專(zhuān)利名稱(chēng)：Fmu-epcam-4f6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，特別涉及一種抗人EPCAM 的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。
背景技術(shù)：
上皮細(xì)胞黏附分子(EPCAM)最初是作為結(jié)腸癌的優(yōu)勢(shì)表位被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)認(rèn)為其作 用是細(xì)胞黏附和治療用抗體的可靠結(jié)合位點(diǎn)。目前研究認(rèn)為，EPCAM是糖基化的I型跨膜 糖蛋白，分子量為30到40kD，其結(jié)構(gòu)包括有一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣和一個(gè)甲狀腺球蛋白樣的 胞膜外區(qū)，一段跨膜區(qū)和一段26個(gè)氨基酸的胞漿區(qū)。在正常細(xì)胞中EPCAM主要位于上皮細(xì) 胞間隙的緊密連接處。由EPCAM表達(dá)的強(qiáng)度和頻率顯示，其基本上高表達(dá)于所有人類(lèi)腺癌、 部分鱗狀細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌。2007年以前對(duì)EPCAM功能方面的研究發(fā)現(xiàn)EPCAM在細(xì)胞增殖、遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中 具有重要作用。例如EPCAM在人和嚙鼠動(dòng)物細(xì)胞的增強(qiáng)表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞錨定和血清生長(zhǎng) 因子非依賴(lài)的增殖，并且增加了如c-myc和cyclins在內(nèi)的各種靶基因的表達(dá)；在乳腺癌細(xì) 胞系，EPCAM信號(hào)經(jīng)RNA干涉，可造成細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低。最近的研究證實(shí)=EPCAM可以作為一些實(shí)體腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物之一，也可 以作為正常干細(xì)胞表面標(biāo)志物的組成部分。同時(shí)，研究結(jié)果還很好地解釋了 EPCAM在腫瘤 細(xì)胞高表達(dá)的原因，并且發(fā)現(xiàn)其與一些腫瘤患者預(yù)后較差和生存率較低有關(guān)；并進(jìn)一步解 釋了 EPCAM與腫瘤的關(guān)系。此外，小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EPCAM在腫瘤干細(xì)胞、正常干 細(xì)胞上的高表達(dá)和其自身正反饋的上調(diào)，對(duì)確保維持這些正常干細(xì)胞及以惡性干細(xì)胞的增 殖非常重要?？笶PCAM抗體用于腫瘤治療的研究一直是抗體治療研究的熱點(diǎn)。早在1979年開(kāi) 發(fā)的鼠源性抗EPCAM抗體17-1A，于1982年就用于對(duì)腫瘤的臨床治療。但是鼠源性抗體藥 物在人體使用時(shí)，由于其具有免疫原性，會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，從而造成對(duì)抗體藥物的清 除或免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。對(duì)鼠源性抗體基因改造可以部分解決其免疫原性問(wèn)題， 如構(gòu)建嵌合抗體或人源化抗體等?？贵w單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過(guò)鏈間二 硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。H鏈和L鏈包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可變區(qū) (V區(qū))由高變區(qū)/互補(bǔ)決定區(qū)(HVR/CDR)和骨架區(qū)(FR)組成；靠近C端為恒定區(qū)(C區(qū))。 重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)形成的蛋白質(zhì)折疊是抗原結(jié)合部位，其中的CDR/HVR 是抗體與抗原決定基互補(bǔ)結(jié)合的部位，C區(qū)引發(fā)抗原抗體識(shí)別后的反應(yīng)。抗體根據(jù)FR/C區(qū) 不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內(nèi)使用時(shí)具有免疫原性，易引起人體的免疫反 應(yīng)，這些免疫反應(yīng)可引起對(duì)鼠源性抗體的清除以及免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。為了克服 鼠源性抗體的缺陷，需要構(gòu)建高親和力的特異性嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。在改造過(guò)程中，最為重要的是首先必須獲得具有良好特異性和親和力鼠源性親本 抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，然后將這兩條基因進(jìn)行改造，構(gòu)建重組抗體基因。針對(duì)這些問(wèn)題，抗EPCAM治療性抗體的研發(fā)不斷取得進(jìn)展，抗EPCAM的大鼠和小鼠雙特異性抗體Catumaxomab，單鏈抗體Proxinium，人源化抗體ING-I，人源化融合抗體EMD和完全人源 化抗體Adecatumumab (MT201)等先后進(jìn)入臨床治療腫瘤的研究。目前在臨床試驗(yàn)中，通過(guò) 改造的抗體Adecatumumab治療乳腺癌取得了良好的效果。因此，篩選出高親和力鼠源性抗 人EPCAM單克隆抗體，從中克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因，對(duì)進(jìn)一步改善以EPCAM為靶點(diǎn)的藥 物制備和對(duì)腫瘤的治療具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈 和重鏈可變區(qū)，包括其氨基酸和核苷酸序列，為構(gòu)建高親和力的抗EPCAM嵌合或人源化基 因工程抗體提供支持。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決 定區(qū)(CDR)序列分別為CDRl :Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn-Trp ；CDR2 Leu-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；所述重鏈可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)序列分別為CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr ；CDR3 :Lys-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。