲狀真菌的基因組相比時，里氏木霉基因組中具有出奇少的編碼糖苷水解酶的基因(總共有200種)(Martinez等，2008)。例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)禾口禾谷鍵刀菌(Fusarium graminearum)分別編碼 285、263、247 和 243 種糖基水解酶(Martinez 等，2008)。絲狀真菌產(chǎn)生植物細胞壁降解酶(如纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶和果膠酶) 主要是響應(yīng)于可用碳源在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控。葡萄糖通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(如crel)的作用抑制纖維素酶基因表達(Strauss等，1995)。在葡萄糖受限的條件下，纖維素酶轉(zhuǎn)錄去阻遏，而轉(zhuǎn)錄的充分激活需要有誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物或誘導(dǎo)物(如纖維素或連接的二糖(如纖維二糖、槐糖、龍膽二糖和乳糖))的存在(Ilmen等，1997)，而半纖維素酶轉(zhuǎn)錄的激活取決于生長培養(yǎng)基中木聚糖或其衍生物(木糖、木二糖和阿拉伯糖)的存在情況 (Margolles-Clark 等，1997)。最初在黑曲霉(Aspergillus niger)中鑒定出的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子XlnR(木聚糖酶調(diào)節(jié)因子)控制編碼半纖維素酶和纖維素酶的約20 30種基因的轉(zhuǎn)錄(Strieker等，2008， 及其參考文獻)。此外，木聚糖的胞外降解和D-木糖的細胞內(nèi)代謝通過XlnR對xyrA (其編碼D-木糖還原酶)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而偶聯(lián)(Hasper等，2000)。里氏木霉和米曲霉中的直系同源轉(zhuǎn)錄因子(分別為Xyrl (木聚糖酶調(diào)節(jié)因子1)和Ao XlnR)也是纖維素酶和半纖維素酶基因表達的通用調(diào)節(jié)因子(Striker等，2006 ；Marui等，2002)。對真菌中一些其它經(jīng)鑒定的木聚糖酶表達調(diào)節(jié)因子的研究局限于半纖維素酶基因的調(diào)控(Tamayo等，2008 ；Rao 等，2002 ；Calero-Nieto等，2007)。例如，已顯示，在禾谷鐮刀菌中缺失Xyrl的直系同源轉(zhuǎn)錄因子不影響木聚糖酶和纖維素酶的基礎(chǔ)表達水平，但抑制高的可誘導(dǎo)表達(Brimner等， 2007)。這一發(fā)現(xiàn)與木霉屬和曲霉菌屬的研究結(jié)果相矛盾，在后一研究結(jié)果中將對應(yīng)的調(diào)節(jié)因子敲除徹底阻斷了纖維素酶和木聚糖酶的表達。這些結(jié)果催生了用于產(chǎn)生同源和/或異源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中利用受XlnR調(diào)節(jié)的啟動子連同來自多個基因拷貝的過表達的木聚糖酶調(diào)節(jié)因子XlnR(美國專利No. 6，177，261B1,2001)。木聚糖酶調(diào)節(jié)因子(例如來自木霉屬的Xyrl和來自曲霉菌屬的XlnR)屬于僅在真菌中發(fā)現(xiàn)的第三類雙核鋅簇蛋白家族，并在蛋白質(zhì)N-端部分擁有保守的氨基酸基序 (CX2CX6CX5_12CX2CX6_8C) (MacPherson等，2006)。這類轉(zhuǎn)錄因子很獨特，其只包含與兩個鋅原子結(jié)合的一個鋅指。木聚糖酶調(diào)節(jié)因子結(jié)合靶基因啟動子上的5' -GGC(T/A)3-3'響應(yīng)元件，并且可以作為單體、同二聚體或異二聚體與DNA相互作用(MacPherson等，2006 ； Strieker等，2008)。一些研究顯示，里氏木霉Xyrl對于所有主要(半)纖維素酶基因的表達是必需的(Strieker等，2006)，并且它結(jié)合木聚糖酶1、2和3基因的啟動子(Rauscher 等，2006 ；Strieker等，2007 ；Furukawa等，2009)。然而，最近才在體外證明了里氏木霉Xyrl 與纖維素酶基因啟動子的結(jié)合(Furukawa等，2009 ;Ling等，2009)。計算機分析表明，在里氏木霉中，5' -GGC(T/A)3-3'基序作為單一位點廣泛分布在所有受Xyrl調(diào)節(jié)之基因的 5'上游區(qū)域中(Furukawa等，2009)。然而，對Xyrl結(jié)合選定基序的體外研究顯示，只有其中部分基序可被該轉(zhuǎn)錄因子識別(Furukawa等，2009)。通過對黑曲霉XlnR進行失活突變和理性設(shè)計誘變分析鑒定出另一些功能結(jié)構(gòu)域 (Hasper等，2004)。這些研究表明，第二個推測卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)的核定位。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，在黑曲霉XlnR和里氏木霉Xyrl中，兩個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域處于相似的位置。