專利名稱：鑒別自然感染和人工免疫口蹄疫病毒的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種可被用于鑒別口蹄疫病毒自然感染和接種疫苗動(dòng)物重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，也涉及一種鑒別口蹄疫病毒自然感染和接種疫苗動(dòng)物的ELISA方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一種由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth DiseaseVirus, FMDV)引起的人及偶蹄動(dòng)物共患的的急性、烈性傳染病。本病傳播途徑多， 傳染性強(qiáng)，危害程度嚴(yán)重。國(guó)際獸疫局(Office International Des Epizooties, ΟΙΕ)將其列為A類傳染病。FMD是一種世界性的傳染病，先后在歐洲、拉丁美洲、非洲及亞洲等六十多個(gè)國(guó)家流行。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，病毒顆粒直徑20nm 30nm。FMDV有A、0、 C.Asia I,SAT I,SAT II、SATIII七種血清型，而每一血清型又分為多種亞型。不同血清型的病毒結(jié)構(gòu)蛋白誘生的中和抗體對(duì)另一血清型病毒沒有交叉保護(hù)反應(yīng)。FMDV的基因組是單鏈正股RNA。在FMDV基因的指導(dǎo)下，可產(chǎn)生12種病毒蛋白。這些病毒蛋白可被分為結(jié)構(gòu)蛋白(structuralproteins, SP)禾口豐勾胃白(nonstructural proteins, NSP) 。g豐勾胃白* VP1，VP2，VP3和VP4。非結(jié)構(gòu)蛋白有L，2A，2B, 2C，3A，3B, 3C和3D。在生成非結(jié)構(gòu)蛋白的過程中，3A，;3B，3C 或 3A，;3B 可結(jié)合成 3ABC 或 3AB 蛋白[Grubman MJ，et al. Biochemical map ofpolypeptides specified by foot-and-mouth disease virus. J. Virol 1984 ；50 (2) 579-86]。非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列高度保守，誘生的非中和性抗體，沒有型特異性[Saiz Μ, NunezJI, et al.Foot-and-mouth disease virus :biology and prospects for disease control. Microbes Infect. 2002,4(11) :1183-92]。發(fā)達(dá)國(guó)家控制FMD的主要策略是大面積的捕殺感染和疑似感染的動(dòng)物，而在發(fā)展中國(guó)家控制FMD的主要策略是大面積注射常規(guī)疫苗。目前接種疫苗只能保護(hù)免疫動(dòng)物不發(fā)病，但不能阻止隱性感染。在疫區(qū)接種疫苗的動(dòng)物群中，有一定數(shù)量的動(dòng)物因?yàn)殡[性感染而成為病毒攜帶者，這些動(dòng)物有可能短期排毒，形成持續(xù)性感染，而病毒可在牛、羊體內(nèi)長(zhǎng)期存在。因此，隱性感染動(dòng)物不但可能引發(fā)新的疫情，還為病毒變異，產(chǎn)生新毒株提供了環(huán)境。自然感染口蹄疫病毒和接種疫苗動(dòng)物的鑒別也是OIE判斷一個(gè)國(guó)家或地區(qū)有無(wú)疫情的依據(jù)[Officelnternational des Epizooties, World Organization for Animal Health,2000. Foot and mouth disease. In :0IE Standards Commission(Ed. ), Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines,fourth ed. Office International des Epizooties, Paris, France, 1-27 (Chapter 2. 1.1)]。另外，隱性感染動(dòng)物對(duì)食品安全及進(jìn)出口貿(mào)易帶來巨大的隱患。接種疫苗和自然感染的動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生口蹄疫病毒特異性抗體， 如何區(qū)分自然感染口蹄疫病毒的動(dòng)物和接種疫苗的動(dòng)物一直是控制和消滅FMD的重要課題。大量研究結(jié)果表明，通過檢測(cè)血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體可以區(qū)分自然感染和接種疫苗的動(dòng)物。自然感染的動(dòng)物體內(nèi)有病毒的增殖，非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒增殖過程，因此導(dǎo)致大量非結(jié)構(gòu)蛋白的產(chǎn)生。