專利名稱：一種細(xì)菌阿魏酸脫羧酶基因及其晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌阿魏酸脫羧酶基因及其晶體結(jié)構(gòu)，屬分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
阿魏酸(4-羥基-3甲氧基-2-丙烯酸)是一種廣泛存在植物界的羥基肉桂酸，是麥麩中含量最高的酚酸，可達(dá)其干重0.5～1％。它主要通過酯鍵與多糖和木質(zhì)素交聯(lián)，或自身酯化或醚化形成二阿魏酸。許多植物、真菌、細(xì)菌、放線菌、微藻等能將阿魏酸分解生成香蘭素，阿魏酸作為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的前體物質(zhì)，具有易得、價廉以及對微生物的毒性較小等優(yōu)點，因此對以阿魏酸為前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成香蘭素的代謝途徑的研究具有很大的理論意義和生產(chǎn)價值。
香蘭素(4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)，又名香草醛，是一種重要的廣譜型香料之一，香氣幽雅、爽快，可直接應(yīng)用于化妝品、香煙、糕點、糖果以及烘烤食品等行業(yè)，也可用作植物生長促進劑、殺菌劑、潤滑油消泡劑等。香蘭素是重要的有機合成中間體，在國內(nèi)香蘭素主要應(yīng)用于食品添加劑，近幾年來在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用被不斷拓寬，已成為香蘭素最有發(fā)展?jié)摿Φ膽?yīng)用領(lǐng)域。除此外，它還可在電鍍工業(yè)中用作上光劑，農(nóng)業(yè)中用作催熟劑等。
在阿魏酸代謝生成香蘭素的途徑中，阿魏酸脫羧酶催化阿魏酸生成4-乙基愈創(chuàng)木酚，是阿魏酸代謝形成香蘭素的關(guān)鍵酶。另外4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為一種感覺閾值極低的物質(zhì)，能產(chǎn)生一種特別的酚類物質(zhì)的香氣。這種物質(zhì)能提高食品的感官品質(zhì)，對酒、食品，飲料的自然香氣也有很大影響。
以往對以阿魏酸為底物轉(zhuǎn)化形成香蘭素的研究主要集中于代謝途徑方面，目前一些主要的代謝途徑已經(jīng)逐漸的被報道。然而參與細(xì)菌Enterobacter sp.Px6-4催化阿魏酸形成4-乙基愈創(chuàng)木酚的脫羧酶的基因還沒有被報道。為了更加深入的了解Enterobacter sp.Px6-4中阿魏酸脫羧酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，本發(fā)明通過基因克隆、表達(dá)和懸滴擴散結(jié)晶方法獲得了阿魏酸脫羧酶的晶體，并通過X-衍射方法對阿魏酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)進行了解析。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸形成4-乙基愈創(chuàng)木酚和香蘭素的細(xì)菌Enterobacter sp.Px6-4中克隆得到阿魏酸脫羧酶的編碼基因。該菌株已經(jīng)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國，北京中關(guān)村；保藏日期2007年4月12日；保藏號CGMCC No.1999。
本發(fā)明的目的是通過基因克隆的方法擴增得到細(xì)菌Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶的編碼基因，在大腸桿菌E.coli中表達(dá)，并運用懸滴擴散法得到阿魏酸脫羧酶的蛋白質(zhì)結(jié)晶，并通過X-衍射方法對該酶的結(jié)構(gòu)及活性中心進行了解析。為進一步研究阿魏酸脫羧酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系以及改變4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量提供理論上的指導(dǎo)。
1.本發(fā)明中從細(xì)菌Enterobacter sp.Px6-4中克隆得到阿魏酸脫羧酶的編碼基因，并在大腸桿菌E.coli中成功表達(dá)的方法包括如下步驟 1)本發(fā)明根據(jù)GenBank(國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上報道的6條細(xì)菌來源的羥基肉桂酸脫羧酶的基因序列(AF017117，AJ276891，AJ27863，AJ492219，U63827 and X84815)設(shè)計了一對簡并引物PS和Px2(表1)用于擴增阿魏酸脫羧酶的保守序列。
2)依據(jù)該保守片段設(shè)計了6條特異性引物PxT31，PxT32，PxT33，PxT51，PxT52，PxT53(表1)，并應(yīng)用DNA Walking SpeedUpTM Premix試劑盒擴增得到Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶保守序列兩端的未知序列。