因此，里氏木霉Xyrl的第二個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域有可能也負責(zé)其轉(zhuǎn)運入核。XlnR的C-端對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控是必需的；缺失C-端的78個氨基酸導(dǎo)致XlnR靶基因的表達增加(甚至是在葡萄糖阻遏的條件下)，這表明該區(qū)域抑制了 XlnR的轉(zhuǎn)錄激活(Hasper 等，2004)。然而，該區(qū)域中的某些單氨基酸突變(例如Tyr864Phe、Leu823Ser和Tyr864Asp) 導(dǎo)致XlnR激活的嚴重抑制(Hasper等，2004)。雖然黑曲霉XlnR和里氏木霉Xyrl在結(jié)構(gòu)和共有結(jié)合位點上具有相似性，但是有證據(jù)表明，這兩種因子通過不同的機制與啟動子相互作用。例如，已顯示，黑曲霉XlnR作為單體(Hasper等，2004)、而里氏木霉Xyrl作為同二聚體或與Ace2(已知的里氏木霉纖維素酶的表達正調(diào)控因子)形成的異二聚體(Strieker等，2006，2008)與被調(diào)控基因啟動子中的反向重復(fù)序列結(jié)合。還推測，在里氏木霉中由Xyrl和Ace2進行的半纖維素酶和纖維素酶基因表達的調(diào)控可涉及另一些調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化和招募(Strieker等，2008)。里氏木霉Xyrl還與Acel (纖維素酶基因的負調(diào)控因子)具有相互拮抗的關(guān)系，并可能通過這兩種因子對纖維素酶啟動子中同一結(jié)合位點的競爭來實現(xiàn)(Strieker等，2006)。已從若干其它真菌物種(例如構(gòu)巢曲霉、埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)和粗糙脈孢菌 (Neurospora crassa))中分離出推測的Acel編碼基因(Aro等，2005)。但是，它們與XlnR 可能的相互作用以及它們是否參與水解酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄激活尚不清楚(Strieker等， 2006)。在纖維素酶誘導(dǎo)條件下，里氏木霉產(chǎn)生低水平的木聚糖酶活性；但是，利用木聚糖、木糖和阿拉伯糖培養(yǎng)的里氏木霉培養(yǎng)物得到的酶系統(tǒng)富含半纖維素酶活性(相比于纖維素酶活性而言)(Mach 和 Zeilinger, 2003 ；MargolIes-Clark 等，1997 ；Xiong 等，2004)。 當(dāng)目標是產(chǎn)生具有高的木聚糖降解活性(相比于纖維素酶活性而言)時，例如在動物飼料、 紙漿和造紙工業(yè)中，這可能是有益的。美國專利No. 6，300, 112和5，298，405公開了使用纖維素酶缺失菌株作為生產(chǎn)用于動物飼料以及用于生物漂白中的富含半纖維素酶的酶制劑的替代性方法，有些情況下，期望使用碳水化合物來源(主要含有源自半纖維素的木糖和另一些戊糖，例如通過化學(xué)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì)而產(chǎn)生的那些)從真菌培養(yǎng)物得到具有高纖維素酶比活性的纖維素酶混合物。這些可包含HDC或CIC。然而，這樣的碳源導(dǎo)致酶組合物具有高的半纖維素酶活性以及降低的纖維素酶比活性，因此，需要較大量的總蛋白質(zhì)以獲得有效的纖維素水解。此外，半纖維素酶的產(chǎn)生和分泌使用了細胞能量途徑和分泌途徑的資源，從而限制了宿主細胞表達和分泌纖維素酶的能力。據(jù)報道，源自木聚糖的碳水化合物與纖維素酶誘導(dǎo)物(例如纖維二糖或乳糖) 的組合可導(dǎo)致由里氏木霉分泌的蛋白質(zhì)混合物中存在不同比例的纖維素酶和半纖維素酶 (Zeilinger, S.等，1996)。此外，已發(fā)現(xiàn)，8 (檢查) 15%的誘導(dǎo)物濃度(需要確定)可提高利用半纖維素來源之碳水化合物(hemicellulose derived carbohydrate, HDC)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，其幾乎可達到當(dāng)使用誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物作為碳源時產(chǎn)生的水平(參見共同待決的美國申請No. 12/200492)。然而，由于產(chǎn)生碳水化合物的成本較高，因此大規(guī)模地使用此類混合物會顯著增加酶生產(chǎn)成本。此外，這樣的酶混合物中仍含有相當(dāng)比例的半纖維素酶。因此，由于半纖維素酶含量高且需要添加誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物，所以目前利用誘導(dǎo)半纖維素酶之碳水化合物生產(chǎn)纖維素酶成本很高。因此，在本領(lǐng)域需要費用低廉的利用絲狀真菌生產(chǎn)含有低水平半纖維素酶活性的纖維素酶混合物的方法，其主要利用半纖維素來源之碳水化合物(HDC)，而不含有誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物(例如，纖維素)或連接二糖(例如纖維二糖、槐糖、龍膽二糖和乳糖)或含有低水平的此類碳水化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種使用經(jīng)遺傳改造之絲狀真菌生產(chǎn)具有高比例之纖維素酶組分的纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，所提供的碳源包含半纖維素來源之碳水化合物(HDC)， 而不含有或含有低水平的傳統(tǒng)的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物(cellulase inducing carbohydrate, CIC)。