專利名稱：一株用于生產(chǎn)l-天冬酰胺酶ⅱ的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一株胞外表達(dá)L-天冬酰胺酶II的工程菌，及 其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明是利用現(xiàn)代生物技術(shù)、基因工程方法來構(gòu)建胞外表達(dá)L-天冬酰 胺酶II的工程菌，并選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，使得到的酶活力達(dá)到較高水平。
背景技術(shù)：
L-天冬酰胺酶(E. C. 3. 5. 1. 1)可催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，人們已從 不同細(xì)菌源獲得了 L-天冬酰胺酶。 1953年，Kidd發(fā)現(xiàn)豚鼠血清有抗腫瘤作用。后來，Broome證實了豚鼠血清的抗腫 瘤因子是血清中的L-天冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感腫瘤細(xì)胞氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸 的代謝紊亂，從而抑制腫瘤生長。 大腸桿菌含有天冬酰胺酶的兩種同工酶L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II。 L-天冬酰胺酶I位于胞質(zhì)溶膠中，對天冬酰胺的親和性低。L-天冬酰胺酶II(Accession : NP 417432)位于周質(zhì)，對天冬酰胺具有高親和性。因此，L-天冬酰胺酶II可通過去除細(xì)胞 外的天冬酰胺，來治療依賴L-天冬酰胺進行蛋白質(zhì)合成的腫瘤或癌癥，其在治療白血病， 例如急性淋巴細(xì)胞白血病中特別有效。 基因重組技術(shù)的出現(xiàn)，使人們可以根據(jù)自己的意愿表達(dá)蛋白質(zhì)。通過國內(nèi)外專利 及文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，已有用基因工程菌來表達(dá)并生產(chǎn)L-天冬酰胺酶，但酶都定位于細(xì)胞內(nèi)周 質(zhì)空間中，胞外表達(dá)的報道極少，還沒有用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是將原本存于在細(xì)胞 內(nèi)周質(zhì)中的L-天冬酰胺酶II轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，以便于產(chǎn)物回收。 本發(fā)明提供了一種不同于CN1705880A中所公開的工程菌的構(gòu)建方法以及培養(yǎng)條 件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了表達(dá)L-天冬酰胺酶II工程菌，及其構(gòu)建和發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所說的表達(dá)L-天冬酰胺酶II工程菌，由重組質(zhì)粒pET-ASP轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21而得到；其中重組質(zhì)粒pET-ASP的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
上述重組工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟 1)將L-天冬酰胺酶II基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pET22b上，得重組質(zhì)粒pET-ASP ;
2)用重組質(zhì)粒pET-ASP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到重組工程菌。
所說的L-天冬酰胺酶II基因，可通過基因工程技術(shù)從大腸桿菌中獲得。作為本 發(fā)明的一個實例，所說的L-天冬酰胺酶II基因是從E. coli JM109中分離提取染色體DNA， 再用PCR方法從上述染色體DNA中釣取得到。 應(yīng)用本發(fā)明重組工程菌生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的方法，是將重組工程菌進行培養(yǎng) 發(fā)酵，表達(dá)產(chǎn)生L-天冬酰胺酶II。將發(fā)酵液離心或過濾除去菌體，清液過親和層析柱，洗脫液脫鹽后冷凍干燥，即可得到產(chǎn)品。
上述生產(chǎn)方法中，具體地，用于重組工程菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基為