所述的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1，重鏈可變區(qū)的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的編碼單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可 變區(qū)的基因序列如SEQ ID N0. 4所示。所述的單克隆抗體應(yīng)用于以人EPCAM為靶點(diǎn)的基因工程抗體或診斷試劑的制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明提供的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體是一種抗人EPCAM的高親和力單克 隆抗體，經(jīng)過(guò)間接ELISA檢測(cè)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)該單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合人 EPCAM ；2、克隆該單克隆抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因和氨基酸序列，序列分析證實(shí)了該抗 體序列的惟一性。3、分析獲得輕鏈、重鏈可變區(qū)的⑶R區(qū)，在此基礎(chǔ)上為構(gòu)建高親和力的抗人EPCAM 嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。


圖1是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體與C0L0205和SKBr_3細(xì)胞系表面 表達(dá)的EPCAM結(jié)合的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖Ia為與C0L0205細(xì)胞系結(jié)合檢測(cè)結(jié)果圖， 圖Ib為與SKBr-3細(xì)胞系結(jié)合檢測(cè)結(jié)果圖；其中，F(xiàn)ITC 異硫氰酸熒光素，橫軸為熒光強(qiáng)度，縱軸為相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，Ml表示陽(yáng)性細(xì)胞范圍；圖2是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4F6單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測(cè) 結(jié)果圖；圖3是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4F6單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測(cè) 結(jié)果圖；圖4是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4F6單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢 測(cè)結(jié)果圖；圖5是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4F6單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢 測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式申請(qǐng)人:用重組人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制備了一組小鼠抗人EPCAM單克隆抗 體，篩選出能穩(wěn)定分泌高親和力抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制 備腹水獲得高親和力抗人EPCAM單克隆抗體。確 認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性及 其CDR序列；為抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明具體按以下步驟實(shí)施1小鼠抗人EPCAM高親和力抗體的制備1. 1單克隆抗體的制備、純化參照GENBANK NM_002354序列設(shè)計(jì)引物，并擴(kuò)增編碼人EPCAM胞膜外區(qū)蛋白的基 因；然后將此基因克隆入PGEX-4T-3載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；再通過(guò) IPTG誘導(dǎo)，凍融加超聲裂解法獲得重組人EPCAM胞膜外區(qū)的可溶蛋白。按單克隆抗體制備方法(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一版，P9-P17)，用重組人 EPCAM胞膜外區(qū)蛋白免疫BALB/c小鼠(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；初次免疫，使用 福氏完全佐劑，后續(xù)免疫使用福氏不完全佐劑，每次間隔3周，均為皮下多點(diǎn)注射，共免疫4 次。末次免疫7-10天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果。間隔2-3周后，經(jīng)靜脈注射抗原再 加強(qiáng)免疫，3天后處死動(dòng)物取脾進(jìn)行細(xì)胞融合。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0計(jì)數(shù)，同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液。將骨髓瘤 細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 10比例混合進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞(正 常Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)的96孔板，37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)。待克隆出現(xiàn)后，間接 ELISA檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆。對(duì)含有陽(yáng)性克隆孔的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，直至獲 得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞系(體外連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)6個(gè)月)，并對(duì)其分泌的抗體進(jìn)行 常規(guī)核型鑒定和Ig亞類(lèi)測(cè)定，結(jié)果為IgG2a亞類(lèi)。在獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株后，按小鼠腹水制備方法制備包含單克 隆抗體的腹水(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一版，P9-P17)。腹水經(jīng)40%飽和硫酸銨沉 淀后，采用QFF陰離子交換層析法純化。