本文描述的方法和遺傳改造可用于開發(fā)產(chǎn)生高產(chǎn)量高品質(zhì)纖維素酶的真菌菌株，其中纖維素酶的表達不依賴于誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物的存在情況。遺傳改造絲狀真菌宿主使其過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)向所述絲狀真菌宿主提供含有半纖維素來源之碳水化合物及低水平的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物的碳源時，這種遺傳改造產(chǎn)生富含纖維素酶活性的纖維素酶混合物。本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，其包括a)提供經(jīng)遺傳改造過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的絲狀真菌宿主；以及b)在含有如下碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟a)所述的絲狀真菌宿主，所述碳源包含約60重量％至約100重量％ 的半纖維素來源之碳水化合物和約0重量％至約3重量％的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物， 或者所述培養(yǎng)基包含含有約25重量％至約100重量％的半纖維素來源之糖醇、約0重量％ 的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物以及約0重量％至約75重量％的葡萄糖、甘油或其組合的碳源，以產(chǎn)生纖維素酶混合物。由此產(chǎn)生的纖維素酶混合物包含約40%至約100%的纖維素酶組分，并且與在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)的不過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子的親本絲狀真菌相比，其纖維素酶活性提高到至少1.7倍。本發(fā)明發(fā)酵方法中使用的絲狀真菌宿主中過表達的Xyrl轉(zhuǎn)錄因子是包含SEQ ID NO :27氨基酸序列的蛋白質(zhì)、氨基酸序列與SEQ ID NO :27氨基酸序列表現(xiàn)出約90%至約 100%同一性的蛋白質(zhì)。Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子是氨基酸序列與SEQ ID NO :27氨基酸序列表觀出約45%至約99%同一性的蛋白質(zhì)；氨基酸序列與SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33,SEQ ID NO :34 或 SEQ ID NO :35氨基酸序列表現(xiàn)出約90%至約99%同一性的蛋白質(zhì)，或者具有雙核鋅簇的蛋白質(zhì)，其具有與含有SEQ ID NO :27氨基酸序列之蛋白質(zhì)等價的特異性針對纖維素酶和/ 或半纖維素酶啟動子序列中GGC(T/A)3-樣基序共有序列的DNA結(jié)合活性。本發(fā)明發(fā)酵方法中使用的絲狀真菌宿主可以是屬于盤菌亞門(Pezizomycotina) 的纖維素分解真菌物種。例如，絲狀真菌宿主可以是木霉屬、肉座菌屬(Hypocrea)、曲霉菌屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬或脈孢菌屬的物種。優(yōu)選地，絲狀真菌宿主是里氏木霉或紅褐肉座菌。在本發(fā)明發(fā)酵方法的第一個實施方案中，絲狀真菌宿主包含Xyrl基因構(gòu)建物，其中編碼Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列與啟動子核酸序列有效連接。絲狀真菌宿主可通過用Xyrl基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化并篩選含有該基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化子來獲得。對于編碼Xyrl轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列來說，啟動子核酸序列可以是本源的 (native)或異源的。所述啟動子核酸序列可以源自這樣的基因，即在含有半纖維素來源之碳水化合物的碳源條件下，該基因在絲狀真菌宿主生長過程中被誘導(dǎo)表達。例如，如果絲狀真菌宿主是里氏木霉，則啟動子核酸序列可以來自編碼β “木糖苷酶1、β _木糖苷酶2、木聚糖酶1、木聚糖酶2、木聚糖酶3的里氏木霉基因的一個或多個或者其任意組合。啟動子核酸序列還可以是來自兩種或更多種啟動子的核酸序列組合?；蛘?，啟動子核酸序列可以源自這樣的基因，所述基因在絲狀真菌宿主生長過程中組成型表達，并且其表達水平不依賴于發(fā)酵方法所用的碳源。在本發(fā)明發(fā)酵方法的第二個實施方案中，對所述經(jīng)改造絲狀真菌宿主進行進一步改造以使其在一種或多種半纖維素酶表達方面具有部分或完全地缺陷，所述半纖維素酶包括但不限于木聚糖酶、β “木糖苷酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、β -甘露聚糖酶、α -葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶及其任意組合。