3)通過DNAman生物學(xué)軟件進行拼接獲得Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶的全長編碼基因序列(詳見阿魏酸脫羧酶基因序列表)。
4)依據(jù)Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶的全長編碼基因序列設(shè)計了特異性Px1e和Px2e(表1)用于擴增Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶編碼序列。
表1.本發(fā)明所用到的引物序列

5)將PCR產(chǎn)物用EcoR I和Hind III進行雙酶切，回收純化酶切后的小片段并與經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后的pET-28a連接，構(gòu)建表達(dá)載體。
6)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，E.coli BL21大量表達(dá)有活性的阿魏酸脫羧酶。
7)經(jīng)過親和層析柱、陰離子柱、疏水柱純化后，獲得阿魏酸脫羧酶的純酶。
2.本發(fā)明中阿魏酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)和活性中心的確定方法 1)將純化的阿魏酸脫羧酶濃縮至10mg/mL后，通過懸滴結(jié)晶法于0.1M HEPES(pH7.3)、26％w/v PEG10,000的結(jié)晶條件下獲得阿魏酸脫羧酶的結(jié)晶。
2)將純化的阿魏酸脫羧酶濃縮至10mg/mL與7mM的阿魏酸鈉混合，通過懸滴結(jié)晶法于0.1M HEPES(pH7.3)、26％w/v PEG10,000的結(jié)晶條件下獲得阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉復(fù)合體的晶體。
3)收集并分析步驟1)中得到的阿魏酸脫羧酶晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，獲得阿魏酸脫羧酶的電子密度。
4)收集并分析步驟2)中得到的復(fù)合體的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，獲得與阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉結(jié)合的電子密度。
5)以步驟3)中獲得的阿魏酸脫羧酶的電子密度為基礎(chǔ)，獲得阿魏酸脫羧酶精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。
6)以步驟4)中得到的阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉結(jié)合的電子密度，獲得阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，從而確定了阿魏酸脫羧酶的活性中心 步驟3)和4)中晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)收集與整理可采用如下方法 首先使用Hampton Research公司的尼龍晶體環(huán)，從晶體浸泡液中獲取浸泡一定時間(浸泡時間控制在2—48小時之間)的晶體，并迅速使用Rigaku公司的冷卻系統(tǒng)或Oxford Cyrosystem公司的冷卻系統(tǒng)，將晶體在以上所述的兩種冷凍系統(tǒng)產(chǎn)生的低溫氮氣流中冷凍至零下150℃—180℃；使X射線通過晶體，使用旋進法收集X射線衍射數(shù)據(jù)。
在收集到晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)后，按照下述步驟進行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理 首先，使用HKL2000等(包括Mosflm、D*trek等)衍射數(shù)據(jù)處理程序包等常用的數(shù)據(jù)處理的方法，對收集得到的衍射數(shù)據(jù)進行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件。
其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等各種分子置換(MolecularReplacement)程序等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理方法，利用分子置換(MolecularReplacement)的方法，以酚酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)(PDB code2P8G)為初始模型，得到阿魏酸脫羧酶的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)；以阿魏酸脫羧酶的母體晶體結(jié)構(gòu)為初始模型，得到阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)阿魏酸脫羧酶的總體結(jié)構(gòu)的特征為阿魏酸脫羧酶的單體結(jié)構(gòu)的分辨率為