1)種子培養(yǎng)基配方為牛肉膏含量5g/L 25g/L，蛋白胨含量5g/L 20g/L，NaCl 含量8g/L 15g/L，氨芐青霉素含量為0. 02g/L 1. 85g/L， pH值為6. 5 7. 8 ;優(yōu)選的配 方為牛肉膏含量5g/L 10g/L，蛋白胨含量9g/L 15g/L，NaCl含量9g/L 13g/L，氨芐 青霉素含量為0. 08g/L 1. 25g/L， pH值為6. 9 7. 3 ; 2)搖瓶培養(yǎng)基配方為酵母浸出膏含量15g/L 40g/L，蛋白胨含量8g/L 30g/ L，甘油含量2g/L 10g/L， pH值為6. 5 7.8 ;優(yōu)選的配方為酵母浸出膏含量20g/L 25g/L，蛋白胨含量11g/L 15g/L，甘油含量3g/L 6g/L， pH值為6. 9 7. 3 ;
3)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米漿含量50g/L 150g/L，甘油含量為5g/L 30g/L， pH為6. 5 7. 5 ;優(yōu)選的配方為玉米漿含量為70g/L 100g/L，甘油含量為9g/L 14g/ L， pH為6. 9 7. 3。
上述生產(chǎn)方法中，具體地，培養(yǎng)條件如下 搖瓶培養(yǎng)條件接種量O. 5% 5%，溫度30°C 40。C，振蕩轉(zhuǎn)速180rpm 300rpm，裝液量8X 25X，培養(yǎng)0h 10h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為lg/L 10g/L， 誘導(dǎo)8h 24h。優(yōu)選的搖瓶培養(yǎng)條件為接種量1% 2%，溫度35°C 38t:，振蕩轉(zhuǎn)速 200rpm 230rpm，裝液量10 % 15 % ，培養(yǎng)lh 4h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為2g/L 4g/L，誘導(dǎo)lh 4h ; 發(fā)酵培養(yǎng)條件接種量1 % 10 % ，發(fā)酵溫度30°C 40°C ，攪拌速度160rpm 280rpm，罐壓0.02MPa 0. 10MPa，裝液量40X 75X，通風(fēng)量1 : 0. 4VVM 1 : 2. OVVM， 培養(yǎng)2h 14h后加入誘導(dǎo)劑乳糖，終濃度為lg/L 30g/L，誘導(dǎo)8h 24h。優(yōu)選的發(fā)酵 培養(yǎng)條件為接種量1 % 5 % ，發(fā)酵溫度35 °C 38°C ，攪拌轉(zhuǎn)速190rpm 230rpm，罐壓 0. 04MPa 0. 08MPa，裝液量55X 70X，通風(fēng)量l : 0. 7VVM 1 : 1. OVVM，培養(yǎng)8h llh 后加入誘導(dǎo)劑乳糖，終濃度為3g/L 6g/L，誘導(dǎo)10h 14h。 本發(fā)明的優(yōu)點可進行大規(guī)模生產(chǎn)L-天冬酰胺酶11 ，原料來源廣，成本低，產(chǎn)物在 發(fā)酵液中，分離純化步驟少，得率高。


圖1是重組質(zhì)粒pET-ASP結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是重組質(zhì)粒pET-ASP構(gòu)建示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明包括如下一些工藝步驟從能夠合成L-天冬酰胺酶II的原始菌株中分離 染色體DNA、引物設(shè)計、用PCR方法釣取酶的基因、基因序列測定、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì) 粒在宿主菌中表達(dá)、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明重組質(zhì)粒的構(gòu)建及工程菌的培養(yǎng)方法的上 述各步詳細(xì)內(nèi)容如下 1.從合成L-天冬酰胺酶II的原始菌株中分離染色體DNA 原始菌株為大腸桿菌JM109 (購自Sigma公司)，在LB培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)過夜，離 心收集菌體，加溶菌酶至終濃度lmg/mL， (TC作用15min，加RNase至終濃度100 y g/mL， 37°C
4作用30min，加蛋白酶K至終濃度100 y g/mL， 37。C作用2h后用苯酚氯仿(1 : 1)將蛋白 抽提5次，移出水相，加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液，加入2. 5倍體積-2(TC預(yù)冷的無 水乙醇，小心混勻后用無菌牙簽順時針纏繞取出沉淀DNA，放至4°C TE緩沖液中逆時針釋放 DNA，即得提取的染色體DNA。
2.引物設(shè)計和PCR方法釣取酶基因 用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的L-天冬酰胺酶II的基因是通過PCR方法從上述染色體DNA 中擴增得到的。兩個引物是根據(jù)已報導(dǎo)的大腸桿菌L-天冬酰胺酶II的基因序列及表達(dá)質(zhì) 粒的多克隆酶切位點而設(shè)計的。Nco I在酶基因的5'端，并以其中的ATG為起始密碼子， Xho I在酶基因的3'端。其中primer-1 :5' __CCA TGG CAT TAC CCA ATA TCA-3'