用SDS-PAGE鑒定純化抗體的純度，純化的單克隆 抗體FMU-EPCAM-4F6純度達(dá)到95%。1. 2抗人EPCAM單克隆抗體效價(jià)測(cè)定用間接ELISA方法測(cè)定純化前腹水以及純化后單克隆抗體(mAb)的相對(duì)親和力。其中包被抗原為重組人EPCAM胞膜外區(qū)的可溶蛋白，待測(cè)樣品為系列梯度稀釋(IXlO1 IO9的梯度稀釋)的腹水以及純化后mAb，檢測(cè)抗體為羊抗鼠-HRP酶標(biāo)記抗體，底物使用 ABTS0所篩選出的高親和力FMU-EPCAM-4F6mAb，腹水效價(jià)為1 X 10_6，純化后效價(jià)為lng/ml， 而一般采用間接ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)達(dá)IX 10_5以上的抗體即可使用。1. 3流式細(xì)胞術(shù)熒光染色檢測(cè)抗人EPCAM單克隆抗體FMU-EPCAM-4F6與細(xì)胞表面 EPCAM結(jié)合的活性以SED mAb作為陰性抗體對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FMU-EPCAM_4F6mAb與C0L0205禾口 SKBr-3細(xì)胞系表面表達(dá)的EPCAM的結(jié)合；C0L0205和SKBr_3細(xì)胞系用10% FCS-RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整 細(xì)胞濃度為5 X IO6 1 X 107/ml ；取50 μ 1細(xì)胞懸液并加入特異性FMU-EPCAM_4F6mAb腹水 1 μ 1，再加1 μ 1滅活正常兔血清，4°C孵育30min ；同樣方法制備陰性對(duì)照組。然后用洗滌液(5% FCS-PBS-4% NaN3)洗滌孵育后的細(xì)胞2次，每次加洗滌液2ml， IOOOrpmX5min離心后棄上清；加入100 μ 1工作濃度的羊抗鼠熒光標(biāo)記抗體，充分振搖， 4°C 孵育 30min ；再用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml，1000r/minX 5min離心后棄上清；加0. 5ml 的流式固定液(2%葡萄糖，甲醛，0. 02% NaN3的DPBS溶液)，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析 FMU-EPCAM-4F6mAb與細(xì)胞表面EPCAM的結(jié)合情況；結(jié)果如圖1所示，在C0L0205細(xì)胞系與陰性對(duì)照相比，結(jié)合了 FMU-EPCAM_4F6mAb 而落入Ml陽(yáng)性細(xì)胞范圍的C0L0205細(xì)胞達(dá)8% ；在SKBr-3細(xì)胞系與陰性對(duì)照相比，結(jié)合了 FMU-EPCAM_4F6mAb而落入Ml陽(yáng)性細(xì) 胞范圍的SKBr-3細(xì)胞達(dá)6% ；以上流式細(xì)胞術(shù)熒光染色檢測(cè)表明FMU-EPCAM-4F6mAb可以識(shí)別并結(jié)合C0L0205 和SKBr-3細(xì)胞表面表達(dá)的天然EPCAM。通過(guò)上述2種FMU-EPCAM_4F6mAb結(jié)合實(shí)驗(yàn)，在不同水平的鑒定結(jié)果表明， FMU-EPCAM-4F6mAb既可以識(shí)別重組表達(dá)的EPCAM (間接ELISA檢測(cè))，又可以識(shí)別細(xì)胞表面 天然表達(dá)的EPCAM，說(shuō)明FMU-EPCAM-4F6mAb與相應(yīng)抗原EPCAM結(jié)合具有良好的特異性和親 和力。2抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆2. 1FMU-EPCAM-4F6雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)按常規(guī)方法復(fù)蘇(細(xì)胞培養(yǎng)，第一版，P88)FMU-EPCAM-4F6雜交瘤細(xì)胞，用含10% 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37°C,5% CO2孵箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2. 2總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成采用TRIZOL Reagent (購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)提取總RNA，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，在得到總RNA后按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 合成cDNA第一鏈。2. 3PCR 法擴(kuò)增 FMU-EPCAM_4F6mAb 的 VL 禾Π VH 基因PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自TakaRa公司，利用VL F (上游引物)和VL B (下游引物)以及VH F和 VH B兩對(duì)引物，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增FMU-EPCAM_4F6mAb的 VL 和 FMU-EPCAM-4F6mAb 的 VH 基因；反應(yīng)體積50 μ 1，反應(yīng)條件為94°C 5min ；95°C 30s，58°Clmin,72°C lmin，循環(huán) 35 次；72°C7min;引物序列為VL F :gttagatctc cagcttggtc cc22bp ；VL B:gacattcagc tgacccagtc tcca24bp ；VH F:tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34bp ；VH B:aggtsmarct gcagsagtcw gg22bp ；(IUB 標(biāo)準(zhǔn)兼并堿基代碼s :c/g ； ；m :a/c ； ；r :a/g ； ；w :a/t)2. 4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和篩選PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用小量膠回收試劑盒(購(gòu)自上海華舜生物工程 有限會(huì)司)回收PCR擴(kuò)增片段，用DNA連接試劑盒(購(gòu)自TakaRa公司)將該片段按說(shuō)明書(shū)， 利用加A尾插入pMD-TIS載體(購(gòu)自TakaRa公司)中，連接物轉(zhuǎn)化E. coli (購(gòu)自中國(guó)普通 微生物菌種保藏中心，CGMCC，北京)，在Amp抗性LB瓊脂培養(yǎng)平皿中37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑取LB瓊脂培養(yǎng)平皿中克隆，在Amp抗性LB培養(yǎng)基中37°C搖菌過(guò)夜，以1 μ 1菌 液為模板，通過(guò)上述針對(duì)輕鏈、重鏈可變區(qū)設(shè)計(jì)的引物，用PCR法篩選重組陽(yáng)性Ε. coli克 隆；將所獲得重組陽(yáng)性Ε. coli克隆搖菌，菌體送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 完成基因序列測(cè)定，輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3FMU-EPCAM-4F6mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列及同源性分析3. 