呈圓筒形，總尺寸為

由9股β折疊股、2個α螺旋和3段η螺旋構(gòu)象構(gòu)成；每一個單體分子又分為三部分即中心部分、螺旋狀的底部和C末端延伸；其中，中心部分從β折疊股1到β折疊股8和β折疊股9，這九股反平行的β折疊股環(huán)繞形成了末端開口的β桶狀結(jié)構(gòu)；螺旋狀底部由α螺旋構(gòu)象1、α螺旋構(gòu)象2和η螺旋構(gòu)象1、η螺旋構(gòu)象2構(gòu)成；C末端延伸是位于β折疊股9之后的一段長卷曲，其中η螺旋構(gòu)象2位于卷曲的中部。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)阿魏酸脫羧酶底物結(jié)合位點(活性中心)其特征為底物類似物阿魏酸鈉結(jié)合到阿魏酸脫羧酶β桶狀結(jié)構(gòu)中心的中部和螺旋狀的底部；在它半開式的底部，β折疊股8、β折疊股9和位于β折疊股1和β折疊股2、β折疊股3和β折疊股4之間的發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)成的殘基形成了一個相對疏水的底物結(jié)合口袋；位于β折疊股1和β折疊股2、β折疊股3和β折疊股4之間的發(fā)夾結(jié)構(gòu)在底物結(jié)合口袋的前面擔(dān)當(dāng)了兩扇門板的作用，我們在此將其命名為門板1和門板2；位于第25位的色氨酸擔(dān)當(dāng)了門鎖的功能；在底物結(jié)合口袋關(guān)閉的狀態(tài)下，門板1和門板2朝向β折疊股9移動約5

將口袋關(guān)閉并且將底物與接觸反應(yīng)的中心隔開；在底物結(jié)合口袋開啟的狀態(tài)下，門板1門板2移開將口袋從關(guān)閉的形式變?yōu)殚_放的形式；在開放的狀態(tài)下，底物結(jié)合中心形成一個8×8×15

的口袋，有利于底物進入活性中心。
為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的具體實施例。下述實施例僅僅是用于解釋本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制本發(fā)明范圍。



圖1.是阿魏酸脫羧酶在大腸桿菌E.coli的表達(dá)和純化電泳圖譜。M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1無IPTG誘導(dǎo)的總蛋白質(zhì)；Lane 2IPTG誘導(dǎo)的總蛋白質(zhì)；Lane 3用Ni-chelating column洗脫的蛋白質(zhì)；Lane 4用Resource Q column洗脫的蛋白質(zhì)；Lane 5用HiLoad 16/60 Superdex column純化的阿魏酸脫羧酶。
圖2.阿魏酸脫羧酶的單體結(jié)構(gòu)。阿魏酸脫羧酶的單體結(jié)構(gòu)為桶狀結(jié)構(gòu)，大小為
圖3.是阿魏酸脫羧酶和阿魏酸鈉復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)圖。A.阿魏酸脫羧酶的底物結(jié)合位點；B.阿魏酸鈉和阿魏酸脫羧酶相互作用的氨基酸分子。

具體實施例方式 1.細(xì)菌基因組DNA的提取 1)將Enterobacter sp.Px6-4接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)12小時； 2)取1mL的培養(yǎng)物12000rpm離心2分鐘，去掉上清； 3)沉淀用TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA，pH8.0)洗兩次； 4)用567μL的TE緩沖液重懸后加入30μL SDS(10％)和15μL蛋白酶K(20mg/mL)，混均后于37℃溫浴1小時； 5)依次加入100μL NaCl(5M)、80μL的CTAB/NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)，混均后于65℃溫浴10分鐘； 6)加入700μL的苯酚氯仿異戊醇(25241v/v)顛倒數(shù)次混均后5000rpm離心5分鐘； 7)將上清移至一個新的EP管中加入0.6倍體積的異丙醇，4℃、12000rpm離心10分鐘； 8)沉淀用70％的乙醇洗兩次，真空干燥5分鐘后，用50μL的去離子水將沉淀溶解。
