專利名稱：來自大腸桿菌合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的應用。
背景技術(shù)：
低矮整齊的草坪在美化人們的生活環(huán)境方面起著重要作用，為了保持草坪草低矮，目前人們普遍采用定期修剪的方式，造成了人力和資源的浪費，因此有必要培育矮生草坪草新品種。近期，分子生物學技術(shù)的發(fā)展為分子育種手段培育矮生草坪草新品種提供了技術(shù)平臺。
海藻糖是一種由兩個葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷鍵相連而成的非還原二糖， 在生物界中廣泛存在，它能清除有害的氧自由基，保護蛋白和磷脂膜抗氧化脅迫，維持細胞膜在高滲透壓下的穩(wěn)定狀態(tài)，阻止細胞內(nèi)膜變性，抑制膜融合、降低相變溫度、保持膜的流動性等等。因此人們通過轉(zhuǎn)基因方法在植物中積累海藻糖以培育耐逆植物新品種。 同時為了消除海藻糖的前體6-磷酸-海藻糖在植物體內(nèi)的積累而影響植物的生理代謝禾口生長(Trehalose Mediated Growth Inhibition of ArabidopsisSeedlings Is Due to Trehalοse-6-Phosphate Accumulation. Plant Physiology,2004，135 :879_890)。 人們將合成海藻糖的TPS和TPP基因融合后轉(zhuǎn)入植株以得到生長不受影響的耐逆植株。如將大腸桿菌的TPS和TPP融合基因轉(zhuǎn)化水稻，成功獲得了正常生長的耐逆的轉(zhuǎn)基因 /K 禾 (Expression of a bifunctional fusion of theEscherichia coli genes for trehalose-6-phosphate synthase andtrehalose-6-phosphate phos phatase in transgenic rice plants increasestrehalose accumulation and abiotic stress tolerance without stuntinggrowth. Plant physiology,2003，131 (2) :516_524)將融合的酵母TPS和TPP基因轉(zhuǎn)入煙草，或是將TPS基因?qū)肴~綠體，或是逆境誘導表達TPS 都能得到了正常生長的耐逆轉(zhuǎn)基因煙草等等。(Improved drought tolerance without undesired sideeffects in transgenic plants producing trehalose Plant Mol. Biol.2007,64 :371_386) 但是，在草坪草的轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，將TPS和TPP融合基因轉(zhuǎn)化草坪草，能得到矮生的轉(zhuǎn)基因植株，為用分子生物學手段培育矮生草坪草新品種提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種培育矮生草坪草的方法及其所用的融合蛋白。
本發(fā)明提供了一個融合蛋白。
所述融合蛋白可包括磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶。
所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸海藻糖合成酶的羧基端。
所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來自大腸桿菌。
所述融合蛋白具體可為下述a)、b)的蛋白質(zhì) a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
上述a)或b)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述b)中的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'端第1至2247位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
所述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述編碼基因具體可為如下1)至3)的DNA分子之一 1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第1至2247位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
上述嚴格條件可為在5 X SSC，5 X Denhardt，S溶液，0. 05mg/mL魚精DNA，50 %去離子甲酰胺溶液中，在65°C下雜交，然后在室溫用2XSSC，0. 1% SDS，在42°C用0. 25 X SSC, 0. 1% SDS各洗膜15分鐘兩次。
含有所述基因的表達盒、重組表達載體、細胞系或重組菌均屬本發(fā)明的保護范圍。
可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達載體。
所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與 mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用所述融合蛋白編碼基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的融合的蛋白編碼基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
