專利名稱：重鏈和結(jié)構(gòu)域抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物感染的VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。本發(fā)明也涉及含這些VHH或 VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的遞送系統(tǒng)，及含編碼這些VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的表達(dá)載體的宿主。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含將抗體遞送到胃腸道(GIT) 的遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑，其中抗體在腸道中是有活性的。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(也稱為抗體)是糖蛋白，可特異識(shí)別外源分子。這些被識(shí)別的外源分子稱為抗原。當(dāng)抗原侵入人體或動(dòng)物時(shí)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，包括由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。通過(guò)免疫應(yīng)答，可使微生物、較大的寄生蟲(chóng)、病毒和細(xì)菌毒素成為無(wú)害的?？贵w特異識(shí)別并以高親和力結(jié)合與各種類型抗原的特性使其成為醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究中的有用分子。在脊椎動(dòng)物中有5種免疫球蛋白類型，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其在免疫系統(tǒng)中的功能各不相同。Igk是血液中最豐富的免疫球蛋白。其基本結(jié)構(gòu)是含有2個(gè)相同的重(H)鏈多肽和兩個(gè)相同的輕(L)鏈多肽。H和L鏈通過(guò)二硫橋和非共價(jià)鍵結(jié)合在一起。 鏈本身可分為可變區(qū)和恒定區(qū)。氨基酸序列高度變化的重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)位于抗體分子的N末端部分。VH和VL—起形成特異的抗原識(shí)別位點(diǎn)。其余的C末端區(qū)的氨基酸序列變化較小，稱為CHI、CH2、CH3和CL?？贵w分子的非抗原結(jié)合部分稱為恒定區(qū)Fe，具有幾個(gè)免疫功能，例如與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合及補(bǔ)體固定功能?？贵w的特異抗原結(jié)合位點(diǎn)包括重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)。 每個(gè)結(jié)構(gòu)域含4個(gè)框架區(qū)(FR)和3個(gè)稱為CDRs (互補(bǔ)決定區(qū))的區(qū)域或高變區(qū)。CDRs序列高度變化，決定抗體的特異性。VL和VH區(qū)一起形成與特異抗原結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)?？赏ㄟ^(guò)抗體的蛋白水解作用，例如通過(guò)木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化或其它酶學(xué)方法來(lái)產(chǎn)生幾種具有功能的抗原結(jié)合抗體片段。這種技術(shù)可用于產(chǎn)生Fab、Fv或單結(jié)構(gòu)域片段。Fab片段是抗體分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^(guò)木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體的來(lái)制備Fab片段。Fv片段是含整個(gè)IgG抗體的完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小片段( 30kDa)。Fv 片段由可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)結(jié)構(gòu)域組成。這個(gè)稱為Fv片段(即可變片段)的異源二聚體仍可與抗原結(jié)合。重鏈抗體構(gòu)成了由camelids——例如駱駝和美洲駝所產(chǎn)生的IgG抗體的約四分之一部分(Hamers-Casternian C，et al. (1993)) 這些抗體由兩個(gè)重鏈形成，但不含輕鏈。因此，可變抗原結(jié)合部分是指VHH結(jié)構(gòu)域，是最小的天然發(fā)生的完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)， 長(zhǎng)度約120個(gè)氨基酸((DeSmyter，A. , et al. (2001)) 0可通過(guò)免疫作用產(chǎn)生針對(duì)各種抗原的具有高特異性和親和性的重鏈抗體(van der Linden, R. H. , et al. (1999))，VHH部分可在酵母中克隆和表達(dá)(Frenken, L. G. J.，et al. (2000))。其表達(dá)水平、可溶性和穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的F(ab)或Fv片段高(((ihahroudi，Μ. A. et al. (1997))。鯊魚也在其抗體中也有單 VH 樣結(jié)構(gòu)域，稱為 VNAR (Nuttall et al. (2003)) ； (Dooley et al. (2003)) ； (Nuttall et al. (2004)) 。Holt等Q003)綜述了稱為“結(jié)構(gòu)域抗體”或dAbs的抗原結(jié)合片段，它僅含抗體的 VH或VL結(jié)構(gòu)域，因此比例如Fab和scFv更小。DAbs是已知最小的抗體的抗原結(jié)合片段， 從IlkDa到15kDa。它們?cè)谖⑸锛?xì)胞培養(yǎng)物中高度表達(dá)。每個(gè)dAb含抗體的6個(gè)天然存在的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)中的3個(gè)。由于單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，生成用于傳統(tǒng)免疫治療的抗體成為可能。因此抗體可應(yīng)用于包括研究、醫(yī)學(xué)及最近的消費(fèi)者應(yīng)用在內(nèi)的多種領(lǐng)域。遺憾的是，傳統(tǒng)的免疫治療存在很多問(wèn)題。這種應(yīng)用依賴于抗體的大規(guī)模生產(chǎn)并涉及作為從例如抗體表達(dá)系統(tǒng)收獲的蛋白的抗體或抗體片段本身的使用。因此，包括在給藥前需要進(jìn)行抗體純化等的相關(guān)生產(chǎn)花費(fèi)都是非常昂貴的，從而阻礙了其作為免疫制劑的廣泛應(yīng)用。另外，為了治療大部分群體，需要大量傳統(tǒng)的免疫治療產(chǎn)物。例如，如果治療基于初乳和/或免疫的雞蛋，則很難得到大規(guī)模所需量的免疫治療產(chǎn)物。另夕卜，在最近的一篇文獻(xiàn)中〃 In situ delivery of passive immunity by lactobacilli producing single-chain antibodies " Nature Biotechnol. (2002)20, 702-706，Kruger等報(bào)道了通過(guò)革蘭氏陽(yáng)性食品級(jí)細(xì)菌玉米乳桿菌(LactcAacillus zeae) 產(chǎn)生針對(duì)變異鏈球菌的scFv抗體。