例如，經(jīng)改造絲狀真菌宿主可以在一種或多種木聚糖酶、一種或多種木糖苷酶、一種或多種α-阿拉伯呋喃糖苷酶或其任意組合的表達方面具有缺陷。如果經(jīng)改造絲狀真菌宿主是里氏木霉或紅褐肉座菌的菌株，則該宿主可以被改造以使木聚糖酶1、木聚糖酶2、β -木糖苷酶1、β -木糖苷酶2、α -阿拉伯呋喃糖苷酶1、 α-阿拉伯呋喃糖苷酶2或其任意組合具有部分或完全地缺陷。在本發(fā)明發(fā)酵方法中提供給絲狀真菌宿主的碳源可在半纖維素來源之碳水化合物的基礎(chǔ)上包含其它碳源。例如，所述碳源可包括甘油或其它糖醇(例如木糖醇或阿拉伯糖醇)或有機酸(例如醋酸或葡萄糖醛酸)。與不過表達Xyrl的絲狀真菌宿主的發(fā)酵方法的單位生產(chǎn)率(specific productivity, qp)相比，本發(fā)明發(fā)酵方法的qp可以提高到至少約兩倍。本發(fā)明的發(fā)酵方法可以在約20°C至約35°C溫度下以及pH值約3. 0至約6. 5的條件下實施，并且該方法可以分批、分批補料或連續(xù)方法來進行。任何這些模式均可以在有氧 (存在氧氣)或無氧(不存在氧氣)的條件下操作。本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在碳源包含半纖維素來源之碳水化合物(HDC) 或半纖維素來源之糖醇(HDSA)且不含有或含有低水平的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物的發(fā)酵方法中，過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子的絲狀真菌宿主可以產(chǎn)生纖維素酶組分比例高的纖維素酶混合物。本發(fā)酵方法的生產(chǎn)率明顯高于使用不過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子和/或具有半纖維素酶野生型產(chǎn)生水平的絲狀真菌宿主時的同樣方法。與不過表達Xyrl的親本絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶混合物的纖維素酶活性相比， 本發(fā)明的發(fā)酵方法所產(chǎn)生的纖維素酶混合物的纖維素酶活性提高到至少約1. 7倍。本發(fā)明發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物包含占總蛋白質(zhì)約40重量％至約100重量％的纖維素酶組分。如此生產(chǎn)的纖維素酶混合物可用于將纖維素底物水解以生產(chǎn)葡萄糖。例如，所述纖維素酶混合物可用于水解包含在預(yù)處理的木質(zhì)纖維原料中的纖維素。


圖1.A-用于內(nèi)切葡聚糖酶2(cel5a)缺失和制備P285-6菌株的里氏木霉轉(zhuǎn)化載體。B-使用cel5a編碼序列作為探針證實cel5a在P285-6和P285-4轉(zhuǎn)化子中成功缺失的 Southern雜交。上圖顯示了本源cel5a基因座和轉(zhuǎn)化載體靶向整合后被破壞的cel5a基因的示意圖。用于消化基因組DNA的限制性位點標示于底部。用于Southern雜交的探針的位置標示于頂部。下圖顯示Southern雜交，菌株名稱或質(zhì)粒名稱標示于頂部，片段大小標示于左側(cè)。
圖2. A-用于木聚糖酶2缺失和制備P491P菌株的里氏木霉轉(zhuǎn)化載體。B-在木糖作為碳源的微培養(yǎng)中生長的親本和轉(zhuǎn)化菌株中木聚糖酶2的產(chǎn)生。由親本菌株(M2C38和 M2C38aux5)和轉(zhuǎn)化子(P43W、P491N、P491P、P509A-G)產(chǎn)生的總分泌蛋白等分樣品(IOyg) 利用SDS-PAGE進行分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜并使用針對里氏木霉木聚糖酶2得到的抗體進行免疫印跡。純化的Xyn2(泳道1)用作對照。箭頭指示了對應(yīng)于Xyn2的蛋白條帶。WkD 為單位的蛋白質(zhì)分子量標記標示于左側(cè)。圖3.基因cel7a(條紋柱)、xyrl(黑柱)和acel(灰柱)的相對轉(zhuǎn)錄物水平。用于分離總RNA的生物質(zhì)樣品采集自里氏木霉P59G菌株發(fā)酵42小時時，其利用 10 0 %阿拉伯糖、9 8 %木糖+ 2 %纖維二糖或6 5 %葡萄糖+ 3 5 %誘導(dǎo)纖維素酶之混合物 (cellulase-inducing cocktail, CIC)作為培養(yǎng)用碳源。通過實時qRT-PCR對相對轉(zhuǎn)錄物水平進行評估，并使用Ntf2基因的轉(zhuǎn)錄水平歸一化。圖4.A-用于制備過表達xyrl之里氏木霉轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化載體。B-從含有 Pbxlixyrl表達盒的經(jīng)改造絲狀真菌宿主及其親本絲狀真菌菌株分離的基因組DNA中PCR 擴增嵌合的xyrl基因片段。Xyrl表達盒的圖示顯示于每幅圖的底部。PCR擴增所用引物用箭頭標示。泳道1加載了 DNA分子量標記(DNA ladder)，且每個標記的大小顯示于左側(cè)。PCR 產(chǎn)物從以下模板擴增從親本P285-6auX (泳道2)和經(jīng)改造絲狀真菌宿主菌株P(guān)692A(泳道3)、P692B (泳道4)、693A (泳道5)、693B (泳道6)分離的基因組DNA，作為陰性對照的水 (泳道7)和作為陽性對照的pPbxl :xyrl-pyr4載體(泳道8)。