非結(jié)構(gòu)蛋白具有較高的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白特異性的抗體。而現(xiàn)有的口蹄疫疫苗主要是口蹄疫病毒滅活疫苗。在生產(chǎn)過程中，在滅活苗中的口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白應(yīng)被去除?？谔阋卟《镜幕蛑亟M疫苗主要采用口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白研制，不含任何口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的成分。因此，即使多次接種疫苗后也不會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白特異性的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
采用逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)從口蹄疫病毒分離到了一段口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因。在大腸桿菌中表達(dá)了該編碼基因產(chǎn)物，進(jìn)而分離純化到了一種口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，這種重組蛋白被命名為3aB。將純化后的3aB作為檢測(cè)抗原建立了一種ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))方法區(qū)分自然感染?？谔阋卟《竞徒臃N口蹄疫病毒滅活疫苗的動(dòng)物。用該方法檢測(cè)了來自90頭牛的血清，這些血清來自口蹄疫Asia 1型和0型病毒感染、接種雙價(jià)口蹄疫病毒滅活疫苗、接種基因工程疫苗及未感染口蹄疫病毒的牛。結(jié)果顯示，所有病毒感染動(dòng)物的血清在該檢測(cè)系統(tǒng)中均表現(xiàn)抗體陽(yáng)性，而接種口蹄疫病毒疫苗和未感染口蹄疫病毒的動(dòng)物血清均表現(xiàn)抗體陰性。說明用3aB蛋白建立的ELISA具有非常高的特異性和敏感性，以該蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法可被用于區(qū)分自然感染口蹄疫病毒和接種口蹄疫病毒的動(dòng)物。該方法具有特異性強(qiáng)和敏感性高，操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少的特點(diǎn)，適合于大量血清的篩查。該方法不僅可以用于篩查陰性動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，清除隱性感染的動(dòng)物，消滅潛在傳染源，有利于控制和消滅FMD。也可以為活牲畜進(jìn)出口檢疫提供篩查病毒感染動(dòng)物的方法，同時(shí)為肉類和奶制品安全提供保障。


圖1 重組Asia 1型口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB DNA片段瓊脂糖凝膠電泳泳道1 :2000DNA分子量標(biāo)尺泳道2 :3aB DNA片段，在432bp處有目的DNA片段。3AB編碼DNA大小為672bp， N端截短240bp后的3aB大小為432bp，與理論大小一致。圖2 :PMD18T-3aB重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳
泳道1 :pMD18T_3aB重組質(zhì)粒對(duì)照泳道2 :2000DNA分子量標(biāo)尺泳道3 :PMD18T-3aB重組質(zhì)粒酶切后釋放出432bp的DNA片段，如箭頭所示。圖3 :pET28a (+) _3aB重組質(zhì)粒酶切電泳泳道1 :2000DNA分子量標(biāo)尺泳道2 :pET28a (+) _3aB重組質(zhì)粒對(duì)照泳道3 :pET28a (+) -3aB重組質(zhì)粒酶切后酶切后釋放出432bp的DNA片段，如箭頭所示。圖4 重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB的SDS-PAGE分析及^festern blot鑒定A 重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB的SDS-PAGE分析泳道1 蛋白分子量標(biāo)尺
