專利名稱：表面功能化的磷光微球、含磷光微球的試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用磷光的特性進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的
技術(shù)，更具體的涉及一種表面功能化的磷光微球、含磷光微球的試劑盒和檢測(cè)裝置及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于熒光光譜具有高探測(cè)靈敏度，目前熒光光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物檢測(cè)和成像等行業(yè)。熒光聚合物微球還可以放大信號(hào)，使檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高，從而在商業(yè)上有非常廣泛的應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)技術(shù)中所用的作為探針的熒光分子和微球具有很多局限性。比如，許多熒光探針承受著嚴(yán)重的光褪色。大多數(shù)的有機(jī)熒光探針具有較窄的斯托克頻移(Stoke shifts)，從而很難從背景中區(qū)分出熒光信號(hào)。熒光檢測(cè)試驗(yàn)往往需要昂貴的光學(xué)元件如帶通濾波器。這些限制使得傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)技術(shù)在一些需要非
常高探測(cè)靈敏度的應(yīng)用中不盡人意。近io年來，時(shí)間分辨的熒光檢測(cè)技術(shù)得到了很多的
關(guān)注，并已被證明在化學(xué)檢測(cè)和生物樣品檢測(cè)領(lǐng)域能提供高靈敏度探測(cè)，這是因?yàn)榕c傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)技術(shù)相比，時(shí)間分辨的熒光檢測(cè)技術(shù)具有更低的背景和更高的信噪比(Merio，L. ;Pattersson， K. ;Lovgren， T. Clin. Chem. 1996，42，1513-1517. Harma， H. ;Soukka T.;Lovgren， T. Clin. Chem. 2001，47，561-568). (Qin， Q. ;Peltola， 0. ;Pettersson， K. Clin.Chem. 2003,49， 1105-1113. Wang， G， ；Yuan， J. ;Mats翻to， K. ;Hu， Z. Anal. Biochem. 2001，299， 169-172. Hai， X. ;Tan， M. ;Wang， G. ;Ye， Z. ;Yuan， J. ;Mats翻to， K. Anal. Sciences,2004，2，245)。 目前只發(fā)現(xiàn)了有限種的熒光探針具有足夠長(zhǎng)的熒光壽命足以明顯區(qū)分典型背景熒光和散射光。對(duì)于構(gòu)造簡(jiǎn)單、低成本的時(shí)間分辨的熒光檢測(cè)儀器來說，長(zhǎng)熒光壽命也是一個(gè)決定性的條件。最為人熟知的適合時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)的熒光探針是銪(Eu)螯合探頭。銪螯合物和封裝有螯合物的納米微球具有高熒光輸出，大斯托克頻移(Stokeshifts)以及較長(zhǎng)的使用壽命，已成功地用于生物化驗(yàn)和醫(yī)療診斷中。(Qin， Q. ;Peltola，0. ;Pettersson， K. Clin. Chem. 2003， 49， 1105-1113. Wang， G， ；Yuan， J. ;Mats翻to， K.;Hu， Z. Anal. Biochem. 2001,299， 169-172. Hai， X. ;Tan， M. ;Wang， G. ;Ye， Z. ;Yuan， J.;Matsumoto， K.Anal. Sciences,2004， 2， 245)。 但是，現(xiàn)有的銪螯合物只能在270 370nm被激發(fā)。在這個(gè)波長(zhǎng)范圍的強(qiáng)紫外光源并不便宜，而且銪螯合物存在著嚴(yán)重的光褪色現(xiàn)象。此外，大部分的生物樣本、食物樣本及環(huán)境樣品對(duì)這個(gè)波長(zhǎng)范圍具有很強(qiáng)的吸收，會(huì)大大干擾測(cè)量。另外，大多數(shù)的生物樣品能被該范圍內(nèi)紫外線破壞。最近，一些新類型的采用束縛的配體的銪螯合物被合成出來，以增加它們的結(jié)合常數(shù)和提高熒光的輸出。盡管如此，他們?nèi)匀挥泄馔噬珕栴}，仍然需要昂貴的紫外線激發(fā)光源。銪螯合物也被封裝在聚合物微球中來增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性和進(jìn)行信號(hào)放大。銪螯合物的聚苯乙烯微球已被商業(yè)應(yīng)用。然而，他們?nèi)匀挥袊?yán)重的光褪色問題，以及需要昂貴的紫外激發(fā)光源。 相對(duì)于普遍應(yīng)用在分析化學(xué)、生物檢測(cè)、生物成像、醫(yī)學(xué)診斷、食品監(jiān)測(cè)和環(huán)境監(jiān)
4測(cè)領(lǐng)域的熒光檢測(cè)技術(shù)，雖然磷光檢測(cè)技術(shù)也具有很多優(yōu)點(diǎn)，但磷光光譜還沒有應(yīng)用在這些領(lǐng)域。例如，磷光一般有很長(zhǎng)的熒光壽命，對(duì)理想的時(shí)間分辨發(fā)光檢測(cè)來說消除背景噪聲和提高信噪比方面非常理想，可大幅度提高檢測(cè)靈敏度。有以下兩個(gè)主要原因?qū)е铝坠夤庾V的應(yīng)用不足。首先，只發(fā)現(xiàn)了有限數(shù)量的強(qiáng)磷光發(fā)射器；第二，磷光很容易被氧猝滅。氧猝滅磷光對(duì)熒光檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用來說是非常不利的，特別是定量分析來說。盡管如此，磷光還是在化學(xué)和生物檢測(cè)和分析上具有潛在的廣泛應(yīng)用。