圖5. A-親本絲狀真菌(里氏木霉P285-6)以及過表達xyrl之經(jīng)改造絲狀真菌宿主(里氏木霉P692菌株)中基因xyrl、cel7a、cel7b、xynl、xyn2和bxll的相對表達水平。 B-在誘導(dǎo)纖維素酶表達48和72小時后，親本絲狀真菌(里氏木霉RutC30菌株)以及過表達xyrl之經(jīng)改造絲狀真菌宿主(里氏木霉RutC30-R3菌株)中基因xyrl和cel7a的相對表達水平。用于總RNA提取的生物質(zhì)樣品按實施例4. 2所述制備。通過實時qRT-PCR對相對轉(zhuǎn)錄水平進行評估，并使用Ntf2基因?qū)D(zhuǎn)錄水平進行歸一化。發(fā)酵運行編號標示于柱的頂部。圖6.過表達Xyrl的經(jīng)改造絲狀真菌宿主(里氏木霉P692B) (A)和親本絲狀真菌 (里氏木霉P285-6菌株)(B)在pH 3. 5、以100%木糖作為碳源培養(yǎng)的發(fā)酵中蛋白質(zhì)(實線)和生物質(zhì)(虛線)的積累(表示為g/L)。圖7.過表達Xyrl的經(jīng)改造絲狀真菌宿主(里氏木霉RutC30_R3) (A)和親本絲狀真菌(里氏木霉RutC30菌株)(B)在pH 3. 5、以100%木糖作為碳源培養(yǎng)的發(fā)酵中蛋白質(zhì) (實線)和生物質(zhì)(虛線)的積累(表示為g/L)。圖 8.里氏木霉菌株 P1194E(A)、P1197B(B)、P491P(C)和 M2C38 (D)在 pH 3. 5、以 100%木糖作為碳源培養(yǎng)的發(fā)酵中蛋白質(zhì)(實線)和生物質(zhì)(虛線)的積累(表示為g/L)。圖9. (A)顯示了由親本絲狀真菌P285-6菌株和經(jīng)改造絲狀真菌宿主菌株 P692B(xyrl+)和P692A(xyrl+)分泌的纖維素酶混合物的相對纖維素水解活性。根據(jù)用于這些菌株中每一種發(fā)酵的碳源將纖維素酶混合物分組。發(fā)酵參考編號示于柱的頂部。 (B)顯示了利用100%木糖、100%阿拉伯糖、25%木糖/50%葡萄糖/25%甘油或25%木糖醇/50%葡萄糖/25%甘油培養(yǎng)的親本絲狀真菌宿主(P285-6菌株)和經(jīng)改造絲狀真菌宿主(P692B和P692A菌株)產(chǎn)生的纖維素酶混合物中各纖維素酶和木聚糖酶組分Cel7A、Cel6A、Ce17B、Xynl和Xyn2的相對豐度(以總分泌蛋白的重量百分比表示)。圖10. (A)顯示了由親本絲狀真菌RutC30菌株和經(jīng)改造絲狀真菌宿主RutC30_R3 菌株(xyrl+)分泌的纖維素酶混合物的相對纖維素水解活性。根據(jù)用于這些菌株中每一種發(fā)酵的碳源將纖維素酶混合物分組。發(fā)酵參考編號示于柱的頂部。(B)顯示了利用100% 木糖或25%木糖醇/50%葡萄糖/25%甘油培養(yǎng)的親本絲狀真菌宿主(RutC30)和經(jīng)改造絲狀真菌宿主(RutC30-R3)產(chǎn)生的纖維素酶混合物中各纖維素酶和木聚糖酶組分Cel7A、 Cel6A、Ce17B、Ce15A、Xynl和Xyn2的相對豐度(以總分泌蛋白的重量百分比表示)。圖11.顯示了由利用含有100%木糖或35% CIC+65%葡萄糖的碳源培養(yǎng)的親本絲狀真菌菌株RutC30、M2C38和P491P以及經(jīng)改造絲狀真菌宿主菌株RutC30_R3、P1194E、 P1194F和P1197B(xyrl)分泌的纖維素酶混合物的相對纖維素水解活性。發(fā)酵參考編號示于柱的頂部。圖12. (A)顯示了相對纖維素水解活性與纖維素酶混合物中纖維素酶組分 (Cel7A+Cel6A+Cel7B)之相對比例之間的關(guān)系，該纖維素酶混合物由利用100 %木糖、 100%阿拉伯糖、25%重量木糖/50%重量葡萄糖/25%甘油或25%木糖醇/50%葡萄糖 /25%甘油作為碳源發(fā)酵的菌株P(guān)285-6、P692B(xyrl+)和P692A (xyrl+)產(chǎn)生。虛線表示 P285-6、P692B和P692A纖維素酶混合物的所有相對活性與纖維素酶組分百分比的線性回歸分析。線性回歸的r-平方值為0.75。(B)顯示了相對纖維素水解活性與纖維素酶混合物中纖維素酶組分(Cel7A+Ce16A+Ce17B+Cel5A)之相對比例之間的關(guān)系，該纖維素酶混合物由菌株RutC30和RutC30-R3 (xyrl+)產(chǎn)生。虛線表示RutC30和RutC30_R3纖維素酶混合物的所有相對活性與纖維素酶組分百分比的線性回歸分析。圖13.里氏木霉Xyrl (SEQ ID NO 27)與Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子之氨基酸序列的比對，所述等價轉(zhuǎn)錄因子來自黑曲霉(同一性為46. 65%，SEQ ID 25)、構(gòu)巢曲霉(同一性為 46. 24%, SEQ ID 28)、白曲霉(Aspergillus kawachii)(同一性為47. 06%，SEQ ID 29)、米曲霉(同一性為 46. 55%，SEQ ID 30)、土曲霉(Aspergillus terreus)(同一性為 42. 83%， SEQ ID 31)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)(同一性為 59. 30%，SEQ ID 32)、粗糙脈孢菌(同一性為 58. 65%, SEQ ID 33)、變灰青霉(Penicillum canescens)(同一性為 50. 91%, SEQ ID 34)和小麥德氏霉有性型(Pyrenophora tritici-r印entis)(同一性為 42. 