泳道2 未誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解物泳道3 =IPTG誘導(dǎo)池后的細(xì)菌裂解物，重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB如箭頭所示。重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB的分子量約為^KD。B =Western blot鑒定重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB泳道2 未誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解物，未被口蹄疫病毒特異性抗體識(shí)別，沒有可識(shí)別的條帶。泳道3 :IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解物，重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB被口蹄疫病毒特異性抗體識(shí)別，出現(xiàn)特異性條帶。如箭頭所示。圖5 鑒定重組蛋白3aB可溶性表達(dá)的SDS-PAGE電泳泳道1 未誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解物泳道2 =IPTG誘導(dǎo)池后的細(xì)菌裂解物，重組蛋白3aB如箭頭所示。泳道3 超聲裂解菌體后的沉淀重懸液，含少部分重組蛋白3aB。泳道4 超聲裂解菌體后的上清液，含大部分重組蛋白3aB。泳道5 蛋白分子量標(biāo)尺圖6 重組蛋白3aB純化的SDS-PAGE電泳泳道1 蛋白分子量標(biāo)尺泳道2 未經(jīng)純化的含重組蛋白3aB的細(xì)菌裂解物泳道3 經(jīng)過鎳柱后未跟介質(zhì)結(jié)合的雜蛋白溶液泳道4 從鎳柱上洗滌下來的雜蛋白溶液泳道5 從鎳柱上洗脫下來的含有重組蛋白3aB的溶液泳道6 含有重組蛋白3aB的溶液經(jīng)過除鹽柱除鹽后的溶液箭頭所示為3aB重組蛋白。圖7 :3aB-ELISA方法檢測(cè)牛血清中3aB蛋白特異性抗體橫坐標(biāo)中的天然血清為未被口蹄疫病毒感染也未人工接種疫苗的牛血清，F(xiàn)MDV感染特異性抗體陰性；FMDV感染血清為人工接種FMDV Asia 1型和0型病毒的牛血清，F(xiàn)MDV 感染特異性抗體陽(yáng)性；接種疫苗血清是人工接種雙價(jià)滅活苗和基因工程疫苗后的牛血清， FMDV感染特異性抗體陰性性?？v坐標(biāo)表示ELISA檢測(cè)中顯色反應(yīng)的OD值。橫線為區(qū)分 FMDV感染特異性抗體陽(yáng)性和陰性的臨界值。實(shí)施例1重組Asia 1型口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3aB編碼基因的獲得材料口蹄疫Asia 1型病毒(內(nèi)蒙古金宇生物集團(tuán)有限公司)；Trizol試齊U、 DEPC (TakaRa公司)；氯仿、異丙醇、乙醇、CaC12、葡萄糖、Tris, EDTA, NaOH, SDS、醋酸鉀、冰醋酸、酚、氯仿、DMSO(北京化工廠)；AMV、I nasin、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、foiase、ECOR I、 Sal I、solution IJ4 連接酶、pMD18T、pEI^8a(+) (TakaRa 公司)；氨芐青霉素(上海生工生物工程有限公司)；LB培養(yǎng)基(0X0ID LTD. ENGLAND) ；JM109禾口BL21 (DE3) (Novagen 公司)PCR 引物引物 1:5' CCATGGAATTCAGATCT AAGAGACAGCAGATGGTGA 3'引物 2 5 ‘ AAGCTTCTAGTCGACGGATCCCTCAGTGACAATCAAGTTC 3 ‘
及Oligo dT (上海生工生物工程有限公司合成)方法1. 口蹄疫病毒RNA的提取采用Trizol法從滅活的口蹄疫Asia 1型病毒中提取RNA。具體步驟如下1)取0. 4ml滅活病毒原液，加入0. 8ml無(wú)水乙醇。充分顛倒混勻，IlOOOrpm離心 15min。2)加入0. 5ml Trizol試劑，溶解沉淀，上下劇烈搖動(dòng)混勻30s，室溫孵育lOmin。3)加入0. 2ml氯仿，上下劇烈顛倒混勻15s，室溫孵育5min ；11, OOOrpm，4°C，離心 15min。4)上層水相移入另一離心管中，加入等體積異丙醇。室溫放置10min，ll，000rpm 離心15min。5)棄上清，于沉淀對(duì)面緩慢貼壁加入Iml 75%乙醇(臨用前IOmin配制)， llOOOrpm，離心 20s。棄上清，干燥 3_15min。6)用 9 μ 1 DEPC-水溶解 RNA 待用。2.逆轉(zhuǎn)錄以O(shè)ligo dT為引物，上述所得的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在0.5ml 離心管中加入 Oligo dT (100 μ M) 1 μ 1，RNA 9μ1。混勻后置 70°C 水浴 lOmin，立刻冰浴 2min.之后加入下列試劑:5XAMV buffer 4. Ομ 1，RNasin (40U) 2. O μ 1， dNTPs(10mM)2. Ομ l,AMV(5U/y 1)2. O μ 1。終體積為 20μ 1，混勻后置 42°C 水浴 60min。70°C 水浴15min，用于PCR擴(kuò)增。3. PCR 擴(kuò)增 3aB DNA 片段以步驟2得到的cDNA為模板，用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μ 1反應(yīng)體系，加入 cDNA 2μ 1, IOXPCR buffer 5 μ 1， ΝΤΡ(10μΜ)1μ 1，Mgcl2 (50 μ Μ) 3 μ 1，上游引物(10μΜ)0. 5μ 1，下游引物(10μΜ)0. 