專利名稱：有效跳躍人杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良前mRNA外顯子45的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體而言涉及人類遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及人杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良前mRNA剪接的調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
肌病是導(dǎo)致肌肉功能性損傷的病癥。肌營(yíng)養(yǎng)不良(MD)是指特征為骨骼肌的逐漸衰弱和退化的遺傳學(xué)疾病。杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良(Becker muscular dystrophy,BMD)是最常見(jiàn)的兒童形式的肌營(yíng)養(yǎng)不良。它們是隱性遺傳疾病，因?yàn)樨?fù)責(zé)DMD和BMD的基因位于X染色體上，突變主要影響男性，發(fā)病率約為每3500名男孩中一例。DMD和BMD是由編碼抗肌萎縮蛋白的DMD基因的遺傳學(xué)缺陷導(dǎo)致，所述抗肌萎縮蛋白是細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用所必需的肌肉蛋白，用于在收縮期間維持肌纖維的穩(wěn)定性。DMD是嚴(yán)重且致死的神經(jīng)肌肉病癥，導(dǎo)致在12歲之前依靠輪椅維持，并且由于呼吸或心臟衰竭，DMD患者通常在30歲之前死去。相比之下，BMD患者通常直至晚年仍能走動(dòng)，并具有近乎正常的預(yù)期壽命。DMD基因中的DMD突變主要特征為移碼插入或缺失或無(wú)義點(diǎn)突變，導(dǎo)致功能性抗肌萎縮蛋白的缺乏。通常，BMD突變保持閱讀框完整，允許合成具有部分功能性抗肌萎縮蛋白。最近十年，已經(jīng)出現(xiàn)為了恢復(fù)DMD轉(zhuǎn)錄本的破壞的閱讀框而進(jìn)行的剪接的特定修飾，作為杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)的有希望的療法(van 0mmen,van Deutekom, Aartsma-Rus, Curr Opin MolTher. 2008 ；10(2) :140-9, Yokota, Duddy, Partidge, Acta Myo1. 2007 ； 26(3) :179-84, van Deutekom et al.，N Engl J Med. 2007 ；357 (26) :2677-86)。使用干擾剪接信號(hào)的反義寡核苷酸(AON)，可以在DMD前mRNA中誘導(dǎo)特定的外顯子跳躍，從而恢復(fù)開(kāi)放閱讀框并將嚴(yán)重的DMD轉(zhuǎn)變成較輕微的BMD表型(van Deutekom et al. Hum Mol Genet. 2001；10 :1547-54 ；Aartsma-Rus et al.，Hum Mol Genet 2003 ；12(8) 907-14.)。在由于外顯子23中無(wú)義突變導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白缺乏的mdx小鼠模型中首次獲得體內(nèi)概念驗(yàn)證(proof-of-conc印t)。肌內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射靶向突變的外顯子23的 AON恢復(fù)抗肌萎縮蛋白的表達(dá)持續(xù)至少三個(gè)月(Lu et al. Nat Med. 2003 ；8 =1009-14 ；Lu et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 ；102(1) :198-203)。這是通過(guò)纖維膜處抗肌萎縮蛋白關(guān)聯(lián)蛋白的恢復(fù)以及處理的肌肉的功能性改善來(lái)實(shí)現(xiàn)的。還在hDMD小鼠模型中實(shí)現(xiàn)人外顯子的體內(nèi)跳躍，所述hDMD小鼠模型包含整合在小鼠染色體5中的人DMD基因的完整拷貝(Bremmer-Bout et al. Molecular Therapy. 2004 ；10 :232-40 ； ‘ t Hoen et al. J Biol Chem. 2008 ；283 :5899-907)。由于大多數(shù)DMD患者具有集中在熱點(diǎn)區(qū)的缺失，因此少量外顯子跳躍適用于相對(duì)多數(shù)的患者。可以用DMD突變數(shù)據(jù)庫(kù)所報(bào)道的缺失、復(fù)制和點(diǎn)突變來(lái)確定外顯子跳躍的實(shí)際應(yīng)用，DMD突變數(shù)據(jù)庫(kù)例如可在棚.dmd. nl獲得的萊頓DMD突變數(shù)據(jù)庫(kù)。DMD前mRNA 外顯子45的治療性跳躍將恢復(fù)具有缺失的DMD患者的開(kāi)放閱讀框，所述缺失包括但不限于 DMD 前 mRNA 的外顯子 12-44、18-44、44、46、46-47、46-48、46-49、46-51、46-53、46_55、 46-59、46-60，所述DMD患者共占具有缺失的所有DMD患者的16% (Aartsma-Rus and van Deutekom,2007, Antisense Elements(Genetics)Research Focus,2007 Nova Science Publishers, he)。此外，對(duì)于某些DMD患者，需要同時(shí)跳躍除了外顯子45之外的一個(gè)或多個(gè)外顯子，例如外顯子51或53，來(lái)恢復(fù)正確的閱讀框。非限制性實(shí)例包括，具有外顯子 46-50缺失的患者需要外顯子45和51的共跳躍或具有外顯子46-52缺失的患者需要外顯子45和53的共跳躍。最近，成功完成了首次用于人體的研究，其中將誘導(dǎo)外顯子51跳躍的AON注入 4名DMD患者脛骨前肌的小區(qū)域內(nèi)。在治療的所有四名患者的大多數(shù)肌纖維中觀察到新抗肌萎縮蛋白表達(dá)，并且該AON是安全且耐受良好的(van Deutekom et al. N Engl J Med. 2007；357 :2677-86)。研究的多數(shù)AON包含高達(dá)20個(gè)核苷酸，并且已經(jīng)證明該相對(duì)短的尺寸改善AON的組織分布能力和/或細(xì)胞滲透能力。然而，這類短AON將由于增加的與基因組別處存在相同序列的風(fēng)險(xiǎn)而導(dǎo)致有限的特異性，和由于AON-靶標(biāo)復(fù)合物的低自由能而導(dǎo)致有限的靶標(biāo)結(jié)合力或靶標(biāo)親和力。因此，本發(fā)明人決定設(shè)計(jì)不會(huì)表現(xiàn)出所有這些缺點(diǎn)的新的并任選地改良的寡核苷酸。發(fā)明的詳細(xì)描述^^第一方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)和/或促進(jìn)患者中，優(yōu)選所述患者分離的細(xì)胞中DMD 前mRNA的外顯子45跳躍的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞和/或所述患者提供與所述外顯子中的至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的分子。因此，本文提供了誘導(dǎo)和/或促進(jìn)，優(yōu)選患者分離的細(xì)胞中，DMD前mRNA的外顯子 45跳躍的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞和/或所述患者提供與所述外顯子中的至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的分子。應(yīng)當(dāng)理解，所述方法包括體外、體內(nèi)或離體方法。本文所定義，DMD前mRNA優(yōu)選表示DMD或BMD患者DMD基因的前mRNA。DMD基因或蛋白相當(dāng)于抗肌萎縮蛋白基因或蛋白。優(yōu)選地，患者意圖表示患有本文隨后所定義的具有DMD或BMD的患者，或由于他或她的遺傳學(xué)背景而易于發(fā)展為DMD或BMD的患者。外顯子跳躍是指誘導(dǎo)細(xì)胞中的成熟mRNA不包含正常存在其中的特定外顯子。通過(guò)向表達(dá)所述mRNA的前mRNA的細(xì)胞提供能干擾諸如剪接供體或剪接受體序列的序列的分子，或能干擾外顯子包含信號(hào)的分子來(lái)實(shí)現(xiàn)外顯子跳躍，所述剪接供體或剪接受體序列為允許剪接的酶促過(guò)程所必需的，所述外顯子包含信號(hào)是識(shí)別一段核苷酸作為待包括在mRNA 中的外顯子所必需的。術(shù)語(yǔ)前mRNA是指通過(guò)轉(zhuǎn)錄從細(xì)胞核中的DNA模板合成的未加工的或部分加工的前體mRNA。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，本文所指的誘導(dǎo)和/或促進(jìn)外顯子跳躍表示治療的患者的一個(gè)或多個(gè)(肌肉)細(xì)胞中至少 1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的DMD mRNA不包含所述外顯子。