(Papkovsky，D. B. ;0'Riordan，T. ;Soini ， A. Biochem. Soc. Transactions, 2000， 28， 74-77. Hendrix， J. L. U. S. Patent5， 464， 741 (1995). Sag證，G. ;De Hass， R. ;Gi jlswi jk. R. ;Tanke， H. U. S. Patent6， 004， 530 (1999). Sun， B. ;Yi，G. ;Zhao， S. ;Chen， D. ;Zhon. ， Y. ;Cheng， J. Anal.Lett. ，2001,34， 1627-1637. Scholl， P. F. ;Bargeron， C. B. ;Phillips， T. E. ;Wong， T.;Abubaker， S. ;Groopman， J. D. ;Strickland， P. T. ;Benson， R. C. in in_VitroDiagnosticInstrumentation of Proceedings of SPIE，2000，3913，204-213.Christopoulos，T. K. ;Diamandis， E. P. Anal. Chem. 1992,64， 342-346. Phimphivong， S. ;Saavedra，S. S.Bioconjugate Chem. 1998，9，350—357. Matveeva， E. G. ;Gribkova， E. V. ;Sanborn，J.R. ;Gee，S.J. ;Hammock， B. D. ;Savitsky， A. P. Anal. Lett. 2001， 34， 2311-2320)。令人遺憾的是產(chǎn)生強(qiáng)磷光一般需要無氧的環(huán)境。 把磷光分子封裝在低氧或無氧的基體內(nèi)也許可以解決氧猝滅的問題。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含鹵聚合物可以作為非常好的一個(gè)封裝磷光分子的基體，以防止明顯的磷光猝滅。但是，還沒有可以簡(jiǎn)單地制造單分散的磷光微球的可靠、穩(wěn)定的方法。聚丙烯腈也被報(bào)道是一個(gè)封裝磷光分子的很好的選擇，可以在室溫條件下得到強(qiáng)磷光性，這是由于它的低氧滲透性.報(bào)道中它們的磷光強(qiáng)度和壽命和相應(yīng)的無氧環(huán)境的磷光分子很相似。(0'Riordan，T. C. ;Soini， A. E. ;Papkovsky， D.B.Anal.Biochem.2001，290，366-375. 0' Riordan，T.C. ;Soini，A.E. ;Soini，J.T. ;Papkovsky， D. B. Anal. Chem. 2002， 74， 5845. Po薩arev，G. V. ;Vladimirovich， D. ;Meltola， J.J. ;Soini， A. E. U. S. Patent6， 582， 930 Bl(2003).Kuerner, J. M. ;Klimant， I. ;Krause， C. ;Preu， H. ;K皿z，W. ;Wolfbeis， 0. S. BioconjugateChemistry, 2001， 12， 883-889.然而，報(bào)道中聚丙烯腈磷光微球非常小，非常容易聚集而難以制造。這些聚丙烯腈磷光微球不交聯(lián)，并經(jīng)常有穩(wěn)定性問題。聚苯乙烯的磷光微球已經(jīng)商用。然而，聚苯乙烯的磷光微球的磷光性很弱，壽命也較短，這是因?yàn)樗鄬?duì)較高的氧滲透性和溶解性。聚苯乙烯的磷光微球不適合用于高靈敏度檢測(cè)。 對(duì)時(shí)間分辨發(fā)光探測(cè)技術(shù)來說， 一種在室溫條件下具有長(zhǎng)壽命強(qiáng)磷光性，能制造成形狀和大小都單分散的，可以具有使生物和化學(xué)分子共價(jià)標(biāo)記的表面官能團(tuán)，并能在紫外線以外的區(qū)域被有效激發(fā)，以及具有化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性的磷光分子需求十分迫切。本發(fā)明因此而來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種表面功能化的磷光微球，解決了現(xiàn)有技術(shù)中磷光分子在
有氧條件下易猝滅以及需要紫外線有效激發(fā)等問題。 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是 —種表面功能化的磷光微球，其特征在于所述微球包括以下組成
聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙烯酸甲酯單體至少占所述磷光微球的總重量的50% ; 磷光分子，所述磷光分子在無氧或低氧環(huán)境下產(chǎn)生磷光，且均勻分布在所述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中； 所述微球表面具有一種或一種以上的官能團(tuán)，所述官能團(tuán)直接與配體或生物學(xué)大分子反應(yīng)形成微球表面的共價(jià)鍵連接，所述表面官能團(tuán)也可以激活后與配體或生物學(xué)大分子進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記。 優(yōu)選的，所述磷光微球的粒徑在40納米到10微米之間。更優(yōu)選的，所述磷光微球?yàn)榍蛐巍?本發(fā)明技術(shù)方案中所述的封裝是指將磷光性微球非常均勻地嵌入在基體中。PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)的聚合物和共聚物可指甲基丙烯酸甲酯單體重量超過50 %的任意聚合物。 由于現(xiàn)有技術(shù)中還沒有理想的磷光微球可以應(yīng)用于時(shí)間分辨磷光檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明人經(jīng)長(zhǎng)期研究開發(fā)發(fā)現(xiàn)了基于P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)的磷光微球，該微球是非常理想的檢測(cè)器，可以用于時(shí)間分辨磷光檢測(cè)技術(shù)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基于P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)的磷光微球除了環(huán)境條件下的長(zhǎng)壽命的強(qiáng)磷光性，還可以很容易地被制造，且具有制備穩(wěn)定性和良好的單分散性。此外，基于P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)的磷光微球可以很容易用各種官能團(tuán)和生物物種對(duì)微球的表面進(jìn)行改性，使微球在時(shí)間分辨磷光檢測(cè)技術(shù)中成為高靈敏度分析檢測(cè)和定量測(cè)試中的理想標(biāo)記。 本發(fā)明涉及的表面功能化磷光微球中，磷光分子被封裝入主要是PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物或P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)共聚物的聚合物基體中。PMMA的聚合物和共聚物作為一個(gè)封裝基體。微球中的PMMA(甲基丙烯酸甲酯)單體重量占微球總重量的比例從50%至99%。磷光分子被充分均勻地置入微球基體的中心，磷光分子的成分占總體的比例為10%或更低。這里的總體是指兩個(gè)或多個(gè)直接物理連接的磷光分子形成的簇。