primer-2 :5' -CTC GAG GTA CTG ATT GAA GAT CT-3' 以上述染色體DNA為模板，在上述一對引物的引導(dǎo)下進行PCR，產(chǎn)物為比大腸桿菌 JM109的L-天冬酰胺酶基因N端少63bp的核酸序列。 PCR反應(yīng)染色體DNA模板1. 5ii g，2. 5UTaq聚合酶，lOOpmol DNA引物，2. 5mMdNTP
2ii L， 10X緩沖液2. 5ii L，加無菌水至終體積25ii L，每循環(huán)中95。C變性30sec，55t:退火
40sec，72。C延伸90sec，循環(huán)30次后72。C延伸10min。 所得PCR產(chǎn)物在1 % agarose中電泳，產(chǎn)物大小約lkb。 3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建 重組質(zhì)粒的構(gòu)建分兩個步驟構(gòu)建重組T-載體和構(gòu)建重組表達(dá)載體。詳細(xì)內(nèi)容如 下 1)構(gòu)建重組T-載體 所采用的T-載體購自Takara公司，其特點是質(zhì)粒載體已經(jīng)切開成直鏈狀，且在 兩端加上poly T形成的黏性末端，便于與PCR產(chǎn)物連接，T-載體上含有抗氨芐青霉素基因 (Ampr)。 PCR產(chǎn)物與T-載體在T4-DNA連接酶的作用下連接成重組T-載體T-ASP (圖2)， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化方法和條件如下用CaCl2法制備宿主菌感受態(tài) 細(xì)胞(《分子克隆實驗指南》)。將5 ii L重組T-載體與100 ii L感受態(tài)細(xì)胞混合，于冰上 放置30min，42。C 90sec，后置于冰上2min，加入900 y L LB培養(yǎng)基，于37 。C培養(yǎng)lh，后取 100 ii L涂布于LB平板上(100 ii g/mL Amp)，平板上預(yù)先涂布40 y L X-gal (20mg/mL)和4 y L IPTG(200mg/mL)。平板37"C放置過夜，挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37"C過夜培養(yǎng)后 提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取采用堿裂解法37t:過夜培養(yǎng)的菌體離心，沉淀加入100i! L溶液I，完 全打開沉淀后加入200 ii L溶液II，小心混勻后冰上放置5min，加入150 y L溶液III，小心 混勻后冰上放置5min，離心，上清液用苯酚氯仿(1 : 1)抽提1次，水相用2.5倍體積的 無水乙醇沉淀重組質(zhì)粒DNA，沉淀用75%乙醇洗滌，干燥后用4°C TE溶液溶解。
提取得到的重組質(zhì)粒DNA用Nco I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)低熔點膠電泳，切 下所需的帶(L-ASP gene)進行回收純化。
2)構(gòu)建重組表達(dá)載體 所用表達(dá)載體pET22b購自Novagen公司，其主要特點是在多克隆位點中設(shè)計了 pelB信號肽序列，可以將插入其后的基因表達(dá)產(chǎn)物引導(dǎo)至細(xì)胞外；在多克隆位點下游設(shè)計
5有6XHis標(biāo)簽，有利于產(chǎn)物的分離純化。 表達(dá)質(zhì)粒pET22b用Nco I和Xho I酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)低熔點膠電泳，切下所需的 帶(大片斷)進行回收純化。將兩次膠回收產(chǎn)物用上述同樣的方法進行連接，得到重組表 達(dá)載體pET-ASP(如圖1、圖2)。
4.重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主獲得重組工程菌 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入至大腸桿菌BL21中，即可得到將L-天冬酰胺酶分泌到細(xì)胞 外的工程菌。其轉(zhuǎn)化方法和條件如下用CaClj去制備宿主菌感受態(tài)細(xì)胞(《分子克隆實 驗指南》)，宿主菌BL21購自Sigma公司。將5 y L重組質(zhì)粒與100 y L感受態(tài)細(xì)胞混合，于 冰上放置30min，42。C 90sec，后放冰上2min，加入900 y L LB培養(yǎng)基，于37。C培養(yǎng)lh，后取 100 ii L涂布于LB平板上(100 ii g/mL Amp) ， 37。C放置過夜，即得到含重組表達(dá)載體的工程 菌pET-ASP。 5.工程菌的發(fā)酵培養(yǎng) 工程菌的種子培養(yǎng)基是牛肉膏含量5g/L 25g/L，蛋白胨含量5g/L 20g/
L， NaCl含量8g/L 15g/L，氨節(jié)青霉素含量為0. 02g/L 1. 85g/L， pH值為6. 5 7. 8。