5μ 1，Taq DNA 聚合酶(5U/y 1)0. 25μ 1，超純水 37. 75 μ I0離心混勻后置PCR儀中，94°C熱啟動(dòng)5min，進(jìn)行如下循環(huán)94°C，30s ；57°C, Imin ； 72°C,2min ；25個(gè)循環(huán)后72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。4. 3aB DNA片段的純化回收先將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳(120v，15min)，當(dāng)目的片段與雜帶分開后， 用清潔刀片切下含目的片段的凝膠塊。-20°C凍存20min后擠膠回收。結(jié)果見圖1。3aB DNA片段的大小為432bp。圖中箭頭所示為3aB DNA片段，大小約 432bp0實(shí)施例2 pMD18T-3aB重組質(zhì)粒構(gòu)建材料乙醇丄8(12、葡萄糖、111^8』014、妝0!1、303、醋酸鉀、冰醋酸、酚、氯仿、01^0(北京化工廠)；Rnase、ECOR I.Sal I, solution I、pMD18T(TakaRa 公司)；氨節(jié)青霉素(上海生工生物工程有限公司);JM109(NOVagen公司)；LB培養(yǎng)基(0X0ID LTD. ENGLAND)；瓊脂糖 (北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)
方法1. 3aB DNA片段與線性pMD18T連接將回收后的3aB DNA片段與線性pMD18T載體通過T_A連接，連接體系為10 μ 1， 即=DNA 片段 4. 7 μ 1，pMD18T 載體 0. 3 μ 1，solution I 5 μ 1，16°C連接過夜。2.感受態(tài)細(xì)胞的制備1)挑一單菌落于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)12_16h。2)取ImL上述培養(yǎng)物接種于IOOmL LB培養(yǎng)基中，37°C，225rpm速度振蕩培養(yǎng)至OD 值為0.5左右。3)將菌液冰浴lOmin，然后2500Xg，4°C離心20min收集菌體。4)棄上清，倒置離心管Imin除凈剩余液體，然后加入IOmL冰冷的lOOmmol/L CaCl2溶液(高壓除菌)懸浮細(xì)胞，冰浴45min。5) 2000 X g, 4°C離心IOmin收集菌體，棄上清，加入4mL冰冷的100mmol/L CaCl2溶液，懸浮細(xì)胞。6)用含0.05%DMS0和15%甘油的CaC12溶液懸起細(xì)胞，用加樣器輕輕混勻，分裝 100 μ 1/管，保存于-70度備用。3. 3aB DNA片段與線性pMD18T連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109菌1)在超凈臺(tái)中將10 μ 1連接產(chǎn)物加入JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰上放置 30mino2)將Eppendorf管迅速轉(zhuǎn)移到42°C水浴中，妨S。迅速轉(zhuǎn)移到冰上，放置5min。3)菌液加到Iml LB培養(yǎng)基中，37°C，150rpm，30min使細(xì)胞復(fù)蘇。4)取菌液置于Eppendorf管中，5000rpm離心5min。棄800 μ 1上清，用剩余培養(yǎng)
液重懸菌。5)重懸菌液移入具有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平皿上，涂抹均勻，倒置放入37度恒溫箱中過夜培養(yǎng)。4. pMD18T_3aB重組質(zhì)粒的提取1)挑單克隆菌落于5ml LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素50 μ g/ml)，37°C，180r/m振蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。2)將菌液倒入2ml管中分離心(llOOOrpm，4°C，離心^iin)，棄培養(yǎng)液。再次離心，
將培養(yǎng)液吸凈。3)將細(xì)菌沉淀重懸于300μ 1預(yù)冷的solution I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/ LTris. Cl (pH8. 0)，lOmmol/LEDTA(pH8. 0))中，漩渦振蕩器振蕩，吹打混勻。4)現(xiàn)配 solution II (0. 2mol/LNa0H, 1 % SDS, 1 1)。加 300 μ 1 新配制的 solution II，上下輕柔顛倒EP管6次，以裂解細(xì)菌，開蓋見拉絲現(xiàn)象即可。5)馬上加預(yù)冷的solution III (5mol/L醋酸鉀60ml，冰醋酸11. 5ml，去離子水 28. 5ml) 300 μ 1，上下顛倒 5 次混勻，置冰上 5min，4°C，IlOOOrpm 離心 5min。6)將上清轉(zhuǎn)移至另一 EP管中，再次離心，去除白色沉淀。加等體積TE飽和的酚 氯仿(1 1)，振蕩混勻 lmin，4°C，IlOOOrpm 離心 5min。7)將上層水相移至另一 Ep管中，加等體積的氯仿，振蕩混勻，IlOOOrpm，離心 3min。