優(yōu)選的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物具有式(2)的結(jié)構(gòu)通式
其中，m， > 50。 優(yōu)選的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物具有式(2)的結(jié)構(gòu)通式
優(yōu)選的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的共聚物具有式(1)的結(jié)構(gòu)通式
AnBm(l); 其中n，m大于50，A為甲基丙烯酸甲酯單體，B選自與甲基丙烯酸甲酯單體連接且 不包括甲基丙烯酸甲酯單體本身的任何單體。 除了PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和/或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)共聚 物，微球可能還包含50%或更少的其他類的基體成分。 一些基體成分也可以采用丙烯酸和 甲基丙烯酸的聚合物和共聚物；而另一些基體成分可以采用包括具有以下單體的聚合物和 共聚物氟乙烯，氯乙烯，溴乙烯和乙烯碘化，苯乙烯和丙烯酸。
優(yōu)選的，所述磷光微球?yàn)楹薩殼結(jié)構(gòu)的微球。 正于發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的，該磷光微球也可能有核殼結(jié)構(gòu)。核_殼的化學(xué)成分可能相 同或不同。核可以只裝入磷光分子，殼里面嵌有熒光分子，反之亦然。 一種具體的實(shí)現(xiàn)為 一個(gè)核主要包含封裝有磷光分子的P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和共聚物，外殼由聚 苯乙烯構(gòu)成。另一種實(shí)現(xiàn)為核主要包含封裝有熒光分子的聚苯乙烯，殼主要包含封裝有磷 光分子的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和共聚物。核和殼的相對(duì)質(zhì)量可以改變。
優(yōu)選的方案是所述磷光微球的核心包括封裝有磷光分子的聚甲基丙烯酸甲酯聚 合物。 優(yōu)選的，所述磷光微球的外殼包括封裝有熒光分子的聚苯乙烯聚合物。
該微球至少包含一種能夠在低氧氣濃度的條件下產(chǎn)生長(zhǎng)壽命強(qiáng)磷光的磷光分子。 在某些情況下，兩種或多種類型的磷光分子被封裝入一個(gè)微球基體中。磷光分子在整個(gè)包 含PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)的基體微球中非常均勻地分布，通常，磷光微球包含占總重量 的0. 05% 10%的磷光分子。優(yōu)選的，磷光分子占總微球的重量的0. 2% 5%。
可用于封裝的磷光分子可以有不同的結(jié)構(gòu)。它們可以是有機(jī)化合物、有機(jī)/無機(jī) 混合材料，以及具有有機(jī)配體的金屬螯合物。適合封裝的磷光分子包括、但不局限于與各種 配體絡(luò)合的鉑，鈀，釕，鋨，銥，銦，鉬，锝，銅，鐵，鉻，鎢，鋅，錸絡(luò)合物。與這些金屬絡(luò)合的配 體包括卟啉及其衍生物，卟吩及其衍生物，多吡啶及其衍生物，吡啶，吡嗪，異煙酰胺，咪唑， 雙聯(lián)吡啶，三聯(lián)吡啶，鄰菲羅啉和雙吡啶吩嗪。 合適的配體可用烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛 基、羧胺基、氰基、氨基、羥基、亞氨基、醇羰基、氨羰基、脒、胍、酰脲、含官能團(tuán)的硫基、含官 能團(tuán)磷基和N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯基取代。卟啉及卟吩金屬絡(luò)合物具有耦合成亞甲基 橋的吡咯基，從而形成具有金屬螯合內(nèi)部空穴的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。許多這樣的分子在室溫情況下、 在適當(dāng)?shù)娜軇?例如水)中和無氧的環(huán)境中能表現(xiàn)出強(qiáng)烈的磷光特性。 一些能夠表現(xiàn)出磷光特性的嚇啉絡(luò)合物包括但不限于鉬(II)糞卟啉I和ni、鈀(II)糞口卜啉、釕糞嚇啉、鋅 (II)糞卟啉I及其衍生物等等。同樣，一些能夠表現(xiàn)出磷光特性的卟吩絡(luò)合物包括但不限 于鉬(ID四-氟苯基卟吩，和鈀(ID四-氟苯基卟吩。 如上所述，雙吡啶金屬絡(luò)合物也可以用于本發(fā)明。 一些合適的雙吡啶絡(luò)合物的例 子包括但不局限于雙[(4，4'-甲酯基)-2，2'雙吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2' _雙吡啶_4 基)丙基]-l，3-釕(II);雙(2，2'雙吡啶)[4-(丁醛)-4' _甲基_2，2' _雙吡啶]釕
(II);雙(2，2'雙吡啶)[4-(4'-甲基-2，2' -雙吡啶4' _基)丁酸]釕(II);三(2， 2'雙妣啶)釕(II) ;(2，2'雙吡啶)[雙二 (1，2-二苯基膦基)乙烯]2-[3-(4-甲基-2， 2' _雙吡啶4' _基)丙基]l，3-二氧戊環(huán)鋨(II);雙(2，2' _雙吡啶)[4_(4'-甲 基-2，2'-吡啶)丁基]釕(II);雙(2，2'雙吡啶)[l-溴-4(4'-甲基_2，2'-雙卩比 啶-4-基)丁烷]釕(II)，雙(2，2'-雙吡啶)馬來酰亞胺基己酸，4-甲基-2，2'-雙吡 啶4' -丁酰胺釕(II)等等。 優(yōu)選的，所述的磷光分子包括有機(jī)磷光分子和有機(jī)/無機(jī)混合材料、磷光金屬螯 合物。 優(yōu)選的，所述的磷光分子選自與配體螯合的鉑，鈀，釕，鋨，銥，銦，鉬，锝，銅，鐵， 鉻，鎢，鋅，錸螯合物；所述配體選自卟啉及其衍生物，嚇吩及其衍生物，多吡啶及其衍生物， 吡啶，吡嗪，異煙酰胺，咪唑，雙聯(lián)吡P定，三聯(lián)吡P定，鄰菲羅啉和雙吡啶吩嗪；所述配體可為以 下有機(jī)基團(tuán)任選取代烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛基、 羧胺基、氰基、氨基、羥基、亞氨基、醇羰基、氨羰基、脒、胍、酰脲、含官能團(tuán)的硫基、含官能團(tuán) 磷基和N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯基。 