0. 15MPa滅菌20min，冷卻后加入氨節(jié)青霉素，終濃度0. 002% 0. 185%。 工程菌的搖瓶培養(yǎng)基是酵母浸出膏含量15g/L 40g/L，蛋白胨含量8g/L
30g/L，甘油含量2g/L 10g/L， pH值6. 5 7. 8， 0. 15MPa滅菌20min。 工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基是玉米漿含量50g/L 150g/L，甘油含量為5g/L 30g/L，
pH 6. 5 7. 5， 0. 15MPa滅菌30min。 搖瓶發(fā)酵用過夜培養(yǎng)的工程菌作為種子液，接種量為0. 5% 5%，30°C 40°C 培養(yǎng)Oh 10h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為lg/L 10g/L，繼續(xù)培養(yǎng)8h 24h后停止發(fā) 酵。 發(fā)酵罐發(fā)酵用過夜培養(yǎng)的工程菌作為種子液，接種量為1% 10%，30°C 40°C 培養(yǎng)2h 14h后加入誘導(dǎo)劑乳糖，終濃度為lg/L 30g/L，繼續(xù)培養(yǎng)8h 24h后停止發(fā) 酵。 酶活力測定方法取lmL發(fā)酵液，6000rpm離心10min，取上清液為待測酶液。測定 步驟取O. 50mL 0.04mol/L L-天冬酰胺溶液作為底物，加入O. 45mL 0. 05mol/L Tris緩沖 液，O. 05mL待測酶液，37。C下反應(yīng)10min，加入0. 10mL 1. 5mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)。離心 后取上清液，加入3. 50mL蒸餾水和1. OmL奈氏試劑，混合均勻后放置10min，于480nm波長 處用比色法測定吸光度值。 酶活力定義在上述條件下，每分鐘催化L-天冬酰胺水解釋放1 ii mol氨所需的酶 量定義為一個酶活力單位。 通過以上的技術(shù)實施，本發(fā)明得到了一個含L-天冬酰胺酶基因的重組質(zhì)粒 pET-asp，該重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中轉(zhuǎn)化后得到一個重組基因工程菌，該工程菌可以 將L-天冬酰胺酶分泌到細(xì)胞外，在發(fā)酵培養(yǎng)誘導(dǎo)后，基質(zhì)中的酶活力可達(dá)20 45U/mL。
實施例1 按照上述五步工藝方法構(gòu)建L-天冬酰胺酶工程菌和培養(yǎng)該工程菌， 一具體實施 例如下 首先取已知菌種大腸桿菌JM109分離提取染色體DNA。主要是37。C培養(yǎng)過夜的JM109培養(yǎng)液離心收集菌體，加溶菌酶至終濃度lmg/mL，(TC作用15min，加RNase至終濃度 100iig/mL，37t:作用30min，加蛋白酶K至終濃度100 y g/mL， 37。C作用2h后用苯酚氯 仿(1 : 1)將蛋白抽提5次，移出水相，加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液，加入2. 5倍體 積-2(TC預(yù)冷的無水乙醇，小心混勻后用無菌牙簽順時針纏繞取出沉淀DNA，放至4°C TE緩 沖液中逆時針釋放DNA，即得提取的染色體DNA。 然后用PCR方法釣取酶基因。方法如下染色體DNA模板1. 5 y g， 2. 5U Taq聚合 酶，100pmo1 DNA引物，2.5mM dNTP 2 ii L， 10 X緩沖液2. 5 ii L，加無菌水至終體積25 ii L，每 循環(huán)中95。C變性30sec，55。C退火40sec，72。C延伸90sec，循環(huán)30次后72。C延伸10min。
所得的PCR產(chǎn)物與T載體連接，得到的重組T-載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì) 胞，其轉(zhuǎn)化方法和條件如下用CaClJ去制備宿主菌感受態(tài)細(xì)胞(《分子克隆實驗指南》)。 將5 ii L重組T-載體與100 ii L感受態(tài)細(xì)胞混合，于冰上放置30min， 42°C 90sec，后放冰上 2min，加入900ii LLB培養(yǎng)基，于37t:培養(yǎng)lh，后取100 y L涂布于LB平板上(100iig/mL Amp)，平板上預(yù)先涂布40 ii L X-gal (20mg/mL)和4 y L IPTG (200mg/mL)。平板37。C放置過 夜，挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37t:過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取采用堿裂解法 37t:過夜培養(yǎng)的菌體離心，沉淀加入100 ii L溶液I，完全打開沉淀后加入200 ii L II，小心 混勻后冰上放置5min，加入150 y L溶液III，小心混勻后冰上放置5min，離心，上清液用苯 酚氯仿(1 : 1)抽提1次，水相用2. 5倍體積的無水乙醇沉淀重組質(zhì)粒DNA，沉淀用75% 乙醇洗滌，干燥后用4°C TE溶液溶解。 將所得到的重組質(zhì)粒用Nco I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)低熔點膠電泳，回收小 片段。將此小片段用T4-DNA連接酶連接在用相同方法處理后回收的pET-22b大片段上，得 到重組表達(dá)質(zhì)粒。 將此重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在大腸桿菌JM109中，方法與上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 a相 同，最后取100 ii L涂布于LB平板(lOOii g/mLAmp)上，37。C放置過夜。