如實(shí)施例中所述，這優(yōu)選通過(guò)PCR來(lái)評(píng)價(jià)。優(yōu)選地，本發(fā)明方法通過(guò)誘導(dǎo)或促進(jìn)患者的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中的DMD前mRNA的外顯子45的跳躍，向所述患者提供功能性抗肌萎縮蛋白和/或減少所述患者中異?？辜∥s蛋白的產(chǎn)生。因此，優(yōu)選的方法是這樣的方法其中向患者或所述患者的細(xì)胞提供功能性抗肌萎縮蛋白和/或其中所述患者或所述患者的細(xì)胞中異?？辜∥s蛋白的產(chǎn)生減少。減少異?？辜∥s蛋白的產(chǎn)生可以在mRNA水平上評(píng)價(jià)，并且優(yōu)選表示通過(guò)RT PCR仍然可檢測(cè)到異?？辜∥s蛋白mRNA最初數(shù)量的99 %、90 %、80 %、70 %、60 %、50 %、 40%,30%,20%,10%,5%或更少。異?？辜∥s蛋白mRNA或蛋白在本文也被稱為非功能性抗肌萎縮蛋白mRNA或蛋白。非功能性抗肌萎縮蛋白優(yōu)選是不能與肌動(dòng)蛋白和/或DGC 蛋白復(fù)合物成員結(jié)合的抗肌萎縮蛋白。非功能性抗肌萎縮蛋白或抗肌萎縮蛋白mRNA通常沒(méi)有或不編碼具有蛋白的完整C-末端的抗肌萎縮蛋白。增加所述患者或所述患者細(xì)胞中功能性抗肌萎縮蛋白的產(chǎn)生可以在mRNA水平上評(píng)價(jià)(通過(guò)RT-PCR分析)，并且優(yōu)選表示通過(guò)RT PCR仍可檢測(cè)到可檢測(cè)數(shù)量的功能性抗肌萎縮蛋白mRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)到的抗肌萎縮蛋白mRNA的1 %、5%、10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多是功能性抗肌萎縮蛋白mRNA。增加所述患者或所述患者細(xì)胞中功能性抗肌萎縮蛋白的產(chǎn)生可以在蛋白水平上評(píng)價(jià)(通過(guò)免疫熒光和western印跡分析)，并且優(yōu)選表示通過(guò)免疫熒光或western印跡分析檢測(cè)可檢測(cè)數(shù)量的功能性抗肌萎縮蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)到的抗肌萎縮蛋白的1%、5%、 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多是功能性抗肌萎縮蛋白。本文所定義，功能性抗肌萎縮蛋白優(yōu)選是與具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白相應(yīng)的野生型抗肌萎縮蛋白。功能性抗肌萎縮蛋白優(yōu)選是這樣的抗肌萎縮蛋白，其具有在它的N末端部分中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(N末端的前240個(gè)氨基酸)、半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(氨基酸3361至3685)和C末端結(jié)構(gòu)域(C末端的最后325個(gè)氨基酸)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，這些結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)都存在于野生型抗肌萎縮蛋白中。本文所指的氨基酸與SEQ ID NO :1表示的野生型抗肌萎縮蛋白的氨基酸相符合。換而言之，功能性抗肌萎縮蛋白是至少在一定程度上表現(xiàn)出野生型抗肌萎縮蛋白活性的抗肌萎縮蛋白。“至少在一定程度上”優(yōu)選表示野生型功能性抗肌萎縮蛋白的相應(yīng)活性的至少10<%、20%、30%、 40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^ 100%。在本文中，功能性抗肌萎縮蛋白的活性是優(yōu)選與肌動(dòng)蛋白和與抗肌萎縮蛋白關(guān)聯(lián)的糖蛋白復(fù)合物(DGC)結(jié)合(Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)條目確定閱讀框規(guī)則的突變類型反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144).通過(guò)使用總蛋白提取物的免疫共沉淀或來(lái)自肌肉活檢的橫斷面的免疫熒光分析可以顯現(xiàn)抗肌萎縮蛋白與肌動(dòng)蛋白和與DGC復(fù)合物的結(jié)合，這對(duì)本領(lǐng)技術(shù)人員是已知的?；级排d肌營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體或患者通常在DMD基因中具有突變，其阻止完整抗肌萎縮蛋白的合成，即提前的終止阻止C-末端的合成。在貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良中，DMD基因與野生型基因比較也包含突變，但是所述突變通常不會(huì)誘導(dǎo)提前的終止且通常合成C-末端。因此合成的功能性抗肌萎縮蛋白具有至少與野生型蛋白一樣的活性，盡管沒(méi)有必要是相同的活性量。BMD個(gè)體的基因組通常編碼這樣的抗肌萎縮蛋白，其包含N末端部分(N末端的前240個(gè)氨基酸)、半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(氨基酸3361至3685)和C末端結(jié)構(gòu)域(C末端的最后325 個(gè)氨基酸)，但是它的中央桿狀結(jié)構(gòu)域可以短于野生型抗肌萎縮蛋白之一(Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)條目確定閱讀框規(guī)則的突變類型和反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144)。用于DMD治療的外顯子跳躍通常通過(guò)跳躍桿狀結(jié)構(gòu)域中的外顯子以糾正閱讀框和允許包含C-末端的抗肌萎縮蛋白的殘余部分的合成， 克服前mRNA中的提前終止，盡管由于較小的桿狀結(jié)構(gòu)域，所述蛋白略小。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，患有DMD并通過(guò)本文所定義的方法治療的個(gè)體會(huì)提供至少在一定程度上表現(xiàn)出野生型抗肌萎縮蛋白活性的抗肌萎縮蛋白。更優(yōu)選地，如果所述個(gè)體是杜興患者或疑似杜興患者，功能性抗肌萎縮蛋白是患有BMD個(gè)體的抗肌萎縮蛋白通常所述抗肌萎縮蛋白能與肌動(dòng)蛋白和DGC兩者相互作用，但是它的中央桿狀結(jié)構(gòu)域可以短于野生型抗肌萎縮蛋白的中央桿狀結(jié)構(gòu)域(Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)條目確定閱讀框規(guī)則的突變類型和反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144).野生型抗肌萎縮蛋白的中央桿狀結(jié)構(gòu)域包含M個(gè)血影蛋白樣重復(fù)(Aartsma-Rus A et al，(2006)，萊頓杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)條目確定閱讀框規(guī)則的突變類型和反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144)。例如，本文所提供的抗肌萎縮蛋白的中央桿狀結(jié)構(gòu)域可以包含5_23 個(gè)、10-22個(gè)或12-18個(gè)血影蛋白樣重復(fù)，只要它能與肌動(dòng)蛋白和與DGC結(jié)合。本發(fā)明方法可以緩解來(lái)自含有缺失的DMD患者的肌細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)特征， 所述缺失包括但不限于所述患者的DMN前mRNA的外顯子12-44、18_44、44、46、46_47、 46-48、46-49、46-51、46-53、46-55、46-59、46-60(Aartsma-Rus and van Deutekom，2007， Antisense Elements(Genetics)Research Focus,2007 Nova Science Publishers, Inc), 以及環(huán)節(jié)來(lái)自需要同時(shí)跳躍除了外顯子45之外的一個(gè)或多個(gè)外顯子的DMD患者的肌細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)特征，所述需要同時(shí)跳躍除了外顯子45之外的一個(gè)或多個(gè)外顯子的DMD患者包括但不限于需要共跳躍外顯子45和51具有外顯子46-50缺失的患者，或需要共跳躍外顯子45和53的具有外顯子46-52缺失的患者。在優(yōu)選的方法中，緩解來(lái)自DMD患者的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的一種或多種癥狀或特征?？梢栽诩?xì)胞、組織水平或患者自身評(píng)價(jià)這類癥狀或特征。