所述表達載體具體可為如圖1所示的表達載體。
本發(fā)明還提供了一種培育矮生草坪草的方法，是將這些DNA片段導入植物細胞，得到矮生草坪草。
可通過任何常規(guī)方法將所述DNA片段導入植物細胞，如通過如圖1、圖2所示的表達載體將所述DNA片段導入植物細胞，得到矮生草坪草。
本發(fā)明提供了一個融合蛋白包括磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來自大腸桿菌。將本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因?qū)氩萜翰葜?，可以得到矮生草坪草。本發(fā)明的融合蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤牟萜翰萦酗@著作用。應用本發(fā)明方法培育矮生草坪草可以節(jié)省人力、節(jié)約資源，有較大的應用前景。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為質(zhì)粒pBI121: :mALB的結(jié)構(gòu)圖 圖2為轉(zhuǎn)pBI121 :mALB草坪草的PCR結(jié)果電泳鑒定 圖3為轉(zhuǎn)pBI121::mALB草坪草的表型
具體實施例方式細菌基因組DNA的提取采用SDS裂解法，植物基因組DNA的提取采用CTAB法，具 Sambrook and Russell “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual" (2001)；
Cloning :A Practical Approach, " Volumes I and II" (D. N. Glover, ed. ,1985)。
細胞總RNA的提取采用TRIZOL RNA提取液(鼎國生物技術(shù)公司)，并按供應商提供的方案進行總RNA的提取。將得到的總RNA用DNase酶(Prmega，America)消化，以去除殘存的DNA，以分光光度計(Eppendorf公司，德國)檢測樣品中總RNA的濃度。取5 μ g總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法進行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA片段為模板進行如下所示的PCR擴增反應。
除非有特殊說明，25 μ IPCR反應體系為0. 1 μ g模板DNA、1. 5mM MgCl2, 20mMTri s-HCl (pH8. 4)、50mM KCl、0. 2mM dNTP 混合物、0. 2μΜ 正向引物和 0. 2μΜ 反向引物，以及IU的pfu高保真DNA聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在 PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)反應94°C預變性4分鐘，94°C變性30秒，按各特定溫度復性，復性時間30秒，72°C延伸，延伸時間各反應特定，30個循環(huán)，最后72 °C、10分鐘。
本發(fā)明中所用的引物均為上海生工公司合成。
本發(fā)明中所用的引物如下 P 1 :5’ -AAGCCATCCCTTTCGCCTCC-3’ P2 :5’ -CCTGGGACGGCTATCTACGC-3’ 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、 一、磷酸海藻糖磷酸酶基因和磷酸海藻糖合成酶基因的改造 大腸桿菌的磷酸海藻糖磷酸酶基因和磷酸海藻糖合成酶基因序列已知 (GenbankAccession X69160)。參照已知序列，再將其中的植物稀有密碼子經(jīng)過置換，得到人工合成大腸桿菌的磷酸海藻糖磷酸酶基因和磷酸海藻糖合成酶基因融合基因(三博遠志)?？傞L度2247bp，其中磷酸海藻糖磷酸酶基因長1422bp，從序列5 ‘第1個堿基到第 1422個堿基，磷酸海藻糖合成酶基因長801bp，從序列5 ‘第1447個堿基到第2247個堿基， 兩者之間有一段長24bp的連接序列從從序列5 ‘第1423個堿基到第1446個堿基。此融合基因命名為mALB，編碼749個氨基酸。
二、融合基因mALB的植物表達載體構(gòu)建 將mALB融合基因DNA片段連接到質(zhì)粒pBI 121 (Genbank Accession NumberX52329)的Sma I-SacI (經(jīng)CIAP處理，寶生物)位點處，得到的重組質(zhì)粒命名為 pBI121: :mALB。在此植物表達載體中ALB受到35S啟動子控制。
將質(zhì)粒pBI121: :mALB轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，得到菌株LBA4404/ALB，用于植物組織的侵染。同時，以PBI121做為陰性對照轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，得到菌株 LBA4404/121。
三、草坪草轉(zhuǎn)化 1、愈傷組織誘導 選取成熟飽滿的草坪草早熟禾的種子，室溫下在蒸餾水中浸泡4小時后剝?nèi)シN皮，再放入蒸餾水中繼續(xù)浸泡過夜。浸泡好的去皮種子先用70%酒精過兩遍，再用30%次氯酸鈉消毒30分鐘，無菌水沖洗三遍。在無菌條件下，將種子接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基。接種密度100粒/皿，平皿直徑75mm。
每升愈傷組織誘導培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0，5丨81^，美國)2!^，6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國)0. lmg，pH 5. 8。