最后搖瓶培養(yǎng)工程菌l個裝有3mL種子培養(yǎng)基(5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，10g/ L NaCl，pH7. 2)的10mL小試管，經(jīng)0. 15MPa滅菌20min后接入氨節(jié)青霉素，終濃度0. lg/L， 再接入工程菌斜面，37t:振蕩培養(yǎng)過夜，以此作為種子液。 在250mL三角瓶中裝入30mL搖瓶培養(yǎng)基(20g/L酵母浸出物，16g/L蛋白胨，5g/L 甘油，pH7. O)，O. 15MPa滅菌20min，接入0. 3mL上述過夜培養(yǎng)種子液，37。C振蕩培養(yǎng)4h，加 入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度3g/L，繼續(xù)培養(yǎng)14h，最后發(fā)酵液中L-天冬酰胺酶活力為40. 4U/mL。
實施例2 本實施例中，方法和條件與實施例1相同，不同之處僅在于加入誘導(dǎo)劑的終濃度 為5g/L。最后所得發(fā)酵液中L-天冬酰胺酶活力為39. 6U/mL。
實施例3 本實施例中，方法和條件與實施例1相同，不同之處僅在于工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)在5 升發(fā)酵罐中進行，誘導(dǎo)劑由IPTG改為乳糖。 將工程菌斜面接入已滅好菌的裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37t:培養(yǎng) 過夜。 在5L發(fā)酵罐中裝入3L發(fā)酵培養(yǎng)基(70g/L玉米漿，8g/L甘油，pH7. 2) ， 0. 15MPa滅 菌30min，接入30mL上述過夜培養(yǎng)液。37。C培養(yǎng)8h，接入誘導(dǎo)劑乳糖，終濃度3g/L，繼續(xù)培養(yǎng)12h，最后發(fā)酵液中L-天冬酰胺酶活力為32. 4U/mL。
實施例4 本實施例中，方法和部分條件與實施例3相同，不同之處僅在于誘導(dǎo)劑乳糖的濃 度為5g/L，37t:培養(yǎng)10h后加入乳糖，最后所得發(fā)酵液中L-天冬酰胺酶活力為36. 8U/mL。
實施例5 取實施例1所得的發(fā)酵液25mL，6000rpm離心10min，取上清液20mL以lmL/min 的流速通過鎳瓊脂糖凝膠柱(1. 6X20cm，柱體積10mL)，用50mmol/LpH7. 4的磷酸緩沖液沖 洗，流速為2mL/min，然后用pH7. 4的50mmol/L咪唑-磷酸緩沖液洗脫，流速為2mL/min。經(jīng) 檢測，收集的洗脫液中L-天冬酰胺酶的純度提高了 2. 4倍，相對于培養(yǎng)介質(zhì)中最初的重組 L-天冬酰胺酶，回收得率為85% 。
權(quán)利要求
一株用于生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的重組工程菌，其特征在于該工程菌由重組質(zhì)粒pET-ASP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21而得到；其中重組質(zhì)粒pET-ASP的構(gòu)建如圖1所示。
2. 權(quán)利要求1所述重組工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1) 將L-天冬酰胺酶II基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pET22b上，得重組質(zhì)粒pET-ASP ;2) 用重組質(zhì)粒pET-ASP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到重組工程菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所說的L-天冬酰胺酶 II基因是通過下述步驟獲得從E. coli JM109中分離提取染色體DNA ;用PCR方法從上述 染色體DNA中釣取L-天冬酰胺酶II基因。
4. 一種用權(quán)利要求l所述重組工程菌生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于，是將 重組工程菌進行培養(yǎng)發(fā)酵，表達(dá)產(chǎn)生L-天冬酰胺酶II。