可以通過(guò)對(duì)來(lái)自患者的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞進(jìn)行下述任何測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)一種或多種癥狀或特征的緩解減少的肌細(xì)胞鈣攝取、減少的膠原蛋白合成、改變的形態(tài)學(xué)、改變的脂質(zhì)合成、減少的氧化應(yīng)激和/或改善的肌纖維功能、完整和/或存活。通常使用肌肉活檢的橫斷面的免疫熒光和/或組織化學(xué)分析來(lái)評(píng)價(jià)這些參數(shù)。還可以使用下述測(cè)定中的至少一個(gè)來(lái)評(píng)價(jià)肌纖維功能、完整性和/或存活的改善血液中肌酸激酶可檢測(cè)地減少、疑似營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉的活檢橫斷面中肌纖維壞死可檢測(cè)地減少和/或疑似營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉的活檢橫斷面中肌纖維直徑的同質(zhì)性可檢測(cè)地增加。 這些測(cè)定中的每一種都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。可以如Hodgetts et al (Hodgetts S. ,et al, (2006) ,Neuromuscular Disorders, 16 :591-602. 2006)所述檢測(cè)血液中的肌酸激酶。肌酸激酶可檢測(cè)地減少可以表示與治療前的同一 DMD患者中的肌酸激酶濃度相比減少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90% 或更多。肌纖維壞死可檢測(cè)地減少優(yōu)選在肌肉活檢中評(píng)價(jià)，更優(yōu)選如Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16 :591-602. 2006)所述使用活檢橫斷面來(lái)評(píng)價(jià)。壞死可檢測(cè)地減少可以是其中使用活檢橫斷面鑒定為壞死區(qū)域減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。通過(guò)與治療前的同一 DMD患者中評(píng)價(jià)的壞死比較來(lái)測(cè)量所述減少。肌纖維直徑的同質(zhì)性可檢測(cè)地增加優(yōu)選在肌肉活檢橫斷面中評(píng)價(jià)，更優(yōu)選如 在 Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al，(2006)，Neuromuscular Disorders，16 591-602. 2006)中所述評(píng)價(jià)。通過(guò)與治療前的同一 DMD患者的肌肉活檢橫斷面中的肌纖維直徑的同質(zhì)性比較測(cè)量所述增加。可以通過(guò)對(duì)患者自身進(jìn)行任何下述測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)一種或多種癥狀或特征的緩解 將喪失行走的時(shí)間延長(zhǎng)、肌力的改善、舉重物能力的改善、從地上站起來(lái)所需時(shí)間的改善、 9米行走時(shí)間改善、攀爬四層樓梯所需時(shí)間的改善、腿功能等級(jí)的改善、肺功能的改善、心臟功能的改善、生活質(zhì)量的改善。這些測(cè)定中的每一種都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。舉例而言，Manzur at al (Manzur AY et al, (2008), Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy (杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)留類)(綜述)，Wiley publishers,The Cochrane collaboration.)的公開(kāi)對(duì)這些測(cè)定中的每一種都給出大量的說(shuō)明。對(duì)于這些測(cè)定中的每一種，一旦發(fā)現(xiàn)測(cè)定中測(cè)量的參數(shù)可檢測(cè)地改善或延長(zhǎng)，則將優(yōu)選表示使用本發(fā)明方法已經(jīng)緩解了個(gè)體的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的一種或多種癥狀?？蓹z測(cè)地改善或延長(zhǎng)優(yōu)選統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改善或延長(zhǎng)，如Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16 :591-602. 2006)中所述?？蛇x擇地，可以通過(guò)測(cè)量如本文后所定義的肌纖維功能、完整性和/或存活的改善來(lái)評(píng)價(jià)杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良一種或多種癥狀的緩解。本發(fā)明方法的治療可以持續(xù)至少一周、至少一個(gè)月、至少七個(gè)月、至少一年、至少 2、3、4、5、6年或更長(zhǎng)。本發(fā)明的寡核苷酸、組合物或化合物的給藥頻率可以依賴于數(shù)個(gè)參數(shù)，例如患者年齡、突變類型、分子數(shù)(劑量)、所述分子的劑型。所述頻率可以在兩周至少一次、或三周至少一次或四周至少一次或五周至少一次或更長(zhǎng)的時(shí)間周期之間改變。本文所定義的用于本發(fā)明中的每個(gè)分子或寡核苷酸或其等同物都可適用于直接給予受DMD影響或有發(fā)展為DMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的體內(nèi)細(xì)胞、組織和/或器官，并且可以被體內(nèi)、體外或離體直接給藥。本文所定義的寡核苷酸可適用于給予受DMD影響或有發(fā)展為DMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的體內(nèi)細(xì)胞、組織和/或器官，并且可以被體內(nèi)、體外或離體給藥。所述寡核苷酸可直接或間接給予受DMD影響或有發(fā)展為DMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的體內(nèi)細(xì)胞、組織和/或器官，并且可以被體內(nèi)、體外或離體直接或間接給藥。由于杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良在肌細(xì)胞中具有顯著的表型，因此優(yōu)選所述細(xì)胞是肌細(xì)胞，優(yōu)選所述組織是肌肉組織和/或優(yōu)選所述器官包含肌肉組織或由肌肉組織組成。優(yōu)選的器官是心臟。優(yōu)選地，所述細(xì)胞包含編碼突變體抗肌萎縮蛋白的基因。 優(yōu)選地，所述細(xì)胞是患DMD的個(gè)體的細(xì)胞?？梢詫⒎肿踊蚬押塑账峄蚱涞韧镞f送至細(xì)胞。當(dāng)將所述分子、寡核苷酸或其等同物給藥至個(gè)體時(shí)，優(yōu)選將它溶解在與遞送方法相容的溶液中。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、膜內(nèi)給藥和/或心室內(nèi)給藥，所述溶液優(yōu)選是生理鹽水。特別優(yōu)選的本發(fā)明方法是使用賦形劑，所述賦形劑將進(jìn)一步增強(qiáng)本文所定義的所述分子、寡核苷酸或其功能等同物遞送至細(xì)胞或細(xì)胞中，優(yōu)選肌細(xì)胞。優(yōu)選的賦形劑在題目為“藥物組合物”的部分中界定。如實(shí)施例所示，我們用聚乙烯亞胺(PEI，EXGen500，MBI Fermentas)在體外獲得了非常好的結(jié)果。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，使用能誘導(dǎo)和/或促進(jìn)患者DMD前mRNA的不同外顯子跳躍的其他分子。優(yōu)選地，第二外顯子選自患者抗肌萎縮蛋白前mRNA的外顯子7、44、46、51、 53、59、67。表2中列出了可以使用的分子。優(yōu)選的分子包含表2所公開(kāi)的任一個(gè)寡核苷酸或由所述寡核苷酸組成。還可以組合使用數(shù)個(gè)寡核苷酸。這樣，阻止了從該前mRNA產(chǎn)生包含DMD前mRNA兩個(gè)或多個(gè)外顯子的mRNA。