2.Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶保守序列的獲得 1)PCR擴增體系 10 x Pfu Buffer 5μL dNTP Mixture 1μL PS(10μM) 1μL P x 2(10μM) 1μL Template <1μg Pfu DNA Polymerase(5u/μL) 0.5μL dH2O 50μL 2)PCR 反應(yīng)程序 95℃ 5.5min1個循環(huán) 94℃1min 56℃40sec 72℃2min35個循環(huán) 72℃10min 1個循環(huán) 4℃ ∞ 1個循環(huán) 3)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶保守序列的純化回收方法見百泰克生物公司膠回收試劑盒說明書 4)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶保守序列和載體pMD18-T連接 連接體系 SolutionI 5μL 回收的目的片段 4μL pMD18-T vector 1μL 16℃水浴過夜連接 5)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α a.從-70℃冰箱中取出100μL感受態(tài)細(xì)胞懸液放在冰上進行解凍； b.加入連接產(chǎn)物，冰上放置30分鐘；42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后速置于冰上冷卻3-5分鐘； c.向管中加入0.8-1mL LB液體培養(yǎng)基，混均后37振蕩培養(yǎng)1小時； d.菌液8000rpm離心1分鐘，棄大部分上清，留約100μL菌液涂布于Amp篩選平板上，正面向上放置30分鐘后37℃倒置培養(yǎng)10-20小時。
6)目的片段的克隆子培養(yǎng)液送測序公司測序 3.Enterobacter sp.Px6-4阿魏酸脫羧酶基因全長序列的獲得 1)應(yīng)用DNA Walking SpeedUpTM Premix試劑盒擴增得到阿魏酸脫羧酶保守序列兩端的未知序列，具體方法參見試劑盒的說明書。
2)擴增產(chǎn)物的回收、連接和測序，方法同上。
3)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶全長序列利用DNAman生物學(xué)軟件進行拼接得到阿魏酸脫羧酶的全長序列(具體序列見附件1)。
4.Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶編碼區(qū)序列的擴增 1)阿魏酸脫羧酶編碼序列的擴增利用特異性P x 1e和P x 2e(表1)擴增得到Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶編碼序列，具體方法同上。
2)擴增產(chǎn)物的回收、連接和測序，方法同上。
5.構(gòu)建帶有Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶編碼區(qū)序列的重組質(zhì)粒 1)阿魏酸脫羧酶編碼序列的酶切處理，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III酶切處理PCR擴增產(chǎn)物和載體pET-28a。
酶切體系 EcoR I 2.5μL Hind III2.5μL 編碼區(qū)序列/pET-28a 30μL dd H2O 15μL 10 x Buffer M 5μL 37℃溫浴6小時 2)Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶編碼序列與酶切處理后的pET-28a的連接。
連接體系 編碼區(qū)序列 3μL pET-28a2μL 連接酶 5μL 3)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選方法同上。
6.阿魏酸脫羧酶在E coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá) 1)帶有Enterobacter sp.P x 6-4阿魏酸脫羧酶編碼區(qū)序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21。
a.從-70℃冰箱中取出100μL感受態(tài)細(xì)胞懸液放在冰上進行解凍； b.加入連接產(chǎn)物，冰上放置30分鐘；42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后速置于冰上冷卻3-5分鐘； c.向管中加入0.8-1mL LB液體培養(yǎng)基，混均后37℃振蕩培養(yǎng)1h；菌液8000rpm離心1分鐘，棄大部分上清，留約100μL菌液涂布于Amp篩選平板上，正面向上放置30分鐘后37℃倒置培養(yǎng)10-20小時。
2)IPTG誘導(dǎo)阿魏酸脫羧酶異源表達(dá) a.LB平板過夜活化菌種；LB液體活化37℃、180rpm培養(yǎng)3小時； b.按1％接種量轉(zhuǎn)接液體LB37℃、180rpm培養(yǎng)3小時后加入0.2mM的IPTG后30℃、200rpm過夜誘導(dǎo)。
7.阿魏酸脫羧酶的純化 1)活化種子 a.以帶有重組質(zhì)粒的E.coli BL21作為種子； b.平板上活化的種子轉(zhuǎn)接于50mL液體LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖3小時，按3％的接種量轉(zhuǎn)接1L的液體LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm搖大約2小時，加入IPTG終濃度為0.2mM，30℃，200rpm過夜誘導(dǎo)； c.8000rpm離心20分鐘收集菌體，用50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)，洗兩次； d.以1L發(fā)酵液用30mL的50mM、Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)的比例重懸。