11%, SEQ ID 35)。兩個序列之間一致的氨基酸用黑色陰影的白色字體表示；兩個序列之間相似的氨基酸用灰色陰影的黑色字體表示。SEQ ID NO各序列與里氏木霉Xyrl的同一性百分比在括號中列示。使用DNAman程序(其中空位罰分為3且K-tuple為2)計算同一性。圖14.顯示了里氏木霉Xyrl的343-940位氨基酸對應(yīng)的區(qū)域與來自黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉、白曲霉、粗糙脈孢菌、變灰青霉、尖孢鐮刀菌、小麥德氏霉有性型的 Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子和里氏木霉Xyrl343-940氨基酸相應(yīng)區(qū)域兩兩之間的氨基酸序列同一性百分比。使用DNAman程序(其中空位罰分為3且K-tuple為2)計算同一性。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于從經(jīng)改造絲狀真菌宿主生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵方法。如下僅以舉例的方式描述優(yōu)選的實施方案，而對為實施本發(fā)明必需的特征組合無限制。
經(jīng)改造絲狀真菌宿主增加一兩句有關(guān)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成以及各結(jié)構(gòu)域在何處起始和終止的描述。對本發(fā)明發(fā)酵方法中使用的絲狀真菌宿主進行改造以提高Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl 等價轉(zhuǎn)錄因子的表達。本文使用的“Xyrl轉(zhuǎn)錄因子”是一種屬于真菌雙核鋅簇轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID NO :27具有約90%至約100%的同一性或顯示與里氏木霉Xyrl等價的DNA結(jié)合活性。例如，該蛋白可與SEQ ID NO :27具有90%、92%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100% (或其間任何數(shù)值)的序列同一性。本文使用的Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子是一種屬于真菌雙核鋅簇轉(zhuǎn)錄因子家族、其氨基酸序列與SEQ ID NO :27氨基酸序列具有約45%至約99%同一性的蛋白質(zhì)；其氨基酸序列與 SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO 34 或 SEQ ID NO 35 中任一個表現(xiàn)出約 90%至約 99% 同一性的蛋白質(zhì)；或者具有雙核鋅簇的蛋白質(zhì)，其具有與含有SEQ ID N0:27氨基酸序列之蛋白質(zhì)等價的特異性針對纖維素酶和/或半纖維素酶啟動子序列中GGC(T/A)3-樣基序共有序列的DNA結(jié)合活性。圖13顯示了的里氏木霉Xyrl轉(zhuǎn)錄因子(SEQ ID NO 27)與來自其它真菌物種的 Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的比對。所有這些酶均與SEQ ID NO :27表現(xiàn)出約42%至約59%的氨基酸序列同一性(表1)。此外，如圖14所示，在來自盤菌亞門的其它纖維素水解絲狀真菌的Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子與里氏木霉Xyrl的343-940位氨基酸相對應(yīng)的氨基酸與里氏木霉 Xyrl (SEQ ID NO 27)的343-940位氨基酸表現(xiàn)出約48%至約66%的同一性。表1 :Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，所述方法包括a)提供過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)改造絲狀真菌宿主；以及b)在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟a)所述的經(jīng)改造絲狀真菌宿主以產(chǎn)生纖維素酶混合物，其中所述碳源含有約60重量％至約100重量％的半纖維素來源之碳水化合物以及約 0重量％至約3重量％的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物；其中，與在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的親本絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶混合物相比，所述纖維素酶混合物的纖維素酶活性至少提高到約 1.7 倍。
2.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述Xyrl轉(zhuǎn)錄因子選自a)包含SEQID NO 27氨基酸序列的蛋白質(zhì)；b)氨基酸序列與SEQID NO :27氨基酸序列表現(xiàn)出約90%至約100%同一性的蛋白質(zhì)；c)含有雙核鋅簇的蛋白質(zhì)，其具有與含有SEQID NO :27氨基酸序列之蛋白質(zhì)等價的特異性針對纖維素酶和/或半纖維素酶啟動子中GGC(T/A)3-樣共有基序的DNA結(jié)合活性。