該治療包括在口腔黏膜部位通過(guò)被動(dòng)免疫而進(jìn)行原位遞送，其中只有遞送的單鏈抗體片段在大鼠中產(chǎn)生針對(duì)齲齒的保護(hù)作用。從1960年代，已報(bào)道乳桿菌具有抗腹瀉特征(Beck，C，et al. Beneficial effects of administration of Lactobacillus acidophilus in diarrhoeal and other intestinal disorders. Am. J. Gastroenterol (1961) 35, 522-30)。最近有限的可控試驗(yàn)已表明乳桿菌的特定種在急性病毒性腸胃炎中具有治療和預(yù)防特性(Mastretta，Ε.，et al. Effect of Lactobacillus CG and breast-feeding in the prevention of rotavirus nosocomial infection. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. (2002)35,527-531)。已表明植物乳桿菌(Lactobacillus casei)和干酪乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的選擇菌株在黏膜和全身免疫應(yīng)答中具有強(qiáng)烈的佐劑作用。乳桿菌是一種已知用于產(chǎn)生食品的細(xì)菌。例如，酸奶酪通常是通過(guò)用乳桿菌發(fā)酵牛奶而制備的。然后在合適的時(shí)間將仍含活乳桿菌的發(fā)酵的酸性產(chǎn)物冷卻消耗。乳桿菌在食品中的另一個(gè)用途是生成肉類食品例如香腸。在包裝前將乳桿菌加到肉中，然后通過(guò)一段時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程而成熟。乳桿菌在食品生產(chǎn)中的另一個(gè)用途是腌制諸如卷心菜(泡菜)、胡蘿卜、橄欖或甜菜這樣的蔬菜?？赏ㄟ^(guò)加入適量的乳桿菌起始培養(yǎng)物來(lái)控制天然的發(fā)酵過(guò)程。乳桿菌在食品中的用途通常與幾種健康效果相關(guān)，參見(jiàn)例如A. C. Ouwehand等在 Int. Dairy Journal 8 (1998) 749-758中的描述。特別是食品的用途與幾種健康效果相關(guān)， 例如與諸如IBS(腸易激綜合征)、降低乳糖消化不良、腹瀉的臨床癥狀、免疫刺激、抗腫瘤活性和增強(qiáng)礦物質(zhì)吸收這樣的腸道健康相關(guān)。WO 99/23221描述了使抗菌素失活的多價(jià)抗原結(jié)合蛋白。宿主是用于產(chǎn)生此后收獲并使用的抗體結(jié)合片段的乳酸菌。WO 99Λ3211描述了加入收獲的抗體片段而產(chǎn)生抗腹
瀉作用。WO 00/65057是通過(guò)單價(jià)抗原結(jié)合蛋白抑制病毒感染?？乖Y(jié)合蛋白可以是來(lái)源于諸如WO 94/04678中所述的來(lái)源于camelids的這樣的天然無(wú)輕鏈的免疫球蛋白的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。WO 00/65057描述了用編碼單價(jià)抗原結(jié)合蛋白的基因來(lái)轉(zhuǎn)化宿主。合適的宿主可包括乳酸菌。該發(fā)明涉及發(fā)酵過(guò)程領(lǐng)域及阻礙發(fā)酵的噬菌體感染問(wèn)題。具體地，美洲駝VHH片段本身可通過(guò)中和乳酸乳球菌(Lactoccoccus lactis)噬菌體P2來(lái)用于解決噬菌體感染問(wèn)題。WO 00/65057和WO 99/23221涉及從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)所收獲的抗體片段的用途。US 6，605，286涉及用革蘭氏陽(yáng)性菌向機(jī)體遞送諸如細(xì)胞因子這樣的有生物活性的多肽的用途。US 6，190，662和EP 0 848 756 Bl涉及獲得所需蛋白或多肽的表面表達(dá)的方法。Monedero等2004涉及關(guān)于通過(guò)干酪乳桿菌表達(dá)識(shí)別輪狀病毒VP8和外部衣殼片段， 從而體外阻斷輪狀病毒感染的單鏈抗體(scFv)的體外研究。但這些文獻(xiàn)均沒(méi)有揭示VHH 或VNAR型治療免疫球蛋白或其片段或結(jié)構(gòu)域抗體的用途。這些已知系統(tǒng)的一個(gè)主要不利之處是在治療人類疾病時(shí)使用抗體或抗體片段本身(即收獲的蛋白)，這可能造成抗體在提供所需的健康用途前，甚至在到達(dá)所需部位前被降解或消化。另外，需要保證抗體或抗體片段在機(jī)體的特定部位具有活性。這依賴于所治療的特定感染類型。導(dǎo)致腸道疾病的微生物是在腸道產(chǎn)生疾病的微生物。這種微生物的例子包括大腸桿菌和沙門氏菌。導(dǎo)致腸道疾病的病原菌的另一個(gè)例子是輪狀病毒。輪狀病毒是世界上嬰兒腹瀉唯一的最常見(jiàn)原因，多數(shù)兒童在最初5年被感染。在發(fā)展中國(guó)家，輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉每年導(dǎo)致600，000到870，000例死亡，在發(fā)達(dá)國(guó)家，輪狀病毒疾病造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。在 1999年七月腸套疊相關(guān)的恒河猴輪狀病毒四價(jià)疫苗取消之后，已通過(guò)幾種策略來(lái)發(fā)展安全的疫苗。目前有5種口服活性衰減的輪狀病毒疫苗正在進(jìn)行應(yīng)用于兒童的臨床試驗(yàn)，例如 Barnes, G. L. et al. (1997)。但特別是在發(fā)展中國(guó)家的年已通過(guò)被動(dòng)免疫治療進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，例如 Off it，P. A. et al. (1985)。分泌性免疫球蛋白是指抵抗包括輪狀病毒在內(nèi)的多種黏膜病原體感染的第一道防線。已表明臨床疾病的保護(hù)作用主要依賴于產(chǎn)生抗外部殼蛋白VP4或VP7的中和抗體 (Ruggeri, F. M. at al. (1998)) ； (Giammarioli, A-M. et al. (1996))。但最近已表明非中和性VP6特異IGA抗體可抑制輪狀病毒復(fù)制(Feng, N. et al. (2002)) ；Schwartz-Corni 1, I.et al. (2002)) 0已表明超免疫牛初乳和雞蛋黃來(lái)源的抗體可有效治療輪狀病毒腹瀉 (Davidson et al. (1989)) ； (Sarker, S. A.，et al. (2001)) 已證明用來(lái)源于免疫的牛初乳免疫球蛋白可成功治療兒童的輪狀病毒腹瀉(Sarker S. A. et al. (1998))。但生產(chǎn)這些免疫球蛋白制劑的高額費(fèi)用限制了其作為免疫治療法的廣泛的大規(guī)模應(yīng)用。至今仍沒(méi)有獲得廣泛處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物和病毒的特異治療方法。例如， 當(dāng)前處置輪狀病毒誘導(dǎo)的腹瀉主要包括預(yù)防和口服再水合。因此，需要通過(guò)治療和/或預(yù)防來(lái)提供處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物的替代方法。本發(fā)明涉及治療和/預(yù)防導(dǎo)致腸道疾病的微生物的新方法。