優(yōu)選的，所述的磷光分子選自雙[(4，4'-甲氧基)_2，2'聯(lián)吡啶]2-[3_(4_甲 基-2，2'-聯(lián)吡啶_4基)丙烷基]-l，3-二氧戊環(huán)釕(ID、雙(2，2'聯(lián)吡啶)[4-(丁 醛)-4'-甲基-2，2'-雙吡啶]釕(ID、雙(2，2'聯(lián)吡啶)[4-(4'-甲基_2，2'-聯(lián) 吡啶4'-基)丁酸]釕(ID、三(2，2'聯(lián)吡啶)釕(ID、(2，2'聯(lián)吡啶)[雙二 (1，2-二 苯基膦基)乙烯]2-[3-(4-甲基-2，2' _聯(lián)吡啶4' _基)丙基]-l，3-二氧戊環(huán)鋨(11)、 雙(2，2'聯(lián)吡啶)[4-(4'-甲基-2，2'-吡啶)丁基]釕(ID、雙(2，2'-聯(lián)吡啶) [l-溴-4(4'-甲基-2，2'-聯(lián)妣啶_4-基)丁烷]釕(ID、雙(2，2'-雙妣啶)馬來 酰亞胺基己酸，4-甲基-2，2' _聯(lián)吡啶4' -丁酰胺釕(n)、鉬(二)四-氟苯基卟吩，鈀 (II)四-氟苯基卟吩。 優(yōu)選的，所述的磷光分子占所述磷光微球總重量的0. 05% 5%。更優(yōu)選的，所述 磷光分子占所述磷光微球總重量的0. 2% 5%。 對(duì)于兩種或兩種以上的磷光分子在同一微球中的情況，這兩種磷光分子要不會(huì)相 互影響。這兩種磷光分子各自獨(dú)立地發(fā)射出磷光。他們可以由相同波長(zhǎng)或不同波長(zhǎng)的光子 激發(fā)。他們可能會(huì)放出相同波長(zhǎng)或不同波長(zhǎng)的光子。它們放射磷光的時(shí)長(zhǎng)可能相同或明顯 不同。在許多情況下，優(yōu)選采用放射磷光的壽命和發(fā)射波長(zhǎng)有很大不同的情況，從而使它們 的磷光放射性可以通過不同的波長(zhǎng)和/或壽命來區(qū)分出來。例如，光學(xué)過濾器可用于分離 不同波長(zhǎng)的光放射。時(shí)間閘技術(shù)也可用于分離不同壽命的光放射。在某些情況下，光學(xué)過 濾器和時(shí)間閘技術(shù)可以同時(shí)使用，以實(shí)現(xiàn)不同波長(zhǎng)和壽命的光放射分離。
優(yōu)選的，所述的表面官能團(tuán)選自一種或一種以上的以下基團(tuán)羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基，環(huán)氧基，異氰酸酯基，三聚氰胺基，金屬醇鹽，水解類甲硅烷基， P-酮酸酯基和聚乙二醇基。 該微球的表面官能團(tuán)，可直接與配體或生物高分子反應(yīng)，使這些配體或生物高分 子附著在微球的表面形成共價(jià)連接，或者被激活后和這些分子共價(jià)標(biāo)記。表面官能團(tuán)優(yōu)選 采用選自由羧酸基、乙醇胺基、羥基，胺基，氨基，亞胺基及其它們的組合物組成的親水性基 團(tuán)。 此外，微球可以有一個(gè)以上的表面官能團(tuán)。這些基團(tuán)包括，但不限于硫酸鹽，磷酸 鹽，羥(基)氫氧基，羧基，酯，酰胺，脒，胺，巰基和乙醛。這些表面基團(tuán)在修飾該微球的物 理性質(zhì)方面很重要。 優(yōu)選的，所述的磷光微球還包括一種或一種以上的交聯(lián)兩個(gè)或兩個(gè)以上的聚甲基
丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體的交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑可使聚合物微球性能穩(wěn)定。 優(yōu)選的，所述的交聯(lián)劑選自雙功能交聯(lián)丙烯酸單體、多功能交聯(lián)丙烯酸單體和雙
反應(yīng)丙烯酸單體。 優(yōu)選的，所述的雙功能交聯(lián)丙烯酸單體選自乙烯基乙二醇二甲基丙烯酸脂和1， io-癸烷二甲基丙烯酸脂。 優(yōu)選的，所述的多功能交聯(lián)丙烯酸單體選自季戊四醇三丙烯酸酯和三甲基色氨酸 丙烷三丙烯酸酯。 優(yōu)選的，所述的雙反應(yīng)丙烯酸單體選自2-氨乙基甲基丙烯酸鹽氫氯化物和2_氰 乙基丙烯酸鹽。 優(yōu)選的，所述的交聯(lián)劑占磷光微球總質(zhì)量的0. 5% 25%。 雖然非交聯(lián)的P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)磷光微球已足夠適用于一些應(yīng)用。但在 某些應(yīng)用中，使用更穩(wěn)定的交聯(lián)P匿A (聚甲基丙烯酸甲酯)磷光微球是更優(yōu)的選擇。在本發(fā) 明中，磷光微球可進(jìn)一步地包含至少一種可以交叉結(jié)合兩個(gè)或更多PMMA聚合物的交聯(lián)劑， 從而使這些微球可以更穩(wěn)定，即使在相對(duì)惡劣的條件下，如高溫、存在有機(jī)溶劑和表面活性 劑的情況下也難以降解。這種交聯(lián)劑通常占微球總重量的0. 5% 25%。
目前存在許多可以用于交聯(lián)PMMA聚合物、共聚物或微球其他組分的交聯(lián)劑， PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和共聚物可通過聚合物部分和部分之間的連接實(shí)現(xiàn)直接 交聯(lián)，或者通過其他單獨(dú)的橋接或交聯(lián)材料來實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。例如，包含但不限于由比如順丁 烯二酸酐、順丁烯二酸、反丁烯二酸和甲叉丁二酸等不飽和二酸制成的不飽和聚合物；或是 如聚乙二醇_ 二 (烯丙基碳酸鹽)、聚酰亞胺、聚馬來酰亞胺的不飽和聚合物；或是有兩個(gè) 完全相同的反應(yīng)終點(diǎn)的同源雙功能交聯(lián)劑，比如雙(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸鹽、雙琥珀酰 亞胺基酒石酸鹽和雙磺基琥珀酰亞胺酒石酸鹽；或是有兩個(gè)不同的反應(yīng)終點(diǎn)的異源雙功能 交聯(lián)劑，比如m-順丁烯酰胺苯甲酸-N-羥基丁二酰亞胺酯，[N-(E-馬來酰亞胺己酸)_琥 珀酰亞胺]，以及馬來酰亞胺順丁烯二酰亞胺PEG酰肼聚合物，或是能夠交叉連接包含鹵素 的聚合物的小分子，其他的連接單元可以包含乙醇胺基、羥基、胺基、氨基、亞胺基、或聚乙 二醇基。另一種交聯(lián)方法是，通過利用兩個(gè)或多個(gè)PMMA共聚物，其中一個(gè)作為主封裝基體， 另一個(gè)或其他的作為交叉連接用聚合物，這樣的結(jié)構(gòu)同樣能產(chǎn)生非常穩(wěn)定的微球。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還有一種交聯(lián)方法，由包含嵌段共聚物和一個(gè)或更多交聯(lián)的小 分子的一個(gè)或多個(gè)PMMA(甲基丙烯酸甲酯嵌段)共聚物組成的聚合物系統(tǒng)，嵌段共聚物可嵌段中選擇。嵌段和嵌段之間的排列可以是頭對(duì)尾、頭對(duì)頭、尾對(duì)尾尾端基團(tuán)連接。其中至少有一個(gè)共聚物要有能提供生物制劑結(jié)合的親水基聚合物。例如，包括但不限于甲基異丁烯酸鹽[酯]單體和順丁烯二酸酐單體組成的共聚物，或是順丁烯二乙酯單體和反丁烯二乙酯單體組成的共聚物。