2)超聲波破碎獲得粗酶液 將細(xì)胞重懸液放置于冰上，以50％的頻率，超聲8秒后停12秒的條件超聲破碎約20分鐘，直到完全清亮為止。
3)粗酶液過親和層析柱 a.選擇鎳柱作為親和層析柱； d.用50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)將柱子平衡后上樣； c.繼續(xù)用50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)將位與柱子結(jié)合的雜質(zhì)沖去； d.用50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)+100mM咪唑洗脫，收集洗脫液。
4)洗脫的酶液透析處理 將洗脫的酶液裝入透析袋中，用20mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)作為透析液，放置于冰上透析處理24小時。
5)透析后的酶液過陰離子柱 a.用20mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)將柱子平衡后上樣； d.繼續(xù)用20mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)將位與柱子結(jié)合的雜質(zhì)沖去； c.繼續(xù)用緩沖液1M NaCl+20mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)作梯度洗脫，收集含有目的蛋白的洗脫液。
6)含有目的蛋白的洗脫液過疏水柱 a.將過陰離子柱后含有目的蛋白的洗脫液中加入0.5M的硫酸銨； d.用0.5M的硫酸銨加50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)將柱子平衡后上樣； c.繼續(xù)用0.5M的硫酸銨加50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)將位與柱子結(jié)合的雜質(zhì)沖去； d.用50mM的Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)作梯度洗脫后，用去離子水洗脫收集含有目的蛋白的洗脫液。
7)SDS電泳分析阿魏酸脫羧酶的純度，實驗結(jié)果見附圖1。
8.純化后的阿魏酸脫羧酶結(jié)晶及結(jié)構(gòu)分析 1)阿魏酸脫羧酶結(jié)晶 a.將純化后的阿魏酸脫羧酶濃縮到10mg/mL； b.在10mL的注射器中填入硅油； c.在每個培養(yǎng)孔邊上畫一個2mm寬的硅油圈； d.在組織培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中加入400μL的0.1M HEPES(pH7.3)+26％w/v PEG10,000緩沖液； c.將蓋玻片放在干凈的濾紙上，只接觸其邊緣； d.用加樣器在蓋玻片上點0.5μL緩沖液和0.5μL蛋白質(zhì)溶液； e.用鑷子夾住蓋玻片邊緣，將其翻轉(zhuǎn)，使液滴懸垂在蓋玻片下； f.置蓋玻片于培養(yǎng)板相應(yīng)的孔上，保證蓋玻片邊緣將孔密閉； g.用手指將蓋玻片均勻而有力的壓合在孔上； h.輕柔的蓋上蓋子，置于16℃儲藏。
2)阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉共結(jié)晶 a.將純化后的阿魏酸脫羧酶濃縮到10mg/mL； b.在10mL的注射器中填入硅油； c.在每個培養(yǎng)孔邊上畫一個2mm寬的硅油圈； d.在組織培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中加入400μL的0.1M HEPES(pH7.3)+26％w/v PEG10,000緩沖液； c.將蓋玻片放在干凈的濾紙上，只接觸其邊緣； d.用加樣器在蓋玻片上點0.5μL緩沖液、0.5μL的7mM阿魏酸鈉、0.5μL蛋白質(zhì)溶液； e.用鑷子夾住蓋玻片邊緣，將其翻轉(zhuǎn)，使液滴懸垂在蓋玻片下； f.置蓋玻片于培養(yǎng)板相應(yīng)的孔上，保證蓋玻片邊緣將孔密閉； g.用手指將蓋玻片均勻而有力的壓合在孔上； h.輕柔的蓋上蓋子，置于16℃儲藏。
3)阿魏酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的收集及結(jié)構(gòu)解析 通過懸滴擴散法獲得阿魏酸脫羧酶的晶體，阿魏酸脫羧酶母體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)在100K的低溫條件利用同步輻射裝置Mar165 CCD探測器收集數(shù)據(jù)。衍射數(shù)據(jù)應(yīng)用HKL2000軟件包進行處理。阿魏酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)以酚酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號為2P8G)作為搜索模型應(yīng)用PHASER程序通過分子置換來獲得初始相位。阿魏酸脫羧酶結(jié)晶屬于P21空間組，在晶胞不對稱單元(unit)內(nèi)包括兩個單體分子。