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8Immunol. 116，193-205(1999).Zimmerman, C. Μ. , Bresee, J. S. , Parashar, U. D. , Riggs, Τ. L. , Holman, R. C. & Glass, R. I. Cost of diarrhoea-associated hospitalizations and outpatient visits in an insured, population of young children in the United States. Pediatr. Infect. Dis. J. 20，14-19(2001).發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種將抗體遞送到GIT中的遞送系統(tǒng)，其包含VHH 或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，其中免疫球蛋白或其片段在腸道中是有活性的。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種含編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種微生物，優(yōu)選地是用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的乳桿菌。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種用編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因轉(zhuǎn)化的微生物向腸道中遞送抗體，從而治療由導(dǎo)致腸道疾病的微生物所造成的感染的方法，包括步驟i)用含 VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物，及ii)對(duì)需治療的人和動(dòng)物的腸道給藥轉(zhuǎn)化的微生物，從而使VHH 或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段在腸道中表達(dá)和/或分泌。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了 VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，或上述遞送系統(tǒng)在治療中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了 VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，或上述遞送系統(tǒng)在制備用于治療由導(dǎo)致腸道疾病的微生物所造成的感染，特別是輪狀病毒感染的藥物中的用途。進(jìn)一步的技術(shù)方案包括含將抗體遞送到GIT中的遞送系統(tǒng)的食品，其中抗體在腸道中是有活性的，還包含將抗體遞送到GIT中的遞送系統(tǒng)的藥物制劑，其中抗體在腸道中是有活性的，抗體是VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種制造食品或藥物制劑的方法，包括在制造食品或藥物制劑時(shí)向食品或藥物制劑中添加遞送系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了按如上所述方法給病人的腸道帶來(lái)健康益處的食品或藥物制劑的用途。附圖的簡(jiǎn)要描述下面參照附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。圖Ia和b所示的是輪狀病毒特異的VHH顆粒在體外對(duì)輪狀病毒的中和。圖2所示的是輪狀病毒特異的VHH顆粒在體內(nèi)對(duì)輪狀病毒的中和。圖3所示的是乳桿菌表達(dá)載體的圖譜(a)2A10_ 錨定區(qū)；
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(b)VHHl-錨定區(qū)，通過(guò)與干酪乳桿菌蛋白酶P的最后244個(gè)氨基酸融合而介導(dǎo)抗體片段的表面錨定表達(dá)；(c)2A10_ 分泌區(qū)；及(d)VHHl-分泌區(qū)帶有插入到E-標(biāo)記序列后的終止密碼子(TAA)，介導(dǎo)抗體片段的分泌。Tldh 干酪乳桿菌乳酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄終止子；缺失的TId 缺失Tldh后的剩余序列；2A10-scFv 抗 VP4/VP7 的單鏈抗體；VHHl 抗輪狀病毒的重鏈抗體片段；長(zhǎng)錨定區(qū)，來(lái)自干酪乳桿菌蛋白酶P基因的錨定序列044氨基酸)；Tcbh 植物乳桿菌80共軛膽酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄終止子序列；Pldh 干酪乳桿菌乳酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列，SSPrtP =PrtP基因的信號(hào)序列(33aa)，N-端PrtP，I^rtP基因的N-末端(36氨基酸)；Ampr 氨芐青霉素抗性基因；Ery 紅霉素抗性基因；Rep 來(lái)自 L. pentosis 質(zhì)粒 p353_2 中的 r印A 基因；Ori 復(fù)制起點(diǎn)(Ori+ =大腸桿菌的ori，Ori-=乳桿菌的ori)。箭頭表示終止密碼子。圖如所示的是流式細(xì)胞技術(shù)的結(jié)果，表示通過(guò)鼠抗E標(biāo)記抗體檢測(cè)E標(biāo)記而顯示的2AW-ScFv(亮灰色)和VHHl (暗灰色)在類干酪乳桿菌表面的表達(dá)。(b)掃描電子顯微鏡(SEM)照片，顯示類干酪乳桿菌表面表達(dá)的VHH與輪狀病毒的結(jié)合。圖5所示的是體外中和檢測(cè)法的結(jié)果，檢測(cè)乳桿菌表達(dá)的VHHl錨定片段抑制輪狀病毒感染MA104細(xì)胞的效率。感染降低60%或以上表示特異性中和。實(shí)線表示乳桿菌產(chǎn)生的E標(biāo)記純化的VHHl抗體(20 μ g/ml)的中和水平。點(diǎn)線表示2A10單克隆雜交瘤上清 (147ng/ml)的中和水平。通過(guò)不同濃度的VHHl錨定乳桿菌(■ )，2A10錨定的乳桿菌(a ) 和未轉(zhuǎn)化乳桿菌(口)獲得的中和作用。圖6(a)所示的是用表達(dá)VHHl錨定片段的乳桿菌處理的小鼠腹瀉的傳播。三次實(shí)驗(yàn)的綜合結(jié)果。(b)用表面表達(dá)2A10-SCFv的乳桿菌處理的小鼠腹瀉的傳播。三次實(shí)驗(yàn)的
綜合結(jié)果。圖7所示的是用不同配方處理的幼畜的十二指腸和空腸切片，用蘇木精和伊紅染色。線條bar長(zhǎng)度為100 μ m。圖8所示的是vp7 RNA在小腸組織樣品的裝載，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。圖9所示的是不同劑量表達(dá)VHHl錨定片段的乳桿菌的評(píng)估及其降低腹瀉的效率。

圖10所示的是凍干形式的表達(dá)VHHl錨定片段的乳桿菌的評(píng)估。圖11所示的是掃描電子顯微鏡(SEM)圖譜，表示輪狀病毒與表達(dá)在類干酪乳桿菌表面的VHHl的結(jié)合。圖12所示的是對(duì)輪狀病毒顆粒有親和性的VHH的序列比對(duì)。發(fā)明的詳細(xì)描述