另一種交聯(lián)微球的方法是通過磷光材料的交聯(lián)形成(比如共價(jià)耦合的方式)，這種磷光材料可以用含有鹵原子的聚合物封裝起來。另一種方法是使用含有鹵原子的磷光材料和一個(gè)單獨(dú)的交聯(lián)材料。例如采用包括但不限于獨(dú)立使用的主要是基于基礎(chǔ)胺反應(yīng)的交聯(lián)劑，如酰亞胺酯和N-羥基_琥珀酰亞胺酯，基于巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑如馬來酰亞胺(順丁烯二酰亞胺)，鹵代乙?；衔锖瓦拎せ蚧?；羰基反應(yīng)交聯(lián)劑如等酰肼，碳化二亞胺，以及光反應(yīng)交聯(lián)劑如P-疊氮苯甲酰肼，4-&-疊氮水楊酰胺)丁胺和N-羥基琥珀酰亞胺-4-疊氮水楊酸。最后，可以使用一種交聯(lián)的、含有鹵原子的磷光材料。微球的交聯(lián)可以采用本領(lǐng)域熟知的方法來實(shí)現(xiàn)，比如通過熱、光引發(fā)和自由基交聯(lián)。 優(yōu)選的，所述磷光微球還包括一種或一種以上的通過所述官能團(tuán)共價(jià)連接而覆蓋在所述微球表面的生物活性物種。 優(yōu)選的，所述的生物活性物種選自抗體、抗原、半抗原、核酸、配體、受體、人工多
肽、蛋白質(zhì)和多糖，所述生物活性物種能參與特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)。 優(yōu)選的，所述的生物活性物種選自酶反應(yīng)物。 本發(fā)明涉及的一種生物活性磷光微球，可以以共價(jià)鍵形式、也可以物理形式包覆在化學(xué)和生物物種表面，這些物種可以參與特異性識(shí)別反應(yīng)，包括特異性結(jié)合、核酸雜交和酶反應(yīng)。 本發(fā)明的另一 目的在于提供了一種表面功能化的磷光微球在分析檢測(cè)和成像方面的應(yīng)用。 本發(fā)明的又一目的在于提供了一種試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的磷光微球，作為分析檢測(cè)用的探針或標(biāo)記物。 本發(fā)明的又一目的在于提供了試劑盒在免疫檢測(cè)技術(shù)、核酸雜交技術(shù)和酶檢測(cè)技術(shù)方面的應(yīng)用。 本發(fā)明的又一 目的在于提供了試劑盒在濕化學(xué)領(lǐng)域方面的應(yīng)用。 本發(fā)明的又一 目的在于提供了試劑盒在干化學(xué)領(lǐng)域方面的應(yīng)用。 本發(fā)明的又一 目的在于提供了 一種檢測(cè)裝置，其特征在于所述裝置內(nèi)設(shè)置磷光微
球?yàn)樘结樆驑?biāo)記物。 本發(fā)明的又一目的在于提供了一種檢測(cè)裝置在免疫層析方面的應(yīng)用。
包含作為發(fā)射源的磷光分子的磷光微球可以在微球表面與生物活性物種進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記。生物活性物種可通過一個(gè)具有明顯親水性的間隔區(qū)域來實(shí)現(xiàn)共價(jià)標(biāo)記。這種間隔區(qū)域可以是諸如乙烯乙二醇低聚物的小分子間隔區(qū)域，也可以是諸如肽、蛋白質(zhì)、聚乙二醇、sacharrides和多糖的大分子實(shí)體。微球表面和生物活性種的結(jié)合包括氨基鍵結(jié)合，酯鍵結(jié)合，C-C鍵結(jié)合，C-N鍵結(jié)合和包含電荷相互作用的螯合。這里所指的生物活性物種包括可以參與特定的結(jié)合反應(yīng)或酶反應(yīng)的任何化學(xué)實(shí)體。生物活性物種的例子包括包含在特定的識(shí)別和結(jié)合中的分子實(shí)體，比如抗體、抗原/半抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)、多糖。生物活性物種的例子還包括參與酶反應(yīng)的化學(xué)實(shí)體，比如酶作用物。酶作用物的例子包括多肽、核酸、蛋白質(zhì)、小分子脂、糖和多糖。 目前存在著許多技術(shù)可以制作表面功能化的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的磷光微球?？梢圆捎矛F(xiàn)知的很多方法將磷光分子納入到基于P匿A(聚甲基丙烯酸甲酯)的微球中，比如甲基丙烯酸甲酯單體和包含染料的共聚用單體的共聚合，或在聚合物微球水懸浮液中添加在合適的有機(jī)溶劑中的合適的染料衍生物。例如，PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的磷光微球可以自由激發(fā)的、單一不飽和的單體的懸液通過無氧或低氧性共聚合產(chǎn)生，可能包含或可能不包含如羧基、氨基或羥(基)氫氧基的共價(jià)鍵組，和適當(dāng)數(shù)量的磷光分子占單體總重量的至少10%。磷光聚甲基丙烯酸甲酯微球也可以通過以下方法來得到往攪拌的PMMA微球的水懸浮液中逐步增加泡在合適的溶液中的磷光染料溶液。 表面功能化的磷光微球可以通過分散聚合技術(shù)產(chǎn)生。典型的，甲基丙烯酸甲酯單體、提供表面官能團(tuán)的其他如甲基丙烯酸的單體、引發(fā)劑、諸如12-羥基硬脂酸的穩(wěn)定劑、可能或者可能沒有如乙烯基的聚合體的磷光分子在一個(gè)溶劑系統(tǒng)中都是分散的。排除分散系統(tǒng)的氧氣后通過溫度升高開始聚合形成磷光微球。當(dāng)然，分散系統(tǒng)也可以包含可導(dǎo)致的交叉連接的表面功能化磷光微球的交聯(lián)劑。具體制造微球的分散聚合過程可能會(huì)有所不同，這取決于所需要的微球的大小、該磷光分子的溶解性。 表面功能化PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)磷光微球也可由眾所周知的乳液聚合來產(chǎn)生。典型的包括，形成含有丙烯酸甲酯單體、其他如提供表面官能團(tuán)的甲基丙烯酸的單體，可能包含或可能不包含聚合體的磷光分子、如P-苯乙烯酯的乳化穩(wěn)定劑，如過硫酸鉀水溶液之類的引發(fā)劑的乳液。如果想得到交聯(lián)微球，乳化系統(tǒng)也可以包含如乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯的交聯(lián)劑。乳劑聚合反應(yīng)通過加熱進(jìn)行，得到磷光微球。 表面功能化的聚甲基丙烯酸甲酯的磷光微球也可以由將脂溶性的、但微溶于水的磷光分子封裝入預(yù)先制成的表面功能化的空聚甲基丙烯酸甲酯微球中，或通過膨脹技術(shù)使它要么不交叉連接，要么交叉連接。這種方法的一大好處是可以預(yù)先準(zhǔn)備具有預(yù)期特性的統(tǒng)一的聚合體微球，通過仔細(xì)地優(yōu)化程序，然后加入精選的磷光染料系列。此外，基于溶液的添加程序提供了很大的靈活性，可以調(diào)整染料的相對(duì)濃度，相對(duì)濃度是實(shí)現(xiàn)高效率的能量轉(zhuǎn)移時(shí)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在某些情況下，這可能是得到理想的磷光微球的首選方法。