3.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子選自a)氨基酸序列與SEQID NO 27氨基酸序列表現(xiàn)出約45%至約99%同一性的蛋白質(zhì)；b)氨基酸序列與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34 或 SEQ ID NO :35 之氨基酸序列表現(xiàn)出約90%至約99%同一性的蛋白質(zhì)；和c)含有雙核鋅簇的蛋白質(zhì)，其具有與含有SEQID NO :27氨基酸序列之蛋白質(zhì)等價的特異性針對纖維素酶和/或半纖維素酶啟動子序列中GGC (T/A) 3"樣基序共有序列的DNA結(jié)合活性。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的發(fā)酵方法，其中所述經(jīng)改造絲狀真菌宿主在一種或多種半纖維素酶表達方面具有部分或完全地缺陷。
5.權(quán)利要求4的發(fā)酵方法，其中所述一種或多種半纖維素酶選自木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-甘露聚糖酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶及其組合。
6.權(quán)利要求5的發(fā)酵方法，其中所述一種或多種半纖維素酶選自木聚糖酶、β-木糖苷酶及其組合。
7.用于生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，其包括a)遺傳改造絲狀真菌宿主，使其過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子；以及b)在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟a)所述的絲狀真菌宿主以產(chǎn)生纖維素酶混合物， 其中所述碳源含有約60重量％至約100重量％的半纖維素來源之碳水化合物以及約0重量％至約3重量％的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物；其中，與在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的親本絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶混合物相比，所述纖維素酶混合物的纖維素酶活性至少提高到約 1.7 倍。
8.權(quán)利要求7的發(fā)酵方法，其中所述遺傳改造步驟包括a)用Xyrl基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述絲狀真菌宿主，在所述Xyrl基因構(gòu)建物中編碼Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列與啟動子核酸序列有效連接；以及b)從步驟a)的轉(zhuǎn)化子中選出含有Xyrl基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化子。
9.權(quán)利要求7的發(fā)酵方法，其中所述Xyrl轉(zhuǎn)錄因子選自a)包含SEQID NO 27氨基酸序列的蛋白質(zhì)；b)氨基酸序列與SEQID NO :27氨基酸序列表現(xiàn)出約90%至約100%同一性的蛋白質(zhì)；c)含有雙核鋅簇的蛋白質(zhì)，其具有與含有SEQID NO :27氨基酸序列之蛋白質(zhì)等價的特異性針對纖維素酶和/或半纖維素酶啟動子中GGC(T/A)3-樣共有基序的DNA結(jié)合活性。
10.權(quán)利要求7的發(fā)酵方法，其中所述Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子選自a)氨基酸序列與SEQID NO 27氨基酸序列表現(xiàn)出約45%至約99%同一性的蛋白質(zhì)；b)氨基酸序列與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34 或 SEQ ID NO :35 之氨基酸序列表現(xiàn)出約90%至約99%同一性的蛋白質(zhì)；和c)含有雙核鋅簇的蛋白質(zhì)，其具有與含有SEQID NO :27氨基酸序列之蛋白質(zhì)等價的特異性針對纖維素酶和/或半纖維素酶啟動子序列中GGC (T/A) 3"樣基序共有序列的DNA結(jié)合活性。
11.權(quán)利要求8的發(fā)酵方法，其中所述啟動子核酸序列相對于絲狀真菌宿主來說是本源的或異源的。
12.權(quán)利要求8的發(fā)酵方法，其中所述啟動子核酸序列源自這樣的基因，所述基因的表達在利用含有半纖維素來源之碳水化合物的碳源培養(yǎng)絲狀真菌宿主的過程中被誘導(dǎo)。
13.權(quán)利要求12的發(fā)酵方法，其中所述啟動子核酸序列源于選自以下的基因里氏木霉(T. reesei)bxll、里氏木霉xlnl和里氏木霉xln2。
14.權(quán)利要求8的發(fā)酵方法，其中所述啟動子核酸序列來自這樣的基因，所述基因在所述絲狀真菌宿主生長過程中組成型表達。
15.權(quán)利要求7的發(fā)酵方法，其中所述遺傳改造步驟還包括修飾所述絲狀真菌宿主中編碼半纖維素酶的一種或多種基因，從而使所述絲狀真菌宿主在所述一種或多種半纖維素酶的表達方面部分或完全地缺陷，所述半纖維素酶選自木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-甘露聚糖酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶及其組合。