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本發(fā)明將通過(guò)實(shí)施例和技術(shù)方案進(jìn)行描述?？傮w上，本發(fā)明涉及將VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段遞送到胃腸道(GIT)，適于處置由腸道微生物感染所導(dǎo)致的疾病。本發(fā)明也涉及含將抗體遞送到GIT的遞送系統(tǒng)的食品或藥物成分，其中抗體在腸道中是有活性的?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。優(yōu)選地，免疫球蛋白或其片段具有一下特征i)在存在于GIT中的條件下具有很好的結(jié)合親和性和所需的抑制作用；及ii)具有很好的蛋白水解穩(wěn)定性，在蛋白水解酶的降解下是穩(wěn)定的。優(yōu)選地，VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，特異針對(duì)導(dǎo)致腸道疾病的微生物。Van der Linden，R. H.等〃 Comparison of physical properties of llamas VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies “ Biochim. Biophys. Acta(1990) 1431,37-46獲得了針對(duì)各種抗原的具有高特異性和親和性的治療抗體。另外， 重鏈免疫球蛋白易于在細(xì)菌和酵母中克隆和表達(dá)，如Frenken，L.G. J.等〃 Isolation of antigen specific llamas VHH antibody fragments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae " . J. Biotechnol. OOOO) 78，11-21 中所述。包括用編碼抗體或片段的表達(dá)DNA序列轉(zhuǎn)化霉菌或酵母的大規(guī)模制備這種免疫球蛋白或其片段的方法， 在Unilever的WO 94/25591中有所描述。最后，EP-A-0584421描述了從camelids獲得的治療免疫球蛋白區(qū)。Nuttal等Q003 and 2004)和Dooley等Q003)描述了各種VNAR抗體的分離。！1011等Q003)描述了與VHH免疫球蛋白具有相同特性的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)的分離和鑒定。優(yōu)選地，抗體是美洲駝重鏈抗體，更優(yōu)選地是VHH抗體或其片段。1993年， Hamers-Casterman等在camelids，即駱駝、單峰駱駝和美洲駝中發(fā)現(xiàn)了新型的IgG抗體 (“Naturally occurring antibodies of devoid light-chains" Nature(1993)363, 446-448)。重鏈抗體構(gòu)成了 camelids的美洲駝所產(chǎn)生的IgG抗體的四分之一。這些抗體由兩條重鏈形成，但沒(méi)有輕鏈?？勺兊目乖Y(jié)合部分是指VHH結(jié)構(gòu)域，它是最小的天然發(fā)生的完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Desmyter，A.，et al. “ Antigen specificity and high affinity binding provided by one single loop of a camel single-domain antibody " J. Biol. Chem. (2001)276，26285_26290)?？僧a(chǎn)生針對(duì)各種抗原具有高特異性和親和性的重鏈抗體，這些抗體易于在細(xì)菌和酵母中克隆和表達(dá)(Frenken，L. GJ.，et al. “ Isolation of antigen specific llamas VHH antibody fragments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae " . J. Biotechnol. (2000)78, 11-21)。其表達(dá)水平、可溶性和穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的F(ab)或Fv片段高(Ghahroudi, M. A. et al “ Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chainantibodies" FEBS Lett. (1997)414,521—526)。重鏈抗體的另一個(gè)較好的來(lái)源是鯊魚。最近表明鯊魚在其抗體中具有單獨(dú)的VH ^^ ^ , VNAR(Nuttall et al. “ Isolation and characterization of an
11IgNAR variable domain specific for the human mitochondrial translocase receptor Tom70 “ Eu r.J. Biochem. (2003)270,3543-3554 ；Dooley et al. “ Selection and characterization of naturally occurring single-domain(IgNAR)antibody fragments from immunized sharks by phage display" Molecular Immunology(2003)40,25-33 ； Nuttall et al. " Selection and affinity maturation of IgNAR variable domains tergeting Plasmodium falciparum AMAl " Proteins :Structure, Function and Bioinformatics (2004) 55,187-197)?？墒褂?VNAR 型免疫球蛋白的片段。Holt 等 “Domain antibodies :proteins for therapy " Trends in Biotechnology (2003) :Vol. 21，No. 11 :484-490 綜述了稱為“結(jié)構(gòu)域抗體”或 dAbs 的抗原結(jié)合片段，它僅含有抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域，因此比例如Fab和scFv更小。Dabs是抗體最小的已知的抗原結(jié)合片段，從IlkDa到15kDa。它們?cè)谖⑸锛?xì)胞培養(yǎng)物中高度表達(dá)。每個(gè) dAb含抗體5個(gè)天然存在的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)中的3個(gè)。免疫球蛋白可以是多價(jià)的，即二價(jià)、三價(jià)、四價(jià)，其中含有多個(gè)可以結(jié)合位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以來(lái)源于相同的親本抗體或其片段或來(lái)源于結(jié)合相同抗原決定簇的不同抗體。 如果所有結(jié)合位點(diǎn)具有相同的特異性，則可產(chǎn)生單特異性的免疫球蛋白。選擇性地，可產(chǎn)生與相同抗原的不同抗原決定簇或甚至與不同抗原結(jié)合的多特異性免疫球蛋白。VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體 (dAbs)或其片段可天然產(chǎn)生，即對(duì)用所需抗原免疫的動(dòng)物體內(nèi)采血或通過(guò)基因工程技術(shù)合成?？贵w或其片段可天然產(chǎn)生或通過(guò)本領(lǐng)域已知的基因工程技術(shù)獲得。可篩選對(duì)多種不同抗原，包括微生物、較大的寄生蟲(chóng)、病毒和細(xì)菌毒素有活性的抗體。也設(shè)計(jì)了 VHH、VNAR和dAbs的功能等價(jià)物。功能等價(jià)物是指與全長(zhǎng)序列有相同抗原結(jié)合親和性的序列。例如，功能等價(jià)物包括添加或缺失不引起功能改變的氨基酸。合成基因、將其整合到微生物宿主中并在微生物中表達(dá)基因的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，技術(shù)人員可通過(guò)常用的通用技術(shù)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明?？