4)阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的收集及結(jié)構(gòu)解析 阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉復(fù)合結(jié)晶的結(jié)構(gòu)以阿魏酸脫羧酶的母體結(jié)構(gòu)作為搜索模型，應(yīng)用PHASER程序通過分子置換來獲得初始相位。阿魏酸鈉和脫羧酶的結(jié)合參照1Fo-Fc電子密度圖進行構(gòu)建。并應(yīng)用軟件COOT和Refmac根據(jù)2Fo-Fc和1Fo-Fc電子密度圖對結(jié)構(gòu)進行最終的手工重新構(gòu)建和修正。在隨后的位置修正、約束的不嚴(yán)格(restraints were relaxed)和體積溶劑的修正通過Rfree的指導(dǎo)來實現(xiàn)。模型幾何學(xué)的修正用了PROCHECK程序。溶劑分子的定位依據(jù)于在σA-weighted Fo-Fc差值電子密度圖上的立體化學(xué)的合理的峰值。阿魏酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)和復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的衍射數(shù)據(jù)見表2。阿魏酸脫羧酶與阿魏酸鈉復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)見附圖2。
表2.晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和修正

aRmerge＝∑h∑1|Iih-<Ih>|/∑h∑I<Ih>，<Ih>是觀測值的平均Iih的參照h bRwork＝∑(||Fp(obs)|-|Fp(calc)‖)/∑|Fp(obs)|；Rfree指沒有包括在優(yōu)先細(xì)化的衍射點抽取子集(5％)后的R因子 c圓括號中的值表示相應(yīng)的最高分辨率的數(shù)值. 9.阿魏酸脫羧酶的應(yīng)用 本發(fā)明克隆、表達(dá)、純化的阿魏酸脫羧酶能快速、高效的分解阿魏酸使之生成其脫羧產(chǎn)物4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。通過酶作用獲得的產(chǎn)物符合歐洲經(jīng)濟共同體(EEC)對天然產(chǎn)品的要求。
本發(fā)明通過X-射線衍射方法解析了阿魏酸脫羧酶的三維結(jié)構(gòu)，并且通過對阿魏酸脫羧酶和阿魏酸鈉的共結(jié)晶的衍射結(jié)果確定了該酶的底物結(jié)合位點和活性中心，這些晶體結(jié)構(gòu)學(xué)上的數(shù)據(jù)能全方位的反映該酶的氨基酸間構(gòu)象，為阿魏酸脫羧酶的結(jié)構(gòu)改造提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量提供理論上的指導(dǎo)，具有良好的應(yīng)用前景。
本文中所涉及的各種實驗用品(包括但不限于化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等)之中，對于那些特殊的或不易獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法；未經(jīng)特別說明的，均為常規(guī)實驗用品，可以通過各種方式(例如購買、自行制備等)很方便地獲得。
阿魏酸脫羧酶基因[1][1].ST25
SEQUENCE LISTING
<110> 云南大學(xué)
<120> 一種細(xì)菌阿魏酸脫羧酶基因及其晶體結(jié)構(gòu)
<130> 01
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> Enterobacter sp.Px6-4
<220>
<221> fad gene
<222> (100)..(606)
<223>
<220>
<221> promoter
<222> (8)..(57)
<223>
<400> 權(quán)利要求
1、一種細(xì)菌阿魏酸脫羧酶基因，其特征在于阿魏酸脫羧酶編碼基因的核苷酸序列如下
aattaatcta aaatttggat gaatttgatt caaacatagc gttattcatt cgttttttga 60
aggaataaga tcgtctcatc aaaacaaagg agacatctta tgaacacctt cgacaaacat 120
gatttaagcg gcttcgtcgg caaacatctg gtttatacct acgataacgg ctgggaatat 180
gaaatttacg tcaaaaacga aaacaccctc gactaccgta ttcacagcgg cctggtcggc 240