8)將上層水相移至另一 Ep管中，加入2-2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，_20°C 沉淀 20min, IlOOOrpm 離心 IOmin09)盡量棄凈上清，IlOOOrpm離心aiiin，用加樣器吸棄無(wú)水乙醇。37°C恒溫箱充分干燥質(zhì)粒DNA，約IOmin。10)用20 μ 1含RNase 25 μ g/ml的去離子水，溶解質(zhì)粒DNA，_20°C凍存。5.pMD18T_3aB重組質(zhì)粒的鑒定酶切鑒定用ECORI和Ml I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為10 μ 1 質(zhì)粒 2 μ 1, ECOR I 0. 5μ 1, Sal I 0. 5μ 1, IOXH buffer 1口1，去離子水6口1。37°C，45min。
瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小。將酶切鑒定后為陽(yáng)性克隆菌送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果見圖2。pMD18T-3aB重組質(zhì)粒經(jīng)ECOR I和Ml I雙酶切后理論上應(yīng)釋放432bp 大小的DNA片段。圖中箭頭所示為釋放的DNA片段，大小約為432bp，與理論上一致。序列測(cè)定的結(jié)果如序列表中序列2所示。實(shí)施例3 pET28a (+) _3aB重組質(zhì)粒構(gòu)建材料CaC12、葡萄糖、Tris, EDTA, NaOH, SDS、醋酸鉀、冰醋酸、酚、氯仿、DMSO(北京化工廠)；I nase、EC0R I.Sal I、T4連接酶、pEI^8a(+) (TakaRa公司)；卡那霉素(上海生工生物工程有限公司)；LB 培養(yǎng)基(0X0ID LTD. ENGLAND) ；BL21 (DE3) (Novagen 公司)方法1. 3aB DNA 片段與線性 pET28a(+)連接3aB DNA片段與pET28a(+)載體的酶切回收將測(cè)序后正確的pMD18T_3aB重組質(zhì)粒與pET28a(+)質(zhì)粒分別用ECOR I和Ml I酶切。酶切體系為20 μ 1 質(zhì)粒5 μ 1，ECOR I 1μ 1, Sal I 1 μ 1，10XH buffer 2 μ 1，去離子水 11 μ 1。37°C，60min。瓊脂糖凝膠電泳分離3aB片段和線性化的pET28a(+)載體。在紫外燈下，切下目的條帶，置于_20°C冰箱中冷凍20min，取出后擠膠回收3aB基因片段和pET28a(+)線性載體。再次瓊脂糖凝膠電泳定量。3aB基因片段與pET28a(+)載體連接連接體系為20μ 1，即3aB基因片段14 μ 1， pET28a(+)載體 3μ1，Τ4 連接酶 lyl，10Xbuffer 2μ 1 16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化將10 μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法如前所述。2. pET28a (+) _3aB重組質(zhì)粒的提取與鑒定用如上所述的堿裂解法小量提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定。用ECOR I和Ml I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為10 μ 1 質(zhì)粒2 μ 1，ECOR I 0. 5μ 1, Sal I 0. 5 μ 1，10XH buffer 1111，去離子水6111。37°C，45min。1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切后釋放DNA片段的大小。將酶切鑒定后為陽(yáng)性克隆菌送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果見圖3。pET28a (+) _3aB重組質(zhì)粒用ECOR I和I雙酶切后理論上釋放432bp 大小的DNA片段。圖中箭頭所示為釋放的DNA片段，大小約為432bp，與理論上一致。序列測(cè)定的結(jié)果如序列表中序列2所示。
實(shí)施例4重組蛋白3aB的誘導(dǎo)表達(dá)材料甘油(北京化工廠)；卡那霉素(上海生工生物工程有限公司)；IPTG(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。方法將經(jīng)鑒定后的含pET28-3aB重組質(zhì)粒的BL21(DE3)甘油菌種，按0. 5 1/1000比例接種于20mL卡那霉素抗性(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，150r/m培養(yǎng)12小時(shí)作為一級(jí)種子。次日，將一級(jí)種子全部接種于IL LB培養(yǎng)基中，37°C搖床225r/m振蕩培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)A600，達(dá)0. 5-0. 