紤]了復(fù)制或整合載體的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，一種包括將抗體遞送到GIT的遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑，其中抗體是VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，它們?cè)谀c道中是有活性的。優(yōu)選地，遞送系統(tǒng)是微生物，免疫球蛋白是美洲駝來(lái)源的抗體或其片段。我們驚奇的發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化的微生物可在其表面表達(dá)駱駝重鏈抗體或其片段，能降低病毒裝載，使病理學(xué)規(guī)范化，并在輪狀病毒感染的動(dòng)物模型中減輕腹瀉。另外，駱駝的重鏈抗體或其片段可在輪狀感染的體外和體內(nèi)模型中有效降低感染。本發(fā)明也包含不表現(xiàn)出抗原結(jié)合親和性的整個(gè)抗體片段或部分的用途。片段優(yōu)選地是功能片段。重鏈的功能片段是指免疫球蛋白重鏈的片段，該片段對(duì)同全長(zhǎng)序列類似的抗原具有結(jié)合親和性。當(dāng)解離常數(shù)大于10eXp5時(shí)具有結(jié)合親和性。這種片段可利于治療。 例如，它可能具有很小的免疫原性，如果需要，它由于具有更小的體積而可以穿過(guò)組織。抗體適于遞送到GIT中，而且必須在胃和/和腸道中是有活性的。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括體內(nèi)產(chǎn)生或釋放含VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，定位于GIT中避免了口腔給藥抗體在胃中降解的實(shí)際問(wèn)題。為了測(cè)定VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段是否適于本發(fā)明，可進(jìn)行下列檢驗(yàn)。產(chǎn)生的抗體在低pH，優(yōu)選地從1. 5到3. 5，并存在胃蛋白酶(一種在胃中含量豐富的蛋白酶)的特定條件下進(jìn)行篩選，以獲得在GIT中很好工作的非常有用的分子，從而適于本發(fā)明的用途。本發(fā)明通常用于處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及處置導(dǎo)致腸道疾病的病毒和/或?qū)е履c道疾病的細(xì)菌。處置可理解為包括治療和/或預(yù)防。導(dǎo)致腸道疾病的微生物包括例如沙門氏菌、Campilobacter、大腸桿菌或螺桿菌。 導(dǎo)致腸道疾病的病毒包括例如Noro病毒(諾沃克類病毒)、腸道腺病毒、冠狀病毒、杯狀病毒和小病毒。輪狀病毒和諾沃克家族的病毒是病毒性胃腸炎的主要原因，但許多其它病毒也可能與爆發(fā)有關(guān)。最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及處置輪狀病毒感染。本發(fā)明也用于治療其它非導(dǎo)致腸道疾病，例如病毒性肝炎。選擇性地，遞送系統(tǒng)包括益生微生物。益生微生物優(yōu)選地可在通過(guò)GIT后存活，并在胃/腸道中具有活性。優(yōu)選地，微生物可在GIT中產(chǎn)生短暫克??；在GIT中表達(dá)基因；并可刺激腸道免疫系統(tǒng)。合適的益生微生物的例子包括諸如釀酒酵母(Saccharomyces)、Debaromyces、克魯維酵母(Kluyveromyces)和畢赤酵母(Pichia)之類的酵母，諸如曲霉(Aspergillus)、 根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)和青霉(Penicillium)之類的霉菌，及諸如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、 腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、明串球菌屬(Leuconostoc)、魏其Jf氏菌屬 (Weissella)、酒球菌屬(Oenococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)之類的細(xì)菌。合適的益生微生物的特定例子有乳酸克魯維酵母(Kluyveroniyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、巴其Jf德畢赤酵母(Pichia pastoris)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 布拉第酵母(Saccharomyces boulardii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、米赫毛霉(Mucor miehei)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、 納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)、青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、 動(dòng)物雙岐桿菌(B. animal is)、短雙歧桿菌(B. breve)、兩歧雙歧桿菌(B. bifidum)、 嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)、乳雙岐桿菌(B. lactis)、長(zhǎng)雙岐桿菌(B. Iongum)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、獎(jiǎng)腸球菌(Enterococcus faecalis)、大腸桿菌 (Escherichiacoli)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳桿菌(L. brevis)、 干酪乳桿菌(L. casei)、德氏乳桿菌(L. delbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(L. fermentum)、格氏乳桿菌(L. gasseri)、纖維二糖乳桿菌(L. helveticus)、L. johnsonii、乳酸乳桿菌 (L. lactis)、類副干酪乳桿菌/副干酪乳桿菌(L. paracasei)、植物乳桿菌(L. ρlantarum)、 羅伊氏乳桿菌(L. reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus)、米酒乳桿菌(L. sakei)、唾液乳桿菌(L. salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Lactococcus cremoris、
13腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、 乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球菌(P. cerevisiae)、戊糖片球菌 (P. pentosaceus)、費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、i|t 氏丙酸桿菌 (Propionibacterium shermanii)禾口唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)。特定益生菌株有布拉第酵母(Saccharomycesboulardii)、于酪乳桿菌代田株(Lactobacillus casei shirota) > Lactobacillus casei immunitas> zF -^L If 1 (Lactobacillus casei)DN-114001、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(ATCC53103)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)ATCC55730/SD2112,鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HNOO1、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)299v(DSM9843)、 Lactobacillus johnsonii Lal (I—1225CNCM)、植物IL桿菌(Lactobacillus plantarum) WCFS1、乳雙岐桿菌(Bifidobacterium lactis)HN019、動(dòng)物雙岐桿菌(Bifidobacterium animalis)DN-173010、動(dòng)物雙岐桿菌(Bifidobacterium animalis)Bbl2、干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)431、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri) ING1、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)UCC118、費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii) JS、大腸桿菌(Escherichia coli)Nissle 1917。實(shí)用來(lái)說(shuō)，微生物可以是乳酸細(xì)菌(lactic acid bacterium)。更優(yōu)選地，微生物從乳桿菌屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)選擇。更優(yōu)選地，微生物是乳桿菌(LactcAaci 1 Ius)。具體地，乳桿菌是干酪乳桿菌393pLZ15。干酪乳桿菌最近重新鑒定為類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) (Perez-Martinez，2003)。微生物也可以是益生菌芽孢桿菌種，如Le H. Due et al.，Applied and Environmental Microbiology, 2004, p. 2161)所述，更優(yōu)選地是賭質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus cereus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)禾口微小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。基于益生菌的系統(tǒng)是安全的、吸引人的方法，是最便宜的抗體產(chǎn)生系統(tǒng)。微生物——優(yōu)選地是表達(dá)的抗體相對(duì)較容易的乳桿菌的大規(guī)模應(yīng)用，需要最小的處理和儲(chǔ)存費(fèi)用，是比較經(jīng)濟(jì)的。選擇性地，微生物可以是酵母。合適的酵母包括烘烤用的酵母釀酒酵母。其它的酵母例如博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、甲醇畢赤酵母(Pichia tnethanolica)和巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)，也是已知的產(chǎn)生異源蛋白的系統(tǒng)，可用于本發(fā)明中。絲狀真菌、特別是來(lái)自木霉和曲霉屬的種可在其培養(yǎng)基中分泌大量蛋白、代謝物和有機(jī)酸。該特性廣泛應(yīng)用于食品和飲品工業(yè)，其中由這些絲狀真菌種分泌的化合物已使用多年。應(yīng)理解這些微生物可以是遺傳修飾的微生物。根據(jù)本方面的遞送系統(tǒng)包含用編碼VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段的基因轉(zhuǎn)化的微生物。這種基于益生菌的系統(tǒng)是一種安全的吸引人的將抗體遞送到GIT的方法。益生菌在本領(lǐng)域是已知的，是一種最便宜的抗體產(chǎn)生系統(tǒng)。因此，大規(guī)模應(yīng)用乳桿菌表達(dá)抗體相對(duì)較容易，需要最小的處理和儲(chǔ)存費(fèi)用。另外，益生菌至少可在腸道中產(chǎn)生短暫克隆數(shù)天、數(shù)周或幾個(gè)月，可在腸道中保持更長(zhǎng)的時(shí)間，從而持續(xù)產(chǎn)生抗體，以更持續(xù)并延長(zhǎng)對(duì)導(dǎo)致腸道疾病的微生物或病毒的保護(hù)作用。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可用于治療或預(yù)防由導(dǎo)致腸道疾病的微生物所造成的感染。更具體地，VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段可用于治療或預(yù)防由輪狀病毒引起的病毒性胃腸炎或腹瀉。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)是使用了益生菌微生物表達(dá)VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其功能片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其功能片段，可使微生物——例如乳桿菌能提供與該益生菌微生物相關(guān)的正常的健康益處，并在處置需要進(jìn)行治療的感染中具有預(yù)防/治療的益處。該“雙重作用”的治療具有協(xié)同作用，從而比本領(lǐng)域已知的治療方法對(duì)病人具有更大的健康益處可。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，VHH型重鏈免疫球蛋白或其功能片段來(lái)自 camelids，包括美洲駝和駱駝。重鏈抗體的選擇性來(lái)源是鯊魚。最近表明鯊魚在其抗體中也具有單個(gè)VH類似的結(jié)構(gòu)域，稱為VNAR。根據(jù)本發(fā)明可使用VNAR型免疫球蛋白片段。也可考慮使用前述功能等價(jià)物。選擇性地，可使用重鏈或輕鏈免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs) 或其片段。優(yōu)選地，免疫球蛋白是美洲駝來(lái)源的重鏈抗體或其片段。已在本領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)多種美洲駝來(lái)源的重鏈抗體片段。更優(yōu)選地是對(duì)輪狀病毒，特別是輪狀病毒株Wa、CK5、Wal、RRV 或CK5的結(jié)合親和性的解離常數(shù)至少為IOexp 5的重鏈免疫球蛋白或其片段。因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體可有效治療輪狀病毒感染，因此它是特別有利的。已發(fā)現(xiàn)美洲駝VHH抗體片段在輪狀病毒感染過(guò)程中可降低病毒裝載、使病理學(xué)規(guī)范化，并可減輕腹瀉。特別優(yōu)選地，在本發(fā)明的序列表，SEQ ID No 1到21中提供了對(duì)輪狀病毒具有親和性的美洲駝來(lái)源的VHH序列。選擇性地，根據(jù)本發(fā)明，與SEQ ID No. 1至少有70%、80%、 85 %、90 %、95 %、98 %或99 %氨基酸同源性并對(duì)輪狀病毒顆?；蚩贵w具有親和性的VHH序列也是優(yōu)選的技術(shù)方案。如本領(lǐng)域所述，VHH序列可來(lái)源于駱駝，通過(guò)免疫和/或親和性篩選獲得，也可來(lái)源于其它諸如鼠或人這樣的哺乳動(dòng)物，和/或通過(guò)氨基酸替代使其駱駝化。 