1確定測(cè)序無(wú)誤后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行核苷酸序列同源 性分析(Blastn)。FMU-EPCAM-4F6mAb輕鏈可變區(qū)基因與編號(hào)為GeneID =243420的小鼠Ig輕鏈可變 區(qū)基因同源性最高，達(dá)296/299(98% )，如圖2所示；FMU-EPCAM-4F6mAb重鏈可變區(qū)基因與編號(hào)為GeneID =668469的小鼠Ig重鏈可變 區(qū)基因同源性最高，為279/295(94% )，如圖3所示。同源性分析表明，編碼FMU-EPCAM_4F6mAb的輕、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，盡管 與其它基因序列有一定同源性，但未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明完全相同的基因序列，表明本發(fā)明在基 因序列上具有惟一性。3. 2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸序列分析單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析結(jié)果表明，F(xiàn)MU-EPCAM-4F6mAb輕鏈氨基酸序列與編號(hào)為ABR32168. IGI 149799217的小鼠IgK鏈同源性最高，達(dá)108/111 (97% )，如圖4所示；FMU-EPCAM-4F6mAb重鏈氨基酸序列與編號(hào)為S55541 GI 1363159的小鼠Ig重鏈 蛋白的同源性最高，為104/117(88% )，如圖5所示。同源性分析表明，F(xiàn)MU-EPCAM_4F6mAb輕、重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，盡管與其它蛋白氨基酸序列有一定同源性，但未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明完全相同的氨基酸序列，表明本發(fā)明在氨基酸序列上也具有惟一性。3. 3利用IMGT/V-QUEST分析可變區(qū)結(jié)構(gòu)，確定⑶R區(qū)。將測(cè)序所得FMU-EPCAM-4F6mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，在IMGT/V-QUEST網(wǎng)站 (http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest)進(jìn)行分析，得出其 CDR 區(qū)。輕鏈可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)序列，如SEQ ID NO. 1劃線部分所示，具體 為CDRl:Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn-Trp ；CDR2 Leu-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；所述重鏈可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)序列為CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr ；CDR3 :Lys-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。4.基因工程抗體設(shè)計(jì)基于抗人EPCAM單克隆抗體FMU-EPCAM-4F6的表達(dá)、純化以及序列分析，設(shè)計(jì)構(gòu)建 以下生物制品1)單鏈抗體的構(gòu)建可將本發(fā)明的FMU-EPCAM-4F6mAb輕、重鏈可變區(qū)基因通過(guò) linker連接，插入原核或真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌或轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，用于制備可對(duì)乳腺 癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等腫瘤有治療作用的單鏈抗體。2)人-鼠抗EPCAM嵌合抗體的構(gòu)建可將本發(fā)明的FMU-EPCAM_4F6mAb輕、重鏈可 變區(qū)基因插入通用型嵌合抗體表達(dá)載體中，獲得含嵌合基因的載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，用于制 備可望對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等腫瘤有治療作用的嵌合抗體。3)人源化抗體的構(gòu)建可將本發(fā)明的FMU-EPCAM_4F6mAb輕、重鏈可變區(qū)基因 的CDR區(qū)移植到人源抗體可變區(qū)的骨架區(qū)(FR)中，形成互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植抗體 (CDR-grafted antibody)，也禾爾重構(gòu)(reshapingantibody) ^iKMVcijiW (humanized antibody)。利用CDR移植技術(shù)改造抗體，可以獲得既保持鼠源性親本mAb特異性，又更加接近人 抗體的新型抗體，用于制備可對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等腫瘤有治療作用的人源化抗體。4)可根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對(duì)人EPCAM功能表位 的其它生物制品。5)可利用本發(fā)明的抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4F6特異性單抗作為區(qū)分上皮和 非上皮來(lái)源組織的工具，以確診一些易于混淆的疾病。通過(guò)采用本發(fā)明的抗人EPCAM的 FMU-EPCAM-4F6特異性單抗染色，觀察組織中EPCAM的表達(dá)強(qiáng)度，可能作為一些上皮來(lái)源腫 瘤預(yù)后及分化程度的判斷標(biāo)志。6)可應(yīng)用本發(fā)明的高親和力FMU-EPCAM-4F6mAb制備測(cè)定體液中EPCAM胞膜外區(qū) 蛋白的ELISA試劑盒，可望在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的臨床診斷中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。氨基酸及核苷酸序列表<110>中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
<120>FMU-EPCAM"4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)<160>4<210>1<211>111<212>PRT<213>人工合成