8時(shí)，加入終濃度為1 μ mol/L IPTG，誘導(dǎo)3h后收集濕菌，稱重后_70°C凍存。結(jié)果見圖4A。圖中泳道2為誘導(dǎo)池后的細(xì)菌裂解物，在^KD處可見一條表達(dá)量較高的蛋白條帶即為重組蛋白3aB，分子量大小與軟件預(yù)測(cè)一致。實(shí)施例5重組蛋白3aB的^festern blot鑒定材料考馬斯亮藍(lán)、DAB(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；脫脂奶粉(完達(dá)山乳業(yè)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG(Sigma) ；H2O2 (北京化工廠)；NC膜(武漢博士德生物工程有限公司)；方法將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的BL21 (DE3)菌體裂解進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，根據(jù)凝膠面積按0. 65mA/cm2電轉(zhuǎn)移池。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將凝膠通過考馬斯亮藍(lán)染色并脫色，以判斷是否成功轉(zhuǎn)膜。對(duì)轉(zhuǎn)膜成功的硝酸纖維素濾膜(NC膜)，根據(jù)膜面積以0. lmL/cm2的量加入封閉液(5% [W/V]脫脂奶粉)，封閉過夜。次日，按0. lmL/cm2的量加入第一抗體(FMDV AsiaI 病毒感染血清，1 50稀釋)，將NC膜平放在平緩搖動(dòng)的搖床上，于室溫孵育池后，用PBS 洗滌3次后(IOmin/次)。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG (1/5000稀釋)，于室溫孵育池后，用PBS洗滌3次(IOmin/次)。用9mL的PBS溶液中溶解6mg的二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)JaAlOmL 30% H2O2，混勻后立即將NC膜放入顯色。觀察NC膜顯色，發(fā)現(xiàn)蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求后，終止顯色。結(jié)果見圖4B。圖中泳道2為誘導(dǎo)池后的菌體裂解物，在^KD處有一條被口蹄疫病毒感染后牛血清識(shí)別的條帶。該條帶為重組蛋白3aB被口蹄疫病毒特異性抗體識(shí)別。實(shí)施例6重組蛋白3aB可溶性表達(dá)的鑒定方法超聲裂菌按1 5(111/力？85重懸1 16誘導(dǎo)汕后的含有3動(dòng)重組蛋白的見21 菌體，冰上混勻。超聲粉碎儀調(diào)至800W，工作5，，間歇5，，超聲60次，共IOmin超聲處理。 11000r/m,離心30min，收集上清。將沉淀用PBS洗滌三次后，用與上清等體積的PBS重懸沉淀。將上清和懸起沉淀的液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定3aB蛋白的表達(dá)方式。結(jié)果見圖5。超聲不能破碎包涵體，因此超聲后的上清液中所含的目的蛋白即重組蛋白3aB可溶性表達(dá)部分。沉淀中所含的目的蛋白為包涵體表達(dá)部分。圖中可見約70% 3aB重組蛋白在上清液，因此，70%的重組蛋白3aB為可溶性表達(dá)。實(shí)施例7可溶性重組蛋白3aB的純化材料Sepharose4B-Ni2+> Sephadex G25(Pharmacia) ;Tris、NaCl (北京化工廠)；咪唑(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；Lowry蛋白定量試劑(sigma分裝)； BSA (LVSHENGYUANBI0TECHN0L0GY)。方法3aB蛋白的純化將裂菌后得到的上清緩慢加到鎳親和層析柱上，待上清液全部加入后，用洗滌緩沖液OOmmol/LTris ；0. 5mol/LNaCl ；30mmol/L咪唑；PH 7. 8)緩慢沖洗柱床4h，至雜蛋白全部洗滌下柱；用洗脫液洗脫3aB蛋白GOmmol/L Tris ；0. 5mol/L NaCl ； 0.5mol/L咪唑；PH 7. 8)；收集含3aB蛋白的洗脫液。將洗脫液加入除鹽柱，除鹽緩沖液 (20mmol/L Tris ；0. 9% NaCl ； PH 7.8)洗脫，收集 3aB 蛋白。SDS-PAGE 分析，鑒定重組蛋白的純度。3aB蛋白的定量采用Bradford法對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行定量分析，即以 BSA(BSA，人血清白蛋白)作為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨機(jī)取三支凍干蛋白，超純水溶解并做2 個(gè)或3個(gè)稀釋度。3復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A576值。結(jié)果見圖7。圖中泳道7在^KD處有一明顯的蛋白條帶即為純化后重組蛋白3aB。經(jīng)軟件分析，純化后的3aB重組蛋白的純度達(dá)90 %以上。