在另一個(gè)技術(shù)方案中，VHH序列可被融合而產(chǎn)生具有2、3、4、5或多個(gè)VHH單位的多聚體單位，選擇性地通過(guò)間隔分子連接。在另一個(gè)技術(shù)方案中，可將幾個(gè)單獨(dú)的或在多聚體分子中的VHH序列組合。優(yōu)選地，VHH序列具有不同的特異性，例如可組合VHH序列而對(duì)特定病原體提供廣譜親和性。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，將對(duì)任何一個(gè)輪狀病毒株Wa、CK5、Wal、RRV 或CK5具有親和性的2、3、4、5或更多的VHH序列組合成單獨(dú)的單體單位或載體上——例如在益生菌和/或多聚體分子上——的組合單位。另外，也出乎意料地發(fā)現(xiàn)美洲駝重鏈抗體適于在GIT中給藥。美洲駝重鏈抗體高度抵抗胃中蛋白酶降解，可抵抗胃中的酸性環(huán)境。盡管蛋白水解系統(tǒng)在GIT中比在例如口中活性更高。腸道中的活性被蛋白水解活性——包括蛋白酶和肽酶所抑制。我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)在GIT中體內(nèi)產(chǎn)生或釋放抗體片段可解決口服抗體在胃中和腸道中降解的實(shí)際問(wèn)題。 本發(fā)明是第一個(gè)可在GIT中表達(dá)抗體的系統(tǒng)，適于治療輪狀病毒感染。當(dāng)選擇益生菌微生物作為遞送系統(tǒng)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化的微生物可在其表面表
15達(dá)美洲駝重鏈抗體或其片段，從而降低病毒裝載、使病理學(xué)規(guī)范化，并在輪狀病毒感染的動(dòng)物模型中減輕腹瀉。美洲駝重鏈抗體在GIT中由微生物表達(dá)。美洲駝來(lái)源的VHH抗體片段可在微生物表面和/或作為微生物的分泌蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，VHH抗體片段的分泌形式是多聚體形式的，以增強(qiáng)病毒裝載的聚集和清除。優(yōu)選地，微生物或更優(yōu)選地益生菌，是用含美洲駝重鏈抗體或其片段的基因的表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化的。表達(dá)載體可包含組成型啟動(dòng)子以表達(dá)抗體或其片段。這種組成型啟動(dòng)子可支持在給藥后，抗體由轉(zhuǎn)化的乳桿菌進(jìn)行持續(xù)的(至少短時(shí)間)原位表達(dá)。選擇性地，可選擇僅在GIT中和/或胃/腸道中有活性——例如僅適于GIT特異表達(dá)的啟動(dòng)子。這可保證在GIT中表達(dá)和/或分泌美洲駝重鏈抗體或其片段。多種乳桿菌組成型啟動(dòng)子在本領(lǐng)域是已知的，特異的在GIT中表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子是Pldh(PoUwels et al “ Lactobacilli as vehicles for targeting antigens to mucosal tissues by surface exposition of foreign antigens " Methods in Enzymology(2001) 336 369-389)。實(shí)施例中描述的表達(dá)載體可在轉(zhuǎn)化的乳桿菌中復(fù)制，并表達(dá)抗體片段。應(yīng)理解本發(fā)明不對(duì)這些復(fù)制表達(dá)載體進(jìn)行限定。在本領(lǐng)域已知可將整個(gè)表達(dá)盒插入到所謂的“整合”質(zhì)粒中，從而使表達(dá)盒在轉(zhuǎn)化后整合到乳桿菌染色體中。(PouwelS，P. H. and Chaillou, S.Gene expression in lactobacilli(2003)Genetics of lactic acid bacteria page 143-188)。根據(jù)選擇的技術(shù)方案，如果選擇膠囊作為遞送系統(tǒng)，膠囊方法應(yīng)該在通過(guò)胃和GIT 后可存活，并可在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放抗體。從而保證將美洲駝重鏈抗體或片段隨時(shí)間遞送到胃中。美洲駝重鏈抗體或VHH或VNAR片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體 (dAbs)或其片段，由于在釋放時(shí)可在腸中存活的能力，因此特別適于該方法。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，抗體遞送到GIT中可通過(guò)使用食品和制藥工業(yè)已知的膠囊而實(shí)現(xiàn)?？墒褂锰烊簧锒嗑垠w。例子包括Caalginate、角叉菜膠、結(jié)冷膠或明膠。遞送系統(tǒng)可以是本領(lǐng)域已知的膠囊方法，將免疫球蛋白或其片段特異地遞送到腸道中。因此膠囊必須存活，直到進(jìn)入腸道中，然后進(jìn)行釋放。這種遞送系統(tǒng)包含通用的保護(hù)系統(tǒng)，可避免抗體降解。這種技術(shù)包括脂質(zhì)體引導(dǎo)法、轉(zhuǎn)盤掃描和凝聚過(guò)程。可使用任何觸發(fā)因子來(lái)促進(jìn)膠囊化成分的釋放，例如PH改變(腸包被)、機(jī)械壓迫、溫度、酶活性。這些技術(shù)在Sebastien Gouin“ Microencapsulation industrial appraisal of existing technologies and trends" Food Science and jTechnologyOO(M) 15 :330-347 中進(jìn)行了擴(kuò)展。選擇性地，膠囊化方法可使抗體在腸道和/或胃中緩慢釋放。從而使抗體或其功能片段或等價(jià)物在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放。美洲駝重鏈抗體或其片段可用于治療或預(yù)防病毒感染，例如病毒性胃腸炎或輪狀病毒感染。具體地，抗體可通過(guò)已用美洲駝重鏈抗體轉(zhuǎn)化的微生物遞送到GIT中，包括步驟 i)用編碼美洲駝重鏈抗體的基因轉(zhuǎn)化微生物，及ii)對(duì)需治療的人或動(dòng)物的GIT中給藥轉(zhuǎn)化的微生物。遞送系統(tǒng)可包含用在腸道中表達(dá)和/或分泌的抗體或抗體片段轉(zhuǎn)化的微生物。因此，使用微生物作為遞送系統(tǒng)具有在GIT環(huán)境中體內(nèi)定位產(chǎn)生抗體片段的優(yōu)點(diǎn)，從而解決了 口服抗體在胃中降解的實(shí)際問(wèn)題。這種基于益生菌的系統(tǒng)是一種安全的吸引人的將抗體遞送到GIT中的方法。因此，大規(guī)模使用乳桿菌表達(dá)抗體是相對(duì)較容易的，需要最小的處理和儲(chǔ)存費(fèi)用，是非常經(jīng)濟(jì)的。另外，益生菌將在腸道中存活更長(zhǎng)的時(shí)間，從而可持續(xù)產(chǎn)生抗體，以更持續(xù)地抵抗導(dǎo)致腸道疾病的微生物。微生物在本發(fā)明的食品中合適的量是每份IO6至IO11或者(例如，如果每份體積未知)為100克產(chǎn)物IO6至1011，更優(yōu)選地，這些水平為每份或每IOOg產(chǎn)物IO8到109。根據(jù)本發(fā)明的抗體必須在腸道/胃中有活性，即它們必須是有功能的，并保持滅活靶標(biāo)的正?；钚浴８鶕?jù)本發(fā)明的活性抗體應(yīng)與其靶標(biāo)正常結(jié)合，因此，抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和性應(yīng)該是正常的。當(dāng)解離常數(shù)大于IO5時(shí)具有結(jié)合親和性。