該實(shí)施方案也被稱為雙重或多重外顯子跳躍 (Aartsma-Rus A, Janson AA，Kaman WE, et al. Antisense-induced multi 夕卜顯子跳躍 for 杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良makes more sense (杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的反義誘導(dǎo)的多重外顯子跳躍更有意義).Am J Hum Genet 2004 ；74(1) :83-92,Aartsma-Rus A,Kaman WEiWeij R，den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic 夕卜顯子跳躍 for 杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良 by double targeting within one or multiple exons(通過(guò)雙重靶向一個(gè)或多個(gè)外顯子來(lái)開(kāi)發(fā)對(duì)杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良治療的外顯子跳躍的前沿).Mol Ther 2006； 14 (3) :401-7)。在大多數(shù)情況下，雙重外顯子跳躍導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白前mRNA僅排除兩個(gè)靶向外顯子。然而，在其他情況下，發(fā)現(xiàn)所述前mRNA中的靶向外顯子和所述外顯子之間的全部區(qū)域在產(chǎn)生的mRNA中都不存在了，即使這些區(qū)域中存在其他外顯子(其間的外顯子)。該多重跳躍顯然是來(lái)自DMD基因的寡核苷酸組合的結(jié)果，其中將外顯子45的一個(gè)寡核苷酸和外顯子51的一個(gè)寡核苷酸添加到轉(zhuǎn)錄DMD基因的細(xì)胞中。這種安排導(dǎo)致產(chǎn)生的 mRNA不包含外顯子45-51。顯然地，在所提及寡核苷酸存在的情況下，前mRNA的結(jié)構(gòu)是這樣的刺激剪接體系使外顯子44和52彼此連接。通過(guò)在兩條互補(bǔ)的寡核苷酸之間提供連接，也有可能特定地促進(jìn)其間的外顯子跳躍。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)連接部分使與至少兩個(gè)抗肌萎縮蛋白外顯子互補(bǔ)的核苷酸區(qū)段分離。因此在該實(shí)施方案中，所述至少兩段核苷酸連接形成單個(gè)分子。如果多于一個(gè)化合物用在本發(fā)明方法中，則可以以任何順序?qū)⑺龌衔锝o予個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可以被同時(shí)給藥(意思是在10小時(shí)之內(nèi)，優(yōu)選在1小時(shí)之內(nèi)給予所述化合物)。盡管如此，這是沒(méi)有必要的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相繼給予所述化合物。第二方面，提供了如前部分題目為“方法”所述的方法中使用的分子。該分子優(yōu)選包含寡核苷酸或由寡核苷酸組成。所述寡核苷酸優(yōu)選是反義寡核苷酸(AON)或反義寡核糖核苷酸。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用與外顯子45中至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的分子，尤其所述外顯子被高頻率地特異跳躍。盡管，該效應(yīng)與所述分子與結(jié)合少于21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段的分子相比的較高結(jié)合親和力有關(guān)，但是可能有其他細(xì)胞內(nèi)參數(shù)參與促成雜交雙鏈的熱動(dòng)力、動(dòng)力或結(jié)構(gòu)特征。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用與所述外顯子中的至少21、25、30、35、 40,45,50個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含與DMD前mRNA的外顯子45的一部分互補(bǔ)的序列的本發(fā)明分子或寡核苷酸是這樣的所述互補(bǔ)部分至少是本發(fā)明寡核苷酸長(zhǎng)度的50%，更優(yōu)選至少是60%，更優(yōu)選至少是70%，更優(yōu)選至少是80%，更優(yōu)選至少是90%或更優(yōu)選至少是 95%甚至更優(yōu)選至少是98%和最優(yōu)選高達(dá)100%?！巴怙@子45的一部分”優(yōu)選表示至少21 個(gè)核苷酸的區(qū)段。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸由與本文所定義的外顯子45 抗肌萎縮蛋白前mRNA的一部分互補(bǔ)的序列組成?？蛇x擇地，寡核苷酸可以包含與本文所定義的外顯子45抗肌萎縮蛋白前mRNA的一部分互補(bǔ)的序列和其他側(cè)翼序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度至少為21、22、23、對(duì)、25、沈、27、觀、29、30、31、 32、33、34、；35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 個(gè)核苷酸?？梢允褂脭?shù)種側(cè)翼序列類型。優(yōu)選地，其他側(cè)翼序列用來(lái)修飾蛋白與所述分子或寡核苷酸的結(jié)合，或用來(lái)修飾寡核苷酸的熱動(dòng)力特征、更優(yōu)選地用來(lái)修飾靶RNA結(jié)合親和力。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其他側(cè)翼序列與不存在于外顯子45中的DMD前mRNA的序列互補(bǔ)。這類側(cè)翼序列優(yōu)選與包含外顯子45的剪接點(diǎn)受體或供體一致序列的序列或由該一致序列組成的序列互補(bǔ)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這類側(cè)翼序列與包含鄰近外顯子45的DMD前mRNA的內(nèi)含子即內(nèi)含子44或45的序列或由該內(nèi)含子組成的序列互補(bǔ)。外顯子45中的至少21、25、30、35、40、45、50個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段優(yōu)選選自序列5 ’ -CCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUU⑶CAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUAAU UCAGCAAUC-3，(SEQ ID NO 2)。發(fā)現(xiàn)與包含SEQ ID NO. 2的至少21、25、30、35、40、45、50個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段或由所述連續(xù)區(qū)段組成的核苷酸序列結(jié)合的分子導(dǎo)致提供有該分子的細(xì)胞中外顯子45的高效跳躍。發(fā)現(xiàn)與包含SEQ ID NO 2的少于21核苷酸的連續(xù)區(qū)段的核苷酸序列結(jié)合的分子以比本發(fā)明分子低效的方式誘導(dǎo)外顯子跳躍。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了這樣的方法其中分子與SEQ ID NO 2中至少21、25、30、35個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合。與通常理解的相反，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)使用長(zhǎng)度至少為21個(gè)核苷酸的寡核苷酸可以達(dá)到更高特異性和效率的外顯子跳躍。所示的序列沒(méi)有一個(gè)源自剪接點(diǎn)的保守部分。因此，所述分子不可能介導(dǎo)來(lái)自DMD前mRNA的其他外顯子或來(lái)自其他基因的外顯子的差異剪接。在一個(gè)實(shí)施方案中，能干擾DMD前mRNA的外顯子45的包含的本發(fā)明的分子是與指定序列結(jié)合的化合物分子，或者是已經(jīng)被修飾得能與RNA分子上的指定核苷酸序列結(jié)合的諸如RNA結(jié)合蛋白或非天然的鋅指蛋白的蛋白。用于篩查與特定核苷酸序列結(jié)合的化合物分子的方法例如在PCT/NL01/00697和美國(guó)專利6875736中公開(kāi)，通過(guò)引用將二者并入本文。用于設(shè)計(jì)與特定核苷酸序列結(jié)合的RNA結(jié)合鋅指蛋白的方法在Friesen and Darby, Nature Structural Biology 5:543-546(1998)中公開(kāi)，通過(guò)引用將其并入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能干擾DMD前mRNA的外顯子45的包含的本發(fā)明分子包含與DMD基因前mRNA的編碼鏈互補(bǔ)或能堿基配對(duì)的反義寡核苷酸。所述反義寡核苷酸優(yōu)選包含RNA殘基、DNA殘基和/或核苷酸類似物或等同物，這將在下文詳述。