這種技術(shù)的典型步驟包括，首先通過使用一個(gè)包括水和諸如丙酮和二氯甲烷的有機(jī)溶液的溶劑系統(tǒng)，使要么不交聯(lián)要么交聯(lián)的空白表面功能化聚甲基丙烯酸甲酯的微球溶脹。溶脹系統(tǒng)可能還包含其他物種，如用以保護(hù)溶脹的PMMA微球的表面活性劑。在PMMA微球溶脹后，加入磷光分子，使分子能穿透進(jìn)入到溶脹的微球內(nèi)。去除溶脹溶劑驅(qū)動(dòng)磷光分子進(jìn)入微球內(nèi)。另一種驅(qū)動(dòng)磷光分子到微球內(nèi)的方法為在反應(yīng)體系中加入水等溶劑降低溶劑與磷光分子的親性(親脂性)。 無論封裝的磷光微球是以何種技術(shù)形成的，它們的形狀一般不同。具體的可以是，例如，微球呈球形。但是，應(yīng)了解，其他形狀也是可能的，如平板狀、棒狀、圓盤狀、條狀、管狀、和其他不規(guī)則形狀等，此外，微球的大小可能也不同。例如，微球的平均大小(比如直徑)可以從納米到0. 1納米到約100微米， 一種具體的情況是從大約0. 1納米到50微米左右，另一種具體的情況是從約1納米到大約IO微米。例如，"微米級(jí)"微球通常是人們想要得到的。當(dāng)利用時(shí)，這樣的"微米尺度"微球可能具有約1微米到1000微米的平均尺寸，在某種具體的情況時(shí)，從約1微米至100微米左右，在某種具體的情況時(shí)，從1微米到10微米。
11同樣，納米微球也可以被利用。這種"納米級(jí)"微球可能具有約0. 1納米至約10納米的平均尺寸，在某種具體的情況時(shí)，從大約0. 1納米到5納米，而且在某種具體的情況時(shí)，約1納米至5納米大小。 該生物活性物種一般都可以采用多種眾所周知的技術(shù)中的任何一種附著在表面功能化的磷光微球上。例如，可以通過使用羧基、氨基、醛、溴乙酰、碘乙酰、硫醇、環(huán)氧和其他活性或鍵合功能基、以及剩余的自由基和陽離子自由基將生物活性物種共價(jià)附著在微球上，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的耦合反應(yīng)。 一個(gè)表面官能團(tuán)也可以作為官能共聚用單體的一個(gè)組合，因?yàn)槲⑶虻谋砻婵梢园砻鏉舛认鄬?duì)較高的極性基。此外，雖然磷光微球往往合成被功能化，在某些情況下，如聚(苯硫酚)，微球可以直接共價(jià)鍵連接蛋白質(zhì)，而不需要進(jìn)一步的修改。例如，共價(jià)鍵結(jié)合生物活性物種到磷光微球上的第一步是用碳化二亞胺激活微球表面的羧基。第二步，激活的羧基與抗體的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。激活和/或抗體耦合可以發(fā)生在諸如磷酸(鹽)緩沖液(PBS)(例如，pH值7. 2)或2-(N-嗎啉)乙烷磺酸(MES)(例如，pH值5.3)的緩沖劑中。由此產(chǎn)生的微球可以與乙醇胺嵌段，例如，形成微球結(jié)合物。 由于長(zhǎng)壽命的磷光微球具有強(qiáng)磷光性，通過時(shí)間分辨磷光檢測(cè)技術(shù)，這種表面功能化磷光微球是檢測(cè)核酸(如RNA和DNA)、蛋白質(zhì)、多肽、微生物、酶、抗原、抗體、病毒、半抗原、和其他化學(xué)物質(zhì)的理想試劑。使用磷光微球的時(shí)間分辨磷光檢測(cè)技術(shù)可以匹敵同位素放射性檢測(cè)試劑的檢測(cè)靈敏度，還具有最小的毒性和高穩(wěn)定性。這個(gè)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度高于傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)，這是因?yàn)闀r(shí)間分辨磷光檢測(cè)技術(shù)具有較低的背景干擾，顯著提高信號(hào)/噪聲比，特別是非常復(fù)雜的樣品，諸如檢測(cè)生物樣本，包括組織、食物樣本、血樣和環(huán)境樣品。 該磷光微球可以作為結(jié)合試驗(yàn)中的檢測(cè)任何物種的標(biāo)記物。多種多樣的結(jié)合試驗(yàn)中使用的各種標(biāo)記物，包括放射性同位素、熒光分子、熒光微球、酶和有色微球。這些標(biāo)簽可以用本發(fā)明的磷光微球取代。采用磷光微球后可以提高許多不同類型的結(jié)合試驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度，包括核酸雜交化驗(yàn)，抗體抗原結(jié)合試驗(yàn)，抗體半抗原為基礎(chǔ)的化驗(yàn)，和糖蛋白_凝集素結(jié)合化驗(yàn)。為了提供一個(gè)檢測(cè)信號(hào)，在結(jié)合反應(yīng)中一個(gè)或多個(gè)從屬磷光微球被附著于物種上，形成微球標(biāo)記探針?；蛘咭粋€(gè)或多個(gè)結(jié)合的組分附著到一個(gè)單一的磷光微球上。附著一項(xiàng)結(jié)合組分到微球上通常通過使用特異性識(shí)別并緊密結(jié)合的成對(duì)分子來實(shí)現(xiàn)。比如，特異性結(jié)合成對(duì)的部分(如抗生物素蛋白和生物素，或地高辛和抗地高辛抗體)。其中的一個(gè)組分要么直接耦合或者通過連接分子耦合到另一個(gè)結(jié)合組分上。微球標(biāo)記的探針可以用于很寬范圍的結(jié)合檢驗(yàn)試驗(yàn)中，包括夾心法檢測(cè)和競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。 —個(gè)典型的用微球標(biāo)記探針的夾心結(jié)合實(shí)驗(yàn)包括(1)固定一個(gè)結(jié)合的部分(例如，一個(gè)抗體或一個(gè)核酸低聚物)特別是為了在固體基質(zhì)上的感興趣的分析物(如抗原或基因組DNA或RNA)的情況。(2)孵化一個(gè)含有分析物的樣本，以便與固定的部分結(jié)合。(3)去除留下來的樣本的非結(jié)合的其他組成部分；(4)孵化微球標(biāo)記探針，使在微球上的一個(gè)結(jié)合部分(例如，抗體識(shí)別抗原的一個(gè)不同的抗原決定基，或其他核酸低聚物補(bǔ)充與分析物的DNA或RNA不同的序列)與分析物結(jié)合；(5)去除沒有結(jié)合的微球標(biāo)記探針；(6)用脈沖激發(fā)光測(cè)量從結(jié)合微球標(biāo)記探針中發(fā)出的時(shí)間分辨的磷光信號(hào)；(7)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而得到分析無的濃度和數(shù)量的信息。當(dāng)然，其他類型的夾心結(jié)合實(shí)驗(yàn)形式和程序也適用