實(shí)施例8建立3aB_ELISA方法檢測(cè)抗3aB抗體材料脫脂奶(完達(dá)山乳業(yè)有限公司)，HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG(Sigma) ；OPD(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)H2o2(北京化工廠)；各種血清(內(nèi)蒙古金宇生物集團(tuán)有限公司)方法用3aB蛋白包被，建立檢測(cè)抗3aB抗體的間接ELISA方法(命名為3aB_ELISA)1)包被用 PBS 溶液(Nacl 8. 0g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 3. 58g, KH2PO4 0. 24g, PH 7. 2)將3aB蛋白稀釋至終濃度2 μ g/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lmL，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液(PBST 含0. 05% Tween的PBQ洗3次，每次3分鐘。2)封閉封閉液(含5%脫脂奶的PBST)0. 2mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C 孵育1小時(shí)。不洗滌。3)結(jié)合一抗于各反應(yīng)孔中加入用樣品稀釋液(含5%脫脂奶的PBST)1 100新鮮稀釋的待測(cè)血清、陽(yáng)性血清和陰性血清0. lmL。37°C孵育1小時(shí)，如上洗滌。4)結(jié)合二抗于各反應(yīng)孔中加入用樣品稀釋液1 300新鮮稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗牛IgGO. lmL。37°C孵育1小時(shí)，如上洗滌。5)顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的0PD/H202底物溶液0. lmL，室溫避光顯色 5 30分鐘。6)終止于各反應(yīng)孔中加入20%硫酸0.05mL。在ELISA檢測(cè)儀上，于492nm測(cè)各孔OD值。陰性判定值=NCX+3SD (NCX,陰性對(duì)照A492值的平均數(shù)；SD，標(biāo)準(zhǔn)差)陽(yáng)性判定值 =PCX+3SD(PCX，陽(yáng)性對(duì)照A492值的平均數(shù)；SD，標(biāo)準(zhǔn)差)標(biāo)本A492值彡陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，<陰性判定值的為陰性。介于陽(yáng)性判定值與陰性判定值之間為可疑樣本，需要進(jìn)一步判定。用此方法檢測(cè)了 90例不同免疫狀態(tài)的血清，包括40例FMDV自然感染的牛血清 (包括Asia 1型和0型口蹄疫病毒感染血清)>30例接種疫苗的牛血清以及20例健康牛血清。結(jié)果所有病毒感染的血清顯示陽(yáng)性，而所有接種疫苗的血清都為陰性(圖7)。該結(jié)果表明該方法的特異性和敏感性均為100%。結(jié)論以上結(jié)果表明，以重組3aB蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA的方法可被用來區(qū)分口蹄疫病毒感染和和接種口蹄疫疫苗的動(dòng)物。該方法具有特異性和敏感性高，操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少的特點(diǎn)，適合于大量血清的篩查。該方法不僅可以用于篩查陰性動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，清除隱性感染的動(dòng)物，消滅潛在傳染源，有利于控制和消滅FMD。也可以為活牲畜進(jìn)出口檢疫提供篩查病毒感染動(dòng)物的方法，同時(shí)為肉類和奶制品安全提供保障。序列表<110>北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司<120>鑒別自然感染和人工免疫口蹄疫病毒的ELISA試劑盒<160>2<210>1<211>144<212>PRT<213>人工序列<400>1
0168]Lys Arg Gln Gln Met Val Asn Asp Ala Val Asn Glu Tyr lie Asp15
0169]Lys Ala Asn lie Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu Ala Glu30
0170]Lys Asn Pro Leu Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Val Gly Phe Arg45
0171]Glu Arg Thr Leu Pro Gly Arg Lys Thr Ser Asp Asp Val Asn Ser60
0172]Glu Pro Val Lys Pro Val Glu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Gly Pro75
0173]Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg Ala90