本發(fā)明的優(yōu)選分子包含21-50個(gè)核苷酸或堿基的核苷酸類或核苷酸或反義寡核苷酸序列，更優(yōu)選21-40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選21-30個(gè)核苷酸，例如21個(gè)核苷酸、22個(gè)核苷酸、 23個(gè)核苷酸、M個(gè)核苷酸、％個(gè)核苷酸、26個(gè)核苷酸、27個(gè)核苷酸、28個(gè)核苷酸、四個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、31個(gè)核苷酸、32個(gè)核苷酸、33個(gè)核苷酸、；34個(gè)核苷酸、35個(gè)核苷酸、36個(gè)核苷酸、37個(gè)核苷酸、38個(gè)核苷酸、39個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、41個(gè)核苷酸、42個(gè)核苷酸、43 個(gè)核苷酸、44個(gè)核苷酸、45個(gè)核苷酸、46個(gè)核苷酸、47個(gè)核苷酸、48個(gè)核苷酸、49個(gè)核苷酸或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明最優(yōu)選的分子包含25個(gè)核苷酸的核苷酸類序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子與核苷酸序列SEQ ID N0:2中的至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合，或與核苷酸序列SEQ ID NO :2中的至少21個(gè)核苷酸的至少一段連續(xù)區(qū)段互補(bǔ)或反義。在某個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分子包含選自表1所列出的除了 SEQ ID NO 68 之外的反義核苷酸序列的反義核苷酸序列或由所述反義核苷酸序列組成。與存在于DMD基因外顯子45中的SEQ ID NO 2序列反義的本發(fā)明的分子優(yōu)選包含下述反義核苷酸序列或由下述反義核苷酸序列組成SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO IUSEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 28,SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37,SEQ ID NO 38,SEQ ID NO 39,SEQ ID NO 40,SEQ ID NO 41,SEQ ID NO 42,SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55,SEQ ID NO 56,SEQ ID NO 57,SEQ ID NO 58,SEQ ID NO 59,SEQ ID NO 60,SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66 禾口 / 或 SEQ ID NO :67。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分子包含SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 7和/或SEQ ID NO 8反義核苷酸序列或由所述反義核苷酸序列組成。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分子包含SEQ ID NO 3的反義核苷酸序列或由所述反義核苷酸序列組成。發(fā)現(xiàn)該分子在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的DMD前mRNA外顯子45的剪接中是非常有效的。本發(fā)明分子的核苷酸序列可以包含RNA殘基、DNA殘基、核苷酸類似物或等同物， 這在下文將詳述。此外，本發(fā)明的分子可以包括本文所定義的本發(fā)明分子的功能性等同物。優(yōu)選地，本發(fā)明分子包含一個(gè)或至少一個(gè)被修飾的殘基，以增加核酸酶抗性和/ 或增加反義核苷酸與靶序列的親和力。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反義核苷酸序列包含一個(gè)或至少一個(gè)核苷酸類似物或等同物，其中將核苷酸類似物或等同物定義為具有修飾堿基和/或具有修飾主鏈和/或具有非天然核苷間連接或這些修飾的組合的殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸類似物或等同物包含修飾的主鏈。這類主鏈的實(shí)例通過(guò)下述修飾提供嗎啉代主鏈、氨基甲酸酯主鏈、硅氧烷主鏈、硫化、亞砜和砜主鏈、甲酰乙?；?formacetyl)和硫代甲酰乙?；麈?、亞甲基甲酰乙?；?(methyleneformacetyl)主鏈、乙酰核糖主鏈、含有烯烴的主鏈、氨基磺酸、磺酸和磺胺主鏈、亞甲基亞胺和亞甲基胼主鏈，以及氨基主鏈。磷酰二胺嗎啉代寡聚物是之前已被證實(shí)為反義試劑的修飾的主鏈寡核苷酸。嗎啉代寡核苷酸具有不帶電的主鏈，其中DNA的脫氧核糖由六元環(huán)取代，且磷酸二酯連接由磷酰二胺連接取代。嗎啉代寡核苷酸對(duì)酶降解是抗性的，并且似乎是通過(guò)阻止翻譯或干擾前mRNA剪接而非通過(guò)激活RNase H而發(fā)揮反義試劑的功能。通過(guò)物理破壞細(xì)胞膜的方法已成功地將嗎啉代寡核苷酸遞送至組織培養(yǎng)細(xì)胞中，并且一項(xiàng)比較數(shù)種這些方法的研究發(fā)現(xiàn)劃痕標(biāo)記是最有效的遞送方法；然而，由于嗎啉代主鏈不帶電，陽(yáng)離子脂質(zhì)不是嗎啉代寡核苷酸攝入細(xì)胞中的有效介導(dǎo)物。一項(xiàng)最近的報(bào)道表明嗎啉代寡核苷酸形成三螺旋，并且由于非離子型主鏈，這些研究表明在不存在鎂的條件下，嗎啉代寡核苷酸能形成三螺旋。優(yōu)選地，主鏈殘基之間的連接不包含磷原子，例如通過(guò)短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接形成的連接、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基的核苷間連接或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)的核苷間連接。優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包括具有修飾的聚酰胺主鏈的肽核酸(PNA) (Nielsen, et al. (1991) Science 254，1497-1500)?；?PNA 的分子就堿基對(duì)識(shí)別而言是真正的DNA分子模擬物。PNA的主鏈由通過(guò)肽鍵連接的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元組成，其中核苷堿基通過(guò)亞甲羰鍵與主鏈連接。可選的主鏈包含一碳延伸的吡咯烷PNA單體 (Govindaraju and KumaH2005) Chem. Commun，495-497)。由于 PNA 分子的主鏈包含不帶電的磷酸基，因此PNA-RNA雜合體通常分別比RNA-RNA或RNA-DNA雜合體更穩(wěn)定(Egholm et al (1993)Nature 365,566-568)。更優(yōu)選的主鏈包括嗎啉代核苷酸類似物或等同物，其中核糖或脫氧核糖由六元嗎啉環(huán)取代。最優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包括磷酸二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)，其中核糖或脫氧核糖由六元嗎啉環(huán)取代，并且鄰近的嗎啉環(huán)之間的陰離子磷酸二酯連接由非離子的磷二酰胺連接取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸類似物或等同物包含磷酸二酯連接的至少一個(gè)非橋氧的取代。該修飾輕微地使堿基對(duì)不穩(wěn)定，但是顯著增加了對(duì)核酸酶降解的抗性。 優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包含硫代磷酸，手性硫代磷酸，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯，H-磷酸酯，包括3'-烴基亞磷酸酯、5'-烴基亞磷酸酯和手性磷酸酯的甲基和其他烷基磷酸酯，亞膦酸酯，包括3 ‘-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯，硫羰氨基磷酸酯，硫羰烷基磷酸酯，硫羰烷基磷酸三酯，硒磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate)0本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包含一個(gè)或多個(gè)糖部分，其在2'、 3'和/或5'位置處單取代或雙取代，例如-OH ;-F;取代的或非取代的、線性的或分支的低級(jí)(Cl-ClO)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基，以上基團(tuán)可以由一個(gè)或多個(gè)雜原子打斷；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；0-、S-或N-烯丙基；0-烷基-0-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；-氨基氧；甲乙氧基；-二甲氨基乙氧基；以及-二甲氨基乙烯乙氧基。所述糖部分可以是吡喃糖或吡喃糖衍生物、或脫氧吡喃糖或脫氧吡喃糖衍生物、優(yōu)選是核糖或核糖衍生物、或脫氧核糖或脫氧核糖衍生物。