aaccgctggg tgaaagacca gcaggcgtac atcgtccgcg ttggggagag catctataaa 300
atctcctgga ccgagcccac cggcaccgac gtgagcctga ttgtgaacct gggtgacagc 360
ctgttccacg gcacgatctt cttcccgcgc tgggtaatga acaatccgga aaaaaccgtc 420
tgcttccaga acgatcacat tccgttgatg aatagctatc gcgatgcggg cccggcatat 480
ccaaccgaag tgattgatga atttgccact attacttttg ttcgcgactg cggtgccaac 540
aatgaaagcg ttatcgcgtg cgctgccagt gaacttccaa aaaactttcc tgataattta 600
aaataagcgc gacaattaac taaaaagaaa agttcccggc ccatttcata tttattcgaa 660
atggtcggga atttttttgt ttgttgatgt ttggtttaga taaaaagcgc gttaacggtg 720
agcgtaatca caaaacaaat aattcataat ttaataacgc tttgattatt aattggtttt780
2、一種細(xì)菌阿魏酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)，其特征為阿魏酸脫羧酶的單體結(jié)構(gòu)的分辨率為
呈圓筒形，總尺寸為
由9股β折疊股、2個α螺旋和3段η螺旋構(gòu)象構(gòu)成；每一個單體分子又分為三部分即中心部分、螺旋狀的底部和C末端延伸；其中，中心部分從β折疊股1到β折疊股8和β折疊股9，這九股反平行的β折疊股環(huán)繞形成了末端開口的β桶狀結(jié)構(gòu)；螺旋狀底部由α螺旋構(gòu)象1、α螺旋構(gòu)象2和η螺旋構(gòu)象1、η螺旋構(gòu)象2構(gòu)成；C末端延伸是位于β折疊股9之后的一段長卷曲，其中η螺旋構(gòu)象2位于卷曲的中部。
3、權(quán)利要求2所述的細(xì)菌阿魏酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)，其特征在于細(xì)菌阿魏酸脫羧酶的底物結(jié)合位點為底物類似物阿魏酸鈉結(jié)合到阿魏酸脫羧酶β桶狀結(jié)構(gòu)中心的中部和螺旋狀的底部；在它半開式的底部，β折疊股8、β折疊股9和位于β折疊股1和β折疊股2、β折疊股3和β折疊股4之間的發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)成的殘基形成了一個相對疏水的底物結(jié)合口袋；位于β折疊股1和β折疊股2、β折疊股3和β折疊股4之間的發(fā)夾結(jié)構(gòu)在底物結(jié)合口袋的前面擔(dān)當(dāng)了兩扇門板的作用，我們在此將其命名為門板1和門板2；位于第25位的色氨酸擔(dān)當(dāng)了門鎖的功能；在底物結(jié)合口袋關(guān)閉的狀態(tài)下，門板1和門板2朝向β折疊股9移動約
將口袋關(guān)閉并且將底物與接觸反應(yīng)的中心隔開；在底物結(jié)合口袋開啟的狀態(tài)下，門板1門板2移開將口袋從關(guān)閉的形式變?yōu)殚_放的形式；在開放的狀態(tài)下，底物結(jié)合中心形成一個
的口袋，有利于底物進入活性中心。
全文摘要
本發(fā)明涉及阿魏酸脫羧酶的表達(dá)、純化、結(jié)晶方法、結(jié)構(gòu)解析和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，屬于分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因克隆的方法獲得Enterobacter sp.Px6-4中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的關(guān)鍵酶阿魏酸脫羧酶的編碼區(qū)序列、并通過異源表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌(E.coli BL21)中大量表達(dá)了該酶；通過純化的方法獲得了阿魏酸脫羧酶的純品；運用懸滴結(jié)晶法得到阿魏酸脫羧酶的蛋白質(zhì)結(jié)晶，并且掌握了該酶的結(jié)構(gòu)及活性中心。本發(fā)明能獲得大量的高活性阿魏酸脫羧酶，并且通過對該酶活性中心的分析為改造工程菌以及提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量提供理論上的指導(dǎo)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/88GK101397568SQ20081023351
公開日2009年4月1日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者張克勤, 饒子和, 孟照輝, 婁智勇, 楊金奎, 雯 顧 申請人:云南大學(xué)