12于使用微球標(biāo)記探針。 微球標(biāo)記探針也可以用于取代通常用于熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的熒光探針，例如競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)。與用熒光探針測(cè)量熒光信號(hào)不同，從捕獲的微球標(biāo)記探針中測(cè)量得到時(shí)間分辨的磷光，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，獲得樣本中分析物的數(shù)量。 除了應(yīng)用于溶液的結(jié)合化驗(yàn)，微球標(biāo)記探針也可用于干化學(xué)的結(jié)合化驗(yàn)。例如，微球標(biāo)記的探針可以在基于膜的橫向流動(dòng)免疫測(cè)定中取代有色微球聯(lián)合(如金微球或乳膠微球)。微球標(biāo)記的探針也可以在得到分析物量化情況的基于膜的橫向流動(dòng)免疫測(cè)定中取代熒光微球聯(lián)合。勝于在側(cè)流試驗(yàn)裝置的檢測(cè)線上測(cè)量被捕獲的有色微球或被捕獲的熒光微球的熒光的吸收率或是反射率，時(shí)間分辨熒光用于被捕獲的磷光微球探針的測(cè)量。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 圖1為在室溫條件下，懸浮在水中的PMMA鉑微球的時(shí)間分辨激發(fā)和發(fā)射光譜；其中發(fā)射光譜采集于在390nm波長(zhǎng)的光下進(jìn)行激發(fā)的微球，激發(fā)光譜采集650nm波長(zhǎng)下的磷光，延遲時(shí)間為IO微秒。 圖2為在室溫條件下，懸浮在水中的PMMA的鉑微球的磷光衰減曲線；其中脈沖激發(fā)在390nm波長(zhǎng)，在650nm波長(zhǎng)處磷光采集。
圖3為掃描電鏡下的PMMA鉑微球。
圖4為掃描電鏡下的PMMA鈀微球 圖5為對(duì)照A公司的商用銪微球的PMMA Pt微球和PMMA Pd微球兩種情況的光褪色時(shí)間曲線；其中3種微球在水溶液中的微球濃度都相同，銪微球被在375nm被激發(fā)，而兩種磷光微球被在390nm被激發(fā)，收集銪微球在615nm的發(fā)射強(qiáng)度、PMMA Pt微球在650nm的發(fā)射強(qiáng)度，以及PMMA Pd微球在670nm的發(fā)射強(qiáng)度并做歸一化處理，然后繪制成時(shí)間曲線。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明
本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做
進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。 實(shí)施例表面功能化磷光微球的制備 1、磷光微球的制備(聚甲基丙烯酸甲酯鉑微球) 取Polysciences公司的2毫升聚甲基丙烯酸甲酯微球(2. 7%，0. 324um)用水離心過濾清洗一次，懸浮在2ml的milli-Q超純水后進(jìn)行超聲處理。加入含15mg聚乙烯醇的0. 5毫升水，攪拌2分鐘。然后，加入含8毫克十二烷基硫磺酸鈉的0. 5毫升水，攪拌2分鐘混勻。再加入5毫升乙醇，攪拌5分鐘。在含O. 5mg鉑(II)四-氟苯基卟吩的380ul二氯甲烷中，通過注射器慢慢加入前述的混合物中(至少5分鐘)，進(jìn)一步攪拌5分鐘。然后通過一個(gè)注射器以0. lml/分鐘的速率加入10毫升水。然后用氣流去除一些溶劑，最后定容得到15毫升。離心分離去除懸浮的微球。然后用離心過濾法用90%的乙醇洗滌微球3次后懸浮在20ml的水中。 2、磷光微球的制備(聚甲基丙烯酸甲酯鈀微球)
取Polysciences公司的2毫升聚甲基丙烯酸甲酯微球(2. 7%，0. 324um)用水離心過濾清洗一次，懸浮在2ml的milli-Q超純水后進(jìn)行超聲處理。加入含15mg聚乙烯醇的0. 5毫升水，并攪拌2分鐘。然后加入含8毫克的十二烷基硫磺酸鈉的0. 5毫升水，并混合2分鐘。接著加入5毫升乙醇，并攪拌5分鐘。在含0. 5mg鉑(II)四_氟苯基卟吩的380ul二氯甲烷中慢慢加入前述的混合物中(通過注射器注射至少5分鐘)，繼續(xù)攪拌5分鐘。然后通過一個(gè)注射器泵以0. 1ml/分鐘的速率加入10毫升水。然后用氣流去除一些溶劑，最后定容得到15毫升。離心分離去除懸浮的微球。然后離心過濾后用90%的乙醇清洗濾出的微球3次，懸浮在20ml的水中。
3、時(shí)間分辨磷光和激發(fā)情況的測(cè)量 從步驟1中取出的50微升的聚甲基丙烯酸甲酯鉑微球，懸浮在600微升的水中，它們的時(shí)間分辨激發(fā)和磷光光譜和磷光衰減情況用以下的條件進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于時(shí)間分辨的磷光光譜，樣本在390nm被激發(fā)。時(shí)間延遲為0. Olms，樣本窗口是微秒，每次閃光時(shí)間為50微秒。對(duì)于激發(fā)光譜，光的發(fā)射在650nm被收集。時(shí)間延遲為0. Olms，樣本窗口是微秒，每次閃光時(shí)間為50微秒。對(duì)于磷光衰退的情況，樣本在390nm被激發(fā)，磷光在650nm被檢測(cè)。初始延時(shí)在0. Olms，樣品窗為80ms，每次閃光時(shí)間為50微秒。結(jié)果如圖1 5。
上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精
神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種表面功能化的磷光微球，其特征在于所述微球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙烯酸甲酯單體至少占所述磷光微球的總重量的50％；磷光分子，所述磷光分子在無氧或低氧環(huán)境下產(chǎn)生磷光，且均勻分布在所述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團(tuán)，所述官能團(tuán)直接與配體或生物學(xué)大分子反應(yīng)形成微球表面的共價(jià)鍵連接，所述表面官能團(tuán)也可以激活后與配體或生物學(xué)大分子進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記；所述磷光微球的粒徑在40納米到10微米之間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述聚甲基丙烯酸甲酯的共聚物具有式(1)的結(jié)構(gòu)通式AnBm(l);其中n，m大于50，A為甲基丙烯酸甲酯單體，B選自與甲基丙烯酸甲酯單體連接且不包括甲基丙烯酸甲酯單體本身的任何單體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述磷光微球?yàn)楹薩殼結(jié)構(gòu)的微球；所述磷光微球的核心包括封裝有磷光分子的聚甲基丙烯酸甲酯聚合物或共聚物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述磷光微球的外殼包括封裝有熒光分子的聚苯乙烯聚合