這類優(yōu)選的衍生化的糖部分包括鎖核酸(LNA)，其中2'-碳原子與糖環(huán)的3'或4'碳原子連接，因而形成雙環(huán)糖部分。優(yōu)選的LNA包括2' -0,4' -C-乙烯-橋核酸(Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1 :241-242)。這些取代使得核苷酸類似物或等同物耐受RNase H和核酸酶，并增加了對(duì)靶RNA的親和力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，沒(méi)有必要均勻地修飾反義寡核苷酸中的所有位置。此外，可以將多于一個(gè)前述類似物或等同物并入單反義寡核苷酸中，或甚至并入反義寡核苷酸的單一位置中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸具有至少兩種不同類型的類似物或等同物。本發(fā)明優(yōu)選的反義寡核苷酸包含2’-0烷基磷硫酰反義寡核苷酸，例如2’ -0-甲基修飾的核糖(RNA)、2' -0-乙基修飾的核糖、2' -0-丙基修飾的核糖和/或這些修飾的取代衍生物，例如鹵代衍生物。本發(fā)明最優(yōu)選的反義寡核苷酸包含2’-0_甲基磷硫酰核糖?？蓪⒈景l(fā)明分子的功能性等同物定義為本文所定義的寡核苷酸，其中至少在一定程度上保留了所述功能性等同物的活性。優(yōu)選地，所述功能性等同物的活性是誘導(dǎo)外顯子 45跳躍，并提供功能性抗肌萎縮蛋白。因此優(yōu)選地，通過(guò)檢測(cè)外顯子45跳躍并確定功能性抗肌萎縮蛋白的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)所述功能性等同物的所述活性。本文優(yōu)選將功能性抗肌萎縮蛋白定義為能與肌動(dòng)蛋白和DGC蛋白復(fù)合物成員結(jié)合的抗肌萎縮蛋白。對(duì)寡核苷酸所述活性的評(píng)價(jià)優(yōu)選通過(guò)RT-PCR或免疫熒光或Western印跡分析來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選至少在一定程度上保留所述活性，此時(shí)，它表現(xiàn)出功能性等同物來(lái)源的所述寡核苷酸相應(yīng)活性的至少50%、或至少60 %、或至少70 %或至少80 %或至少90 %或至少95 %或更高。遍及本申請(qǐng)，當(dāng)使用詞語(yǔ)寡核苷酸時(shí)，它可以由本文所定義的其功能性等同物代替。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)了解，可以將不同的反義寡核苷酸組合，以有效跳躍人DMD 前mRNA的外顯子45。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少兩個(gè)反義寡核苷酸的組合用于本發(fā)明方法中，例如兩個(gè)不同的反義寡核苷酸、三個(gè)不同的反義寡核苷酸、四個(gè)不同的反義寡核苷酸或五個(gè)不同的反義寡核苷酸或更多。本發(fā)明還包括將表1所列出的除了 SEQ ID N0:68之外的數(shù)個(gè)寡核苷酸或分子組合起來(lái)?？梢詫⒎戳x寡核苷酸與增強(qiáng)所述反義寡核苷酸攝入細(xì)胞中，優(yōu)選生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞中的部分連接。這些部分的實(shí)例是膽固醇、碳水化合物、維生素、生物素、脂質(zhì)、磷脂、細(xì)胞穿透肽(包括但不限于觸角足突變蛋白(antermapediahTAT、transporter!以及諸如寡精氨酸、聚精氨酸、寡賴氨酸或聚賴氨酸的帶正電荷氨基酸)、諸如由抗體提供的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體的Fab片段、或諸如駱駝狀單結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的反義寡核苷酸包含肽連接的ΡΜ0。當(dāng)系統(tǒng)性遞送時(shí)，包含本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物或等同物的優(yōu)選反義寡核苷酸調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的肌細(xì)胞中的剪接。在本方面中，包含特定核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的系統(tǒng)性遞送可能導(dǎo)致靶向肌細(xì)胞的子集，而包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸可能導(dǎo)致靶向肌細(xì)胞的不同子集。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選使用包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸組合來(lái)調(diào)節(jié)人DMD前 mRNA的外顯子45跳躍。通過(guò)基于病毒的載體所提供的質(zhì)粒來(lái)源的反義寡核苷酸表達(dá)或病毒表達(dá)可以將能干擾必需序列的分子提供給細(xì)胞，這導(dǎo)致高效跳躍人DMD前mRNA的外顯子45。這類基于病毒的載體包含驅(qū)動(dòng)本文所定義的反義寡核苷酸表達(dá)的表達(dá)盒。優(yōu)選的基于病毒的載體包括基于腺病毒或基于腺相關(guān)病毒的載體。表達(dá)優(yōu)選由諸如U1、TO或U7 RNA啟動(dòng)子的聚合酶III啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。通過(guò)提供水性溶液中的質(zhì)粒可以將所述質(zhì)粒提供給肌細(xì)胞或生肌細(xì)胞，用于反義寡核苷酸表達(dá)。可選擇地，可以通過(guò)使用已知轉(zhuǎn)染藥劑的轉(zhuǎn)染來(lái)提供質(zhì)粒，例如 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)或聚乙烯亞胺(PEI ；ExGen500 (MBI Fermentas))或它們的衍生物。一個(gè)優(yōu)選的反義寡核苷酸表達(dá)系統(tǒng)是基于腺病毒相聯(lián)病毒(AAV)的載體。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出可以用于小反義核苷酸序列高效表達(dá)的基于單鏈和雙鏈AAV的載體，用于高效跳躍 DMD前mRNA的外顯子45。
優(yōu)選的基于AAV的載體包含由聚合酶III-啟動(dòng)子(Pol III)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒。優(yōu)選的Pol III啟動(dòng)子例如是Ul、TO或U7 RNA啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明還提供了基于病毒的載體，其包含用于表達(dá)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)反義序列的Pol III-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，用于誘導(dǎo)人DMD前mRNA的外顯子45跳躍。藥物組合物如果需要，通過(guò)添加藥學(xué)上可接受的載體可以將本發(fā)明的分子或表達(dá)反義寡核苷酸的載體并入藥學(xué)上有活性的混合物或組合物中。因此，另一方面，本發(fā)明提供了組合物，優(yōu)選藥物組合物，所述藥物組合物包含含有本發(fā)明的反義寡核苷酸的分子和/或表達(dá)本發(fā)明反義序列的基于病毒的載體分子和藥物可接受的載體。優(yōu)選的藥物組合物包含本文所定義的分子和/或本文所定義的載體，以及藥物可接受的載體或賦形劑，任選地與能調(diào)節(jié)DMD前mRNA的外顯子7、44、46、51、53、59、67跳躍的分子和/或載體組合。優(yōu)選的賦形劑包括能形成遞送本文所定義的這類分子的復(fù)合物、介質(zhì)和/或脂質(zhì)體的賦形劑，優(yōu)選將寡核苷酸復(fù)合在或捕獲在囊泡或脂質(zhì)體中通過(guò)細(xì)胞膜。這些賦形劑中許多是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。合適的賦形劑包括聚乙醇胺和衍生物、或包括聚丙烯亞胺或聚乙醇胺共聚物(PEC)和衍生物在內(nèi)的相似的陽(yáng)離子聚合物、合成的兩性物、lipofectinTM、 DOTAP和/或能自我組裝成顆粒的病毒衣殼蛋白，所述顆?？梢詫⑦@類分子，優(yōu)選本文所定義的寡核苷酸遞送至細(xì)胞，優(yōu)選肌細(xì)胞。這種賦形劑已經(jīng)表現(xiàn)出有效地將(寡核苷酸，例如反義)核酸遞送至包括肌細(xì)胞在內(nèi)的大量培養(yǎng)細(xì)胞中。如實(shí)施例中所示，我們用聚乙醇胺 (PEI,ExGen500,MBIFermentas)獲得了非常好的結(jié)果。它們的高轉(zhuǎn)染潛能與對(duì)總細(xì)胞存活的去除的低至中度的毒性結(jié)合?？