16.權(quán)利要求15的發(fā)酵方法，其中所述一種或多種半纖維素酶選自木聚糖酶和β-木糖苷酶。
17.權(quán)利要求1至16中任一項的發(fā)酵方法，其中所述方法產(chǎn)生含有約40重量％至約 100重量％纖維素酶組分的纖維素酶混合物。
18.權(quán)利要求1至17中任一項的發(fā)酵方法，其中，與使用不過表達Xyrl之親本絲狀真菌的等價方法相比，所述方法的特征在于其單位生產(chǎn)率(qp)提高到至少約兩倍。
19.權(quán)利要求1至18中任一項的發(fā)酵方法，其中所述絲狀真菌宿主是木霉屬 (Trichoderma) > j lifM (Hypocrea)、曲霉菌屬(Aspergillus)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、 鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)、脈孢菌屬(Neurospora)、平革菌屬 (Phanerochaete)、 ！ifM (Agaricus) ^"kMM (Chaetomium) ^M'MM (Magnaporthe)的物種。
20.權(quán)利要求19的發(fā)酵方法，其中所述絲狀真菌宿主是里氏木霉(Trichodermareesei)或紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。
21.權(quán)利要求1至20中任一項的發(fā)酵方法，其中所述培養(yǎng)基包含一種或多種額外的碳源。
22.權(quán)利要求21的發(fā)酵方法，其中所述一種或多種額外的碳源是甘油、一種或多種糖醇或有機酸。
23.權(quán)利要求22的發(fā)酵方法，其中所述一種或多種糖醇是木糖醇。
24.權(quán)利要求1至23中任一項的發(fā)酵方法，其中所述培養(yǎng)步驟在約20°C至約35°C溫度下以及PH為約3. O至約6. 5的條件下進行。
25.權(quán)利要求1至24中任一項的發(fā)酵方法，其中所述方法采用分批補料方式。
26.權(quán)利要求1至25中任一項的發(fā)酵方法，其中所述方法采用連續(xù)方式。
27.權(quán)利要求1至26中任一項的發(fā)酵方法，其中所述方法在有氧條件下進行。
28.權(quán)利要求1至27中任一項的發(fā)酵方法，其中所述誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物選自纖維素、乳糖、纖維二糖、槐糖、龍膽二糖及其組合。
29.權(quán)利要求1至28中任一項的發(fā)酵方法，其中所述碳源包含O重量％的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物。
30.用于水解纖維素底物的方法，其包括將所述底物與由權(quán)利要求1至29中任一項發(fā)酵方法產(chǎn)生的纖維素酶混合物相接觸。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述纖維素底物是經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料。
32.用于生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，所述方法包括a)提供過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)改造絲狀真菌宿主；以及b)在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟a)所述的經(jīng)改造絲狀真菌宿主以產(chǎn)生纖維素酶混合物，其中所述碳源含有約25重量％至約100重量％半纖維素來源之糖醇、約0重量％誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物以及約0重量％至約75重量％的葡萄糖、甘油或其組合；其中與在同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不過表達Xyrl轉(zhuǎn)錄因子或Xyrl等價轉(zhuǎn)錄因子的親本絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶混合物相比，所述纖維素酶混合物的纖維素酶活性提高到至少約 1.7 倍。
33.權(quán)利要求32的發(fā)酵方法，其中所述半纖維素來源之糖醇是木糖醇。
34.權(quán)利要求33的發(fā)酵方法，其中所述碳源包含約0重量％至約25重量％甘油和約0重量％至約50重量％葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法。該方法包括提供經(jīng)遺傳修飾的宿主絲狀真菌，所述絲狀真菌過表達Xyr1轉(zhuǎn)錄因子和/或部分或完全缺失一種或多種半纖維素酶的表達。所述絲狀真菌宿主在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述碳源包含約60重量％至約100重量％的半纖維素來源之碳水化合物和少于5％的誘導(dǎo)纖維素酶之碳水化合物或者包含約25重量％至約100重量％的半纖維素來源之糖醇連同約0重量％至約75重量％的葡萄糖、甘油或其組合。
文檔編號C12N15/09GK102292438SQ200980149172
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日
發(fā)明者克里斯托弗·D·欣德爾, 洛雷塔·古迪奈特-薩維奇, 特里薩·C·懷特 申請人:艾歐基能源公司