<400>1Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie Gly Gln Pro Ala Ser15101520lie Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp25303540Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp45505560Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie65707580Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro859095100Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie105110<210>2<211>113<212>PRT<213>人工合成<400>2Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Hir Val Leu Ala Arg Rro Gly Ala Ser Val Asn Met15101520Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg25303540Rro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Rro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr45505560Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Hir Ala Val Hir Ser Ala Ser Hir Val Tyr65707580Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Gly Gly859095100Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Hir Val Hir Val Ser Ser105110<210>3<211>333<212>DNA
〈213〉人工合成<400>3gatgttgtgctgacccagtc tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60atctcttgcaagtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120ttgttacagaggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180tctggagtccctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagattttac actgaaaatc 240agcagagtggaggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300tggacgttcggtggagggac caagctggag ate333<210>4<211>339<212>DNA〈213〉人工合成<400>4gaggtccagctgcaggagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcgtc cgtgaacatg 60tcctgcaaggcttctggcta cagctttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120cctggacagggtctagaatg gattggtgct atttatcctg gaaatagtga tactaggtac 180aaccagaagttcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgtctac 240atggagttcagcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtaa aagaggagga 300aactactggggccaagggtc cacggtcacc gtctcctca339
權(quán)利要求
FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列分別為CDR1Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn-Trp；CDR2Leu-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser；CDR3Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；所述重鏈可變區(qū)的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)分別序列為CDR1Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp；CDR2Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr；CDR3Lys-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。
2.如權(quán)利要求1所述的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，其特征在于， 所述的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，其特征在于， 編碼單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因序列 如 SEQ ID NO. 4 所示。
4.權(quán)利要求1或3所述的FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)應(yīng)用于以人 EPCAM為靶點(diǎn)的基因工程抗體或診斷試劑的制備。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了FMU-EPCAM-4F6單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，F(xiàn)MU-EPCAM-4F6單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明通過(guò)重組人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制備了一組小鼠抗人EPCAM單克隆抗體，篩選出能穩(wěn)定分泌高親和力抗人EPCAM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備腹水獲得高親和力的抗人EPCAM單克隆抗體。確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性及其CDR序列；為抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。
文檔編號(hào)C12N15/13GK101817881SQ20101001366
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者孫元杰, 宋朝君, 張葵, 朱參勝, 楊琨, 謝鑫, 金伯泉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)