梢岳媒Y(jié)構(gòu)修飾的便利來(lái)對(duì)它們其他的(體內(nèi))核酸轉(zhuǎn)移特征或毒性進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和分析。Lipofectin代表脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)例。它由兩種脂質(zhì)組分組成，陽(yáng)離子脂質(zhì) N-[1-(2，3 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨基氯化物(DOTMA)(化學(xué)純(cp.)，DOTAP， 其是甲基硫酸鹽)和中性脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性組分介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)釋放。另一組遞送系統(tǒng)是聚合納米顆粒。聚陽(yáng)離子，例如公知的作為DNA轉(zhuǎn)染試劑的二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖，可以與氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)結(jié)合，以配制成能將本文所定義的分子或化合物，優(yōu)選寡核苷酸穿過(guò)細(xì)胞膜遞送入細(xì)胞中的陽(yáng)離子納米顆粒。除了這些常用的納米顆粒材料之外，陽(yáng)離子肽魚(yú)精蛋白為將本文所定義化合物， 優(yōu)選的寡核苷酸配制成膠體提供了可選的方式。該膠狀納米顆粒系統(tǒng)可通過(guò)簡(jiǎn)單的自我組裝過(guò)程形成所謂的微粒(proticles)，以包裝和介導(dǎo)本文所定義的化合物，優(yōu)選寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)釋放。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇和修改任何上述的或其他可商購(gòu)的可選擇的賦形劑和遞送系統(tǒng)，來(lái)包裝和遞送本文所定義的化合物，優(yōu)選寡核苷酸，用于在本發(fā)明中遞送治療人杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的所述化合物。此外，可以將本文所定義的化合物，優(yōu)選寡核苷酸與特別設(shè)計(jì)的促進(jìn)攝入細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和/或它的核的靶向配基共價(jià)或非共價(jià)連接。這類配基可以包括(i)識(shí)別細(xì)胞、組織或器官特異性元件促進(jìn)細(xì)胞攝取的化合物(包括但不限于肽(-樣)結(jié)構(gòu))和/或(ii)能促進(jìn)本文所定義的化合物的細(xì)胞攝取和/或細(xì)胞內(nèi)釋放的化合物，優(yōu)選從諸如內(nèi)涵體或溶酶體的囊泡釋放寡核苷酸。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文所定義的化合物，優(yōu)選寡核苷酸配制在藥物中，所述藥物提供有至少一種用于遞送的賦形劑和/或靶向配基和/或?qū)⑺龌衔镞f送至細(xì)胞和/或增強(qiáng)它的細(xì)胞內(nèi)遞送的遞送裝置。因此，本發(fā)明還包括藥學(xué)上可接受的組合物，其包含本文所定義的化合物，優(yōu)選寡核苷酸且還包含至少一種用于遞送的賦形劑和/ 或靶向配基和/或?qū)⑺龌衔镞f送至細(xì)胞和/或增強(qiáng)它的細(xì)胞內(nèi)遞送的遞送裝置。應(yīng)當(dāng)理解，不可以將分子或化合物或寡核苷酸配制在一種單一的組合物或制劑中。根據(jù)它們的特性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解對(duì)于每種化合物哪種類型的劑型是最合適的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的本文所定義的分子或寡核苷酸的濃度范圍為 0. InM-I □ M0更優(yōu)選地，所用的濃度范圍為0. 3-400ΠΜ，更優(yōu)選1-200ΠΜ。可以以范圍為 0. l-20mg/kg的劑量使用本文所定義的分子或寡核苷酸，優(yōu)選0. 5-10mg/kg。如果使用數(shù)種分子或寡核苷酸，這些濃度可以指寡核苷酸的總濃度或每種寡核苷酸的濃度。如上文給出的寡核苷酸濃度的范圍是體外或離體使用的優(yōu)選濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)所用的寡核苷酸、待處理的靶細(xì)胞、基因靶標(biāo)和它的表達(dá)水平、所用的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)染與孵育條件、所用的寡核苷酸濃度可以進(jìn)一步改變，并且需要進(jìn)一步的優(yōu)化。更優(yōu)選地，用于在發(fā)明中預(yù)防、治療DMD的化合物，優(yōu)選寡核苷酸和輔助化合物是通過(guò)合成產(chǎn)生的，并且以配制在藥學(xué)可接受的組合物或制劑中的形式直接給予細(xì)胞、組織、 器官和/或患者。藥物組合物至個(gè)體的遞送優(yōu)選通過(guò)一種或多種腸胃外注射實(shí)施，例如靜脈內(nèi)給藥和/或皮下給藥和/或肌內(nèi)給藥和/或膜內(nèi)給藥和/或心室內(nèi)給藥，優(yōu)選在人體的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)注射。麗另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的反義寡核苷酸或分子和/或表達(dá)本發(fā)明一段或多段反義序列的基于病毒的載體和/或藥物組合物在誘導(dǎo)和/或促進(jìn)DMD前mRNA剪接中的用途。優(yōu)選在體外人生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)所述剪接。更優(yōu)選的是在體內(nèi)人生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)剪接。因此，本發(fā)明還涉及本文所定義的分子和/或本文所定義的載體和/或本文所定義的藥物組合物在誘導(dǎo)和/或促進(jìn)DMD前mRNA剪接中的作用或在制備用于治療DMD患者的藥物中的用途。在本文及其權(quán)利要求書(shū)中，動(dòng)詞“包含”與它的同源詞用的是它的非限制性意義， 表示包括緊接著該詞的項(xiàng)目但并不排除未具體提到的項(xiàng)目。此外，動(dòng)詞“由...組成”可以用“基本上由...組成”取代，表示本文所定義的分子或基于病毒的載體或組合物可以包括具體指出的組分之外的其他組分，所述其他組分不會(huì)改變本發(fā)明的特有特征。此外，由不定冠詞“一個(gè)(a)”或“一個(gè)(an)”提及的元件不排除存在多于一個(gè)所述元件的可能性，除非文中明確指出有且只有一個(gè)所述元件。因此，不定冠詞“一個(gè)(a)”或“一個(gè)(an)”通常表示“至少一個(gè)”。可以將本文所示的每個(gè)實(shí)施方案組合起來(lái)，除非另有所指。通過(guò)引用將本說(shuō)明書(shū)所引用的所有專利和參考文獻(xiàn)整體并入本文。下面提供的實(shí)施例僅為說(shuō)明性目的，并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.在人對(duì)照肌管中，在兩個(gè)不同的濃度QOO和500nM)，測(cè)試了均與外顯子45(即SEQ ID NOJ)特定序列中的至少21核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的一系列 A0N(PS220-PS225 ；SEQ ID NO :3_8)。如通過(guò)序列分析(未示出)所確定的，所有6個(gè)AON 在誘導(dǎo)特定的外顯子45跳躍中都是有效的。然而，PS220(SEQ ID NO 3)可重復(fù)地誘導(dǎo)外顯子45跳躍的最高水平(參見(jiàn)圖幻.(NT 未處理細(xì)胞，M 大小標(biāo)記物)。圖2.在人對(duì)照肌管中，測(cè)試增加濃度時(shí)的25-mer PS220 (SEQ ID NO :3)。如通過(guò)Agilent LabChip分析所估計(jì)的，可重復(fù)地觀察到外顯子45跳躍的水平高達(dá)75% (在 400nM 時(shí))。圖3.在人對(duì)照肌管中，直接比較200nM和500nM的“短” 17-merA0N45_5 (SEQ ID NO 68)和與它重疊的“長(zhǎng)” 25-mer對(duì)應(yīng)物PS220。兩個(gè)濃度的PS220顯著地更有效相比 45-5獲得的3%，PS220獲得63% (NT 未處理細(xì)胞，M 大小標(biāo)記物)。