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的磷光分子包括有機(jī)磷光分子和有機(jī)/無機(jī)混合材料、磷光金屬螯合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的磷光分子選自與配體螯合的鉑，鈀，釕，鋨，銥，銦，鉬，锝，銅，鐵，鉻，鎢，鋅，錸螯合物；所述配體選自卟啉及其衍生物，嚇吩及其衍生物，多吡啶及其衍生物，吡啶，吡嗪，異煙酰胺，咪唑，雙聯(lián)吡啶，三聯(lián)吡啶，鄰菲羅啉和雙吡啶吩嗪；所述配體可為以下有機(jī)基團(tuán)任選取代烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛基、羧胺基、氰基、氨基、羥基、亞氨基、醇羰基、氨羰基、脒、胍、酰脲、含官能團(tuán)的硫基、含官能團(tuán)磷基和N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的磷光分子選自雙[(4，4'-甲氧基)-2，2'聯(lián)吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2' _聯(lián)吡啶_4基)丙烷基]-1， 3-二氧戊環(huán)釕(ID、雙(2，2'聯(lián)吡啶)[4-(丁醛)-4'-甲基-2，2'-雙吡啶]釕(ID、雙(2，2'聯(lián)吡啶)[4-(4'-甲基-2，2' _聯(lián)吡啶4'-基)丁酸]釕(ID、三(2，2'聯(lián)吡啶)釕(II)、(2，2'聯(lián)妣啶)[雙二 (1，2-二苯基膦基)乙烯]2-[3-(4-甲基-2，2'-聯(lián)妣啶4' _基)丙基]-l，3-二氧戊環(huán)鋨(ID、雙(2，2'聯(lián)吡啶)[4-(4'-甲基-2，2'-吡啶)丁基]釕(ID、雙(2，2'-聯(lián)吡啶)[1-溴_4(4'-甲基-2，2'-聯(lián)吡啶_4-基)丁烷]釕(II)、雙(2，2'-雙吡啶)馬來酰亞胺基己酸，4-甲基-2，2' _聯(lián)吡啶4' -丁酰胺釕(II)、鉬(二)四-氟苯基卟吩，鈀(II)四-氟苯基卟吩。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的磷光分子占所述磷光微球總重量的0. 05% 5%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的表面官能團(tuán)選自一種或一種以上的以下基團(tuán)羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基，環(huán)氧基，異氰酸酯基，三聚氰胺基，金屬醇鹽，水解類甲硅烷基，P _酮酸酯基和聚乙二醇基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的磷光微球還包括一種或一種以上的交聯(lián)兩個(gè)或兩個(gè)以上的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體的交聯(lián)劑；所述的交聯(lián)劑占磷光微球總質(zhì)量的0. 5% 25%。
11. 根據(jù)權(quán)利要求io所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的交聯(lián)劑選自雙功能交聯(lián)丙烯酸單體、多功能交聯(lián)丙烯酸單體和雙反應(yīng)丙烯酸單體；所述的雙功能交聯(lián)丙烯酸單體選自乙烯基乙二醇二甲基丙烯酸脂和1，10-癸烷二甲基丙烯酸脂；所述的多功能交聯(lián)丙烯酸單體選自季戊四醇三丙烯酸酯和三甲基色氨酸丙烷三丙烯酸酯；所述的雙反應(yīng)丙烯酸單體選自2-氨乙基甲基丙烯酸鹽氫氯化物和2-氰乙基丙烯酸鹽。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述磷光微球還包括一種或一種以上的通過所述官能團(tuán)共價(jià)連接而覆蓋在所述微球表面的生物活性物種。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的生物活性物種選自抗體、抗原、半抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質(zhì)和多糖，所述生物活性物種能參與特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的表面功能化的磷光微球，其特征在于所述的生物活性物種選自酶反應(yīng)物。
15. —種權(quán)利要求1所述的表面功能化的磷光微球在分析檢測(cè)和成像方面的應(yīng)用。
16. —種試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的磷光微球，作為分析檢測(cè)用的探針或標(biāo)記物。
17. —種權(quán)利要求16的試劑盒在免疫檢測(cè)技術(shù)、核酸雜交技術(shù)和酶檢測(cè)技術(shù)方面的應(yīng)用。
18. —種權(quán)利要求16的試劑盒在濕化學(xué)或干化學(xué)領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表面功能化的磷光微球，其特征在于所述微球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙烯酸甲酯單體至少占所述磷光微球的總重量的50％；磷光分子，所述磷光分子在無氧或低氧環(huán)境下產(chǎn)生磷光，且均勻分布在所述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團(tuán)，所述官能團(tuán)直接與配體或生物學(xué)大分子反應(yīng)形成微球表面的共價(jià)鍵連接，所述表面官能團(tuán)也可以激活后與配體或生物學(xué)大分子進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記；所述磷光微球的粒徑在40納米到10微米之間。這些磷光微粒有效地抑制在外界環(huán)境下三重態(tài)氧與受激發(fā)的三重態(tài)磷光分子之間的直接相互作用，從而具有強(qiáng)磷光性，甚至在室溫條件下，這些微球也能保持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的磷光性，可以應(yīng)用于醫(yī)療診斷、生物檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全監(jiān)測(cè)以及不同物種檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101787276SQ20101011620
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者何愛民 申請(qǐng)人:光景生物科技(蘇州)有限公司