5. 如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于用于重組工程菌 培養(yǎng)的培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基配方為牛肉膏含量5g/L 25g/L，蛋白胨含量5g/L 20g/L， NaCl含量 8g/L 15g/L，氨芐青霉素含量為0. 02g/L 1. 85g/L， pH值為6. 5 7. 8 ;搖瓶培養(yǎng)基配方為酵母浸出膏含量15g/L 40g/L，蛋白胨含量8g/L 30g/L，甘油 含量2g/L 10g/L， pH值為6. 5 7. 8 ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米漿含量50g/L 150g/L，甘油含量為5g/L 30g/L， pH為6. 5 7. 5。
6. 如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)配 方為牛肉膏含量5g/L 10g/L，蛋白胨含量9g/L 15g/L，NaCl含量9g/L 13g/L，氨芐 青霉素含量為0. 08g/L 1. 25g/L， pH值為6. 9 7. 3 ;所述的搖瓶培養(yǎng)基配方為酵母浸出膏含量20g/L 25g/L，蛋白胨含量llg/L 15g/ L，甘油含量3g/L 6g/L， pH值為6. 9 7. 3 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米漿含量為70g/L 100g/L，甘油含量為9g/L 14g/L， pH為6. 9 7. 3。
7. 如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于培養(yǎng)條件如下 搖瓶培養(yǎng)條件接種量O. 5% 5%，溫度30°C 40。C，振蕩轉(zhuǎn)速180rpm 300rpm，裝液量8 % 25 % ，培養(yǎng)Oh 10h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為lg/L 10g/L，誘導(dǎo)8h 24h。 優(yōu)選的搖瓶培養(yǎng)條件為接種量1% 2%，溫度35°C 38t:，振蕩轉(zhuǎn)速200rpm 230rpm， 裝液量10 % 15%，培養(yǎng)lh 4h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為2g/L 4g/L，誘導(dǎo)lh 4h ;發(fā)酵培養(yǎng)條件接種量1 % 10% ，發(fā)酵溫度30°C 40°C ，攪拌速度160rpm 280rpm， 罐壓0. 02MPa 0. lOMPa，裝液量40% 75%，通風(fēng)量1 : 0. 4VVM 1 : 2. OVVM，培養(yǎng) 2h 14h后加入誘導(dǎo)劑乳糖，終濃度為lg/L 3g/L，誘導(dǎo)8h 24h。優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)條件 為接種量1% 5%，發(fā)酵溫度35°C 38t:，攪拌轉(zhuǎn)速190rpm 230rpm，罐壓0. 04MPa 0. 08MPa，裝液量55% 70%，通風(fēng)量1 : 0. 7VVM 1 : 1. OVVM，培養(yǎng)8h llh后加入誘 導(dǎo)劑乳糖，終濃度為3g/L 6g/L，誘導(dǎo)10h 14h。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一株新的用于生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的工程菌，其胞外表達(dá)產(chǎn)物具備L-天冬酰胺酶II蛋白活性。本發(fā)明也公開了其構(gòu)建方法和發(fā)酵培養(yǎng)條件。其中，該工程菌由重組質(zhì)粒pET-ASP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21而得到；重組質(zhì)粒pET-ASP的結(jié)構(gòu)如圖1所示。所述重組工程菌是將L-天冬酰胺酶II基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pET22b上，得重組質(zhì)粒pET-ASP；再用重組質(zhì)粒pET-ASP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。將該工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)能大規(guī)模生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II，且原料來源廣，成本低，產(chǎn)物在發(fā)酵液中，分離純化步驟少，得率高。
文檔編號C12N9/78GK101748094SQ20101011636
公開日2010年6月23日 申請日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者嚴(yán)生虎, 朱劼, 王利群, 王文兵, 黃達(dá)明 申請人:江蘇工業(yè)學(xué)院;江蘇大學(xué)