實(shí)施例實(shí)施例1和2材料和方法(部分地)基于通過(guò) m-fold 程序(Zuker, M. (2003)Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction(用于核酸折疊禾口雜交予頁(yè)測(cè)的 Mfold網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器).Nucleic Acids Res.，31，3406-3415)所預(yù)測(cè)的靶外顯子RNA的重疊開(kāi)放的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及(部分地)基于諸如 ESEfinder (Cartegni，L. et al. (2003)ESEfinder A web resource to identify exonic splicing enhancers (ESEfinder :鑒定夕卜顯子剪接增強(qiáng)子的網(wǎng)絡(luò)資源)Nucleic Acids Res, 31, 3568-71 ；Smith, P. J. et al. (2006) An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers (用于預(yù)測(cè)SF2/ASF特異的外顯子剪接增強(qiáng)子的增加的特異性評(píng)分矩陣).Hum. Mol. Genet.，15，2490-2508)的多種軟件程序所預(yù)測(cè)的重疊潛在的SR-蛋白結(jié)合位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)Α0Ν，所述ESEfinder預(yù)測(cè)4個(gè)最豐富的SR蛋白(SF2/ASF、SC35、SRp40 禾口 SRp55)的結(jié)合位點(diǎn)。AON 由 Prosensa Therapeutics B. V. (Leiden,Netherlands)合成， 且包含2’ -0-甲基RNA和全長(zhǎng)磷硫酰(PQ主鏈。組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和RT-PCR分析如前述獲得來(lái)自健康個(gè)體(“人對(duì)照”)的肌管培養(yǎng)物(Aartsma-Rus et al. Hum Mol Genet 2003 ； 12 (8) :907-14)。為了篩查 Α0Ν，用 0_500nM 的每種 AON 轉(zhuǎn)染肌管培養(yǎng)物。 按照生產(chǎn)商的操作說(shuō)明使用轉(zhuǎn)染試劑聚乙醇胺(PEI，ExGen500MBI i^ermentas)，每μ g AON 加2μ 1 ΡΕΙ。通過(guò)用外顯子45側(cè)翼外顯子的引物的巢式RT-PCR分析來(lái)確定外顯子跳躍效率。從瓊脂糖凝膠分離PCR片段用于序列確認(rèn)。為了定量，使用DNA IOOOLabChips Kit和 Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies, USA)來(lái)分析 PCR 產(chǎn)物。結(jié)果設(shè)計(jì)靶向外顯子45中SEQ ID NO 2中的序列的一系列Α0Ν，并通過(guò)轉(zhuǎn)染和隨后的 RT-PCR以及對(duì)分離RNA的序列分析在正常的肌管培養(yǎng)物中檢驗(yàn)。當(dāng)與PS221-PS225 (圖1) 比較時(shí)，PS220(SEQ ID NO 3)可重復(fù)地誘導(dǎo)外顯子45跳躍的最高水平。在400nM PS220已經(jīng)獲得的高水平的外顯子45跳躍高達(dá)75% (圖2)。在直接比較中，在200nM和500nM兩個(gè) AON濃度，PS220Q5-mer)在誘導(dǎo)外顯子45跳躍上比它較短的17_mer對(duì)應(yīng)物AON 45-5 (SEQ ID NO 68 ；之前被公布為 h45A0N5 (Aartsma-Rus et al.Am J Hum Genet 2004 ；74 :83-92)) 更有效，在500nM時(shí)分別為63%與3% (圖3)。該結(jié)果可能是由于這樣的事實(shí)實(shí)際上與 A0N45-5完全重疊的PS220的延長(zhǎng)的長(zhǎng)度增加了 AON-靶標(biāo)復(fù)合物的自由能，使得誘導(dǎo)外顯子45跳躍的效率也增加了。
權(quán)利要求
1.與DMD前mRNA的45外顯子中的至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的分子。
2.如權(quán)利要求1所述的分子，其中所述分子與所述外顯子中的至少25個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分子，其中所述分子包含21-30個(gè)堿基的反義寡核苷酸。
4.如權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的分子，其中所述分子包含25個(gè)堿基的反義寡核苷酸。
5.如權(quán)利要求1-4中的任一項(xiàng)所述的分子，其中所述分子與以下核苷酸序列中的至少 21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合5-CCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUU⑶CAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUAAUUCAGC AAUC(SEQ ID NO 2)。
6.如權(quán)利要求1-5中的任一項(xiàng)所述的分子，所述分子包含反義核苷酸序列或由該反義核苷酸序列組成，所述反義核苷酸序列選自表1列出的除了 SEQ ID NO :68之外的反義核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的分子，所述分子包含反義核苷酸序列或由該反義核苷酸序列組成，所述反義核苷酸序列選自 SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7 和 / 或 SEQ ID NO 8。
8.如權(quán)利要求7所述的分子，所述分子包含來(lái)自SEQID NO 3的反義核苷酸序列，或由所述反義核苷酸序列組成。
9.如權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的分子，所述分子包含2’-O-烷基磷硫酰反義寡核苷酸。
10.如權(quán)利要求9所述的分子，所述分子包含2’-0甲基磷硫酰核糖。
11.基于病毒的載體，其包含驅(qū)動(dòng)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所定義的分子表達(dá)的表達(dá)品.ο
12.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所定義的分子和/或權(quán)利要求11所述的載體，藥物可接受的載體，并且任選地與能誘導(dǎo)或促進(jìn)患者DMD前mRNA的外顯子7、44、 46、51、53、59、67(如表2所列出的)跳躍的分子組合。
13.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所定義的分子、權(quán)利要求11所述的載體或權(quán)利要求12所述的藥物組合物在誘導(dǎo)或促進(jìn)外顯子45跳躍，任選地與DMD前mRNA中的外顯子7、44、46、 51、53、59、67之一的跳躍組合中的用途，或用于制備治療DMD患者的藥物中的用途。
14.用于誘導(dǎo)或促進(jìn)患者中，優(yōu)選所述患者分離的細(xì)胞中DMD前mRNA的外顯子45跳躍的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞提供與所述外顯子中的至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的分子。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中向所述患者提供功能性抗肌萎縮蛋白和/或其中所述患者中異?？辜∥s蛋白的產(chǎn)生減少，其中通過(guò)與所述方法開(kāi)始時(shí)所述患者的抗肌萎縮蛋白的水平進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)所述功能性抗肌萎縮蛋白的水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)或促進(jìn)杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中，優(yōu)選分離的(肌)細(xì)胞中DMD前mRNA的外顯子45跳躍，所述方法包括向所述細(xì)胞提供與所述外顯子中的至少21個(gè)核苷酸的連續(xù)區(qū)段結(jié)合的反義分子。本發(fā)明還涉及用在所述方法中的這類反義分子。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102264903SQ200980152464
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者勒德烏斯·約翰尼斯·普拉滕伯格, 安妮姆耶克·阿斯馬-魯斯, 朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬(wàn)多伊特科姆, 蓋瑞特-揚(yáng)·保德維金·萬(wàn)歐門, 約瑟夫斯·約翰尼斯·德吉姆彼 申請(qǐng)人:普繞申薩公司, 普羅森那技術(shù)公司, 普羅森那控股公司, 萊頓教學(xué)醫(yī)院