因此，根據(jù)本發(fā)明的食品或藥物制劑可選擇性地針對(duì)特定的疾病或疾病癥狀?？贵w的選擇取決于待治療或減輕的疾病或癥狀。應(yīng)理解當(dāng)產(chǎn)物是食品時(shí)可使用任何抗體。但當(dāng)產(chǎn)物是藥物制劑時(shí)，優(yōu)選地是VHH 或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段。優(yōu)選地，抗體或其片段應(yīng)具有一個(gè)或多個(gè)以下特征i)在存在于G/I通道的條件下具有較好的結(jié)合親和性和所需的抑制功能；及ii) 因?yàn)閷?duì)蛋白水解酶的降解是穩(wěn)定的，因此具有較好的蛋白水解穩(wěn)定性。iii)抗體應(yīng)該是熱穩(wěn)定的，從而使其可包含在各種食品中?？赏ㄟ^(guò)巴斯德消毒來(lái)制備食品，優(yōu)選地是盡管進(jìn)行熱處理，但抗體的活性大部分保留。抗體或其片段應(yīng)可在腸道中表達(dá)和分泌。已知本領(lǐng)域中的幾種模擬GIT條件的檢測(cè)法用于例如篩選可在GIT條件下存活的合適的益生菌。在Picot，A.and Lacroix, C. (International Dairy Journal 14(2004)505-515)中描述了測(cè)定抗體是否在 GIT 條件下存活的檢測(cè)法。為了測(cè)定抗體是否適于本發(fā)明，可使用下述檢測(cè)方法。產(chǎn)生的抗體在低pH、優(yōu)選地 1.5到3. 5，存在胃蛋白酶(一種在胃中含量豐富的蛋白酶)特定的條件下進(jìn)行篩選，從而得到在G/I通道中工作，適于本發(fā)明的高效分子。本發(fā)明可用于處置導(dǎo)致腸道疾病的微生物。導(dǎo)致腸道疾病的微生物包括病毒或?qū)е履c道疾病的細(xì)菌。療處置是指治療和/或預(yù)防。本發(fā)明的進(jìn)一步的技術(shù)方案是含上述遞送系統(tǒng)的食品或藥物制劑。可根據(jù)本發(fā)明制備幾種食品，例如膳食替代物、湯、面條、冰激凌、調(diào)料、調(diào)味品、涂抹食品、快餐、谷物、飲料、面包、餅干、其它烘烤食品、甜點(diǎn)、bars、巧克力、樹(shù)脂、奶制品、減肥食品，例如減肥食品或膳食替代物等。雖然上述類型在食品應(yīng)用中是優(yōu)選的，但本發(fā)明的食品可用作飲食的補(bǔ)充。表1所示各種根據(jù)本發(fā)明制備的產(chǎn)品及典型的一份的大小。表1
1權(quán)利要求
1.VHH型重鏈免疫球蛋白或其片段，其具有與SEQID NO :1至少85%同一的氨基酸序列并對(duì)輪狀病毒顆?；蚩乖杏H和性。
2.權(quán)利要求1的重鏈免疫球蛋白或其片段，其中所述的重鏈免疫球蛋白或其片段具有與SEQ ID NO 1至少90%同一的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的重鏈免疫球蛋白，其中所述的重鏈免疫球蛋白具有SEQID N0:1的氨基酸序列。
4.VHH型重鏈免疫球蛋白或其片段，其具有選自SEQ IDNO =2,3,4,12，14，17，19或20的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重鏈免疫球蛋白或其片段，其中所述的重鏈免疫球蛋白或其片段與輪狀病毒具有解離常數(shù)至少10eXp5的結(jié)合親和力。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重鏈免疫球蛋白或其片段，其中所述的輪狀病毒選自輪狀病毒株 Wa、CK5、Wal、RRV 或 CK5。
7.重鏈免疫球蛋白，其結(jié)合與權(quán)利要求3或4的重鏈免疫球蛋白相同的表位。
8.多聚體分子，其包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的VHH型重鏈免疫球蛋白或其片段，其中VHH序列可被融合而產(chǎn)生具有2個(gè)或以上VHH單位的多聚體單位，選擇性地通過(guò)間隔分子連接。
9.多聚體分子，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的2個(gè)或以上的VHH序列，所述VHH 序列可被融合而產(chǎn)生具有2、3、4、5或多個(gè)VHH單位，選擇性地通過(guò)間隔分子連接。
10.權(quán)利要求8或9的多聚體分子，其中，所述的VHH具有不同的特異性。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的多聚體分子，其中，每一VHH具有對(duì)選自輪狀病毒株Wa、 0(5、1&1、1 ^或0(5中任一種的親和力。
12.權(quán)利要求11的多聚體分子，其中，所述的VHH結(jié)合成單獨(dú)的單體單位或載體上的組合單位。
13.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重鏈免疫球蛋白或其片段在制備用于治療或預(yù)防輪狀病毒感染的藥物中的用途。
14.編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的VHH型重鏈免疫球蛋白或其片段的基因。
15.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求14所述的編碼VHH型重鏈免疫球蛋白或其片段的基因。
16.權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其中，所述的表達(dá)載體包含組成型啟動(dòng)子或適于GIT特異表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選pldh。
17.宿主，其包含權(quán)利要求15或16任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
18.權(quán)利要求17的宿主，其中所述的宿主為乳桿菌(Lactobacillus)。
19.多聚體免疫球蛋白，其包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重鏈免疫球蛋白或其片段。
20.權(quán)利要求19的多聚體免疫球蛋白，其中所述的重鏈免疫球蛋白或其片段包含來(lái)自相同親本抗體或其片段的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
21.權(quán)利要求19的多聚體免疫球蛋白，其中所述的重鏈免疫球蛋白或其片段包含來(lái)自結(jié)合相同表位的不同抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其片段，或免疫球蛋白重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)或其片段，適于處置感染，特別是胃腸道感染。本發(fā)明也涉及含VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其功能片段，或免疫球蛋白或其片段的重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)的遞送系統(tǒng)，及含編碼這些VHH或VNAR型重鏈免疫球蛋白或其功能片段，或免疫球蛋白或其片段的重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)的表達(dá)載體的宿主。本發(fā)明也涉及含該遞送系統(tǒng)的食品和藥物制劑，及制備本發(fā)明的食品的方法。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102336832SQ201110288739
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者A·M·勒德博爾, L·G·J·弗倫肯, L·漢馬斯特龍 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司