2、愈傷組織的農(nóng)桿菌侵染 將愈傷組織置于經(jīng)過重懸靜置菌液濃度為0D600 = 0. 1的LBA4404根農(nóng)桿菌菌液中侵染10分鐘，倒去菌液，在無菌濾紙上將愈傷晾干(約5分鐘)，置于覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)3天。所用共培養(yǎng)培養(yǎng)基為步驟_的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。
3、抗性愈傷組織的篩選 共培養(yǎng)后用篩選培養(yǎng)基對愈傷組織進行篩選，每三星期轉(zhuǎn)皿一次，約兩個月后上分化培養(yǎng)基。
每升抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D, Sigma，美國)2mg，6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國)0· lmg, G418(青島生工)20mg-100mg，羧芐青霉素(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)250mg，pH5. 8。
4、抗性愈傷組織的分化 將經(jīng)過篩選的直徑達到0. 5cm以上的抗性愈傷組織放到分化篩選培養(yǎng)基上進行分化，并于25°C下光照培養(yǎng)(16h光/8h暗)。10天后有綠色小芽出現(xiàn)，約兩周后即可生長為幼苗。
每升分化培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6-芐氨基嘌呤 (Sigma，美國)0. 2mg，激動素(Sigma，美國)0. 2mg，G418 (青島生工)50mg, ρΗ5· 8。
5、轉(zhuǎn)化植株的生根 將已分化的幼苗接種于生根培養(yǎng)基，生根。
生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
四、PCR鑒定 取生根培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)pBI121: :mALB苗葉片用CTAB法提取植物DNA，用引物Pl和 P2進行PCR反應驗證，結(jié)果如圖2所示，得到與預期1526bp相一致的條帶(圖中最左列為 marker，左第2列為質(zhì)粒陽性對照，最右列為陰性對照，其余為轉(zhuǎn)pBI121 :mALB基因植物 DNA)轉(zhuǎn)基因陽性率接近100%。
五、表型觀察 將同時轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)pBI121: :mALB和轉(zhuǎn)pBI121草坪草載入沙盆室內(nèi)培育一個半月后可見轉(zhuǎn)PBI121: :mALB的草坪草明顯矮生。如圖3所示，左瓶為轉(zhuǎn)pBI121 :mALB植株，右瓶為轉(zhuǎn)PBI121植株。
將轉(zhuǎn)基因苗及對照苗50厘米間隔同時種于田間，正常施肥澆水不予修剪，第二年五月分別測量植株的高度，數(shù)據(jù)如下
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，包括磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶，所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸海藻糖合成酶的羧基端。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來自大腸桿菌。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為下述a)、b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述融合蛋白，其特征在于其編碼基因為如下1)至3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第1-2247位脫氧核糖核苷酸所示的DNA 分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求4所述基因的表達盒、重組表達載體、細胞系或重組菌；所述表達載體為如圖1所示的表達載體。
6.一種培育矮生草坪草的方法，是將權(quán)利要求1至3中所述融合蛋白的編碼基因?qū)胫参锛毎?，得到矮生草坪草。所述草坪草可以是早熟禾?br> 7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述編碼基因通過如圖1所示的表達載體導入植物細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應用大腸桿菌合成海藻糖的融合蛋白培育矮生草坪草的方法。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括磷酸海藻糖磷酸酶和磷酸海藻糖合成酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。將本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因?qū)胫参镏?，可以得到矮生草坪草。本發(fā)明的融合蛋白及其編碼基因可用于培育美觀少修剪的草坪草新品種。
文檔編號C12N5/10GK102191228SQ20101012299
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者陳蕾, 李欽清, 吳茜, 陳婉麗, 趙建杰, 溫紅雨 申請人:北京北方杰士生物科技有限責任公司