0174]Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg105
0175]Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu120
0176]Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val135
0177]Lys Ala Lys Asn Leu lie Val Thr Glu144
0178]<210>2
0179]<211>432
0180]<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
MGAGACAGCAGATGGTGMTGATGCGGTGMCGAGTACATCGACAMGCCMCATCACC60
ACAGATGACAAGACTCTTGACGAGGCGGMMGMCCCTCTGGAGACCAGTGGTGCTAGC120
ACCGTTGGTTTCAGAGAGAGMCCCTCCCGGGGCGCMGACGAGTGATGACGTGMCTCC180
GAGCCCGTCAMCCCGTGGAGGMCMCCACMGCTGMGGACCCTACGCCGGGCCACTC240
GAGCGTCAGAMCCTCTGMAGTGAGAGCCMGCTCCCACAGCMGAGGGACCCTACGCT300
GGCCCGATGGAGAGACAGMACCACTGAMGTGAMGCMMGCCCCGGTCGTTMGGM360
GGGCCTTACGMGGACCGGTGMGAMCCTGTCGCTTTGAMGTGAMGCGMGMCTTG420
ATTGTCACTGAG43權(quán)利要求
1.一種重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，其具有SEQ ID NOl所示的氨基酸序列。
2.一種重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，其編碼基因具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
3.—種ELISA方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1或2任一所述的重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白鑒別口蹄疫病毒自然感染和接種口蹄疫疫苗的動(dòng)物。其包括如下基本步驟1)利用權(quán)利要求1或2任一所述的重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白做包被抗原包被ELISA 檢測(cè)用的培養(yǎng)板；2)用脫脂奶或其它非重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白封閉ELISA檢測(cè)用的培養(yǎng)板；3)加入待檢測(cè)的動(dòng)物血清；4)加入酶標(biāo)第二抗抗體，這種酶標(biāo)第二抗抗體包括但不限于辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG ；5)加酶底物顯色，這種酶底物包括但不限于OPD；6)終止酶底物顯色反應(yīng)；7)用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。
4.一種鑒別試劑盒及其使用方法，其特征在于應(yīng)用權(quán)利要求1或2任一所述的蛋白，應(yīng)用權(quán)利要求3所述的步驟。
5.權(quán)利要求4所述的試劑盒用于鑒別口蹄疫病毒自然感染和接種口蹄疫疫苗的動(dòng)物的用途。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒用于鑒別口蹄疫相關(guān)病毒的用途。
7.利用權(quán)利要求1或2任一所述的重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白用于鑒別口蹄疫病毒自然感染和接種口蹄疫疫苗動(dòng)物的用途。
8.按照權(quán)利要求3-7所述，其中的動(dòng)物是牛、羊、豬和其它可被口蹄疫病毒感染的動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，該重組蛋白可作為包被抗原被應(yīng)用于ELISA試劑盒；這種ELISA試劑盒可以鑒別自然感染口蹄疫病毒和接種口蹄疫疫苗的動(dòng)物。本發(fā)明還涉及該重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白在鑒別口蹄疫病毒自然感染和接種口蹄疫疫苗動(dòng)物方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/42GK102190714SQ20101011669
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者何春燕, 王麗穎, 王 華 申請(qǐng)人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司, 金宇保靈生物藥品有限公司